DE69123970T2

DE69123970T2 - Ehv-4 glykoprotein vazin

Info

Publication number: DE69123970T2
Application number: DE69123970T
Authority: DE
Inventors: Lesley Bearsden Glasgow G61 1Qh Nicolson; David Edward Bearsden Glasgow G61 1Qh Onions
Original assignee: University of Glasgow; Equine Virology Research Foundation
Current assignee: University of Glasgow; Equine Virology Research Foundation
Priority date: 1990-07-06
Filing date: 1991-07-04
Publication date: 1997-07-24
Anticipated expiration: 2011-07-05
Also published as: WO1992001057A1; ES2099164T3; HUT69920A; ZA915230B; DE69123970D1; NZ238833A; GB9014950D0; CA2086739A1; ATE147100T1; HU9300009D0; DK0538341T3; HU217211B; GR3023297T3; AU8200791A; EP0538341B1; JPH05509226A; EP0538341A1; US6083511A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid des Equinen Herpesvirus 4 kodiert, ein rekombinantes, eine solche Nukleinsäuresequenz umfassendes Nukleinsäuremolekül, ein die Nukleinsäuresequenz enthaltendes Vektorvirus oder eine solche Wirtszelle, ein EHV-4 Polypeptid, mit dem Polypeptid immunoreaktive Antikörper, ein Vakzin gegen EHV-4 Infektion, sowie Verfahren für die Herstellung eines solchen Vakzins.
Das Equine Herpesvirus 4 (EHV-4) ist wie das verwandte Equine Herpesvirus 1, ein Alphaherpesvirus, das für erhebliche ökonomische Schäden innerhalb der Pferdeindustrie verantwortlich ist. EHV-4 ist primär mit respiratorischen Erkrankungen assoziiert, obwohl auch gelegentliche durch EHV- 4 induzierte Aborte berichtet werden.
Das Genom von EHV-4 ist als ein lineares Doppelstrang-DNS- Molekül charakterisiert worden, das aus zwei kovalent verbundenen Segmenten (L, 109 kbp; S, 35 kbp) besteht, von denen das letzere durch invertierte Repetitionen flankiert ist.
Die Glykoproteine von Herpesviren vermitteln essentielle virale Funktionen, wie Zellanheftung, Penetration in die Zellen und Pathogenität. Weiterhin sind herpesvirale Glykoproteine kritische Komponenten bei der Interaktion des Virus mit dem Wirtszellimmunsystem.
Eine Reihe von Untersuchungen, vorrangig mit den gut untersuchten Glykoproteinen von Herpes Simplex Virus (HSV), haben die Bedeutung von Herpesvirus-Glykoproteinen sowohl für die Antikörper-basierte als auch die zelluläre Immunantwort gezeigt.
Obwohl die Herpesvirus-Glykoproteine bezüglich ihrer Struktur und Funktion eine bemerkenswerte Vielfalt aufweisen, konnten einige Ähnlichkeiten in der DNS- und der Proteinsequenz aufgefunden werden. Dies hat zu der Einordnung verschiedener Herpesvirusproteine in verschiedene Gruppen geführt, die jeweils aus homologen Proteinen bestehen, die über das Vorhandensein spezifischer konservierter Regionen oder Orte verwandt sind. Gruppen solcher Homologe sind zum Beispiel Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1) gB, Pseudorabiesvirus (PRV) gII, Bovines Herpesvirus (BHV) gI, EHV-1 gp14; HSV-1 gD, PRV gp50, BHV gIV; HSV-1 gE, PRV gI.
Die gH-Proteine von Herpes simplex Virus Typ 1 Varicella zoster Virus und Pseudorabiesvirus (PRV) sind kartiert und sequenziert worden, und es konnte gezeigt werden, daß sie am Schutz gegen das Virus beteiligt sind (Gompels, U. und A. Minson, (1986) Virology 153, 230; Keller, P.M. et al. (1987) Virology 157, 526, Patentanmeldung WO 89/10965).
Glykoproteinsequenzen vom gC Typ verschiedener Herpesviren sind veröffentlicht worden, z.B. HSV-1, PRV, EHV-1, (Frink, R.J. et al. (1983), J. Virol. 45, 634; Robbins, A.K. et al. (1986), J. Virol. 58, 339; Allen, G.P. and Coogle, L.D. (1988), J. Virol. 62, 2850).
Jedoch offenbart keines dieser Dokumente die Charakterisierung oder exakte Lokalisierung der EHV-4 gH oder gC Homologe auf dem EHV-4 Genom, noch offenbaren oder lehren sie die Verwendung besagter Proteine oder von sie kodierender Gene für die Herstellung eines Vakzins zur Verhinderung einer EHV-4 Infektion.
Hier sollen die EHV-4 gH bzw. gC artigen Proteine als EHV-4 gH bzw. EHV-4 gC bezeichnet werden.
Die Kontrolle von EHV-4 Infektionen durch Impfung ist seit langem ein angestrebtes Ziel.
Derzeitige Vakzine umfassen chemisch inaktivierte Virus- Vakzine und modifizierte Lebendvirus-Vakzine.
Inaktivierte Vakzine induzieren jedoch im Allgemeinen nur ein niedriges Niveau von Immunität, was zusätzliche Immunisierungen erfordert, benötigen nachteilhafte Adjuvantien, und sind teuer in der Herstellung. Weiterhin können einzelne infektiöse Viruspartikel den Inaktivierungsprozess überleben und nach ihrer Verabreichung in das Tier eine Erkrankung auslösen.
Im Allgemeinen werden attenuierte Lebendvirus-Vakzine bevorzugt, weil sie eine lang anhaltende Immunantwort induzieren (häufig sowohl humoral als auch zellulär) und leichter herstellbar sind.
Bis heute sind nur attenuierte Lebend-EHV-4 Vakzine erhältlich, die auf EHV-4 Virus beruhen, das durch serielle Passagen virulenter Stämme in Zellkultur attenuiert worden ist.
Durch diese Behandlung werden jedoch unkontrollierte Mutationen in das virale Genom eingeführt, was zu einer Viruspartikelpopulation führt, die hinsichtlich ihrer Virulenz und ihrer Immunisierungseigenschaften heterogen ist.
Weiterhin ist wohlbekannt, daß solche traditionell attenuierten Lebendvirus-Vakzine ihre Virulenz wiedergewinnen können, was zur Erkrankung der inokulierten Tiere und ggfs. zu einer Ausbreitung des Pathogens auf andere Tiere führt.
Vakzine, die lediglich das notwendige und relevante immunogene EHV-4 Material, das fähig ist, eine Immunreaktion gegen das Pathogen hervorzurufen, oder solches Material kodierende genetische Informationen enthalten, zeigen die oben erwähnten Nachteile von Lebend- oder inaktivierten Vakzinen nicht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können eine EHV-4 gH oder gC Nukleinsäuresequenz, die EHV-4 gH oder gC Polypeptid kodiert, oder ein antigenes Fragment davon, welche dadurch charkterisiert ist, daß sie für ein Polypeptid mit der in SEQ ID No:1 oder SEQ ID No:2 gezeigten Aminosäuresequenz oder ein Derivat dieses Polypeptids kodiert, für die Herstellung eines Vakzins zur Immunisierung von Pferden gegen eine EHV-4 Infektion verwendet werden, das die oben erwähnten Nachteile inaktivierter oder attenuierter Lebendvakzine nicht zeigt.
"Nukleinsäuresequenz", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine polymere Form von Nukleotiden jeglicher Länge unter Ausschluß des natürlichen EHV-4 Genoms, sowohl von Ribonukleinsäuresequenzen als auch von Desoxyribonukleinsäuresequenzen. Im Prinzip bezieht sich der Ausdruck auf die Primärstruktur des Moleküls. Somit umfasst der Ausdruck Doppel- und Einzelstrang-DNS, Doppel- und Einzelstrang-RNS und Modifikationen davon.
Im Allgemeinen bezieht sich der Ausdruck "Polypeptid" auf eine Molekülkette von Aminosäuren mit einer biologischen Aktivität, jedoch nicht auf eine spezifische Länge des Produkts, schließt aber das natürliche EHV-4 Protein in seiner natürlichen Umgebung aus, und kann, falls nötig, in vivo oder in vitro modifiziert werden, zum Beispiel durch Glykosylierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung; somit sind u.a. Peptide, Oligopeptide und Proteine mit erfasst.
Die gH oder gC Polypeptide sind zu ihren gH oder gC Gegenstücken bei anderen Herpesviren homolog und können durch die konservierten Regionen und Orte innerhalb dieser gH oder gC Polypeptide identifiziert und charakterisiert werden.
Das für das gH Polypeptid kodierende Gen kartiert auf dem BamHI C Fragment (Fig. 1) und kodiert für ein Protein von 855 Aminosäuren Länge und einem vorhergesagten Molekulargewicht von 94100 d. Aus der Aminosäuresequenz (SEQ ID No:1) können folgende, für Membranglykoproteine charakteristische strukturelle Merkmale abgeleitet werden:
-Ein Signalpeptid innerhalb der äußeren N-terminalen Region des primären Translationsproduktes, das eine Reihe von hydrophoben Aminosäureresten umfasst, ist identifizierbar. Die Spaltungstelle liegt etwa bei Ala&sub1;&sub9; und das vorhergesagte Molekulargewicht von gH nach der Abspaltung des Signalpeptids beträgt etwa 92130 d.
-Die Reste 20-816 bilden die hydrophile externe Domäne, die über 11 N-gekoppelte Glykosylierungsstellen (N-X-S/T) verfügt.
-Die hydrophobe Transmembrandomäne von etwa 20 Aminosäureresten ist in Richtung auf den C-Terminus gelegen. Die Zytoplasmadomäne von EHV-4 gH erstreckt sich etwa von Aminosäureposition 837 bis 855.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen von gH Proteinen von Alpha-, Beta-, und Gammaherpesviren durch Gompels et al. (J. Gen. Virol. 69, 2819, 1988) und durch Cranage et al. (J. Virol. 62, 1416, 1988) brachte mehrere, durch die Herpesvirusfamilie hindurch konservierte Eigenschaften des gH Proteins ans Licht:
-Eine ungewöhnlich kurze Zytoplasmadomäne von 14 oder 15 Aminosäuren bei Alphaherpesviren bzw. 7 oder 8 Aminosäuren in Beta- und Gammaherpesviren.
-Vier konservierte Cysteinreste an, bezüglich der vermuteten Transmembrandomäne, ähnlichen Positionen und innerhalb einer konservierten lokalen Sequenz und
-eine konservierte Glykosilierungsstellensequenz NGTV 13 bis 18 Aminosäuren N-terminal der transmembranen Domäne.
EHV-4 gH zeigt alle diese oben beschriebenen Merkmale: die vorgeschlagene Zytoplasmadomäne hat eine Länge von weniger als 20 Aminosäuren, die vier konservierten Cysteine befinden sich an den Positionen 556, 591, 663 und 716, und die C- terminale Glykosylierungsstelle befindet sich in der Sequenz NGTV (Aminosäuren 796-799), die 19 Aminosäuren N-terminal der vermuteten EHV-4 Transmembrandomäne liegt. Die Cys Reste an den Positionen 737 und 740 im EHV-4 gH treten an Stellen auf, an denen die meisten Herpesvirus-gHs, mit Ausnahme von HSV-1, Cysteinkonservierung zeigen. Die starke Konservierung von Cysteinresten zwischen den EHV-4 und HSV-1 gHs, und tatsächlich bei den untersuchten Alpha-, Beta-, und Gammaherpesvirus gHs impliziert ein gewisses Maß an Konservierung der sekundären und tertiären Strukturen dieser Proteine, an der vermutlich Disulfidbrücken beteiligt sind (Gompels et al., 1988, ebenda).
Das für das EHV-4 gC Polypeptid kodierende Gen kartiert auf dem BamHI G Fragment (Fig. 2) und kodiert für ein Protein von 485 Aminosäuren Länge mit einem Molekulargewicht von etwa 52500 d. Aus der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:2) lassen sich folgende, für Membranglykoproteine charakteristische, strukturelle Merkmale ableiten:
-Das Signalpeptid ist am N-Terminus identifizierbar und reicht über etwa 32 Aminosäuren, wobei die Abspaltung zwischen den Ala und Ser Resten an den Positionen 32 bzw. 33 erfolgt.
-Die externe Domäne von EHV-4 gC reicht ungefähr von Rest 33 Glykosylierungsstellen (N-X-S/T). Eine antigene Determinante von EHV-4 gC liegt in etwa bei Rest 409 (Asn) (Hopp und Woods (1981), PNAS 78, 3824).
-Die Aminosäuren 445 - 468 bilden die Glykoprotein- Transmembrandomäne.
-Die C-terminale Zytoplasmadomäne reicht von Rest 469 bis 485, ist hydrophil und hat eine positive Nettoladung von 2.
gC Homologe umfassen unter anderem konservierte Aminosäuren in ihrer C-terminalen Hälfte, um sechs Stellen der Cysteinkonservierung herum gelegen. Einige der N-gekoppelten Glykosylierungsstellen liegen an ähnlichen Positionen, sind jedoch nicht streng konserviert. Ein weiteres gemeinsames Merkmal der gCs ist, daß die C-terminale Cytoplasmadomäne kurz und positiv geladen ist (Fitzpatrick, D.R. et al. (1989), Virology 173, 46; Allen, G.P. und Coogle, L.D., ebenda).
Für die Zwecke des Vergleichs von EHV-4 gC mit anderen gCs bezüglich spezifisch konservierter Merkmale wird ein Alignment von EHV-4 gC, BHV-1 gIII, PRV gIII, HSV-1 gC und dem MDV A Antigen durchgeführt. EHV-4 gC besitzt Cysteinreste an allen sechs konservierten Positionen, Aminosäuren 256, 318, 357, 361, 390 und 416. Von den vermuteten EHV-4 gC Glykosilierungsstellen sind neun bei EHV-1 gp13 und drei bei PRV gIII konserviert.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Nukleinsäuresequenzen, die für ein antigenes Fragment der EHV-4 gH oder gC Polypeptide kodieren, d.h. ein Fragment dieser gH oder gC Polypeptide, welches eine molekulare Konfiguration umfasst, die in der Lage ist, einen beliebigen Typ von Immunantwort, humoral und/oder zellulär, gegen das gH oder gC Polypeptid in einem empfänglichen Tier hervorzurufen, wenn es in einer geeigneten Form präsentiert wird.
Weiterhin ist das Fragment für ein EHV-4 gH oder gC Polypeptid charakteristisch.
Insbesondere kann eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz verwendet werden, die für ein EHV-4 Polypeptid mit der in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz oder für ein Derivat dieses Polypeptids kodiert.
Die für das EHV-4 gH und das gC kodierenden Gene wurden auf dem EHV-4 Gen lokalisiert und ihre Nukleotidsequenzen sind in SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 dargestellt.
Diese Informationen können verwendet werden, um diese Gene oder Derivate davon genetisch zu manipulieren, z.B. um die Gene durch in Fachkreisen geläufige rekombinante DNS- Techniken zu klonieren und um die dadurch kodierten Polypeptide in vitro oder in vivo zu exprimieren. Nukleinsäuresequenzen mit den oben erwähnten Nukleotidsequenzen oder deren Derivate werden für die Expression von EHV-4 gH oder gC Polypeptiden vorzugsweise benutzt.
Es versteht sich, daß für bestimmte, hier behandelte EHV-4 gH oder gC Polypeptide natürliche Variationen zwischen einzelnen EHV-4 Viren oder Stämmen bestehen können. Diese Variationen können sich in (einem) Aminosäurenunterschied(en) in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen von (einer) Aminosäure(n) in besagter Sequenz zeigen. Alle diese Derivate liegen im Schutzumfang der Erfindung. Desweiteren besteht die Möglichkeit, rekombinante DNS-Technologie für die Herstellung von für diese verschiedenen Derivate kodierenden Nukleinsäuresequenzen einzusetzen.
Bekanntlich erlaubt die Degeneration des genetischen Codes den Austausch von Basen in einem Codon, was zu einem anderen Codon führt, das jedoch noch immer für dieselbe Aminosäure kodiert; so kann z.B. das Codon für die Aminosäure Glutaminsäure sowohl GAT als auch GAA sein. Demzufolge ist klar, daß für die Expression eines Polypeptids mit der in der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 gezeigten Aminosäuresequenz oder ein antigenes Fragment davon, eine Derivatnukleinsäuresequenz mit einer alternativen Codonzusammensetzung verwendet werden kann, die sich von den in den SEQ IDs gezeigten Nukleinsäuresequenzen unterscheidet.
Weiterhin sind auch Fragmente von der Erfindung umfasst, die von den EHV-4 gH oder gC Polypeptiden oder von den in den SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenzen, die immer noch EHV-4 gH oder gC antigenische Eigenschaften aufweisen, abgeleitet sind, oder Fragmente, die von den für EHV-4 gH oder gC Polypeptid kodierenden Nukleotidsequenzen oder von den in den besagten SEQ IDs dargestellten, antigene Fragmente der gH oder gC Polypeptide kodierenden Nukleotidsequenzen abgeleitet sind.
Alle oben erwähnten Modifikationen, die in solchen Derivaten der EHV-4 gH oder gC Polypeptide oder Gene resultieren, werden von der vorliegenden Erfindung gedeckt, sofern die charakteristischen EHV-4 gH oder gC Merkmale in ihrem Kern unberührt bleiben.
Eine Nukleinsäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kann an verschiedene, expressionsvermittelnde DNS-Sequenzen anligiert werden, die optional Teile von Fusionsproteinsequenzen kodierende DNS enthalten, wie etwa Beta-Galaktosidase, was zu einem sogenannten rekombinanten Nukleinsäuremolekül führt, das zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet werden kann. Solche hybriden DNS Moleküle werden vorzugsweise aus z.B. Plasmiden oder aus in Bakteriophagen oder Viren vorhandenen Nukleinsäuresequenzen erhalten.
Spezifische Vektoren, die zum Klonieren von Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind bekannt (z.B. Rodriguez, R.L. and D.T. Denhardt, Hrsg., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths, 1988).
Die für die Konstruktion eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls gemäß der Erfindung einzusetzenden Verfahren sind Fachleuten geläufig und sind u.a. verdeutlicht in Maniatis, T. et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
"Transformation", wie hierin benutzt, bezieht sich auf die Einführung einer heterologen Nukleinsäuresequenz in eine Wirtszelle, unabhängig von der verwendeten Methode, z.B. direkte Aufnahme oder Transduktion. Die heterologe Nukleinsäuresequenz kann sich durch durch autonome Replikation oder alternativ durch Integration in das Wirtsgenom erhalten. Die rekombinanten DNS-Moleküle werden vorzugsweise mit geeigneten, mit der gewählten Wirtszelle kompatiblen Kontrollsequenzen ausgestattet, welche die Expression der inserierten Nukleinsäuresequenz reguliert.
Eine geeignete Wirtszelle ist eine solche, welche durch eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid kodiert, oder durch ein, eine solche Nukleinsäuresequenz umfassendes rekombinantes Nukleinsäuremolekül transformiert werden kann, und die dazu benutzt werden kann, das durch die Nukleinsäuresequenz kodierte Polypeptid zu exprimieren. Die Wirtszelle kann prokaryotischen Ursprungs, wie z.B. E. coli, B. subtilis und Pseudomonas-Arten, oder eukaryotischen Ursprungs sein, wie etwa Hefen, z.B. Sacharomyces cerevisiae, oder höhere eukaryotische Zellen, z.B. Insekten-, Pflanzen- oder Säugerzellen, einschließlich HeLa Zellen und Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen. Insektenzellen beinhalten die Sf9 Zellinie von Spodoptera frugiperda. Informationen bezüglich der Klonierung und Expression der erfindungsgemässen Nukleinsäuresequenzen in eukaryiotischen Klonierungssystemen können in Esser, K. et al. (Plasmids of Eucaryotes, Springer- Verlag, 1986) gefunden werden.
Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise operativ an die Expressionskontrollsequenzen gekoppelt.
Solche Kontrollsequenzen können Promoter, Operatoren, Induktoren (Inducer), Ribosomenbindungsstellen etc. umfassen.
Wenn es sich bei den Wirtszellen um Bakterien handelt, beinhalten illustrative, nützliche Expressionskontrollsequenzen den trp Promoter und Operator (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8, 4057, 1980); den lac Promoter und Operator (Chang et al., Nature 275, 615, 1978); den Promoter des Außenmembranproteins (EMBO J. 1, 771-775, 1982); den Bakteriophage lambda Promoter und Operator (Nucl. Acids Res. 11, 4677-4688, 1983); den alpha-Amylase (B. subtilis) Promoter und Operator, Terminierungssequenzen und andere expressionsverstärkende und Kontrollsequenzen, die mit der gewählten Wirtszelle kompatibel sind. Wenn die Wirtszelle Hefe ist, beinhalten illustrative nützliche Expressionskontrollsequenzen z.B. alpha-Mating Faktoren. Für Insektenzellen kann der Polyhedrinpromoter von Baculoviren benutzt werden (Mol. Cell. Biol. 3, 2156 - 65, 1983). Wenn die Wirtszelle von Insekten- oder Säugerursprung ist, beinhalten illustrative nützliche Expressionkontrollsequenzen z.B. den SV-40 Promoter (Science 222, 524-527, 1983) oder den Metallothionein Promoter (Nature 296, 39-42, 1982) oder den Hitzeschockpromoter (Voellmy et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 4949-53, 1985).
Alternativ können auch in EHV-4 vorhandene Expressionskontrollsequenzen, insbesondere solche, welche die Expression von gH oder gC regulieren, eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein EHV-4 gH oder gC Polypeptid oder ein antigenes Fragment davon, das im wesentlichen frei von ganzem Virus oder anderem Protein ist, mit dem es gewöhnlich assoziiert ist.
Insbesondere ist ein Polypeptid in der vorliegenden Erfindung beinhaltet, das zumindest einen Teil der in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz oder Derivate davon umfasst.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz verwendet, die durch eine der oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen kodiert wird.
Eine Immunisierung von Pferden gegen eine EHV-4 Infektion kann z.B. durch Verabreichung eines erfindungsgemässen Polypeptids als sogenanntes Untereinheitsvakzin in ein Pferd erreicht werden. Das erfindungsgemässe Untereinheitsvakzin kann ein Polypeptid in reiner Form, optional in Anwesenheit eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers, umfassen. Das Polypeptid kann optional mit einem nicht verwandten Protein kovalent verbunden sein, was z.B. bei der Reinigung des Fusionsproteins vorteilhaft sein kann. Beispiele stellen beta-Galaktosidase, Protein A, Prochymosin, Blutgerinnungsfaktor Xa etc. dar.
In einigen Fällen mag die Fähigkeit, neutralisierende Antikörper gegen diese Polypeptide zu bilden, per se niedrig sein. Kleine Fragmente werden vorzugsweise mit Trägermolekülen konjugiert, um ihre Immunogenität zu steigern. Geeignete Träger für diesen Zweck sind Makromoleküle, wie etwa natürliche Polymere (Proteine, wie Schlüsselloch-nacktschnecken- (key hole limpet) -Hemocyanin, Albumin, Toxine), synthetische Polymere, wie Polyaminosäuren (Polylysin, Polyalanin), oder Mizellen von amphiphilen Stoffen, wie Saponine. Alternativ können diese Fragmente als Polymere davon, vorzugsweise lineare Polymere, bereitgestellt werden.
Polypeptide, die in solchen Untereinheitenvakzinen verwendet werden sollen, können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden, z.B. durch Isolierung der Polypeptide aus EHV-4 mittels rekombinanter DNS Techniken oder durch chemische Synthese.
Falls nötig, kann das erfindungsgemäße Polypeptid, das in einem Vakzin verwendet werden soll, in vitro oder in vivo modifiziert werden, z.B. durch Glykosylierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung.
Eine Alternative zu Untereinheitenvakzinen sind Lebendvektorvakzine. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz wird durch rekombinante DNS-Techniken in einen Mikroorganismus (z.B. ein Bakterium oder ein Virus) dergestalt eingeführt, daß der rekombinante Mikroorganismus noch zur Replikation fähig ist, wodurch ein von der inserierten Nukleinsäuresequenz kodiertes Polypeptid exprimiert wird. Sodann kann dieser rekombinante Mikroorganismus einem Pferd zur Immunisierung verabreicht werden, wonach er sich im Körper des inokulierten Pferdes für einige Zeit selbst erhält oder sogar repliziert und in vivo ein von der erfindungsgemäßen, inserierten Nukleinsäuresequenz kodiertes Polypeptid exprimiert, was zu einer Stimulierung des Immunsystems des inokulierten Pferdes führt. Geeignete Vektoren für die Aufnahme der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz können aus z.B. Viren wie EHV-1, Adenovirus, Vaccinia-Virus oder anderen Poxviren, Papillomavirus oder aus Bakterien wie E. coli oder spezifischen Salmonellenstämmen erhalten werden. Mit rekombinanten Mikroorganismen dieser Art kann in der Wirtszelle synthetisiertes Polypeptid als Oberflächenantigen exponiert werden. In diesem Zusammenhang ist die Fusion des Polypeptids mit OMP-Proteinen oder Pilus-Proteinen von Escherichia coli oder eine synthetische Bereitstellung von Signal- und Ankersequenzen, die vom Organismus erkannt werden, denkbar. Auch ist es möglich, daß das besagte immunogene Polypeptid, ggfs. als Teil eines größeren Ganzen, in dem zu immunisierenden Tier freigesetzt wird. In allen diesen Fällen ist es auch möglich, daß ein oder mehrere immunogene Produkte exprimiert werden, die Schutz gegen verschiedene Pathogene und/oder verschiedene Antigene eines gegebenen Pathogens erzeugen.
Ein erfindungsgemäßes Vakzin kann durch Kultivierung einer Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfasst, hergestellt werden, woraufhin die Zellen und/oder die in ihnen gezogenen Vektorviren gesammelt (optional in einer reinen Form), und zu einem Vakzin verarbeitet werden können, optional in einer lyophilisierten Form.
Die oben erwähnten, eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfassenden Wirtszellen können auch unter Bedingungen kultiviert werden, die für die Bildung eines von dieser Nukleinsäuresequenz kodierten Polypeptids günstig sind. Vakzine können hergestellt werden, indem Proben der Rohkultur, Wirtszelllysate oder Wirtszellextrakte verwendet werden, obwohl in Abhängigkeit vom beabsichtigten Verwendungszweck in einer anderen Ausführungsform höher aufgereinigte, erfindungsgemäße Polypeptide zu einem Vakzin verarbeitet werden. Um die hergestellten Polypeptide zu reinigen, werden die, die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz enthaltenden, Wirtszellen in einem adäquaten Volumen kultiviert und die produzierten Polypeptide werden aus solchen Zellen oder, falls das Protein exkretiert wird, aus dem Medium isoliert. In das Medium exkretierte Polypeptide können durch Standardverfahren isoliert und gereinigt werden, z.B. durch Salzfraktionierung, Chromatographie oder Zentrifugation, während intrazelluläre Polypeptide isoliert werden können, indem zuerst die Zellen gesammelt werden, um sie dann zu lysieren, worauf die Polypeptide von den anderen Zellkomponenten getrennt und zu einem Vakzin verarbeitet werden.
Es versteht sich von selbst, daß bereits durch EHV-4 infizierte Pferde mit gegen dieses EHV-4 gerichteten Antikörpern behandelt werden können. Für das erfindungsgemäße Polypeptid charakteristisches Antiserum oder solche Antikörper können für die therapeutische Behandlung einer EHV-4 Infektion verwendet werden. Ein solches charakteristisches Antiserum oder solche Antikörper können durch Immunisierung von Tieren mit einer wirksamen Menge an EHV-4 gH oder gC Polypeptid, um eine entsprechende Immunantwort hervorzurufen, erhalten werden. Danach werden die Tiere geblutet und ein Antiserum kann präpariert werden.
Gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichtete monoklonale Antikörper können ebenfalls für die Therapie von mit EHV-4 infizierten Pferden verwendet werden. Diese monoklonalen Antikörper können durch für solche Zwecke bekannte Verfahren hergestellt werden, z.B. durch Immunisierung von Mäusen mit dem Polypeptid, Immortalisierung von murinen Milzzellen und Auswählen von Hybridomen, die geeignetete Antikörper produzieren. Immortale, antikörper-produzierende Zellinien können auch durch direkte Transformation von B-Lymphozyten mit onkogener DNS oder Transfektion mit Eppstein-Barr Virus geschaffen werden.
Insbesondere monoklonale Antikörper können verwendet werden, um Anti-Idiotyp-Antikörper durch bekannte Verfahren zu erhalten. Diese Anti-Idiotyp-Antikörper könnten auch für die Prävention von EHV-4 Infektionen bei Pferden nützlich sein.
Die oben erwähnten Antiseren und monoklonalen Antikörper können auch für die immunologische Diagnose von mit EHV-4 infizierten Pferden verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Vakzin kann in einem herkömmlichen Schema für aktive Immunisierung verabreicht werden: Einfache oder wiederholte Verabreichung in einer mit der Dosisformulierung kompatiblen Weise und in einer Menge, die prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksam und immunogen sein wird. Die Verabreichung des Vakzins kann z.B. intradermal, subkutan, intramuskulär, intravenös oder intranasal erfolgen.
Zusätzlich kann das Vakzin auch ein wässriges Medium oder eine wasserhaltige Suspension enthalten, oft in Mischung mit anderen Bestandteilen, um z.B. die Aktivität und/oder die Lagerungsfähigkeit zu erhöhen. Diese Bestandteile können Salz, pH-Puffer, Stabilisatoren (wie Magermilch oder Caseinhydrolysat), Emulgatoren, die Immunantwort verbessernde Adjuvantien (z.b. Öle, Muramyldipeptid, Aluminiumhydroxid, Saponin, Polyanionen and amphipate Substanzen) und Konservierungsmittel sein.
Es ist klar, daß ein erfindungsgemäßes Vakzin auch Immunogene, die mit anderen Pferdepathogenen verwandt sind, oder Nukleinsäuren, welche für diese Immunogene kodieren, enthalten kann, wie Antigene von EHV-1, Pferdeinfluenzavirus, equinem Rotavirus, equinem infektiösen Anämie-Virus, equinem Arteritisvirus, equinem Enzephalitis-Virus, Pferdebornavirus, Pferdeberuevirus, E. coli oder Streptococcus equi, um ein multivalentes Vakzin herzustellen.

Beispiel 1

Isolierung und Charakterisierung des gH Genes

1. Kultivierung des EHV-4 Virus

Rollflaschen mit leicht subkonfluenten Monolayern von equinen Hautzellen (NBL-6), die in Earle's minimalen, essentiellen Medium (FLOW) unter Zusatz von 0,2 % Natriumbicarbonat, 1 % nichtessentieller Aminosäuren, 1 % Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 10 % fötalem Kalbsserum gezogen worden waren, wurden mit EVH-4 Virus vom Stamm 1942 mit einer m.o.i. von 0,003 infiziert. Die Viren durften für 60 min bei 37ºC adsorbieren. Sie wurden dann bei 31ºC inkubiert, bis ausgedehnte zytopathische Effekte erkennbar waren und sich die Mehrheit der Zellen von der Flaschenoberfläche gelöst hat (2-6 Tage). Das infizierte Zellmedium wurde bei 5000 l/min für 5 min zentrifugiert, um die Zellen zu präzipitieren; und der Überstand wurde bei 12000 l/min für 2 Std. in einem Sorvall GSA 6 x 200 ml Rotor zentrifugiert. Das Präzipitat wurde in 5 ml PBS aufgenommen, ultrabeschallt und bei 11000 l/min in einem Sorvall SS34 Rotor für 5 min zentrifugiert, um zelluläre Debris herunterzuholen. Das Virus wurde dann durch einstündige Zentrifugation in einem Sorvall SS34 Rotor bei 18000 l/min präzipitiert. Die Verhältnisse von Viruspartikeln zu Plaque- bildenden Einheiten lag bei etwa 1000 bis 5000.

2. Präparation von EHV-4 DNS

Das präzipitierte Virus wurde in 10 ml NTE (NaCl/Tris/EDTA) resuspendiert und kurz ultrabeschallt. Kontaminierende zelluläre DNS wurde durch Zugabe von 10 µg/ml Endkonzentration an DNase und Inkubation bei 37ºC für eine Std. abgebaut. SDS wurde bis zu einer Endkonzentration von 2 % zugegeben und die Präpartion wurde ungefähr dreimal mit NTE-equilibriertem Phenol extrahiert, bis eine klare Zwischenphase erhalten wurde.
Einer Chloroform-Extraktion folgte eine Ethanolfällung der DNS wie oben beschrieben. Die DNS wurde präzipitiert, mit 70% Ethanol gewaschen, in 10 ml 100 mM NaCL und 10 µg/ml RNase wiederaufgenommen und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die weitere Reinigung wurde durch Behandlung mit 1 mg/ml Proteinase K für 2 Std. bei 31ºC erreicht. Die DNS wurde einmal mit Phenol/Chloroform (1:1 Vol:Vol) und einmal mit Chlorofom extrahiert, und dann mit Ethanol präzipitiert. Es wurde gut dekantiert und die DNS in 0,1 x SSC resuspendiert.

3. Klonierung von EHV-4 DNS

EHV-4 BamHI-Fragmente wurden in den Vektor pUC9, einem Plasmid, das ein Ampicillinresistenzgen vom pBR322 und die Polylinkerregion vom M13mp9 beinhaltet (Vieira, J. und Messing, J. (1982), Gene 19, 259), einligiert. Je 5 µg EHV-4 DNS und 5 µg pUC9 DNS wurden getrennt mit BamHI verdaut.
Die Vollständigkeit des Verdaus wurde durch Gelelektrophorese von Aliquots der Reaktionsansätze überprüft, worauf die DNS zweimal mit einem gleichen Volumen von Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert und mit Ethanol präzipitiert wurde. Die Ligation wurde im wesentlichen nach der Methode von Tanaka und Weisblum (J. Bact. 121, 354, 1975) durchgeführt. Ungefähr 0,1 mg von BamHI verdauter pUC9 und 1 µg von BamHI verdauter EHV-4 DNS wurden in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 8 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP in einem Endvolumen von 40 µl gemischt. 2 Einheiten T4 DNS-Ligase (0,5 µl) wurden dann hinzugegeben. Der Reaktionsansatz wurde bei 4ºC für 16 Std. inkubiert.
Calzium-geschockte E.coli DHI Zellen (Hanahan, D. (1983), J. Mol. Biol. 166, 557) wurden mit dem rekombinanten Plasmid, im wesentlichen wie von Cohen et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 2110, 1972) beschrieben, transformiert. Zusätzliche Klone für eine Sequenzanalyse wurden durch Restriktionsverdau von rekombinanten, BamHI C Fragment (Fig. 1) enthaltendem Plasmid pUC9 gewonnen, gefolgt von Wiedergewinnung des spezifischen EHV-4-Restriktionsfragments und dessen Subklonierung (Maniatis, T. et al, ebenda) in die Multiple Klonierungsstelle des Bluescript M13&spplus; Plasmidvektors (Stratagene) zur Sequenzanalyse.
Die Nukleotidsequenz einer das gH Gen überspannenden Region des BamHI Fragments wurde durch Verwendung von Einzelstrangplasmid-DNS als Template und von Bluescript stammenden und kundenspezifisch angefertigten Oligonukleotiden als Primer in einer Sanger Dideoxy- Sequenzierungsstrategie (Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 74, 5463, 1977) (Fig. 1) bestimmt. Die exakte Lokalisation, Nukleinsäuresequenz und zugehörige Aminosäurensequenz des gH Gens ist in SEQ ID NO:1 gezeigt.

Beispiel 2

Isolierung und Charakterisierung des gC Genes

Kultivierung von EHV-4 Virus, Präparation von EHV-4 DNS und Konstruktion einer BamHI Bibliothek in pUC9 wurde wie oben dargestellt durchgeführt.
Das rekombinante Plasmid pUC9:EHV-4 BamHI G wurde mit Restriktionsenzym verdaut, um Subfragmente von EHV-4 BamHI G zu erzeugen, die dann aus einem 0,7 % Agarosegel isoliert und in einen Bluescript M13&spplus; Plasmidvektor (Stratagene) mittels Standardtechniken (Maniatis, T. et al, ebenda) einkloniert wurde. Die rekombinanten Plasmide wurden im E. coli Stamm JM83 in L-Broth mit 100 µg/ml Ampicillin vermehrt. Die Plasmid-DNS wurde aus 500 ml Bakterienkulturen durch die alkalische Lysemethode extrahiert und durch Bandierung in CsCL-Gradienten gereinigt.
Die Sequenzierung wurde mit der Sanger Dideoxy-Methode (Sanger et al., ebenda) durchgeführt, wobei denaturierte rekombinante Plasmid-DNS als Template und M13&spplus; spezifische oder speziell angefertigte Oligonukleotide als Primer verwendet wurden.
Die Nukleotidsequenz einer das gC überspannenden Region des BamHI G-Fragments wurde durch Analyse von überlappenden Sequenzen gemäß der in Fig. 2 dargestellten Strategie bestimmt.
Die genaue Lokalisation, Nukleotidsequenz und dementsprechende Aminosäurensequenz des gC Gens wird in der SEQ ID NO:2 gezeigt.

Legende:

Fig. 1:

(a): BamHI Restriktionskarte des EHV-4 Genoms (Cullinane, AA. et al., J. Gen Virol. 69, 1575, 1988).
(b): Sequenzierungsstrategie und Lokalisation des EHV.4 gH Gens

Fig. 2

(a): wie in Fig. 1.
(b): Restriktionskarte von BamHI G mit Spaltstellen für SalI, EcoRI, BglI und BglII.
(c): Sequenzierungsstrategie und Grenzen der offenen Leseraster im BamHI G-Fragment

Sequenzauflistung

SEQ ID NO: 1

Sequenztyp: Nukleotid mit correspondierendem Protein
Sequenzlänge: 2730 Basenpaare; 855 Aminosäuren
Strängigkeit: einzel
Topolgie: linear
Molekültyp: genomische DNS

Originalquelle

Organismus: Equines Herpesvirus-4
Unmittelbare experimentelle Quelle: genomische BamHI Bibliothek
Eigenschaften: EHV-4 gH Gen

SEQ ID NO: 2

Sequenztyp: Nukleotid mit correspondierendem Protein
Sequenzlänge: 1560 Basenpaare; 485 Aminosäuren
Strängigkeit: einzel
Topolgie: linear
Molekültyp: genomische DNS

Originalquelle

Organismus: Equines Herpesvirus-4
Unmittelbare experimentelle Quelle: genomische BamHI Bibliothek
Eigenschaften: EHV-4 gC Gen

Claims

1. EHV-4 gH- oder gC-Nucleinsäuresequenz, die ein EHV-4 gH- oder gC-Polypeptid kodiert, oder ein Antigenfragment hiervon, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder Derivaten des genannten Polypeptids dargestellt ist.

2. Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz die Desoxynucleinsäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder Derivaten dieser Desoxynucleinsäuresequenz dargestellt ist.

3. Molekül einer rekombinanten Nucleinsäure, enthaltend eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2, die mit einem Expressionssteuersystem funktionierbar verknüpft ist.

4. Vektorvirus, enthaltend ein Molekül einer rekombinanten Nucleinsäure nach Anspruch 3.

5. Wirtszelle, enthaltend eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2 oder ein Molekül einer rekombinanten Nucleinsäure nach Anspruch 3 oder ein Vektorvirus nach Anspruch 4.

6. EHV-4 gH- oder gC-Polypeptid oder ein Antigenfragment hiervon, enthaltend mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder Derivaten des genannten Polypeptids dargestellt ist.

7. EHV-4-Polypeptid, das durch eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2 kodiert ist.

8. Antikörper oder Antiserum, der bzw. das mit einem Polypeptid nach den Ansprüchen 6 oder 7 immunoreaktiv ist.

9. Impfstoff für den Schutz von Pferden gegen EHV-4-Infektion, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2, ein Molekül einer rekombinanten Nucleinsäure nach Anspruch 3, einen Vektorvirus nach Anspruch 4, eine Wirtszelle nach Anspruch 5 oder ein Polypeptid nach den Ansprüchen 6 oder 7 enthält.

10. Verfahren zum Herstellen eines EHV-4-Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß eine Wirtszelle nach Anspruch 5 gezüchtet wird und anschließend EHV-4-enthaltendes Material gesammelt sowie zu einem pharmazeutischen Präparat mit immunisierenden Wirkung verarbeitet wird.

11. Verfahren zum Herstellen eines EHV-4-Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polypeptid nach den Ansprüchen 6 oder 7 zu einem pharmazeutischen Präparat mit immunisierender Wirkung verarbeitet wird.

12. Verwendung einer wirksamen Menge eines Impfstoffes nach Anspruch 9 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung einer EHV-4-Infektion.