PT639640E

PT639640E - Vacina para aves domesticas com infeccoes provocadas pela estirpe 4/91 do virus da bronquite

Info

Publication number: PT639640E
Application number: PT94305561T
Authority: PT
Inventors: Jane Kathleen Alexandra Cook
Original assignee: Akzo Nobel Nv
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-07-27
Publication date: 2001-03-30
Also published as: GR3035135T3; US5750113A; US6086892A; EP0639640A1; ATE196773T1; DE69426051D1; DK0639640T3; DE69426051T2; JPH07147974A; EP0639640B1; JP3650634B2; ES2152292T3

Description

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DESCRICÃO "Vacina para aves domésticas com infecções provocadas pela estirpe 4/91 do vírus da bronquite" O presente invento refere-se a uma nova estirpe do vírus da bronquite infecciosa pertencente a um novo serótipo, a estirpes atenuadas do vírus da bronquite infecciosa que derivam desta nova estirpe e a uma vacina viva, para utilização na imunização de aves domésticas, vacina essa que contém a estirpe atenuada do vírus da bronquite infecciosa. O invento refere-se também a uma vacina inactivada que contém a nova estirpe que foi inactivada, ou uma estirpe atenuada inactivada dela derivada. O invento refere-se também a um processo para a preparação de vacinas vivas contra a bronquite infecciosa. O vírus da bronquite infecciosa (IBV) é um membro do género coronavirus da família Coronaviridae. O vírus tem normalmente cerca de 80-100nm de comprimento, sendo redondo com espigões de 20 nm que se projectam. O IBV é o agente causador de uma doença aguda, altamente contagiosa, em galinhas de todas as idades, que afecta os sistemas respiratório, reprodutor e renal. O IBV tem sido relatado em todos os países onde se desenvolveu uma indústria intensiva de aves domésticas. As galinhas jovens até 4 semanas de idade são as mais susceptíveis a contrair doenças respiratórias, infecções que conduzem a elevadas taxas de morbidade e a uma mortalidade resultante de infecções bacterianas secundárias. A infecção em aves poedeiras resulta numa diminuição na produção de ovos, ou falha da postura usando todo o potencial, junto com um aumento no número de ovos de pior qualidade, com cascas finas, deformadas, duras e moles. Embora as aves poedeiras normalmente recuperem da doença, a sua produção de ovos raramente retorna aos níveis anteriores à infecção. Deste modo, a infecção por IBV em bandos de galinhas pode ter um sério efeito económico.

Spackman e Cameron (Veterinarv Record. (1983), 113. 354-355.) isolaram o IBV de pombos com um historial de sinais respiratórios e de produção de ovos aberrante. Este problema de doença em pombos foi controlado com sucesso, através da utilização de vacina à base de óleo de IBV 2 85 792 ΕΡ Ο 639 640/ΡΤ inactivado. Desta forma, a expressão aves domésticas, tal como aqui é físáída, pretende englobar galinhas, pombos e qualquer outra ave doméstica que sirva de fonte de ovos ou carne e que seja susceptível a infecção provocada pelo IBV.

Inicialmente, a maioria das estirpes de IBV virulentas isoladas eram do serótipo Massachussetts, e durante muitos anos julgou-se ser este o único serótipo de IVB. No entanto, actualmente sabe-se que parecem existir diferentes serótipos em áreas geográficas distintas; como por exemplo, o Arkansas 99 (Johnson et aL, Avian Pis., (1973), 1_7, 518-523), foi isolado nos EUA enquanto que o serótipo D274 (Davelaar et a/., Proc. World Vet. Poultrv Assoe., Oslo, 1981, p.44) não foi isolado nos EUA. O único meio prático de prevenir a bronquite infecciosa em aves domésticas é vacina-las contra a infecção. Encontram-se disponíveis dois tipos principais de vacina e esses são o atenuado e o inactivado.

Ao longo dos anos, os relatos de novos serótipos têm sido inúmeros, em muitos países. Mais recentemente, por exemplo, Gough et a!., em The Veterinarv Record. (1992), 130, 493-494, divulgaram uma possível nova estirpe de IBV em aves domésticas infectadas, na Grã-Bretanha. Eles mostraram que a "nova estirpe" de IBV tinha diferenças antigénicas da M41 e das variantes holandesas, das quais derivam muitas das vacinas de IBV correntes.

Adicionalmente, Parson et aL, em The Veterinarv Record. (1992), 131. 408-411 descreveram também isolados de IBV que "eram serologicamente distintos dos isolados previamente descritos e capazes de causar infecção respiratória característica do tipo bronquite infecciosa em galinhas novas."

Sabe-se bem que muitos serótipos novos não causarão bronquite infecciosa em aves que tenham sido vacinadas. No entanto, isolou-se agora um novo serótipo de IBV que se verificou causar uma infecção manifesta em galinhas vacinadas.

Nenhuma destas duas publicações recentes descreve o serótipo ou a estirpe de forma a permitir que os peritos na arte sejam capazes de identificar um isolado de IBV como pertencente a este novo serótipo.

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Em conformidade com um aspecto do invento, proporciona-se uma estirpe de IBV pertencente a um novo serótipo, sendo o dito novo serótipo caracterizado por uma estirpe de IBV, da qual se depositou uma amostra no European Collection of Animal Cell Cuttures, Porton Down, Reino Unido, sob o número de depósito V93070612, tendo a dita estirpe de IBV sido significativamente neutralizada por reacção cruzada por anti-soros, criados em galinhas, contra a dita estirpe depositada.

Isolou-se uma estirpe de IBV do presente invento, aqui referida como 4/91, de galinhas que tinham sido previamente vacinadas com uma vacina bivalente inactivada contra a bronquite infecciosa, comercialmente disponível, e que apresentavam os sintomas característicos da infecção por IBV. Recolheram-se amostras de tecido da traqueia e de tonsilas cecais de aves mortas afectadas, homogeneizaram-se e submeteram-se a passagens em culturas de órgãos de traqueia de embriões de galinha. Após a segunda ou terceira passagem em cultura de órgãos, observaram-se partículas de vírus com a morfologia típica de coronavírus, por microscopia electrónica, em sobrenadantes da cultura de órgãos.

Em adição à identificação usando o microscópio de electrónico, verificou-se que o vírus isolado possuía ácido nucleico do tipo do ARN. Usando um ELISA, demonstrou-se que os vírus continham antigénio em comum com coronavírus avícolas conhecidos, como por exemplo a estirpe M41 de IBV, de referência. Identificou-se também o vírus como sendo IBV realizando a reacção em cadeia com polimerase com ARN de vírus usando iniciadores universais para IBV em conformidade com Lin, Z., Archives of Viroloqy. (1991), 116. 19.

Efectuaram-se testes de neutralização de soro em culturas de órgãos da traqueia. Preparou-se, em galinhas, anti-soro monoespecífico para cada um dos 41 serótipos conhecidos e usou-se para testar o serótipo 4/91. O Quadro 1 resume os resultados dos testes de neutralização do vírus. Verificou-se também que o vírus isolado hemaglutinava espontaneamente os glóbulos vermelhos sanguíneos das galinhas e que esta hemaglutinação podia ser inibida por um anti-soro específico.

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Efectuaram-se testes de neutralização cruzada entre o novo serótipo 4/91 de IBV e sete outros serótipos de IVB. Estes foram efectuados em culturas de órgãos de traqueia. Testou-se cada anti-soro monoespecífico numa gama de duplas diluições contra log10 2,0 CD50 de cada vírus (CD50 = dose ciliostática mediana). Os resultados são apresentados no Quadro 2. O Quadro 3 mostra os resultados da análise dos dados em conformidade com o método de Árchetti, I. e Horsfall, F. L., J. Expt. Med., (1950), 92, 441-462, que expressa a relação (r) entre as estirpes, na forma de uma percentagem. Aplicandb este método aos testes de neutralização da IB em embriões, foi sugerido (Locher et al., Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift, (1983), 96, 269-274) que os valores de r superiores a 50 indicavam relações próximas, os valores ente 25 e 50 indicavam um menor grau de relação, enquanto que os valores inferiores a 25 indicavam pouca relação.

Desta forma, a expressão "significativamente neutralizada por reacção cruzada" significa que, usando o método de Árchetti e Horsfall, uma estirpe de IBV com um valor de "r" superior a 50 pode ser considerada intimamente relacionada com o novo serótipo do presente invento. O presente invento refere-se também a um vírus da bronquite infecciosa que pertence ao serótipo 4/91 de IBV, que está atenuado. Pode-se obter este IBV atenuado submetendo o IBV a passagens numa cultura, num meio adequado, um número de vezes suficiente para reduzir a sua patogenicidade mantendo no entanto a sua imunogenicidade. De preferência, submete-se o IBV a passagem pelo menos 30 vezes.

Depositou-se uma estirpe atenuada do novo serótipo de IBV em 6 de Julho de 1 993, no European Collection of Anima! Ce/I Cultures, Porton Down, Reino Unido, de acordo com o Tratado de Budapeste, sob o número de acesso V93070611.

Para atenuar uma estirpe de IBV do presente invento, pode-se submeter o vírus a passagens em ovos embrionados. A inoculação dos ovos pode ser efectuada através da cavidade alantóide, membrana corioalantóide, saco vitelino, cavidade amniótica ou mesmo directamente no embrião. Pode-se

85 792 ΕΡ Ο 639 640/ΡΤ submeter ο vírus a passagens a intervalos regulares, desde 7 horas a 4 dias. Mais vulgarmente, a passagem ocorre entre 16 a 36 horas, de preferência a cada 24 horas.

Em alternativa, pode atingir-se a atenuação submetendo o vírus a passagens numa cultura de células avícolas, tais como em células de rim de embrião de pinto. O IBV atenuado, preparado da forma acima descrita, ou a estirpe atenuada depositada, podem ser utilizados na preparação de uma vacina viva. Desta forma, em conformidade com um outro aspecto do presente invento, proporciona-se uma vacina viva contra a bronquite infecciosa para utilização na imunização de aves domésticas, sendo a dita vacina derivada do IBV descrito acima.

Em conformidade com um outro aspecto do invento, proporciona-se um processo para a preparação de uma vacina viva contra a bronquite infecciosa que compreende submeter uma nova estirpe de IBV, ou estirpe como anteriormente aqui descrita, a passagens numa cultura, num meio adequado, um número de vezes suficiente para reduzir a sua patogenicidade mantendo no entanto a sua imunogenicidade e processando o material colhido para produzir uma vacina. De preferência, submete-se o vírus a passagem pelo menos 30 vezes. O presente invento refere-se também à utilização de uma estirpe de vírus atenuado da bronquite infecciosa, como anteriormente aqui descrita, para a preparação de uma vacina para utilizar na vacinação de aves domésticas, contra o IBV.

Estas vacinas vivas podem ser administradas através de gotas oculares, gotas nasais, em água para beber, ou pulverizando os pássaros, em qualquer idade, desde um dia de idade até à altura de postura (cerca de 18 semanas). A dosagem utilizada está preferencialmente na gama de log10 3,0 a log10 7,0 EID50 por ave, de preferência entre log10 4,0 e log10 5,0 ElD50 por ave.

Esta vacina atenuada contra IB pode ser administrada em combinação com outras vacinas avícolas vivas, como por exemplo com Vírus da doença de

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Newcastle (NDV), Vírus de doença de Mareks (MDV), Doença infecciosa de bolsas (IBD), Reovírus, Encefalomielite avícola, Agente de anemia de galinhas (CAA) e outros serótipos de IBV.

Em alternativa, pode-se apresentar, na forma de vacina inactivada, uma estirpe de IBV em conformidade com o invento e/ou uma estirpe de IBV atenuada, acima descrita. Em conformidade ainda com um outro aspecto do invento, proporciona-se uma vacina inactivada contra a bronquite infecciosa para utilização na imunização de aves domésticas, vacina esta que contém IBV derivado de uma nova estirpe de IBV como se definiu atrás ou da estirpe de IBV atenuada descrita acima.

Tanto para a produção de vacina inactivada como de vacina viva, o IBV é usualmente crescido em ovos de galinha embrionados, isentos de patogénicos específicos (SPF). Após a colheita, pode inactivar-se o vírus, para utilizar numa vacina inactivada, usando por exemplo formaldeído ou β-propiolactona.

Após a inactivação e, se necessário, ajuste do pH e neutralização do agente inactivante, pode-se misturar o vírus inactivado com um adjuvante. O adjuvante pode ser hidróxido de alumínio ou uma composição consistindo em óleo mineral (por exemplo, Marcol 82) ou num óleo vegetal e um ou mais emulsionantes como Tween 80 e Span 80.

As vacinas inactivadas são normalmente administradas através de injecção subcutânea ou intramuscular, entre as 10 e as 20 semanas de idade. A vacina inactivada pode conter o equivalente antigénico de log10 5,0 a log10 8,0 EID50 por dose por ave, de preferência de log10 6,0 a log10 8,0 EID50.

Esta vacina inactivada de IBV pode ser administrada em combinação com outras vacinas avícolas inactivadas, por exemplo NDV, CAA, Síndroma de Egg drop 1 976 e outros serótipos de IBV.

Os seguintes exemplos ilustram o invento. 7 85 792 ΕΡ Ο 639 640/ΡΤ

Exemplo 1

Isolamento de vírus da bronquite infecciosa

Recolheram-se amostras de traqueia, rim e tonsilas cecais de aves mortas, de bandos que manifestavam os sintomas clínicos de infecção por IBV. Homogeneizaram-se as amostras de tecido em meio de Eagle isento de soro, contendo penicilina e estreptomicina, para originar uma suspensão a 10% (p/v).

Após a centrifugação a 1500 g durante 15 minutos, inocularam-se 0,1 ml de sobrenadante em cada uma das 10 culturas de órgãos de traqueia (COT) drenadas. Após 1 hora de adsorsão a 37°C, adicionaram-se 0,5 ml de meio de Eagle isento de soro, a cada cultura. Incubaram-se as COT a 37°C num tambor rolante e examinaram-se diariamente quanto a ciliostase. Efectuaram-se até três passagens "em ocultação" antes de se desprezar uma amostra como negativa.

Indicou-se IBV nas amostras onde se observou ciliostase da COT. Examinaram-se os sobrenadantes de amostras "positivas" quanto à ausência de hemaglutinação (para assegurar a erradicação do vírus da doença de Newcastle), depois confirmaram-se as suas identificações como IB por análise serológica.

Usou-se um ensaio ELISA para caracterizar adicionalmente os isolados (ver Mockett. A. P. A. e Cook, J. K. A., Avian Patholoqy. (1986), J_5, 437). Criou-se anti-soro para o serótipo 4/91 em galinhas vermelhas de Rhode Island isentas de patogénio específico, inoculadas intranasaimente e sangradas quatro semanas mais tarde. O anti-soro monoespecífico criado para o isolado 4/91 mostrou reagir com um título de log2 13,0 no teste ELISA, usando placas revestidas com a estirpe M14 de IBV, prova de que os isolados eram vírus da bronquite infecciosa.

Exemplo 2

Atenuação da estirpe 4/91 de IBV

Inocularam-se inicialmente ovos embrionados de galinhas leghorn brancas SPF, usados sempre entre 8 e 11 dias de pré-incubação, com 0,1 ml de IBV 4/91 patogénico contendo log10 6,4 CD50/ml de vírus através da cavidade alantóide e incubaram-se a 37°C durante 24 horas. Recolheu-se o fluido

85 792 ΕΡ Ο 639 640/ΡΤ 8 alantóide de metade dos embriões por grupo, no tempo fixado. Incubaram-se os restantes ovos embrionados até 17-18 dias de idade, quando se examinaram quanto a anormalidades indicativas de infecção por IBV.

Inoculou-se o fluido alantóide recolhido (0,1 ml), numa diluição adequada, na cavidade alantóide de 10 embriões e recolheu-se, como acima, após 24 horas de incubação. Efectuaram-se continuamente estas passagens até se atingir um número suficiente de passagens (pelo menos 30), com períodos de incubação que variaram de 7 a 36 horas.

Nas passagens seleccionadas, titulou-se o fluido alantóide que se recolheu. Preparou-se uma série de diluições, a dez vezes, do fluido e testaram-se em embriões de 9-11 dias de idade (inoculados por via alantóide) ou em cultura de órgãos de traqueia embrionados de galinhas (COT).

Com intervalos, verificou-se a identidade do vírus submetido às passagens, por meio de um teste de neutralização, em COT. Misturaram-se v diluições duplas sequenciais de um anti-soro de galinha específico para 4/91 positivo conhecido com um volume igual de IBV 4/91 submetido a passagens em embrião (log10 2,0 CD50), incubaram-se a 37°C durante 1 hora, depois inocularam-se em COT drenadas (5/diluição). Após um período de adsorsão de 1 hora, a 37°C, cobriram-se as COT (0,5 ml) com MEM de Eagle contendo hepes e α-metilglucósido, depois incubaram-se a 37°C e leram-se 3 a 4 dias mais tarde.

Exemplo 3

Preparação e determinação de vacina atenuada de IBV

Recolheu-se, da cavidade alantóide, o IBV atenuado, preparado como descrito no Exemplo 2. Clarificou-se o fluido alantóide por centrifugação e/ou filtração e, subsequentemente, processou-se numa preparação de vacina adequada por métodos conhecidos per se.

Inocularam-se grupos de pintos com 9 dias de idade, através de gotas oculares (0,1 ml), com a vacina de IBV atenuado, descrita acima, ou com vacina de Massachusetts (H120) ou vacina MA5. Aos 30 dias de idade, desafiaram-se os pintos por inoculação com log10 4,6 CD50 do serótipo 4/91 de

85 792 ΕΡ Ο 639 640/ΡΤ 9 IBV crescido em cultura de órgãos de traqueia. Sete dias mais tarde, mataram-se 5 frangos/ grupo e removeram-se as suas traqueias para o teste de "ciliostase" (ver Darbyshire, J. H., Avian Patholoqy. (1980), 9, 179-184).

Mataram-se os pintos com injecção intravenosa de Euthatal. Retiraram-se cuidadosamente as suas traqueias e, usando um bisturi, cortaram-se cuidadosamente 10 anéis (3 do topo, 4 do meio e 3 do fundo). Examinara-se os 10 anéis, com ampliação baixa, e classificou-se cada um numa escala de 0 (100% de actividade ciliar) a 4 (100% de ciliostase).

Resultados.

Os resultados resumidos no Quadro 4 mostram que no único tempo testado (7 dias após o desafio) a estirpe de IBV atenuada, preparada no Exemplo 2, protegeu bem contra um desafio homólogo elevado. As duas estirpes de vacina (H120 e MA5) conferiram protecção fraca contra este desafio elevado; em cada caso ficaram protegidas 1/5 das galinhas.

Exemplo 4

Preparação de vacina inactivada contra IB

Inoculou-se IBV, através da cavidade alantóide, em ovos embrionados que tinham sido submetidos a uma pré-incubação durante um período de 8 a 11 dias. Após aproximadamente 1-3 dias de incubação, recolheu-se o fluido alantóide, reuniu-se, clarificou-se por centrifugação e inactivou-se o vírus através da adição de formalina. Confirmou-se a inactivação do vírus da IB por inoculação de ovos embrionados de 9 dias de idade através da cavidade alantóide e subsequente observação dos embriões quanto a sinais de infecção de IB. Preparou-se então uma vacina de emulsão em óleo usando procedimentos padrão. Esta foi inoculada, subcutânea ou intramuscularmente, em grupos de galinhas, que podiam ou não ter sido imunizadas pela administração prévia de vacina viva atenuada de IB. Sangraram-se estas galinhas pelo menos 7 semanas mais tarde e examinaram-se os seus soros quanto a anticorpos específicos para IB por ELISA. 85 792 ΕΡ Ο 639 640/ΡΤ 10

Resultados. 1) Não imunizado, dada vacina inactivada, sangrado 7 semanas mais tarde. Título médio (log2) 9,1 Gama de log2 7,6-10,6 2) Imunizado, dada vacina inactivada, sangrado 7 dias mais tarde. Título médio (log2) 12,6 Gama de log2 11,6-13,6

Quadro 1

Testou-se serótipo 4/91 de vírus de IB num teste de neutralização contra anti-soro monoespecífico criado contra cada um dos seguintes serótipos de IBV.

Em cada caso o título de neutralização foi <1:8.

Serótipos da GB A; B; C; D; F; F1; Η; I; J; 690; 317; 183; 918; 225; HV1-116; D41; VF70-861, Allen.

Holanda D207; D3896; D3128; D212

Portugal 135355/82

Israel IBV-1 1

Alemanha 5423/86; 332/88; IBV-10.

Itália 1767/84; Forli 1; Forli 2. Bélgica B-1486

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EUA

Massachusettes; Connecticut; lowa 609; lowa 97; Holte; Gray; Arkansas; 632. África do Sul 890/80; 145/86.

Quadro 2

Neutralização cruzada entre o serótipo 4/91 de IBV e outros serótipos de IBV. Vírus (log10 2,0 CD=0) 4/91 GB França Marrocos Austrália Anti-soro 591 E CR84084 CR84221 CR88061 G T 4/91 1600* 1 1 NE _ 30 9 _ UK 591 13 1000 ' NE NE NE _ _ UK-E 46 _ 6260 14 _ _ __ Fr.84084 720 10 _ 15 Fr.84221 30 NE 70 42 3240 10 14 Fr.88061 10 NE 140 10 Marrocos G 19 400 _ Austrália T 20 NE 16 58 10 NE - 1300 * Título de anti-soro recíproco (reacção homóloga a sublinhado) - título = <1:8 NE não efectuado

Quadro 3

Resultados analisados pelo método de Archetti e Horsfall (1950).

Valores de "r" 4/91 GB França Marrocos Austrália 591 E CR84084 CR84221 CR88061 G T 4/91 100 2 NE 5 UK 591 100 NE NE NE NE UK-E 100 Fr.84084 100 3 Fr.84221 100 Fr.88061 100 NE Marrocos G 100 Austrália T 100 - = < 1 12 85 792 ΕΡ Ο 639 640/ΡΤ

Quadro 4

Classificação da actividade ciliar em traqueias de 5 aves mortas 7 dias após o desafio com a estirpe virulenta de IBV 4/91

Inoculo original (3 semanas por desafio) 4/91 atenuado H120 MA5 1 * 5 6 1 16 18 2 21 20 2 31 22 5 40 40 Total 11 113 106 Média 2,2 22,6 21,6 * Classificação total dos 10 anéis examinados de cada uma das aves.

Lisboa, -4 £7. 2800

’ ENG.* ANTÓNIO I0À0 DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua des Flores, 74 - 4.' 1EOO LISBOA

Por AKZO NOBEL N.V. - O AGENTE OFICIAL -

Claims

85 792 ΕΡ Ο 639 640/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Estirpe de vírus da bronquite infecciosa (IBV) pertencente a um novo serótipo, sendo o dito novo serótipo caracterizado por uma estirpe de IBV, da qual se depositou uma amostra no European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Reino Unido, sob o número de depósito V93070612, sendo a dita estirpe de vírus da bronquite infecciosa significativamente neutralizada por reacção cruzada, por anti-soros criados em galinhas contra a dita estirpe depositada.
2. Vírus da bronquite infecciosa de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vírus ser atenuado.
3. Vírus atenuado da bronquite infecciosa de acordo com a reivindicação 2 que se pode obter submetendo o vírus da bronquite infecciosa a passagem, numa cultura num meio adequado, um número de vezes suficiente para reduzir a sua patogenicidade mantendo no entanto a sua imunogenicidade.
4. Vírus atenuado da bronquite infecciosa de acordo com a reivindicação 3 que se pode obter submetendo o vírus a passagem, pelo menos 30 vezes.
5. Vírus atenuado da bronquite infecciosa que está depositado no European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Reino Unido, sob o número de acesso V93070611.
6. Vacina viva contra a bronquite infecciosa para utilizar na imunização de aves domésticas, derivada de um vírus da bronquite infecciosa de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5.
7. Vacina inactivada contra a bronquite infecciosa para utilizar na imunização de aves domésticas, derivada de um vírus da bronquite infecciosa de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5.
8. Processo para a preparação de uma vacina viva contra a bronquite infecciosa que compreende submeter a passagens a estirpe de vírus da bronquite infecciosa de acordo com a reivindicação 1, numa cultura num meio adequado, um número de vezes suficiente para reduzir a sua patogenicidade 85 792 ΕΡ Ο 639 640/ΡΤ 2/2 mantendo no entanto a sua imunogenicidade, recolher o vírus atenuado e processar o material recolhido para produzir uma vacina.
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, onde o vírus da bronquite infecciosa é submetido a passagem pelo menos 30 vezes.
10. Utilização da estirpe de vírus atenuado da bronquite infecciosa de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 4, na preparação de uma vacina para usar na vacinação de aves domésticas contra o vírus da bronquite infecciosa. Lisboa, -A r:7 ΊΓίΓ,Α c-w Por AKZO NOBEL N.V. - O AGENTE OFICIAL -

IEMG.e ANTÓNIO )0λ01 DA CUNHA FERRElRAl A§„ 0|. Pr. Ind. I Rua das Floras, 74 - 4.· I 1BQQ LISBOA \