CN110819599B - 一种预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株，克服了现有疫苗株不能够有效预防TW型鸡传染性支气管炎病毒流行毒株攻击，以及保护效果不佳等缺陷，所述疫苗株是以台湾型传染性支气管炎病毒强致病毒株的抗原基因置换传染性支气管炎病毒H120毒株的抗原基因构建而成的重组病毒。其有益效果在于，本发明中重组疫苗株，可有效保护鸡抵抗TW I型传染性支气管炎病毒强毒的攻击，免疫保护率达到100％，同时，具有良好的安全性，无副反应。

Description

一种预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株。

背景技术

禽传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触传染性疾病，是国际兽医局(OIE)及我国规定的家禽B/二类传染病之一。20世纪90年代以来，IB在国内相继爆发，流行十分广泛，给养禽业带来巨大经济损失。IBV防控的难点在于血清型、基因型众多，且不同血清型、基因型间没有交叉保护或者交叉保护很弱，长期的流行病学监控及选择针对本地区流行毒株的疫苗对IB的防控具有重要的意义。

TW I型IBV于20世纪90年代后首先出现在我国台湾地区，IBV在台湾形成特定区域的演化，主要分成两个独立的基因群：台湾I型(TW I型)和II型(TW II型)。TW II型，通常被称为呼吸道型，其症状较轻微；1990年后TW I型IBV出现并很快蔓延而造成台湾鸡群间之广泛传播，主要引起肾脏肿大的肾炎病变故称之为肾炎型。TW I型已成为我国目前第二大优势基因型。

国内现行使用的IBV疫苗主要为Mass型、LDT3-A株、4/91株或YX10-D90株，而TW I型、II型IBV与常用疫苗毒株的血清型不同，S1基因相似性较低，因此商用疫苗毒株对TW I型毒株的保护效果不佳。

发明内容

本发明针对于以上问题，克服现有疫苗株不能够有效预防TW型鸡传染性支气管炎病毒流行毒株的攻击，保护效果不佳等缺陷，提供一种专效预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株，所述疫苗株是以台湾型传染性支气管炎病毒强致病毒株的抗原基因置换传染性支气管炎病毒H120反向遗传毒株的抗原基因构建而成的重组病毒。

由于传染性支气管炎病毒H120株在世界范围内广泛使用近50年，其安全性得到了世界公认，适合作为疫苗载体。本发明的疫苗株是以H120毒株进行反向遗传，获得H120感染性克隆载体后，用流行的台湾型传染性支气管炎病毒强致病毒株的抗原基因通过基因重组置换掉H120感染性克隆上的抗原基因，拯救获得新的重组病毒，因为该重组病毒含有台湾型传染性支气管炎病毒的抗原基因，因而能够针对台湾型传染性支气管炎病毒进行免疫保护，选用强致病性流行毒株是为了激发受体动物产生针对流行毒株的坚强的免疫保护力，同时该重组病毒具有H120株的安全性，不会对受体动物有致病性和不良反应。

进一步，所述抗原基因为S1基因。

S1基因是S基因的一部分，S基因编码IBV的主要结构蛋白-S蛋白。S蛋白在病毒与宿主细胞的识别和结合、组织嗜性、在病毒感染性、抗体产生、血清型等方面占有支配地位。S蛋白是由N端S1(90kDa，520～538AA)和C端S2(84kDa，625AA)两个亚单位构成。而S1蛋白是IBV产生感染性、致病性、刺激机体产生中和抗体的主要蛋白。

本发明上述预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株，根据选择台湾型传染性支气管炎病毒强致病毒株的类型(TW I型或TW II型)即可获得对应类型的疫苗株。

进一步，所述台湾型传染性支气管炎为TW I型传染性支气管炎。

进一步，所述部分置换为置换SEQ ID No.1所示区段的S1基因或SEQ ID No.2所示区段的部分S1基因。

本发明人研究了置换传染性支气管炎病毒H120的S1基因全部和部分S1基因，探究S1基因中与IBV感染性，致病性相关的核心基因区域。

进一步，所述抗原基因还包括N基因。

研究发现，N基因所编码的N蛋白与S1基因编码的S1蛋白存在免疫保护交叉，二者协同作用促进机体的免疫应答。

进一步，所述置换为S基因中SEQ ID No.2所示区段S1基因与SEQ ID No.3所示N基因都置换。

本发明中将以上两种协同作用的抗原基因都置换为流行株的S1和N基因，获得了较完整的具有更强保护力的重组疫苗。

本发明上述置换方式仅为较优的实施例，但并不限于以上几种置换方式。

一株预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株，所述疫苗株为用SEQ ID No.1所示区段的S1基因置换传染性支气管炎病毒H120毒株中对应位置所得重组病毒，所述疫苗株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201986。

一株预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株，所述疫苗株为传染性支气管炎病毒H120毒株中S1和N基因分别被SEQ ID No.2所示区段S1基因与SEQ ID No.3所示N基因置换所得重组病毒，所述疫苗株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201985。

相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：

本发明所述重组疫苗株，可有效保护鸡抵抗TW I型传染性支气管炎病毒强毒的攻击，免疫保护率达到100％，同时，具有良好的安全性，无副反应。

生物材料保藏信息

一株预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株：分类命名：鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)rH120-ΔS1p/GZ14株，所述疫苗株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2019年11月13日，保藏号为CCTCC NO.V201986。

一株预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株：分类命名：鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)rH120-ΔS1z-ΔNz/GZ14株，所述疫苗株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学，保藏日期：2019年11月13日，保藏号为CCTCC NO.V201985。

附图说明

图1为重组疫苗株的滴度测试。

图2免疫和攻毒后各组抗体水平情况。

图3图中上下免疫7天和14天的病理图。

图4为鸡免疫后7天和14天体重监测图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

疫苗株H120株(Accession number：FJ807652)；TW型IBV强毒株GZ14株(KT946798)。

SPF鸡胚(9～11日龄)与2日龄SPF鸡购自广东新兴大华农禽蛋有限公司SPF实验动物中心。

实施例1：

一株预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株，所述疫苗株为用SEQ ID No.1所示区段的S1基因置换传染性支气管炎病毒H120毒株中对应位置所得重组病毒，记为rH120-ΔS1z/GZ14。

本实施例是利用Red/ET重组工程技术对IBV H120株感染性克隆p15A-H120进行修饰与拯救，获得重组毒株。

实施例2

一株预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株，所述疫苗株为用SEQ ID No.2所示区段的S1基因置换传染性支气管炎病毒H120毒株中对应位置所得重组病毒，记为rH120-ΔS1p/GZ14。

本实施例是利用Red/ET重组工程技术对IBV H120株感染性克隆p15A-H120进行修饰与拯救，以获得重组毒株。

实施例3

一株预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株，所述疫苗株为传染性支气管炎病毒H120毒株中S1和N基因分别被SEQ ID No.2所示区段S1基因与SEQ ID No.3所示N基因置换所得重组病毒，记为rH120-ΔS1z-Nz/GZ14。

实验例1

实施例1、2、3中重组疫苗株的滴度测试

将病毒用生理盐水稀释，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各50枚，102EID50/胚。分别于接种后6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h和48h各收获5枚鸡胚的病毒尿囊液，混合后分装，置于-80℃冻存。采用Reed-Muench法测定不同时间点病毒EID50并绘制生长曲线。

结果：rH120-ΔS1z/GZ14、rH120-ΔS1p/GZ14和rH120-ΔS1z-Nz/GZ14生长曲线趋势与母本病毒H120株基本一致，接种后36h达到滴度峰值，10^7.2EID50/0.2ML左右，重组病毒与母本病毒H120株滴度无显著差异(p＞0.05)。

实验例2

免疫和攻毒后各组发病率和死亡率统计

60只2日龄SPF白色来航鸡随机分为6组，每组10只，实验鸡置于负压隔离器中饲养，自由饮水采食，3个实验组于2日龄接种重组病毒104.0EID50/羽，1组作为非免疫攻毒对照组接种无菌PBS，实验组和非免疫攻毒对照组于16日龄接种强毒(GZ14)104.5EID50/只。另外1组作为空白对照组。免疫鸡攻毒后每日观察并记录各组鸡只状态、发病和死亡情况。试验过程中所有死亡鸡只立即进行剖检并观察大体病变具体分组与免疫、攻毒毒株见表1。

表1 实验动物分组与接种、攻毒毒株

表2 免疫和攻毒后各组发病率和死亡率

实验例3

抗体消长规律测定

抗体消长规律是测定抗体效价，评价疫苗的指标之一，并且评价疫苗抗体产生快慢，即检测多长时间抗体可以达到保护效果。方法为：采集免疫前试验鸡血清以及免疫后每周采集一次试验鸡血清。所有血清样品均用IDEXX公司的传染性支气管炎病毒抗体检测试剂盒测定特异性抗体效价，按照试剂盒推荐的结果判定标准，比值＞0.2判为阳性。结果如图2所示：

实验组重组抗体增长趋势与H120组基本一致。空白对照组在实验全程中未检测到IBV特异性抗体效价阳性，攻毒组攻毒前未检测到抗体应答反应。各实验组在重组毒株接种后第7d，抗体水平出现上升趋势但抗体水平较低；接种后第14d均可检测出抗体阳性反应。攻毒后各实验组抗体水平快速上升。rH120免疫组(组4)攻毒后的抗体水平略高于组1、2、3，无显著差异(P＞0.05)。

实验例4

排毒检测

在免疫后7d、14d、21d、28d四个时间点，每组随机抽取只试验鸡6只采集气管棉拭样品进行排毒检测。攻毒后14d，扑杀所有剩余试验鸡，采集肾脏组织，每份样品均分为两部分，一部分进行病毒分离，另一部分用于病理学检查。采集的棉拭样品反复冻融3次后弃去棉拭后10,000×g离心10min取上清备用，肾脏组织样品用含抗生素PBS制成20％的组织悬液，反复冻融3次后10,000×g离心10min取上清备用。处理好的样品经尿囊腔途径接种10日龄鸡胚，每份样品接种3只鸡胚，弃去24h之内的死亡鸡胚，每日观察两次，记录鸡胚的死亡情况。接种96h后将所有活胚置4℃冰箱冻死，无菌收获鸡胚尿囊液，打开鸡胚观察胚体病变，如出现充血、出血、水肿、尿酸盐沉积、发育不良等典型的病变特征则判定为病毒分离阳性对于病毒分离阴性的鸡胚，取尿囊液按照前述方法用IBV-S1-F和IBV-S1-R引物对进行检测，对于检测阳性的也判定为病毒分离阳性。对于既无特征性病变，检测结果也为阴性的样品用日龄鸡胚继续盲传3代。统计最终的病毒分离结果见表3。

表3 免疫和攻毒后各组排毒检测

组1、组4在攻毒后14天，呼吸道、泄殖腔排毒率较高；组2、组3在免疫后14天和攻毒后14天呼吸道、泄殖腔排毒率较低。说明组2疫苗株和组4疫苗株的具有保护效果，能够抵抗病毒在体内复制，抑制通过呼吸道、泄殖腔向体外排毒。

实验例5

病理学检查

将采集的试验鸡肾脏组织样品用10％中性缓冲福尔马林固定之后，进行病理学检查，制备的石蜡切片厚度为5μm，染色方法为HE染色。

结果如图3所示：免疫后7天，组5肾脏肿大，病理学观察间质炎性细胞浸润，其他组未见明显病理变化)。

免疫后14天，组1，4和攻毒对照组5肾脏不同程度肿大。组2，3和空白对照6肾脏大小正常。组1间质大量炎性细胞浸润，肾小球肿胀；组4细胞自溶，肾小管上皮细胞脱落，腔内可见坏死物质团块和盐类物质沉着团块；组5间质大量炎性细胞浸润，肾小球肿胀。组2、3和空白对照组6未见明显病理变化。

实验例7

体重检测

免疫后7天，各实验组与空白对照组体重无显著差异(p＞0.05)；GZ14株攻毒后14天，组2和组3体重高于F组及攻毒对照组(组5)，差异极显著(p＜0.01)，而与空白对照组(组6)体重差异不显著(p＞0.05)。

统计分析

所有试验数据均采用软件进行统计分析。发病率、死亡率以及气管和肾脏的排毒率的差异通过卡方(χ2)检验进行分析。

通过发病率和死亡率比较、抗体产生水平、病理学检查、排毒检测及体重检测综合评价两株H120-TW I型重组毒株：(组2)rH120-ΔS1p/GZ14和(组3)rH120-ΔS1z-Nz/GZ14对台湾型传染性支气管炎病毒的免疫效果好，且更安全。

Claims (2)

1.一株预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株，所述疫苗株为SEQ ID No.1所示区段的S1基因置换所得重组病毒，所述疫苗株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V201986。

2.一株预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株，所述疫苗株为SEQ ID No.2所示区段的S1基因与SEQ ID No.3所示N基因都置换所得重组病毒，所述疫苗株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201985。

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