DE3650289T2 - Spike-protein des virus der infektiösen bronchitis. - Google Patents
Spike-protein des virus der infektiösen bronchitis.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft das Spike-Protein eines infektiösen Bronchitisvirus (IBV) und eine rekombinante DNA Methode oder deren Präparation. IBV ist ein Virus, der Atemwegserkrankungen beim Geflügel verursacht und der so in Bezug auf Geflügel von besonderem Interesse ist.
- IBV ist ein Virus der Typs Coronaviridae. Es hat ein Einzelstrang RNA Genom, annähernd 20 kb lang, mit positiver Polarität, das die Produktion von drei Haupt-Strukturproteinen spezifiziert: Nukleocapsid-Protein, Membran-Glycoprotein und Spike-Glycoprotein. Das Spike-Glycoprotein wird deshalb so genannt, weil es in den tränenförmigen Fortsätzen der Oberfläche vorkommt oder in Spikes, die aus der Lipidmembran des Virus herausstehen. Vom Spike-Protein wird angenommen, das es wahrscheinlich für die Immunogenität des Virus verantwortlich ist, teils durch Analogie mit dem Spike-Protein von anderen Coronaviren und teils durch in vitro Neutralisationsexperimente, siehe, zum Beispiel, D. Cavanagh et al., Avian Pathology 13, 573-583 (1984). Obwohl der Ausdruck "Spike-Protein" verwendet wird um auf das glycoproteinartige Material des Spikes zu verweisen, wurde es kürzlich von D. Cavanagh, Journal of General Virology 64, 1187-1191; 1787-1791; und 2577-2583 (1983) so charakterisiert, daß es zwei oder drei Kopien von zwei Glycopolypeptiden, S1 (90000 Dalton) und S2 (84000 Dalton), in äquimolaren Mengen umfaßt. Die Polypeptidkomponenten der Glycopolypeptide S1 und S2 wurden, nach der enzymatischen Entfernung von Oligosacchariden, auf ein zusammengesetztes Molekulargewicht von annähernd 125000 Dalton geschätzt. Es scheint, daß das Spike-Protein über das S2 Polypeptid an die virale Membran angeheftet ist. Der Großteil des S1-, aber nicht das S2-Protein können vom Virus durch die Verwendung von Harnstoff und BSA abgetrennt werden.
- Die genomische Organisation der viralen IBV Proteine ist beispielsweise in T.D.K. Brown und M.E.G. Boursnell, Virus Research 1, 15-24 (1984) zusammengefaßt. Kurz gesagt wurden sechs polyadenylierte virale IBV mRNA Spezies (A bis F) in infizierten Zellen entdeckt. mRNA A ist die Kleinste und mRNA F besitzt Genomlänge. Diese mRNAs bilden einen sogenannten "nested" oder 3'co-terminalen Satz. Die "nested" mRNAs A bis E haben Größen von annähernd 2, 2,4, 3,4, 4,1 und 7,8 kb, wie aus Formaldehyd-Agarose Gelelektrophorese abgeschätzt wurde. Sie sind in der begleitenden Zeichnung dargestellt. Hinweise aus in vitro Translationsstudien legen nahe, daß die mRNAs A, C und E jeweils translatiert werden, um ein korrespondierendes Hauptpolypeptid zu ergeben. So kodiert mRNA A für das Nukleocapsid-Polypeptid, mRNA C für das Membran Polypeptid und mRNA E für den Vorläufer des Spike-Proteins. In Verbindung mit mRNA E haben D.F. Stern und B.M. Sefton, Journal of Virology 50, 22-29 (1984) herausgefunden, daß diese mRNA die Produktion des Spike-Protein-Vorläufers in einer in vitro Translation kodiert. Die Größen der Translationsprodukte stimmen überein mit der kodierenden Kapazität, die am 5'Ende von jeder mRNA vorhanden ist, aber nicht in der nächst kleineren mRNA vorhanden ist. Mit anderen Worten, liegt der kodierende Anteil innerhalb der "einmaligen" Region, nämlich in dem Bereich der "Nichtüberlappung" zwischen aufeinanderfolgenden RNAs des Satzes. UV Inaktivierungsstudien haben gezeigt, daß die subgenomischen mRNAs nicht durch Prozessierung von größeren RNA Spezies erzeugt werden, sondern unabhängig synthetisiert werden.
- Zur IBV RNA komplementäre DNA (im folgenden als "cDNA" bezeichnet) wurde für den Beaudette-Stamm des IBV in zwei Fragmenten erhalten, die zusammen die ersten 3,3 kb der RNA vom 3'Ende umfassen und sich nahezu bis zum 5'Ende von mRNA C erstrecken. Die Fragmente wurden in Plasmide eingesetzt und in E.coli kloniert. Sie werden als C5.135 und C5.322 bei T.D.K. Brown und M.E.G. Boursnell, siehe oben beschrieben, wobei sich C5.136 etwa von Nukleotid 1000 bis 3300 erstreckt. Sequenzinformationen über C5.136, von etwa Nukleotid 1630 bis 2400, und die Klonierung von cDNA für den IBV Beaudette-Stamm, die die mRNA B und die 5'Region der mRNA A enthält, wurden von M.E.G. Boursnell und T.D.K. Brown, Gene 29, 87-92 (1984) beschrieben. Ferner wurde die C5.136 Sequenz, etwa von Nukleotid 2200 bis 3400, von M.E.G. Boursnell, T.D.K. Brown und M.M. Binns, Virus Research 1, 303-313 (1984) veröffentlicht.
- Mockett et al., J. Gen. Virol. 65, 2281-2286 (1984) beschreiben die Herstellung von Hybridomen, die Antikörper gegen IBV Spike- und Membran-Protein produzieren. Antikörper von zweien der Hybridomen reagierten mit Spike-Protein- Glycopeptiden, aber diese Glycopeptide waren in einer viralen Fraktion enthalten und kein reines Material. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß diese Antikörper M41 IBV neutralisieren aber nicht IBV von anderen Massachusetts-ähnlichen Stämmen.
- In der Veröffentlichung "Genetically Engineered Vaccine against Avian Infectious Bronchitis Virus with the Advantage of Current Live and Killed Vaccines" von D. Cavanagh und durch die gegenwärtigen Erfinder (M.M. Binns, M.E.G. Boursnell und T.D.K. Brown) in "Modern Approaches to Vaccines", Cold Spring Harbor Laooratory, New York 1984, Seite 215-218, wurde bekanntgegeben, daß ein Oligonukleotidprimer hergestellt worden war und wie üblich eingesetzt wurde um die C5.136 DNA so zu verlängern, daß das Spike-Protein-Vorläufer-Gen enthalten ist. Der Oligonukleotidprimer wurde als korrespondierend zu einer Sequenz von 13 Nukleotiden, etwa 150 Basen vom 5' Ende von C5.136 entfernt beschrieben. Die Beschaffenheit und die genaue Lage des Oligonukleotids in der C5.136 cDNA Sequenz, im Abschnitt von Nukleotid 2400 bis 3300 (das 5'Ende), wurde durch diese Forscher in keiner Weise veröffentlicht, weder schriftlich noch mündlich.
- Die vorliegende Erfindung geht aus der Forschungsarbeit hervor, die oben in groben Zügen in "Modern Approaches to Vaccines" dargestellt wurde. cDNA wurde durch die oben beschriebene Primermethode hergestellt und in dieser cDNA wurden Sequenzen identifiziert, die spezifisch für den Spike-Protein-Vorläufer (S) kodieren wie auch Sequenzen, die spezifisch für die S1 und S2 Polypeptide kodieren. Geklonte S, S1 und S2 DNAs sind die Ausgangsmaterialien für die Herstellung von künstlichen Polypeptiden und für einen Impfstoff gegen IBV brauchbar. Darüberhinaus kann solche DNA markiert werden, um Sonden bereitzustellen, die bei der Identifizierung von IBV Infektionen oder bei der Typisierung eines infizierenden Virus diagnostisch brauchbar sind.
- Die beschriebene Forschung wurde an drei IBV-Stämmen durchgeführt, namentlich an Beaudette, M41 und 6/82 Stämmen von IBV, aber es wird erwartet, daß andere IBV Serotypen und Stämme einen hohen Grad an Homologie, in Bezug auf die Spike-Protein-Vorläufer kodierende cDNA, zu einem oder mehreren von diesen aufweisen.
- Gemäß einem wichtigen Merkmal der Erfindung wird ein DNA Molekül bereitgestellt, das für ein IBV Spike-Protein-Polypeptid kodiert, welches ein S1 oder S2 Polypeptid umfaßt (daraus besteht oder einschließt). Eine solche DNA wird praktischerweise kurz als "Spike DNA" bezeichnet. Sie schließt DNA ein, die für den Spike-Protein-Vorläufer kodiert, zeigt mindestens 75%, vorzugsweise mindestens 80%, insbesondere mindestens 90%, vor allem jedoch mindestens 95% Nukleotidsequenz-Homologie mit der korrespondierenden Nukleotidsequenz des IBV Beaudette Stammes.
- Vorzugsweise sind mindestens 80%, insbesondere jedoch mindestens 90% der Aminosäuresequeoz homolog zwischen der Sequenz, für die kodiert wird und der Amioosäuresequenz des korrespondierenden Polypeptids des IBV Beaudette, M41 oder 6/82 Stammes.
- Die Erfindung schließt spezifisch ein DNA Molekül ein, das im wesentlichen nur für eines kodiert (1) den Spike-Protein-Vorläufer, (2) das S1 Signal plus dem S1 Polypeptid, (3) das S1 Polypeptid und (4) das S1 plus dem S2 Polypeptid, wobei jedes der genannten vorzugsweise im Ausmaß von mindestens 80%, insbesondere von mindestens 90% Aminosäuresequenz-Homologie, zwischen der Sequenz, für die kodiert wird und der Aminosäuressequeoz des korrespondierenden Proteins des IBV Beaudette, M41 oder 6/82 Stammes, kodiert.
- Bei Bezugnahme auf DNA, die im wesentlichen nur für die verschiedenen Polypeptide kodierend definiert wurde, erkennt man, daß es beabsichtigt ist, flankierende DNA Sequenzen nicht auszuschließen, welche zum Beispiel cDNA von flankierenden Sequenzen im IBV RNA Genom oder fremde Sequenzen, die von anderen Denen stammen, sein können. Ebenfalls ist es nicht beabsichtigt, daß die S1 DNA notwendigerweise für Aminosäuren, die bis zu den beiden Enden reichen, kodieren soll. Es wird erwartet, daß es möglich sein wird eine Expression der S1 cDNA zu erhalten, der etwa bis zu 5 oder sogar 10 der Aminosäuren (30 Nukleotide) an beiden Enden fehlen.
- Die Erfindung schließt ebenfalls einen Vektor ein, der die oben definierte IBV Spike DNA enthält, einschließlich eines Klonierungsvektors, wie ein Plasmid oder einen Phagen oder einen Expressionsvektor, vorzugsweise einen Pockenvirus-Vektor und einen Wirt, der den Vektor enthält. Säugerzellen, die die IBV Spike DNA entweder als nackte DNA oder in einem Vektor eingesetzt enthalten, sind ebenfalls eingeschlossen. Darüberhinaus beinhaltet die Erfindung künstliche Spike-Protein-Polypeptide und deren Expression durch Säugerzellen.
- Figur 1 ist die Karte von genomischer und Boten-RNA oder zeigt cDNA Klone des IBV Beaudette Stammes und einen Primer der verwendet wurde, um die Spike DNA dieser Erfindung zu erhalten.
- Figur 2 ist eine Karte von rekombinanter DNA, die bestimmte Plasmide definiert, die IBV Spike cDNA der Stämme M41 und 6/82 beinhalten.
- Die Sequenz Formel (1) unten zeigt die komplette Nukleotidsequenz eines cDNA Moleküls der Erfindung, die aus genomischer IBV Beaudette Stamm RNA erhalten wurde. Um die Entsprechung dieser DNA mit der geoomischen und der mRNA umfassender einschätzen zu können, ist es hilfreich, sich zuerst auf Figur 1 der Zeichnung zu beziehen, die den "nested" Satz der mRNAs zeigt. Jede mRNA besitzt eine "Signal"-Sequenz an ihrem 5' Ende, die in der Abbildung als kleines Rechteck dargestellt ist. Die Signal-Sequenz erscheint nicht im korrespondierenden Abschnitt der genomischen RNA, sondern nur am 5'Ende des ganzen Genoms. Der Einfachheit halber sollten wir die bei mRNA/genomischer RNA gemeinsame Sequenz als "Grundkörper" der mRNA bezeichnen. Der IBV Spike-Protein-Vorläufer ist im wesentlichen gänzlich innerhalb des Bereiches der mRNA E lokalisiert, der sich 5'-wärts über das 5'Ende des "Grundkörpers" der mRNA D auf dem Genom hinaus erstreckt, das heißt etwa von Nukleotid 4000 bis 7500 des Genoms. Die Sequenzformel (1) zeigt eine cDNA, die sich vom 5'-Ende des "Grundkörpers" der mRNA E auf dem Genom, von etwa Nukleotid 39 bis zu den beiden Stopcodons bei Nukleotid 3587 bis 3592, erstreckt. Das Startcodon bei Nukleotid 101 bis 103 eröffnet einen offenen Leserahmen von 3486 Nukleotiden, der für 1162 Aminosäuren kodiert, was auf ein nicht-glykosyliertes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 127000 Dalton hinweist.
- Dieses Molekulargewicht liegt nahe an dem, das für die Polypeptidkomponenten S1 und S2 abgeschätzt wird. In vitro Translation von mRNA E hat gezeigt, daß das nicht-glykosylierte Spike Vorläufer Protein ein Molekulargewicht von 110000 Dalton besitzt, wohingegen Abschätzungen des zusammengesetzten Molekulargewichts von S1 und S2, nach Entfernung der Oligosaccharide durch Endoglykosidase H, 115000 und 125000 betrugen.
- Die cDNA enthält die Sequenzen AACTGAACAAAA gegen das 5'Ende hin und AACTGAACAATA gegen das 3'Ende hin, die in Formel (1) unterstrichen sind. Aus ihren kürzlich gefundenen hohen Homologien mit Sequenzen, angedeutet in den Zeichnungen als "Homologie Bereiche", an den 5'Enden der "Grundkörper" der IBV mRNAs A, B und C und aus mRNA Längenmessungen scheint es, daß diese Sequenzen in etwa die Stelle der 5'Enden der "Grundkörper" der mRNAs E und D repräsentieren. überraschenderweise sind die für das Spike-Protein-Gen kodierenden Bereiche nicht vollständig in dem "einmaligen" Bereich der mRNA E enthalten, aber reichen etwa 32 Basen über das vorhergesagte 5'Ende des "Grundkörpers" von mRNA D hinaus.
- Die Spike-Protein-Vorläufer cDNA kann angesehen werden als die gesamte cDNA, die im offenen Leserahmen vorkommt und einen Signalbereich von Nukleotid 101 bis 154, in einem Kästchen dargestellt, einen S1 Polypeptid kodierenden Bereich von Nukleotid 155 bis 1696 und einen S2 Polypeptid kodierenden Bereich von 1712 3586 einschließt. Die für S1 und S2 Polypeptid kodierenden Bereiche sind durch eine Sequenz von 1697 bis 1711 verbunden, die für die Aminosäuren RRFRR kodiert. Von dieser Aminosäuresequenz, die im Vörläuferpolypeptid vorkommt, wird angenommen, daß sie während der posttranslationalen Prozessierung abgespalten wird. Das 5'-Ende der S2 Sequenz wurde durch Aminosäuresequenzierung bestimmt und ist mit einem Pfeil bei Nukleotid 1712 abgebildet. Auf andere Eigenschaften der Sequenz der Formel (1) wird in den nachfolgenden Beispielen eingegangen.
- cDNA für Spike-Protein-Polypeptide des guthbekannten Stammes M41 und des Stammes 6/82 wurde hergestellt, indem Beaudette Stamm RNA oder cDNA als Hybridisierungssonde oder um einen Primer herzustellen verwendet wurde. Stamm 6/82 wurde 1982 isoliert durch Jane K.A. Cook, Vet. Record 112, 104-105 (1983) und ist ohne Einschränkung erhältlich von der Houghton Poultry Research Station, Houghton, Huntingdon, Cambridgeshire PE7 2DA, England, selbstverständlich in Übereinstimmung mit den gesetzlichen Bestimmungen. Stamm 6/82, der das Isolat Nr.2 von J.K.A. Cook ist, Avian Pathology 13, 733-741 (1984) zeigt eine kreuzweise Neutralisationsreaktion mit Dutch-Serotypen.
- Die Sequenzformel (2) unterhalb vergleicht die Spike-DNA-Sequenzen für Beaudette, M41 und 6/82, deren 5'Ende das gleiche wie für Beaudette in der Sequenzformel (1) ist. Es gibt einen Bereich von relativ hoher Heterologie zwischen den Nukleotiden 449 bis 499, der Insbesondere 458 bis 463 für 6/82 einschließt, der sechs zusätzliche Nukleotide besitzt, die nicht in M41 oder Beaudette vorkommen. Das Nummeriarungssystem wurde deshalb so angepaßt, daß es sich nach 6/82 richtet, mit dem Ergebnis, daß die Beaudette Nukleotide nach 458 sechs Stellen weiter sind als die in der Sequenzformel (1). Insgesamt zeigen die drei Sequenzen einen hohen Grad an Homologie. Eine Analyse von M41 und Beaudette zeigte 70/3510 Nukleotid-Austausche, was 43/1139 Aminosäure-Austausche zur Folge hat. Stamm 6/82 zeigt einen geringeren Grad an Homologie mit M41 oder Beaudette.
- Die IBV RNA von vielen anderen Stämmen wird für ziemlich ähnlich zu der von Beaudette, M41 oder 6/82 gehalten, und daher können DNA Moleküle der vorliegenden Erfindung als Sonden für die Hybridisierung mit RNA von anderen Serotypen verwendet werden, so daß auf diese Weise Spike cDNA von anderen Stämmen identifiziert und präpariert werden kann. Zum Beispiel könnte die cDNA von anderen IBV Stämmen des Massachusetts Serotyps oder von den Lebendimpfstoff-Stämmen H52 und H120, die in GB verwendet werden und von denen angenommen wird, daß sie ähnlich zu M41 sind, aus M41 oder Beaudette cDNA hergestellt werden. Jeder der Stämme vom Dutch-Typ, bekannt in den Serogruppen als D207, D2l2, D3128 und D3896, von denen angenommen wird, daß sie ähnlich zu Stamm 6/82 sind (Houghton Poultry Research Station, Huntingdon, England) könnte mittels 6/82 DNA und wahrscheinlich von M41 oder Beaudette cDNA hergestellt werden. Auch wenn der Gesamtanteil der Homologie zwischen irgendeinem dieser IBVs und dem Ausgangs-IBV-Stamm (das heißt Beaudette, M41 oder 6/82) nicht hoch genug ist, um Hybridisierung über eine wesentliche Länge der Sequenz zu erlauben, kann mit großer Wahrscheinlichkeit erwartet werden, daß es einige Abschnitte von mindestens 13 Nukleotiden, besser jedoch von mindestens 18 Nukleotiden gibt, die sehr hohe Homologie besitzen und es erlauben, eine Reihe solcher Sonden aus der Spike cDNA des IBV Ausgangsstammes herzustellen. Einige dieser Sonden werden mit der cDNA der RNA anderer IBV hybridisieren. Durch Sonden-Austestung einer solchen cDNA-Bank kann Spike-Protein cDNA der anderen IBV identifiziert und erhalten werden. Alternativ dazu kann die "Zufalls-Priming " Methode, wie sie oben für die Herstellung von M41 und 6/82 cDNA aus Beaudette beschrieben ist, angewendet werden, um cDNA eines jeden Stammes herzustellen.
- Die Erfindung beinhaltet dafür ebenfalls besondere DNA Moleküle, die für IBV Spike-Protein-Polypeptid kodieren und einen vernünftigen Grad an Homologie der Nukleotidsequenz mit IBV Beaudette Stamm besitzen, um Hybridisierung stattfinden zu lassen. Der oben definierte minimale Anteil an Nukleotidsequenz- Homologie beträgt 75, aber mindestens 80% werden vorgezogen und ein Homologiegrad von 88-100% wäre nützlich, um normalerweise Hyhridisierung unter vernünftig stringenten Bedingungen stattfinden zu lassen. (Falls die DNA verwendet wird, um Viren zu typisieren, würde man natürlich eine Sonden-Hybridisierung unter weitaus stringenteren Bedingungen durchführen).
- Man erkennt, daß der Anteil an Freiheit im genetischen Code, in dem die meisten Aminosäuren von 2, 4 oder 6 Codons kodiert werden, punktförmige Substitutionen von Nukleotiden erlauben wird, ohne das Polypeptid zu verändern, für das kodiert wird. Deshalb ist es in Bezug auf eine mögliche Verwendung der DNA zur Expression unter Bildung von künstlichen Polypeptiden und in Vorwegnahme, daß solche Substitutionen für viele der Unterschiede von Nukleotidsequenzen zwischen verschiedenen IBV Typen oder Stämmen verantwortlich sind, zweckmäßig ebenfalls die Aminosäuresequenz-Homologie zu betrachten. Hierbei ist ein Homologiegrad der Aminosäuresequenz von 80-100), insbesondere 90-100%, vor allem von 95- 100% verglichen mit dem Ausgangsstamm für cDNA beabsichtigt, die aus anderen IBV Typen oder Stämmen hergestellt wird.
- Plasmide in bakteriellen Wirten wurden als Patenthinterlegungen nach dem Budapester Abkommen hinterlegt, wie dies nachfolgend ausgeführt wird. Bequemerweise beziehen sich die Homologien auf die im folgenden und weiter oben eingegangen wird, auf die Spike-Protein-Vorläufer kodierende cDNA, die in diesen Plasmiden enthalten ist oder tatsächlich auf die ganze Plasmid DNA.
- Die S1 oder S2 DNA könnte geeignet verkürzt werden oder kurz vor beiden Enden abgeschnitten werden, insbesondere am 3'-Ende von S1 oder am 5'-Ende von S2, da es üblicherweise möglich ist, auf eine kurze Sequenz am Ende zu verzichten. Man könnte dies auch bequemerweise dementsprechend durchführen, um die S1 DNA an einer geeigneten Stelle herauszuschneiden, für die es eine "einmalige" Restriktionsschnittstelle gibt. Demgemäß könnte die DNA um etwa 1-30, sicherer 1-15 Nukleotide an beiden Enden verkürzt werden.
- Das Ausmaß und die Art jeder flankierenden Sequenz an beiden Enden der DNA der Erfindung ist im wesentlichen irrelevant und wird normalerweise von der einzelnen Verwendung abhängen, für die die Spike-Protein-Polypeptid DNA eingesetzt wird. Es könnte zum Beispiel wünschenswert sein die S1 DNA an fremde Gensequenzen oder an Homopolynukleotidschwanz-Sequenzen zu ligieren, wodurch ein fremdes Gen einfacher angehängt werden könnte. Es könnten flankierende Sequenzen von IBV cDNA selbst vorhanden sein, egal ob sie solche sind, die komplementär zu flankierender DNA in der genomischen oder mRNA E von IBV sind oder nicht. Solche flankierenden IBV cDNA Sequenzen gehen gewöhnlich nicht über 100 Nukleotide an beiden Enden der cDNA hinaus und können durchaus kurz sein, zum Beispiel bis zu 20 Nukleotide. Es ist jedoch verständlich, daß, falls die cDNA der Erfindung in einen Vektor eingebaut wird, zum Beispiel in ein Plasmid, Cosmid, Phagen oder viralen Vektor, die fremden DNA Squenzen, die inhärent vorhanden sind oder in den Vektor eingeführt und mit der cDNA der Erfindung verbunden werden, von sehr beträchtlicher Länge sein werden, und deshalb lassen sich die oben gemachten Feststellungen über die Bevorzugung nicht auf fremde DNA anwenden.
- Die Vektoren, die in der Erfindung enthalten sind, sind Klonierungs- und Expressionsvektoren. Die IBV Spike DNA wird geeignet vervielfältigt durch Einbau in einen Vektor, zum Beispiel pBR322, und Klonierung in einem passenden Wirt, wie in einem bakteriellen Wirt, speziell E.coli oder Bacillus Spezies oder eine Hefe. Für die Expression können Säugerzellen durch die Calciumphosphat Präzipitations-Methode transfiziert werden oder mit einem viralen Vektor transformiert werden. Virale Vektoren schließen Retroviren und Pockenviren, wie Geflügelpocken Virus oder Vacciniavirus ein.
- Die IBV Spike DNA kann in den viralen Vektor wie folgt eingesetzt werden. Die Spike DNA wird in ein Plasmid eingebaut, das ein passendes Pockenvirus Gen, wie das Thymidinkinasegen des Vacciniavirus enthält, so daß das Insert die Gensequenz unterbricht. Ein Virus Promotor wird ebenfalls in die Gensequenz an solcher Stelle eingeführt, daß er auf die eingebaute Spike DNA Sequenz wirkt. Wenn das Pockenvirus und die rekombinante Plasmid DNA in eine Säugerzelle cotransfiziert werden, findet homologe Rekombination zwischen dem Pockenvirus Gen, wie der TK im Vacciniavirus, und dem gleichen, im Plasmid vorhandenen Gen statt. Da die IBV Spike DNA auf diese Weise das Pockenvirus Gen unterbrochen hat, werden Viren, denen das Genexpressionsprodukt fehlt, wie die TK, ausgewählt. Wenn einmal ein solcher rekombinanter Virusvektor auf diese Weise hergestellt worden ist, kann er dazu verwendet werden, die IBV Spike DNA direkt in die gewünschten Wirtszellen einzubringen, ohne daß irgendein gesonderter Schritt zur Transfektion der rekombinanten Plasmid DNA in diese Zellen erforderlich ist.
- Um schließllch die Expression des rekombinanten Virus in vivo zu erreichen, ist das bevorzugte Pockenvirus das Geflügelpockenvirus. Es mag sein, daß die eingebaute IBV DNA eine Sequenz enthält, die im Geflügelpocken-Vektor zu vorzeitiger Termination der Transkription führt. In diesem Falle müßte die Spike DNA geringfügig durch ein oder zwei Nukleotide verändert werden, um es auf diese Weise zu erlauben, daß die Transkription über die ganze Länge des Gens fortläuft.
- Der Vektor kann in jeden geeigneten Wirt durch jede, in der rekombinanten DNA Technologie bekannte Methode eingebracht werden. Die Wirte beinhalten E.coli, Bacillus Spezies, Säugerzellen und Hefen. Die Methode der Einbringung kann die Transformation durch ein Plasmid oder Cosmid Vektor oder Infektion durch einen Phagen oder viralen Vektor etc. sein, wie sie in der rekombinanten DNA Technologie bekannt ist.
- Für die Verwendung als diagnostische Sonden kann die DNA der Erfindung, welche den kodierenden Strang und/oder sein Komplement einschließt, auf lede konventionelle Weise markiert werden, zum Beispiel durch radioaktive Markierung, vorzugsweise mit ³²P, Enzym-Markierung nach der Methode von D.C. Ward et al., Europäische Patentanmeldung 63879 oder A.D.B. Malcolm et al., PCT Patentanmeldung WO84/03250 oder fluoreszierend, siehe CNRS Europäische Patentanmeldung 117 177.
- Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Alle Temperaturen sind in ºC.
- Eine cDNA, die sich etwa von Nukleotid 1000 bis 3300 der genomischen RNA des IBV Beaudette Stammes erstreckt, wurde in E.coli HB 101 kloniert und als Klon C5.136 bezeichnet, siehe T.D.K. Brown und M.E.G. Boursnell, Virus Research 1, 15-24 (1984) und M.E.G. Boursnell, T.D.K. Brown und M.M. Binns, Virus Research 1, 303-313 (1984). Die Karte des Genoms in den begleitenden Zeichnungen zeigt C5.136 und die ungefähre Position einer 13-Basen "Primer"-Sequenz nahe seinem 5'-Ende. Diese 13-Basen Sequenz ist diejenige, die ausgewählt wurde, um die Synthese der cDNA von dem Bereich der genomischen IBV RNA zu primen, der für das Spike-Protein kodiert.
- Die 13-Basen Primer Sequenz liegt in 5' -- > 3' Richtung im viralen Transkript gelesen bei Nukleotid 256 bis 268. In der folgenden Teilsequenz des Transkripts, bezeichnet als Sequenzformel (3), sind diese Nukleotide unterstrichen. Die Sequenz des Primers wurde aufgrund ihrer Lage in der C5.136 Sequenz (nahe am 5'-Ende des Klons) und ihrem Mangel an Selbst-Komplementarität ausgewählt. Obwohl eine Oloigonukleotidsequenz von nur 13 Nukleotiden nicht notwendigerweise einmalig sein muß, hat die umfassende Sequenzierung der gesamten Länge von C5.136, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde, gezeigt, daß sie innerhalb von C5.136 einmalig ist.
- Der verwendete Primer war das reverse Komplement der oben gezeigten 13-Basen Sequenz, das deißt hatte die Formel (4)
- Er wurde durch Verwendung der Phosphotriestermethode synthetisiert, beschrieben von M.J. Gait et al., Nucleic Acids Research 10, 6243-6254 (1982).
- Genomische RNA aus dem Beaudette Stamm von IBV wurde aus gereinigten Virionen isoliert, wie dies von T.D.K. Brown und M.E.G. Boursnell in obiger Literaturstelle auf Seite 16 beschrieben ist. cDNA wurde aus der genomischen RNA unter Verwendung der Methode von U. Gubler und B.J. Hoffman, Gene 25, 263-269 (1983) synthetisiert.
- cDNA wurde wie folgt synthetisiert: die Reaktion für den ersten Strang wurde in 50 Mikrolitern entionisiertem Wasser durchgeführt, worin enthalten waien 0,05 M Tris-HCl pH 8,7 bei 25º, 0,01 M MgCl&sub2;, 0,01 M Dithiothreit, 0,004 M Natriumpyrophosphat, 0,001 M jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 40 Einheiten des humanen, plazentalen RNase Inhibitors, 0,8 Mikrogramm des oben beschriebenen synthetischen Oligonukleotid-Primers, 10 Mikrocurie (alpha-³²P)-markiertes dCTP, etwa 20 Mikrogramm der geoomischen IBV RNA und 160 Einheiten AMV, Reverse Transkriptase. Die Reaktionsmischung wurde für eine Stunde bei 43º inkubiert. Die DNA für den ersten Strang wurde mit Phenol/Chloroform/Methylbutanol (50:49:1 v/v/v) zweimal extrahiert, worin 1g/Liter 8-Hydroxychinolin, äquilibriert mit 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA enthalten war und in Anwesenheit von Ammoniumacetat zwei Ethanolfällungen unterworfen.
- Das Reaktionsgemisch für den zweiten Strang beinhaltete in 100 Mikrolitern entionisiertem Wasser 0,02 M Tris-HCl pH 7,5, 0,005 M MgCl&sub2;, 0,01 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,1 M KCl, 0,15 mM beta-NAD, 0,04 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 50 Mikrogramm Rinderserumalbumin, 10 Mikrocurie (alpha-³²P) markiertes dCTP, 22,5 Einheiten E.coli DNA Polymerase I, 10 Einheiten RNase H und eine Einheit E.coli DNA Ligase (NAD-abhängig). Die Reaktionsmischung wurde für eine Stunde bei 12º und dann für eine Stunde bei 22º inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und Ethanol-gefällt, wie dies oben beschrieben ist.
- dC Homopolymer Schwänze wurden wie folgt zur cDNA zugegeben: die cDNA wurde gelöst in 10 Mikrolitern 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA und auf ein endgültiges Reaktionsvolumen von 50 Mikrolitern aufgefüllt, in dem enthalten war 1x Terminaler Transferasepuffer bezogen van den Bethesda Research Laboratories), 0,6 mM dCTP, 100 Mikrocurie (³H)-dCTP, 100 Mikrogramm Rinderserumalbumin und 50 Einheiten Terminale Transferase. Das Reaktionsgemisch wurde für eine Stunde bei 37º inkubiert, für 10 Minuten auf 65º erhitzt und über eine Sepharose CL-4B Säule geschickt. Die Fraktionen, die am Beginn des eluierten Peaks liegen, wurden vereinigt und mit Sthanol gefält. Etwa ein Mikrogramm doppelsträngiger cDNA konnte durch Anwendung dieses Protokolls erhalten werden. 250 ng dieser cDNA wurden mit 2,5 Mikrogramm pBR322 Plasmid mit dG-Schwanz (bezogen von den Bethesda Research Laboratories) gemischt und dann wurde die Mischung mit Ethanol gefällt. Das Präzipitat wurde gelöst in 40 Mikrolitern 0,2M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA und dem folgenden Anelierungsverfahren unterzogen. Zuerst wurde es für 5 Minuten auf 65º erhitzt, schnell auf 50º abgekühlt und dann allmählach in einem Wasserbad auf 42º gebracht. Die Anelierung konnte dann bei 20º über Nacht weiter stattfinden.
- Die anelierte DNA wurde dann in den E. coli Stamm LE392 (siehe, zum Beispiel, Molecular Cloning - a Laboratory Manual, T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) nach der Methode von D. Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, 557-580 (1983) transformiert.
- Der wie oben beschrieben transformierte E.coli LE392 wurde angezogen und einer Selektion auf Tetracyclinresistenz unterworfen. Die tetracyclinresistenten Kolonien wurden nach IBV Sequenzen durch Kolonie-Hybridisierung mit genomischer IBV BNA gescreent. Demgemäß wurde die cDNA denaturiert und mit ³²P End-markierter, Alkali-behandelter, genomischer IBV RNA als Hybridisierungssonde inkubiert. Das Plasmid, das das stärkste Signal bei der Koloniehybridisierung ergab, wurde mit pMB179 bezeichnet.
- E.coli LE392, der das Plasmid pMB179 enthält, wurde als Patenthinterlegung nach dem Budapester Abkommen über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für den Zweck des Patentverfahrens, am 13. Juni 1985, am National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, P.O. Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen, Schottland AB9 8DG unter der Nummer NCIB 12102 hinterlegt.
- Zufällige Subklone pMB179 wurden durch Klonierung von entweder DNase I behandelten oder Ultraschall-Fragmenten in SmaI geschnittenen, Phosphatase behandelten M13mp10 (Amersham International) erzeugt. Klone, die virale Inserts tragen, wurden identifiziert durch Koloniehybridisierung mit ³²P End-markierter, Alkali-behandelter IBV RNA oder ³²P End-markierten, revers-transkribierten viralen Sonden. Außerdem wurden PstI und RsaI Fragmente in PstI verdauten M13mp11, beziehungsweise in SmaI geschnittenen, Phosphatase-behandelten M13mp10 einkloniert.
- M13 Dideoxy-Sequenzierung wurde unter Verwendung von (alpha-³&sup5;S) dATP (Amersham International) durchgeführt und die vollständige Sequenz wurde auf beiden Strängen erhalten. Reverse Sequenzierung wurde angewendet, um die letzten benötigten Sequenzen zu erhalten. Die Produkte der Sequenzierreaktionen wurden auf Puffer-Gradienten-Gelen analysiert, siehe M.D. Biggin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3963-3965 (1983). Ein Schalldigitalisier-Gerät (Graf/Bar, Science Accesories Corporation) wurde verwendet, um die Daten in einen BBC Mikrocomputer einzulesen und die Daten wurden auf einer VAX 11/750 analysiert, wobei die Programme von B. Staden, Nucleic Acids Research 10, 4731-4751 (1982) und Nucleic Acids Research 12, 521-538 (1984) verwendet wurden.
- IBV, Stamm Beaudette, wurde bezogen von Dr. Bela Lomniczi, Budapest. Jedes folgende Viruswachstum fand in Monolayern von primären Hühner-Nierenzellen (CK) statt, die nach der Methode von Younger (1954) aufbereitet wurden.
- Das Virus wurde sechsmal in CK-Zellen passagiert und wurde dann dreimal über Plaques gereinigt. Das Virus aus einem dieser Plaques wurde einmal passagiert, um einen Arbeitsvorrat an Virus herzustellen.
- Für die radioaktive Markierung wurden zwei 9 cm Plastikschalen von CK- Zellen zweimal mit Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) gewaschen und mit 4 ml aus dem Arbeitsvorrat plus 4 ml frischem EMEM, das 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) enthält, beimpft. Nach 90 Minuten bei 37º in einer 5%/95% CO&sub2;/Luft Atmosphäre wurde das Inokulum entfernt und durch 8 ml EMEM ersetzt. Nach 4,5 Stunden bei 37º wurde das Medium entfernt und durch 8ml EMEM ersetzt, das 500 Mikrocurie ³H- Serin und 0,2% BSA enthält. Nach weiteren 18 Stunden bei 37º wurde das Medium wiedergewonnen, gereinigt, Kälberserum (um eine Proteinquelle bereitzustellen) zugegeben (2%) und ein gleiches Volumen von gesättigtem Ammoniumsulfat zugegeben. Nachdem des Gemisch, umgeben von schmelzendem Eis, für 3 Stunden gerührt worden war, wurde das Präzipitat durch Zentrifugation mit geringer Geschwindigkeit wiedergewonnen, in 1 ml NET Puffer (100 mM Natriumchlorid, 1 mM NaEDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4) gelöst und auf einen 25-55% (w/w) Saccharose Gradienten in NET, der 100 Mikrogramm/ml BSA enthält, aufgebracht. Nach Zentrifugation bei durchschnittlich 30000 g für 16 Stunden bei 40 wurde der Gradient fraktioniert. Fraktionen, die Virus enthielten, wurden vereinigt, 2,5-fach verdünnt und das Virus durch Zentrifugation bei maximal 90000 g für 3 Stunden bei 4º pelletiert. Die Pellets wurden bei 100º für 2 Minuten in 62,5 mM Tris-HCl pH 7,0, das 2% SDS und 2% 2-Mercaptoethanol enthält, gelöst. Die viralen Polypeptide wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in einem Gel aufgetrennt, das einen 5-10% Acrylamidgradienten besitzt, wobei die Puffer von U.K. Laemmli, Nature 227, 680- 685 (1970) verwendet wurden. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in 30 Volumen 1M Natriumsalicylat In Wasser für 30 Minuten geschwenkt. Das Gel wurde unter Vakuum getrocknet und das Polypeptid lokalisiert, indem ein Röntgenfilm dem Gel ausgesetzt wurde. Das S1-Polypeptid ist das mit dem höchsten Molekulargewicht. Der entwickelte, getrocknete Röntgenfilm wurde über das getrocknete Gel gelegt und der Bereich des Gels, der die S1 und S2 Polypeptide enthält, wurde ausgeschnitten. Die Polypeptide wurden aus dem Gel durch das von W.J. Welch et al., Journal of Virology 38, 968-972 (1981) beschriebene Verfahren eluiert, extensiv gegen destilliertes Wasser dialysiert, das 0,03% SDS enthält, und lyophilisiert. Das pulverförmige Protein wurde in 200 Mikrolitern 0,1 M Natriumbicarbonat gelöst, das 4% SDS enthält und zu 100 mg von p-Phenylendiisothiocyanat behandeltem Glas (17 nm Porengröße) gegeben, das nach der Methode von E. Wachter et al., FEBS Letters 35, 97-102 (1973) hergestellt wurde. Anschließend an die Inkubation für 90 Minuten bei 56º unter Stickstoff wurde das Glas mit Wasser und Methanol gewaschen, um nichtkovalent gebundenes Material zu entfernen.
- Das Glas-gekoppelte Polypeptid wurde dann am Aminoende durch automatisierten Festphasen-Edmanabbau, M. Brett und J.B.C. Findlay, Biochemical Journal 211, 561-670 (1983) partiell sequenziert. Die Ergebnisse wiesen auf die Anwesenheit von Serin-Resten in den Positionen 5, 6, 7, 14 und 20 des S1 Polypeptids hin gezählt vom N-terminalen Ende). Diese Ergebnisse bestätigten eindeutig die Sequenz der S1 DNA innerhalb des offenen Leserahmens. Die Aminosäuredaten zeigten, daß eine 18 Aminosäuren lange Signalsequenz MLVTPLLLVTLLCALCSA, die einen typischen hydrophoben Kern und kleine neutrale Reste, Alanin (A) und Cystein (c), den Stellen -1 und -3 von der Spaltstelle aufweist, von S1 während posttranslationaler Prozessierung abgespalten wird. Die Signalsequenz ist in der IBV Spike-Protein cDNA Sequenz Formel (1) oberhalb in einem Kasten abgebildet und der iur den S1 N-Terminus kodierende Bereich (VLYDSSSYV...) beginnt bei Nukleotid 155 in der abgebildeten Sequenz.
- Aminosäuresequenzierung des S2 Polypeptids wies auf einen Serin-Rest in der Aminosäureposition 13 vom N-terminalen Ende hin.
- Zwei andere interessante strukturelle Eigenschaften des Spike Vorläufer Proteins wurden durch die Analyse der Aminosäuresequenz aufgedeckt, die durch die Nukleotidsequenz abgeleitet wurde. Erstens enthält die Sequenz achtundzwanzig potentielle Stellen für N-Glykosylierung (in der Annahme, daß Asn-Pro-Thr und Asn-Pro-Ser nicht verwendet werden), die durch ausgefüllte Kreise in der obigen Sequenzformel (1) dargestellt sind. Zweitens zeigte eine Hydrophobizitätsdarstellung der Aminosäuresequenz, nach Art von J. Kyte et al., Journal of Molecular Biology 157, 105-132 (1982), einen hydrophoben Bereich, der 44 nichtpolare Aminosäuren enthält, und den geladenen Aminosäuren am Carboxylende des S2 Polypeptids vorausgeht. Diese hydrophobe Struktur verankert wahrscheinlich das Spike-Protein in der viralen Hülle, wie es für ähnliche Strukturen bei Hämagglutininen von menschlichen Influenza-Viren und Geflügelpest-Viren vorgeschlagen wurde. Dieser Bereich wird durch die Nukleotide 3374 bis 3505 kodiert und ist durch die gepunktete Unterstreichung in der obigen Sequenzformel (1) gezeigt. Die unterstrichenen Sequenzen von Nukleotid 39 bis 50 und 3556 bis 3567 zeigen hohe gegenseitige Homologie und sind die Bereiche, die mit den 5'Enden der "Grundkörper" der mRNA E bzw. D korrespondieren.
- Durch ein zu dem in Beispiel 1 analogen Verfahren wird eine cDNA hergestellt, die für den Spike-Protein-Vorläufer von IBV Stamm M41 kodiert. Die Methode von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei in Schritt (1) ein 15 Basen langes Primer- Oligonukleotid verwendet wurde, das eine Sequenz hesitzt, die komplementär zu einem Teil der Sequenz der IBV Beaudette cDNA des Plasmids pMB179 ist. Der Primer war das umgekehrte Komplement der 15 Basen, nummeriert mit 3605 bis 3619 in der obigen Formel (1), das heißt besaß folgende Formel (5):
- Schritt (4) ergab ein Plasmid pMB233 in E.coli LE392, das ebenfalls als Patenthinterlegung nach dem Budapester Abkommen vom 13. Juni 1985 am National Collection Industrial Bacteria, hinter der Nummer NCIB 12101 hinterlegt wurde. Von der IBV cDNA in diesem Plasmid wurde festgestellt, daß sie sich etwa 2200 Basenpaare in 5'-Richtung vom Primer ausdehnt.
- In Schritt (5) wurden Subklone aus PstI geschnittenen Fragmenten von pMB233 In PstI geschnittenem M13mp10 erzeugt und es wurde mit Subklonen, die für die S1/S2 Proteinfusion kodieren, eine M13 Dideoxysequenzierung durchgeführt. Formel (6) unterhalb zeigt eine Teilsequenz in dem Bereich der S1/S2 Proteinfusion:
- welche zur IBV Beaudette Stamm cDNA Sequenz aus Formel (1) identisch ist. Die gleiche Nomenklatur wird in Formel (6) verwendet, wobei der Pfeil das 5'Ende des S2 kodierenden Bereiches anzeigt.
- Die gesamte M41 Spike-Sequenz wurde in die zwei Plasmide pMB276 und pMB250 eingesetzt und in E.coli durch eine ähnliche Methode, wie oben für pMB233 beschrieben, kloniert.
- Dann wurden Subklone in M13mp10 hergestellt, wie dies für pMB233 beschrieben wurde. Durch Verwendung dieser Klone und eines anderen ähnlich hergestellten Klons, pMB170, wurde die gesamte Spike-Sequenz von M41 erhalten. Die Lage von pMB276, pMB250 und pMB170, in Bezug auf das Beaudette Plasmid pMB179, wird in Figur (2) der Zeichnungen dargestellt. Das Plasmid pMB250 enthielt eine kleine Insertionssequenz aus anderer, fremder DNA, wie dies als "IS" in Figur 2) dargestellt ist. Falls gewünscht, kann diese leicht entfernt werden, um eine Vollängenkopie der M41 Spike-Sequenz herzustellen.
- In Schritt (6) wurden die S1 und S2 Polypeptide des M41 Stammes von IBV ähnlich isoliert. Das Virus wurde in deembryonierten Hühnereiern angezogen, wie oies von D. Cavanagh, Journal of General Virology 53, 93-101 (1981) beschrieben wurde, und radioaktiv mit einem Millicurie ³H Leucin, ³H Isoleucin oder ³H Valin plus 100 Mikrocurie ³&sup5;S Methionin markiert. Nach Elektrophorese der viralen Proteine in Polyacrylamidgelen wurden die Gele sofort unter Vakuum getrocknet und die Polypeptide lokalisiert, indem ein Röntgenfilm dem Gel ausgesetzt wurde.
- Partielle Aminosäuresequenz-Analyse des Aminoendes von radioaktiv markiertem S2 von IBV M41 bestätigte diese Sequenz, indem gezeigt wurde, daß an den Stellen 2 und 13 des N-Terminus Isoleucin-Reste, Valin-Reste bei 6 and 12 und keine Ceucin-Reste in den ersten 20 Aminosäuren vorkommen.
- Partielle Aminosäuresequenz-Analyse von S1 von IBV M41 zeigte einen Leucin-Rest an Position 2 vom N-terminalen Ende und einen Valin-Rest an Position 9. Diese Ergebnisse stimmen mit der IBV Beaudette cDNA Sequenz überein.
- Obwohl die für den Spike-Protein-Vorläufer kodierende cDNA von M41 hochgradig homolog zu der des Beaudette Stammes zu sein scheint, gibt es einen Unterschied zwischen den beiden am 3'Ende. In M41 ist eines der Nukleotide des Homologiebereiches, der Beaudette 3556 bis 3567 entspricht, ausgetauscht. Nummer 3560 ist eine Thymin-Base (T) anstatt einer Guanin-Base (G), was anzeigt, daß ein Stopcodon UAA in der M41 RNA vorkommt. Daraus folgt, daß das 3'-Ende der Reaudette cDNA mit der Nukleotidsequenz ...GTGGTAACT aufhört und die letzten 9 Aminosäuren am Carboxylende des Beaudette Spike-Protein-Vorläufers nicht in der cDNA des M41 Stammes kodiert sind.
- Dieses Beispiel beschreibt die Klonierung und die Sequenzierung von IBV Spike cDNA des Stammes 6/82.
- Oligodesoxynukleotide wurden aus Kalbsthymus DNA (Sigma) durch Behandlung mit Pankreas DNase und Größenauftrennung auf DEAE-Cellulose hergestellt. Genomische IBV RNA des Stammes 6/82 wurde, wie für den Beaudette Stamm in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. cDNA Synthese wurde unter der Verwendung der Methode von U. Gubler und B.J. Hoffman, siehe obige Literaturstelle, durchgeführt. Demgemäß wurden etwa 20 Mikrooramm Virionen RNA und 100 Mikrogramm Kalbsthymus Oligonukleotid-Primer in einem Reaktionsvolumen von 50 Mikrolitern (50 mM Tris-HCl pH 8,3, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 4 mM Natriumpyrophosphat, 1,25 mM dNTPs) mit 160 Einheiten von AMV Reverser Transkriptase für 30 Minuten bei 43ºC inkubiert. Nach dem Abstoppen der Reaktion mit 20 mM EDTA, gefolgt von einer Phenol Extraktion, wurden die Produkte mit Ethanol und Ammoniumacetat präzipitiert. Für die Synthese des zweiten Stranges wurden die Produkte resuspendiert In 100 Mikrolitern 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 100 mM KCl, 0,15 mM beta-NAD, 50 Mikrogramm/ml BSA und 40 mM dNTPs. 22,5 Einheiten DNA Polymerase I (Biolabs), 2,5 Einheiten RNase H (BRL) und 5 Einheiten E.coli DNA Ligase (Biolabs) wurden zur Reaktion zugegeben, die für 60 Minuten bei 12ºC und dann für 60 Minuten bei 22ºC inkubiert wurde. Die Produkte wurden zweimal mit Phenol extrahiert und mit Ethanol und Ammoniumacetat präzipitiert. Doppelstrang cDNA wurde mit einem Schwanz aus dC-Resten versehen, auf CL Sepbarose 4B nach der Größe aufgetrennt und in PstI gescnnittenen pBR322, der mit dG-Schwänzen versehen wurde, einkloniert. Dieser Vektor wurde verwendet, um E.coli LE392 nach der Methode von D. Hanahan, siehe obige Literatursteile, zu transformieren, und es wurde eine Selektion auf teracyclinresistente Kolonien durchgeführt. Zwischen 2 und 4x10&sup4; tetracyclinresistente Klone wurden in jedem Experiment erhalten, wobei ungefähr 5% von ungeschnittenen Vektormolekülen stammten. Die Klone wurden auf das Vorhandensein von viralen Inserts durch Koloniehybridisierung unter Verwendung von ³²P-markierter, Alkali-behandelter genomischer IBV 6/82 RNA als Sonde gescreent.
- Die viralen Inserts, die in mehreren Klonen vorhanden waren, die in der Koloniehybridisierungstests stark positiv waren, wurden durch Sondentests mit ³²p-markierten M13 Subklonen von pMB179 darauf untersucht, ob sie die IBV Spike-Sequenz enthielten. Die Klone pMB252, 253 und 277 wurden isoliert, die zusammen für den ganzen 6/82 Spike-Protein-Voriäufer kodieren (siehe Figur 2 der Zeichnungen). Subklone in M13mp10 wurden unter Verwendung von PstI und RsaI her-Gestellt und sequenziert, welche die in Pigur 2 gezeigten Daten ergaben. Es kommen weitaus mehr Nukleotidaustausche in 6/82 als in M41 vor, wenn man diese mit der Beaudette Sequenz vergleicht.
- E.coli LE392, der das Plasmid pMB252 besitzt, wurde als Patenthinterlegung nach dem Budapester Abkommen über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für den Zweck des Patentverfahrens, am 11. März 1986 am National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, P.O. Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen, Schottland AB9 8DG unter der Nummer NCIB 12221 hinterlegt.
- Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung von Vacciniavirus als Vektor für die Expression von IBV Spike-Protein-Polypeptid in einer Säugerzellinie.
- Plasmid pMB179, das die IBV Beaudette Spike DNA enthält, wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI und TthIII verdaut. Die geschnittenen Fragmente wurden an hen Enden mit T&sub4; DNA Polymerase repariert, wozu ein BRL End-Repair Kit verwendet wurde, und in einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt. Das Fragment, das die Spike-Sequenz, flankiert von nicht kodierenden Sequenzen, enthält (Gesamtgröße 3672 Basen) wurde aus der Agarose mit der Methode von Dretzen et al., Analytical Biochemistry 112, 295-238 (1981( gereinigt. Dieses Fragment wurde in die Smal Einzelschnittstelle von pGS20 einligiert, einem Plasmidvektor, der für den Einbau von fremden Sequenzen in das Vacciniu-Virus Thymidinkinase (TK) Gen entworfen wurde und von Mackett, Smith und Moss, J. Virology 49, 857-864 (1984) beschrieben wiirde. pGS20 hat weite Verbreitung gefunden.
- Im folgenden wird das Plasmids pGS20 kurz erläutert. pGS20 wurde so konstruiert, daß es das TK Gen des Vacciniavirus enthält, unterbrochen durch (1) eine Vacciniavirus Promotorsequenz und unmittelbar gefolgt von (2) einer Sequenz, die mehrere verschiedene Einfachrestriktionsscbnittstellen enthält, wodurch ein fremdes Gen in eine dieser Schnittstellen eingesetzt werden kann.
- Der Vactiniavirus Promotor liefert ein Signal für die Transkription des fremden Gens. Wenn das fremde Gen in pGS20 eingesetzt ist, wird im folgenden die Anordnung der verschiedenen DNA Sequenzen gezeigt (kurz in linearer Darstellung und nicht maßstabsgerecht). TK gene vaccinia promoter foreign gene
- Das HindIII J Fragment des Vacciniavirus, das das TK Gen enthält, wird unterbrochen durch den Promotor eines frühen Vacciniavirus Gens, das für ein 7,5 kb Polypeptid kodiert, und durch das fremde Gen, welches im vorliegenden Fall in eine SmaI Restriktionsstelle in pGS20 eingesetzt ist. Wenn Zellen mit dem pGS20 Plasmid, das das fremde Gen beinhaltet, und mit Vacciniavirus transfiziert werden, tritt "homologe Rekombination" zwischen den Stellen (genannt A und B) auf heiden Seiten des TK Gens von pGS20 auf, wodurch die Sequenz von A bis B des Plasmids die Sequenz A bis B des viralen Genoms ersetzt. Da pGS20 das fremde Gen und einen Promotor trägt, wird das Virus fortfahren, das fremde Gen zu kopieren, in diesem Falle IBV Spike-Protein-Vorläufer cDNA. Das fremde Gen wird dann unter dem Einfluß seiner eigenen Translations-Initiationsstelle translatiert. Die rekombinanten, virusinfizierten Zellen werden aufgrund ihrer Unfähigkeit TK zu exprimleren selektiert, wobei das TK Gen durch die Insertion inaktiviert wurde.
- Anschließend an die Transformation von pGS20, das die IBV Beaudette Spike DNA enthält, in den E.coli Stamm LE392 werden die rekombinanten Plasmide, durch Koloniehybridisierung mit ³²P-markiertem, nick-translatiertem, Gel-gereinigtem IBV Spike-DNA-Fragment identifiziert. DNA von sechs dieser Plasmide wurde mit HindIII geschnitten, was die Spike-Sequenz asymmetrisch schneidet. Eine Rekombinante, pSB1, die die Spike-Sequenz in der richtigen Orientierung für den Einbau in das Vacciniavirus besitzt, wurde ausgewählt. Die genaue Nukleotidsequenz, die die Verbindung zwischen dem Vaccinia Promotor in pGS20 und dem eingesetzten IBV Spike DNA Fragment umgibt, wurde durch Maxam+Gilbert Sequenzierung bestimmt, um sicherzustellen, daß keine unkorrekten Translationsstart-Sequenzen versehentlich eingeführt wurden.
- Das Transfektionsverfahren und die Selektion der Rekombinanten wurde ausgeführt, wie dies von Mackett, Smith und Moss in "DNA Cloning: a practical approach" Vol.II, ed. Glover, IRL Press Ltd., Oxford 1985, Seiten 191-212 beschrieben wurde. Fast geschlossene Monolayer von Nierenzellen afrikanischer, Grüner Meerkatzen, CV-1 von Flow Laboratories Inc., wurden in 25 cm² Flaschen mit einer Plaque-bildenden Einheit (pfu) pro Zelle des Vacciniavirus Stammes WR infiziert. Eine Stunde später wurden die Zellen mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und dann mit 500 Mikrolitern Calciumphosphat-gefälltem pSB1 pro Flasche transfiziert. Das Präzipitat bestand aus 20 Mikrogramm pSB1, einem Mikrogramm Vacciniavirus DNA, einem ml HEPES gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,12, und 50 Mikrolitern 2M CaCl&sub2; und verblieb 30 Minuten bei den Zellen. Die Zellen wurden 2 Tage später geerntet und die Viren-Nachkommen, in Anwesenheit von Bromdesoxyurldin (BUdR) auf TK&supmin;143 Zellen, erhältlich von der Wistar Institute Inc., über Plaques gereinigt. (Andere, gegenüber Vaccinia empfindliche TK&supmin; Zellen, könnten ebenfalls verwendet werden). Die TK&supmin; selektierten Viren wurden in kleinen Monolayern von TK&supmin; Zellen gezogen und auf die Anwesenheit von Spike- Sequenzen, durch Dotblotten auf Nitrocellulose und Sondennachweis mit ³²P- markiertem, nick-translatiertem pMB179 gescreent. Zwei positive Rekombinanten, Vaccinia-SP1 und Vaccinia-SP2, wurden wieder durch die Plaque-Methode auf TK- Monolayern mit BUdR Selektion gereinigt, erneut durch Dotblotten gescreent, und dann wurden große Mengen von Vaccinia SP1 in CV-1 Zellen ohne Selektionsbedingungen angezogen. Vaccinia-SP1 wurde durch die Ausbildung einer zweifachen Bande in einem 36-50% w/v Saccharose Gradienten gereinigt und die DNA aus den Virionen extrahiert. Diese DNA wurde mit HindIII geschnitten und die erhaltenen Fragmente aui einem 0,6%igem Agarosegel laufen gelassen. Ethidiumbromidfärbung und Sichtharmachung der DNA durch UV zeigte, daß das 5 kb HindIII J Fragment der Wildtyp DNA (das das Vaccinia TK Gen enthält) bei der Rekombinante Vaccinia-SP1 fehlte und statt dessen dort zwei neue HindIII Fragmente auftraten, von denen die Größen mit den Insertionen in die Vaccinia TK der IBV Beaudette Spike-Sequenz übereinstimmten. Ein Southern Blot dieses Agarosegels und Sondennachweis mit nicktranslatiertem, ³²P-markiertem pMB179 bestätigte, daß diese neuen Fragmente in der Tat die Spike-Sequenz beinhalten.
- CV-1 Zellen in 25 cm² Flaschen wurden von Wildtyp oder Vaccinia-SP1 Virus mit 40 pfu pro Zelle infiziert und zwischen 2 und 6 Stunden nach Infektion radioaktiv mit 80 Mikrocurie ³&sup5;S-Methionin markiert. 6 Stunden nach der Infektion wurden Lysate von infizierten und Kontrollzellen hergestellt und mit Kaninchen-anti-Spike-Proteinserum und Staphylakokken Protein A immunpräzipitiert, wie dies von Mackett, Smith und Moss 1985, siehe obige Literaturstelle, beschrieben wurde. Die präzipitierten Polypeptide wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. In Lysaten, die aus Vaccinia-SP1 infizierten Zellen hergestellt wurden, wurden zwei Polypeptide mit hohem Molekulargewicht spezifisch durch anti-Spike-Proteinserum präzipitiert, welche in der Größe mit den Spike-Proteinen S1 und S2 von IBV übereinstimmten. Diese fehlten in den Zelllysaten von nicht infizierten und mit Vaccinia-Wildtyp infizierten Zellen. Indirekte Immunfluoreszenz-Antikörperfärbung von oberflächenfixierten Vaccinia-SP1 infizierten Zellen wurde, unter Verwendung von Kaninchen-anti-Spike-Proteinserum und Fluorescein-konjugiertem anti Kaninchen Serum, wie oben von Mackett, Smith und Moss beschrieben, durchgeführt. Es konnte eine starke Oberflächenmarkierung beobachtet werden, die mit dem Spike Polypeptid übereinstimmt, das auf der Zellmembran von Vaccinia-SP1 infizierten Affen- Nierenzellen exprimiert wird.
Claims (10)
1. DNA-Molekül, das für einen Polypeptidbereich eines Spike-
Proteins eines infektiösen Bronchitisvirus (IBV) kodiert,
welches ein S1- und/oder S2-Polypeptid in voller Länge oder an
jedem Ende um 1 bis 30 Nukleotide verkürzt umfaßt, wobei die
für das S1- und/oder S2-Polypeptid kodierende DNA-Sequenz eine
mindestens 75 %ige Nukleotidsequenzhomologie aufweist zu der
entsprechenden Sequenz des Beaudette-Stamms des IBV, welche wie
in der vorstehend angegebenen "BEAU"-Sequenz definiert ist.
2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, in welcher die
Nukleotidsequenzhomologie mindestens 80% beträgt.
3. DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, in welcher das
Polypeptid aus dem Stamm M41 oder 6/82 stammt.
4. DNA-Molekül nach Anspruch 1, 2 oder 3, welches eine
Nukleotidsequenz umfaßt, welche im wesentlichen nur für ein
beliebiges aus: (1) Spike-Proteinvorläufer, (2) S1-Signal plus
S1-Polypeptid, (3) S1-Polypeptid und (4) S1-Polypeptid plus
S2-Polypeptid, kodiert.
5. Vektor, der eine insertierte Sequenz eines in irgendeinem
der Ansprüche 1 bis 4 beanspruchten DNA-Moleküls trägt.
6. Vektor nach Anspruch 5, der ein Pockenvirus-Vektor ist,
welcher eine virale Promotorsequenz enthält, welche mit einer
insertierten Sequenz eines in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4
beanspruchten DNA-Moleküls verbunden ist.
7. Vektor nach Anspruch 6, in welchem das Virus ein
Geflügelpocken-Virus ist.
8. Vektor nach Anspruch 5, der ein Klonierungsvektor ist.
9. Wirt, welcher einen in Anspruch 8 definierten
Klonierungsvektor aufnimmt.
10. Wirt nach Anspruch 9, der ein E.coli-Bakterium ist.
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