JP3650634B2

JP3650634B2 - 家禽用ワクチン

Info

Publication number: JP3650634B2
Application number: JP17900694A
Authority: JP
Inventors: ジエーン・キヤスリーン・アレクサンドラ・クツク
Original assignee: アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2020-05-25
Also published as: DK0639640T3; ES2152292T3; EP0639640B1; GR3035135T3; EP0639640A1; DE69426051T2; ATE196773T1; DE69426051D1; US6086892A; JPH07147974A; PT639640E; US5750113A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、家禽の免疫に使用するための、新規な感染性気管支炎ウイルス血清型、この新規な血清型由来の弱毒化感染性気管支炎ウイルス株、および感染性気管支炎ウイルスの弱毒株を含む生ワクチンに関する。本発明はさらに、不活化された新規な血清型または、該血清型由来の不活化弱毒化株を含む不活化ワクチンに関する。本発明はさらに、感染性気管支炎生ワクチンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）は、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属の一構成員である。一般にこのウイルスは、約８０−１００ｎｍの大きさであり、突出する２０ｎｍのスパイクを有する球状体をなしている。ＩＢＶは、呼吸器、生殖器および腎臓系に影響を与える、全ての齢のニワトリの急性高感染性疾患の原因物質である。
【０００３】
ＩＢＶは、家禽産業が盛んな全ての国で報告されている。４週齢までのニワトリのひなは、呼吸器性疾患に最もかかり易く、感染による罹患率も高く、その結果二次細菌性感染する。産卵ニワトリに感染すると、産卵率の低下または不完全産卵を招き、薄く、奇形で、表面のきめの粗い、軟殻を有する低品質の卵が多く生まれる。通常、産卵ニワトリは疾患から回復はするが、その産卵率が感染前のレベルに戻ることは稀である。従って、ニワトリ集団がＩＢＶに感染したりすれば、重大な経済的影響を被りかねない。
【０００４】
ＳｐａｃｋｍａｎおよびＣａｍｅｒｏｎ（ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＲｅｃｏｒｄ，（１９８３），１１３，３５４−３５５）は、呼吸性兆候および異常産卵の既往症を有するキジからＩＢＶを分離した。このキジの疾患問題は、油性ベースの不活化ＩＢＶワクチンの使用により抑制に成功した。したがって、本明細書中に使用されている家禽という用語は、ニワトリ、キジ、および、卵または食肉を提供するＩＢＶ感受性の他のすべての家禽を含むように意図されている。
【０００５】
当初、分離されたウイルス性ＩＢＶ株の殆どは、マサチューセッツ血清型のものであったし、長い間、これが唯一のＩＢＶ血清型と考えられていた。しかし現在では、明確に区分された地域には異なる血清型が存在するらしいことが公知となっており、例えば、アーカンザス９９（Ｊｏｈｎｓｏｎら、ＡｖｉａｎＤｉｓ．，（１９７３），１７，５１８−５２３）は米国で分離されたが、Ｄ２７４血清型（Ｄａｖｅｌａａｒら、Ｐｒｏｃ．ＷｏｒｌｄＶｅｔ．ＰｏｕｌｔｒｙＡｓｓｏｃ．，Ｏｓｌｏ，１９８１，ｐ．４４）は、米国では分離されていない。
【０００６】
家禽の感染性気管支炎を予防する唯一の実際的な手段は、感染予防ワクチンを接種することである。ワクチンには、弱毒化されたものと、不活化されたものとの２種の主要タイプがある。
【０００７】
今までに多くの国々で多くの新規な血清型が報告されている。極く最近、例えば、Ｇｏｕｇｈらは、ＴｈｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＲｅｃｏｒｄ，（１９９２），１３０，４９３−４９４において、英国における感染したニワトリの可能な新ＩＢＶ株について発表した。Ｇｏｕｇｈらは、ＩＢＶの「新株」がＭ４１および最近のＩＢＶワクチンの多くが由来するオランダ変異株とは異なる抗原性を有することを示した。
【０００８】
さらにＰａｒｓｏｎｓらも、ＴｈｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＲｅｃｏｒｄ，（１９９２），１３１，４０８−４１１において、「既に述べた分離体とは血清学的に異なっており、ニワトリのひなに特徴的な感染性気管支炎様呼吸器性感染を起こさせ得る」ＩＢＶ分離体について記載している。
【０００９】
多くの新規な血清型がワクチンを接種したトリに感染性気管支炎を起こさせないことは周知である。しかし、ワクチンを接種したニワトリに歴然とした感染を起こさせることが見いだされた新規なＩＢＶ血清型が分離された。
【００１０】
これらの二つの最近の刊行物はどちらも、血清型または株について当業者にＩＢＶ分離体をこの新規な血清型に属するものと認めさせ得るようには記載していない。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１の態様により、ニワトリから分離され、１９９３年７月６日に、ブタペスト条約に基づいて、英国、ポートンダウン所在のＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓに寄託され、受託番号第Ｖ９３０７０６１２号の下に登録された新規な感染性気管支炎ウイルス血清型、および／または、上記寄託株に対してニワトリに産生した抗血清によって有意に交差中和化される感染性気管支炎株が提供される。
【００１２】
本発明の第２の態様により、新規な血清型に属するＩＢＶ株が提供され、該血清型は上記に述べた寄託を特徴としており、上記ＩＢＶ株は該寄託株に対してニワトリに産生した抗血清によって有意に交差中和化される。
【００１３】
以後４／９１と称される本発明の新規なＩＢＶ血清型は、市販の不活化二価感染性気管支炎ワクチンを既に接種されており、ＩＢＶ感染の特徴的な症状を示したニワトリから分離された。死んだ感染トリの気管および盲腸扁桃から細胞試料を採取し、ホモジナイズし、ニワトリの胚の気管支培養物中で継代した。第２または第３の気管支培養継代後に、電子顕微鏡検査により、気管支培養の上清中で典型的なコロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）形態学を有するウイルス粒子が確認された。
【００１４】
電子顕微鏡を用いた確認に加えて、分離されたウイルスはＲＮＡタイプの核酸を有していることがわかった。ＥＬＩＳＡにより、該ウイルスが公知の鳥類コロナウイルス、例えば、ＩＢＶ基準株Ｍ４１と共通の抗原を含んでいることが示された。さらに該ウイルスは、Ｌｉｎ，Ｚ．，ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，（１９９１），１１６，１９によるＩＢＶ用の汎用プライマーを用いてウイルス性ＲＮＡとのポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、ＩＢＶであることが確認された。
【００１５】
気管支培養で血清中和化試験を行った。４１種の公知の血清型の各々に対する単一特異性抗血清をニワトリに産生させ、新規な血清型４／９１の試験に使用した。表１にウイルス中和化試験の結果を要約する。さらに分離されたウイルスがニワトリの赤血球を瞬時に血球凝集することも見いだされ、この血球凝集反応は、特異性抗血清によって抑制可能であった。
【００１６】
新規なＩＢＶ血清型４／９１と他の７種のＩＢＶ血清型との間で交差中和化試験を行った。これは気管支培養で行われた。各単一特異性抗血清を、ｌｏｇ１０２．０ＣＤ₅₀｛ＣＤ₅₀＝中間繊毛静止用量（ｍｅｄｉａｎｃｉｌｉｏｓｔａｔｉｃｄｏｓｅ）｝の各ウイルスの二倍希釈範囲で試験した。その結果を表２に示す。
【００１７】
表３は、Ａｒｃｈｅｔｔｉ，Ｉ．およびＨｏｒｓｆａｌｌ，Ｆ．Ｌ．，Ｊ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．，（１９５０），９２，４４１−４６２の方法によるデータの分析結果を株間の関係（ｒ）の百分率で示している。この方法を胚におけるＩＢ中和化試験に適用すると、ｒ値が５０を超えるときは緊密な関係を示し、２５〜５０の範囲の値は低率の関係を示し、２５未満の値はほぼ無関係を示すことが示唆された（Ｌｏｃｈｅｒら．，ＢｅｒｌｉｎｅｒｕｎｄＭｕｎｃｈｅｎｅｒＴｉｅｒａｒｚｔｌｉｃｈｅＷｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｉｔ，（１９８３），９６，２６９−２７４）。
【００１８】
従って、「有意に交差中和化される」という用語は、ＡｒｃｈｅｔｔｉおよびＨｏｒｓｆａｌｌの方法を用いると、５０を超える「ｒ」値を有するＩＢＶ株は本発明の新規な血清型と密接な関連を有するものであると考えてよいことを意味している。
【００１９】
さらに本発明は、弱毒化感染性気管支炎ウイルス、即ち、ＩＢＶ血清型４／９１、または弱毒化された上記に記載の新規な血清型に属するＩＢＶ株に関する。そのような弱毒化ＩＢＶは、ＩＢＶを好適な培地上の培養中で、その病原性を低減させ且つその免疫原性を保持するに充分な回数、継代することにより得ることが可能である。ＩＢＶを少なくとも３０回継代するのが好ましい。
【００２０】
新規なＩＢＶ血清型の弱毒株は、１９９３年７月６日、ブタペスト条約に基づいて、受託番号第Ｖ９３０７０６１１号で、英国、ポートンダウン所在のＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓに寄託された。
【００２１】
本発明の新規なＩＢＶ血清型を弱毒化するために、ウイルスを胚形式卵中で継代してよく、尿膜腔、漿尿膜、卵黄のう、羊膜腔を介して接種するか、または胚に直接接種することが可能である。ウイルスは、７時間〜４日までの範囲の定期的な間隔で継代可能である。より一般的には、継代を１６〜３６時間の範囲で、好ましくは２４時間毎に行う。
【００２２】
あるいは、ウイルスをヒヨコ胚腎細胞のような鳥類の細胞培養中で継代することにより弱毒化を行ってもよい。
【００２３】
上記のように調製された弱毒化ＩＢＶ、または寄託された弱毒株を生ワクチンの調製に使用してもよい。このように、本発明の他の態様により、家禽の免疫に使用するための、上記に記載のＩＢＶ由来の感染性気管支炎生ワクチンが提供される。
【００２４】
本発明の別の態様により、新規なＩＢＶ血清型または上記に記載の株を、好適な培地上の培養中で、その病原性を低減させ且つその免疫原性を保持するに充分な回数、継代する段階、および採取された物質を処理してワクチンを得る段階を含む感染性気管支炎生ワクチンの製造法が提供される。ウイルスを少なくとも３０回継代するのが好ましい。
【００２５】
さらに本発明は、ＩＢＶに対する家禽の予防接種に使用するワクチンを調製するための、上記に記載の弱毒化感染性気管支炎ウイルス株の使用に関する。
【００２６】
そのような生ワクチンは、１日齢〜産卵時点（約１８週）の間の齢のトリに点眼剤、点鼻薬として、または飲料水に加えて、または噴霧することにより投与してよい。使用される投与量は、トリ１羽当たりｌｏｇ１０３．０〜ｌｏｇ１０７．０ＥＩＤ₅₀、好ましくは、トリ１羽当たりｌｏｇ１０４．０〜ｌｏｇ１０５．０ＥＩＤ₅₀の範囲である。
【００２７】
そのような弱毒化ＩＢワクチンは、他の鳥類用生ワクチン、例えば、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、滑液のう感染症（ＩＢＤ）、レオウイスル、トリ脳脊髄炎、ニワトリ貧血因子（ＣＡＡ）および他のＩＢＶ血清型と組み合わせて投与してもよい。
【００２８】
あるいは、本発明の新規なＩＢＶ血清型および／または上記に記載の新規な弱毒化ＩＢＶ株を不活化ワクチンとして用いてもよい。本発明のさらに別の態様により、家禽の免疫に使用するための不活化感染性気管支炎ワクチンが提供され、該ワクチンは、上記の新規なＩＢＶ血清型由来のＩＢＶ、上記に定義のＩＢＶ株または上記の弱毒化ＩＢＶ株を含む。
【００２９】
生ワクチンおよび不活化ワクチンの調製には、通常、特異性病原体未感染（ＳＰＦ）の胚形成鶏卵中でＩＢＶを増殖させる。採取後、死滅化ワクチンに使用するために、例えば、ホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンを用いて、ウイルスを不活化してよい。
【００３０】
不活化後、必要なら、ｐＨを調整し、且つ不活化物を中和化して、不活化ウイルスをアジュバントと混合してもよい。アジュバントは、水酸化アルミニウム、または鉱油（例えば、Ｍａｒｃｏｌ８２）若しくは植物油およびＴｗｅｅｎ８０およびＳｐａｎ８０のような１種以上の乳化剤からなる組成物であってよい。
【００３１】
不活化ワクチンは、１０〜２０週齢の間に皮下または筋肉内注射によって投与されるのが一般的である。不活化ワクチンは、トリ１羽当たりｌｏｇ１０５．０〜ｌｏｇ１０８．０の範囲、好ましくはｌｏｇ１０６．０〜ｌｏｇ１０８．０の範囲のＥＩＤ₅₀抗原当量（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を含んでいてよい。
【００３２】
そのような不活化ＩＢＶワクチンは、不活化鳥類ワクチン、例えば、ＮＤＶ，ＣＡＡ，エッグドロップ（ＥｇｇＤｒｏｐ）症候群１９７６および他のＩＢＶ血清型と組み合わせて投与してよい。
【００３３】
本発明のさらに別の態様により、上記のワクチンをウイルス感受性のトリに投与することを含む、ＩＢＶに対して家禽を保護する方法が提供される。
【００３４】
【実施例】
本発明を下記の実施例により示す。
【００３５】
実施例１
感染性気管支炎ウイルスの分離
気管、腎臓および盲腸扁桃試料をＩＢＶ感染の臨床的兆候を示す集団中の死亡したトリから採取した。ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むイーグルの無血清培地中で組織試料をホモジナイズして、１０％（ｗ／ｖ）懸濁液を得た。
【００３６】
１，５００ｇで１５分間遠心分離した後で、上清０．１ｍｌを１０個の徐々に消耗する気管支培養物（ＴＤＣ）の各々に接種した。３７℃で１時間吸着させた後、イーグルの無血清培地０．５ｍｌを各培養に加えた。ＴＯＣを３７℃でローラードラム上で培養し、繊毛静止（ｃｉｌｉｏｓｔａｓｉｓ）を毎日検査した。試料が陰性であるとして廃棄される前に「盲」継代を３回までおこなった。
【００３７】
ＴＯＣの繊毛静止が認められた試料中にＩＢＶが示された。「陽性」試料の上清を血球凝集の不在について（ニューカッスル病ウイルスにかかっていないことを確実にするべく）検査し、次いでそれらのＩＢとの同一性を血清学的分析によって確認した。
【００３８】
さらに分離体を特定するべくＥＬＩＳＡ検定を用いた（Ｍｏｃｋｅｔｔ．Ａ．Ｐ．Ａ．およびＣｏｏｋ，Ｊ．Ｋ．Ａ．，ＡｖｉａｎＰａｔｈｏｌｏｇｙ，（１９８６），１５，４３７参照）。経鼻的に接種された、特異性病原体未感染（ＳＰＦ）のロードアイランド赤色ニワトリに血清型４／９１に対する抗血清を産生させ、４週間後に出血させた。分離体４／９１に対する単一特異性抗血清は、ＩＢＶのＭ４１株をコートしたプレートを用いたＥＬＩＳＡ試験において、ｌｏｇ２１３．０の力価に反応することが示され、それによって、該分離体が感染性気管支炎ウイルスであることが証明された。
【００３９】
実施例２
ＩＢＶ株４／９１の弱毒化
先ず、８日〜１１日の間の予備培養を通して使用されたＳＰＦ白色レグホンの胚形成卵に、尿膜腔を介してｌｏｇ１０６．４ＣＤ₅₀／ｍｌのウイルスを含む病原体ＩＢＶ４／９１０．１ｍｌを接種し、３７℃で２４時間培養した。１群当たり半数の胚の尿膜液を指定時間に採取した。ＩＢＶ感染を示す異常の有無を検査する１７−１８日齢になるまで残りの胚形成卵を培養した。
【００４０】
採取された尿膜液を適切に希釈して１０個の胚に接種（０．１ｍｌ）し、上記のように２４時間培養した後で採取した。充分な回数の継代（少なくとも３０回）が達成されるまで、７〜３６時間の範囲内のさまざまな培養時間でこの継代を連続的に行った。
【００４１】
選択された継代時に、採取しておいた尿膜液を滴定した。該液の１０倍希釈系列を調製し、９−１１日齢の胚（尿膜路を介して接種）またはニワトリ胚の気管支培養物（ＴＯＣ）で検定した。
【００４２】
間隔を置いて、ＴＯＣでの中和化試験により、継代されたウイルスの同一性を検査した。２倍希釈系列の既知の陽性４／９１特異的ニワトリ抗血清を、等量の胚継代ＩＢＶ４／９１（ｌｏｇ１０２．０ＣＤ₅₀）と混合し、３７℃で１時間インキュベートし、次いで徐々に消耗されるＴＯＣ（５倍希釈）に接種した。３７℃で１時間吸着させた後、ＴＯＣに、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）およびα−メチルグルコシドを含むイーグルＭＥＭを重層（０．５ｍｌ）し、次いで３７℃でインキュベートし、３〜４日後に読み取りを行った。
【００４３】
実施例３
弱毒化ＩＢＶワクチンの調製および評価
実施例２に記載されているように調製した弱毒化ＩＢＶを尿膜腔から採取した。遠心分離および／または濾過により尿膜液を清澄化し、続いて処理してそれ自体公知の方法によって好適なワクチンを調製した。
【００４４】
９日齢のヒヨコの群に、上記の弱毒化ＩＢＶワクチンまたはマサチューセッツワクチン（Ｈ１２０）若しくはＭＡ５ワクチンを、点眼（０．１ｍｌ）によって接種した。３０日齢の時点で、気管支培養物で増殖したＩＢＶ血清型４／９１ｌｏｇ１０４．６ＣＤ₅₀を接種してヒヨコをチャレンジした。７日後、５羽のヒヨコ／群を殺し、「繊毛静止」試験のためにヒヨコの気管を取り出した（Ｄａｒｂｙｓｈｉｒｅ，Ｊ．Ｈ．，ＡｖｉａｎＰａｔｈｏｌｏｇｙ，（１９８０），９，１７９−１８４参照）。
【００４５】
ユータタル（Ｅｕｔｈａｔａｌ）を静脈注射してヒヨコを殺した。ヒヨコの気管を注意深く取り出し、小刀を用いて、１０個の輪（頂部から３個、中間部から４個、底部から３個）を注意深く切り出した。１０個の輪を低倍率で検査し、それぞれ０（繊毛活性１００％）〜４（繊毛静止１００％）の範囲の目盛り上に評点をつけた。
【００４６】
結果
表４に要約されている結果は、１回目の試験（チャレンジ後７日）では、実施例２で調製された弱毒化ＩＢＶ株は高い均一のチャレンジに対して充分に保護されたことを示している。２種のワクチン株（Ｈ１２０およびＭＡ５）は、この高チャレンジに対する保護力が弱く、どちらの場合にも、保護されたのはニワトリの１／５であった。
【００４７】
実施例４
不活化ＩＢワクチンの調製
尿膜腔を介して、８〜１１日の間予備培養された胚形成卵にＩＢＶを接種した。約１−３日インキュベートした後、尿膜液を採取し、プールし、遠心分離によって清澄化し、ホルマリンを添加してウイルスを不活化した。尿膜腔を介して９日齢の胚形成卵に接種し、次いで胚にＩＢ感染兆候があるかどうかを検査することによりＩＢウイルスの不活化を確認した。次いで、標準的手順を用いて油乳化ワクチンを調製した。これをニワトリ群の皮下または筋肉内に接種した。該ニワトリ群には、初期に弱毒化ＩＢ生ワクチンを投与することにより「初回抗原刺激」を受けさせておいてもよいし、そうしなくてもよい。少なくとも７週後にこれらのニワトリを出血させ、ＥＬＩＳＡにより、それらの血清をＩＢ特異抗体について検査した。
【００４８】
結果
１）初回抗原刺激を受けず、不活化ワクチンを投与し、７週後に出血した場合：
平均タイター（ｌｏｇ２）９．１、
範囲ｌｏｇ２７．６−１０．６。
【００４９】
２）初回抗原刺激を受け、不活化ワクチン投与し、７週後に出血した場合：
平均タイター（ｌｏｇ２）１２．６、
範囲ｌｏｇ２１１．６−１３．６。
【００５０】
【表１】
表１
下記のＩＢＶ血清型の各々に対して産生した単一特異性抗血清に対する中和化試験においてＩＢウイルス血清型４／９１を試験した。
【００５１】
各ケースにおける中和タイターは＜１：８であった。
【００５２】
英国血清型
Ａ；Ｂ；Ｃ；Ｄ；Ｆ；Ｆ１；Ｈ；Ｉ；Ｊ；６９０；３１７；１８３；９１８；２２５；ＨＶ１−１１６；Ｄ４１；ＶＦ７０−８６１；Ａｌｌｅｎ
オランダ
Ｄ２０７；Ｄ３８９６；Ｄ３１２８；Ｄ２１２
ポルトガル
１３５３５５／８２
イスラエル
ＩＢＶ−１１
ドイツ
５４２３／８６；３３２／８８；ＩＢＶ−１０
イタリア
１７６７／８４；フォルリ（Ｆｏｒｌｉ）１；フォルリ２
ベルギー
Ｂ−１４８６
米国
マサチューセッツ；コネティカット；アイオワ６０９；アイオワ９７；ホルテ（Ｈｏｌｔｅ）；グレイ（Ｇｒａｙ）；アーカンザス；６３２
南アフリカ
８９０／８０；１４５／８６
【００５３】
【表２】

【００５４】
【表３】

【００５５】
【表４】

Claims

英国、ポートンダウン所在のＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓに受託番号第Ｖ９３０７０６１２号で寄託されている新規な血清型に属し、且つ、前記寄託された株に対してニワトリに産生した抗血清によって有意に交差中和化されることを特徴とする感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）株。
前記ウイルスが弱毒化されていることを特徴とする請求項１に記載の感染性気管支炎ウイルス。
その病原性を低減させ且つその免疫原性を保持するに充分な回数、感染性気管支炎ウイルスを好適な培地上の培養中で継代することによって得ることができる請求項２に記載の弱毒化感染性気管支炎ウイルス。
ウイルスを少なくとも３０回継代することによって得られる請求項３に記載の弱毒化ＩＢＶ。
英国、ポートンダウン所在のＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓに受託番号第Ｖ９３０７０６１１号で寄託されている弱毒化感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）。
請求項１から５のいずれか一項に記載のＩＢＶ由来である、家禽の免疫に使用するための感染性気管支炎生ワクチン。
請求項１から５のいずれか一項に記載のＩＢＶ由来である、家禽の免疫に使用するための不活化感染性気管支炎ワクチン。
その病原性を低減させ且つその免疫原性を保持するに充分な回数、請求項１に記載のＩＢＶ株を好適な培地上の培養中で継代し、弱毒化ウイルスを採取し、および採取した物質を処理してワクチンを得ることを含む感染性気管支炎生ワクチンの製造法。
ＩＢＶを少なくとも３０回継代する請求項８に記載の方法。
感染性気管支炎ウイルスに対する家禽の予防接種用のワクチン製造のための、請求項２から４のいずれか一項に記載の弱毒化感染性気管支炎ウイルス株の使用。
請求項６または７に記載のワクチンをウイルス感受性の鳥類に投与することを特徴とする感染性気管支炎ウイルスから家禽を保護する方法。