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Die vorliegende Erfindung betrifft neue Expressionsvehikel
und transformierte Wirte, die rekombinante
Mycoplasma-hyopneumoniae-Antigene exprimieren.
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Die durch Mycoplasma hyopneumoniae (insbesondere bei
Schweinen) hervorgerufene Erkrankung tritt weltweit auf und ist
eine Krankheit, die mit dem Verlust von Schweinen verbunden
ist. Diese Erkrankung führt im allgemeinen zu
leistungsunfähigen, verkümmerten und kränklichen Tieren, wobei
befallene Schweine häufig zu einer Sekundärinfektion durch
opportunistische Mikroorganismen neigen. Es gab zahlreiche
Versuche, einen Impfstoff zum Schutz von Schweinen vor
Mycoplasmapneumonie bereitzustellen. Derartige Impfstoffe waren
jedoch nicht erfolgreich.
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In der WO-A-8800977 ist die Expression von Teilen der Gene
von Mycoplasma hyopneumoniae mit Kodierung für die antigenen
Polypeptide A (105 kDa), B (90 kDa), C (85 kDa), D (70 kDa)
und E (43 kDa) beschrieben.
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Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt
ein Expressionsvehikel eine in Fig. 2 dargestellte
DNA-Sequenz oder einen Teil hiervon mit Kodierung für ein zur
Produktion eines Antikörpers, der ein Epitop des 74,5 kDa
großen Mycoplasma hyopneumoniae-Antigens erkennt, fähiges
Protein umfaßt.
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Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird
ein Wirtorganismus mit einem oben definierten
Expressionsvehikel transformiert.
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Die DNA-Sequenz kann für ein Protein kodieren, das das
vollständige Antigen oder ein Fragment oder Derivat des Antigens
oder ein Fusionsprodukt des Antigens oder Fragments und
eines anderen Proteins ist, vorausgesetzt, daß das Protein,
das aus einer derartigen DNA-Sequenz gebildet wird, in der
Lage ist, einen Antikörper zu produzieren, der (ein)
Epitop(e) des M. hyo.-Antigens erkennt. Somit kann die DNA-
Sequenz beispielsweise für ein Protein kodieren, das ein
Fragment des 74,5 kDa großen Antigens (ein Protein mit einem
Molekulargewicht von 43 kDa, das einen Teil der
Peptidsequenz des 74,5 kDa großen Antigens umfaßt) ist,
vorausgesetzt, daß ein derartiges Fragment dazu in der Lage ist,
einen Antikörper zu produzieren, der (ein) Epitop(e) des
74,5 kDa großen Antigens erkennt.
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In ähnlicher Weise kann die DNA-Sequenz für ein Protein
kodieren, das ein Derivat des Antigens ist (beispielsweise
eine Mutation einer oder mehrerer Aminosäuren in der
Peptidkette aufweist), solange ein derartiges Derivat dazu in der
Lage ist, einen Antikörper zu produzieren, der (ein)
Epitop(e) eines oben beschriebenen M. hyo.-Antigens erkennt.
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Die DNA-Sequenz kann für ein Protein kodieren, bei dem es
sich um ein Fusionsprodukt von (i) einem Protein mit der
Fähigkeit zur Produktion eines Antikörpers, der (ein)
Epitop(e) der angegebenen M. hyo.-Antigene erkennt, und (ii)
einem anderen Protein handelt.
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Als Ergebnis umfaßt der Ausdruck "DNA-Sequenz mit Kodierung
für ein zur Produktion eines Antikörpers, der (ein)
Epitop(e) der angegebenen M. hyo.-Antigene erkennt, fähiges
Protein" DNA-Sequenzen, die für Proteine, bei denen es sich
um das geeignete Antigen, Antigenfragment, Antigenderivat
oder ein Fusionsprodukt aus einem derartigen Antigen,
Antigenfragment oder Antigenderivat mit einem anderen Protein
handeln kann, kodieren und/oder derartige Proteine in
geeigneten transformierten Zellen exprimieren.
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Es ist ferner selbstverständlich, daß die in dem Vektor
vorhandene DNA-Sequenz nach Einführung in eine Zelle lediglich
einen Teil des Proteins, der durch eine derartige
DNA-Sequenz kodiert ist, exprimieren kann, wobei eine derartige
DNA-Sequenz unter die angegebene Terminologie fällt,
vorausgesetzt, daß der exprimierte Proteinteil in der Lage ist,
einen Antikörper zu produzieren, der (ein) Epitop(e) eines
oder mehrerer der angegebenen M. hyo.-Antigene erkennt.
Beispielsweise kann die DNA-Sequenz für das gesamte Antigen
kodieren. Das exprimierte Protein ist (jedoch) ein Fragment
des Antigens. Es ist ferner selbstverständlich, daß das
Kloniervehikel DNA umfassen kann, die für mehr als ein M.
hyo.-Antigen oder -Fragment kodiert.
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Die geeignete DNA-Sequenz kann in den verschiedensten
Vektoren oder Plasmiden enthalten sein. Derartige Vektoren
umfassen chromosomale, nichtchromosomale und synthetische
DNA-Sequenzen, beispielsweise Derivate von SV40, bakterielle
Plasmide, Phagen-DNAs, Hefeplasmide, Vektoren, die von
Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs stammen, Virus-DNA,
beispielsweise Kuhpockenvirus, Adenovirus,
Geflügelpockenvirus, Pseudorabisvirus usw..
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Die geeignete DNA-Sequenz kann nach den verschiedensten
Verfahren in den Vektor insertiert werden. Im allgemeinen wird
die DNA-Sequenz durch auf dem einschlägigen Fachgebiet be
kannte Maßnahmen in eine geeignete
Restriktionsendonucleasestelle insertiert. Derartige Maßnahmen und andere Maßnahmen
sind als dem Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet
geläufige Maßnahmen anzusehen.
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Die DNA-Sequenz im Vektor ist betriebsbereit (operatively)
mit (einer) geeigneten Expressionssteuersequenz (en)
(Promotor) zur Steuerung der MRNA-Synthese verknüpft. Als
repräsentative Beispiele für derartige Promotoren lassen
sich der LTR- oder SV40-Promotor, E. coli lac oder trp, der
Phagenlambda-PL-Promotor und andere Promotoren, von denen
bekannt ist, daß sie die Expression von Genen in
prokaryontischen und eukaryontischen Zellen oder ihren Viren steuern,
nennen. Der Expressionsvektor enthält auch eine
Ribosomenbindungsstelle zur Translationsinitiation und einen
Transkriptionsterminator. Der Vektor kann ferner geeignete
Sequenzen zur Verstärkung der Expression enthalten.
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Darüber hinaus enthalten die Expressionsvektoren
vorzugsweise ein Gen, um eine phänotypische Eigenschaft zur Auswahl
transformierter Wirtzellen bereitzustellen, beispielsweise
eine Dihydrofolatreduktase- oder Neomycinresistenz bei
eukaryontischen Zellkulturen oder beispielsweise eine
Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz bei E. coli.
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Der die oben beschriebene geeignete DNA-Sequenz sowie einen
geeigneten Promotor oder eine geeignete Steuersequenz
enthaltende Vektor kann zur Transformation eines geeigneten
Wirts, so daß der Wirt das Protein exprimieren kann,
verwendet werden. Als repräsentative Beispiele für geeignete Wirte
lassen sich Bakterienzellen, wie E. coli, Salmonella
typhimurium, Pilzzellen, wie Hefe, tierische Zellen, wie
CHO- oder Bowes-Melanomzellen, Pflanzenzellen usw nennen. Die
Auswahl eines geeigneten Wirts wird aufgrund der Lehre in
der vorliegenden Anmeldung als in den Umfang des Wissens
eines Fachmanns auf dem einschlägigen Fachgebiet fallend
angesehen.
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Wie oben erwähnt, kann das die an die ausgewählte Stelle
insertierte geeignete DNA-Sequenz enthaltende
Expressionsvehikel eine DNA- oder Gen-Sequenz enthalten, die nicht Teil
des Gens ist, das für das Protein mit der Fähigkeit zur
Produktion von Antikörpern, die Epitope des (der) genannten
M. hyo.-Antigens (Antigene) erkennt, kodiert. Beispielsweise
kann die gewünschte DNA-Sequenz im selben Leserahmen mit
einer DNA-Sequenz fusioniert werden, die die Expression
unterstützt oder eine Reinigung verbessert oder eine Expression
des geeigneten Proteins zuläßt oder die Immunogenität
erhöht.
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Bei der Suche nach der Entwicklung eines Impfstoffs könnten
neutralisierende oder schützende Antikörper auf
diskontinuierliche, konformationsabhängige Epitope des
nativen Antigens gezielt bzw. gerichtet werden. Man muß folglich
bedenken, ob das aus dem rekombinanten Expressionssystem
erhaltene Protein eine dreidimensionale Struktur
(Konformation) aufweist, die sich im wesentlichen von der
des ursprünglichen Proteinmoleküls in seiner natürlichen
Umgebung unterscheidet. So kann man in Abhängigkeit von den
immunogenen Eigenschaften der isolierten Proteine genötigt
sein, es wieder in die natürliche Form zu bringen, um die
geeignete Molekülkonformation wiederherzustellen. Zahlreiche
Verfahren zur Renaturierung der Proteine finden sich in der
wissenschaftlichen Literatur. Sie umfassen: 1) eine
Denaturierung (Entfaltung) von ungeeignet gefalteten Proteinen
unter Verwendung von Mitteln, wie alkalischen Stoffen,
chaotropen Verbindungen (chaotropers), organischen
Lösungsmitteln und ionischen Detergenzien, gefolgt von einer durch
Verdünnung, Dialyse oder pH-Werteinstellung zur Entfernung
des Denaturierungsmittels erreichten Renaturierungsstufe und
2) Wiederaufbau der Proteine zu einer Lipidbischicht oder
einem Liposom, um abermals eine meinbranartige Umgebung für
das immunogene Protein zu erzeugen.
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Wie oben ausgeführt, kann in einigen Fällen das exprimierte
Protein, auch wenn die in dem Kloniervehikel enthaltene DNA-
Sequenz für ein spezifisches Antigen kodiert, lediglich ein
Fragment eines derartigen Antigens sein. Beispielsweise ist
bei der Verwendung von E. coli als Wirtorganismus das Codon
TGA ein Stopcodon für E. coli, wodurch, wenn die DNA-Sequenz
im Kloniervehikel das Codon (TGA) für die Aminosäure
Tryptophan umfaßt, ein derartiges Codon in E. coli als Stopcodon
interpretiert wird, wodurch das gesamte Antigen nicht
exprimiert werden kann.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird
ein Expressionsvehikel bereitgestellt, das (a) mindestens
eine DNA-Sequenz für ein Mycoplasma-Protein, das mindestens
ein Codon für eine Aminosäure eines derartigen Proteins
beinhaltet, das als Stopcodon durch einen mit dem
Expressionsvehikel zu transformierenden Wirtorganismus erkannt
wird, und (b) mindestens eine DNA-Sequenz mit Kodierung für
eine t-RNA, die an das Stopcodon im zu transformierenden
Wirtorganismus bindet und in das naszierende
Mycoplasma-Protein eine Aminosäure insertiert, wodurch eine vorzeitige
Beendigung der Proteinsynthese verhindert wird, umfaßt.
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Die t-RNA, deren DNA-Sequenz in einem Expressionsvehikel
enthalten ist, kann eine t-RNA sein, die dieselbe
Aminosäure, die durch das fragliche Codon in Mycoplasma kodiert
wird, insertiert, oder eine t-RNA, die eine unterschiedliche
Aminosäure insertiert, sein.
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Beispielsweise kann die weitere DNA-Sequenz für eine t-RNA
trp kodieren, die an das Stopcodon im transformierten Wirt
bindet und die Aminosäure Tryptophan in das zu
synthetisierende Mycoplasma-Protein insertiert.
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Andererseits kann die weitere DNA-Sequenz für eine t-RNA
kodieren, die an das Stopcodon im transformierten Wirt bindet
und die Aminosäure Tryptophan im exprimierten Protein durch
eine unterschiedliche Aminosäure, bei der es sich
vorzugsweise um Tyrosin, Phenylalanin oder Isoleucin handelt,
ersetzt.
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Somit führt beispielsweise die Verwendung von weiterer DNA
im Expressionsvehikel mit Kodierung für ein trpT-Gen,
beispielsweise trpT 176 oder trpT 178, die im Wirtorganismus
für eine t-RNA trp kodiert, die an das TGA-Stopcodon bindet,
zu einer Insertion von Tryptophan und somit Verhinderung
einer vorzeitigen Beendigung eines Mycoplasma-Proteins, das
das Codon TGA (das für die Aminosäure Tryptophan in
Mycoplasma kodiert) umfaßt, wobei das exprimierte rekombinante
Mysoplasma-Protein das durch ein derartiges TGA-Codon
kodierte Tryptophan umfaßt.
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Wenn die weitere DNA für eine Variantenform einer t-RNA für
eine von Tryptophan verschiedene Aminosäure kodiert,
beispielsweise ein tyr t-RNA-Gen oder ein Ile t-RNA-Gen oder
ein phet-Gen, das an das TGA-Codon binden und Tyrosin bzw.
Isoleucin bzw. Phenylalanin insertieren würde, ist im
exprimierten Mycoplasma-Protein das normalerweise im in
Mycodlasma synthetisierten Protein vorhandene Tryptophan durch eine
der t-RNA, die durch die weitere DNA kodiert wird,
entsprechende Aminosäure ersetzt.
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Gemäß einer Ausführungsform kann ein Kloniervehikel, das zur
Transformation eines Organismus, der das Codon TGA als Stop
codon erkennt (beispielsweise E. coli), verwendet werden
soll, (neben der DNA-Sequenz mit Kodierung für ein
gewünschtes M. hyo.-Protein mit einem TGA-Codon als Teil der
DNA-Sequenz) eine weitere DNA-Sequenz enthalten, die für eine t-
RNA kodiert, die im Wirtorganismus an das Codon TGA bindet
und Tryptophan in die M. hyo.-Proteinkette, die im
transformierten Organismus gebildet wird, insertiert. Beispielsweise
kann eine DNA-Sequenz mit Kodierung für das trpt176-Gen in
das Kloniervehikel mit einer DNA-Sequenz mit einem
TGA-Codon, wobei die DNA-Sequenz für ein gewünschtes M.
hyo.-Protein kodiert, insertiert werden. Die Verwendung eines der
artigen Kloniervehikels in E. coli führt zur Expression
eines gewünschten M. hyo.-Proteins, das Tryptophan umfaßt. So
kann beispielsweise, wie in Beispiel 3 dargestellt, das 75,4
kda (große) M. hyo.-Antigen in E. coli durch Transformieren
von E. coli mit einem Kloniervehikel, das eine DNA-Sequenz
mit Kodierung für das 74,5 kDa M. hyo.-Antigen und eine DNA-
Sequenz mit Kodierung für das trpt176-Gen umfaßt, exprimiert
werden. Wie in Beispiel 1 dargestellt, führt eine
Transformation von E. coli mit einem Kloniervehikel, das eine DNA-
Sequenz mit Kodierung für das 74,5 kDa M. hyo.-Antigen, aber
keine DNA-Sequenz mit Kodierung für das trpt176-Gen umfaßt,
zur Expression eines Fragments des 74,5 koa M.
hyo.-Antigens.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird
ein Expressionsvehikel bereitgestellt, das mindestens eine
DNA-Sequenz für ein Mycoplasma-Protein umfaßt, wobei die
mindestens eine DNA-Sequenz aus mindestens einer DNA-Sequenz
für ein Mycoplasma-Protein gebildet worden ist, die
mindestens ein Codon für eine Aminosäure eines derartigen
Proteins umfaßt, das durch einen mit dem Expressionsvehikel zu
transformierenden Wirtorganismus als Stopcodon erkannt wird,
wobei das mindestens eine Stopcodon zu einem anderen Codon
mit Kodierung für die genannte Aminosäure mutiert worden ist
und wobei das andere Codon durch den Wirtorganismus nicht
als Stopcodon erkannt wird. Durch die Mutation des
mindestens einen Stopcodons zu einem anderen Codon, das durch
den Wirtorganismus nicht als Stopcodon erkannt wird, wird
eine vorzeitige Beendigung der Proteinsynthese verhindert.
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Beispielsweise wird die Aminosäure in der Position 211 des
74,5 kDa Antigens durch TGA kodiert, das normalerweise für
Tryptophan kodiert, jedoch auch durch E. coli als Stopcodon
erkannt wird. Ein das TGA-Codon enthaltendes Oligonucleotid
kann durch Mutagenese (beispielsweise stellengerichtete
Mutagenese) so verändert werden, daß das TGA-Codon zu TGG,
das auch für Tryptophan kodiert, verändert wird. Die
Oligonucleotidsequenz wird anschließend in dem Teil der DNA-
Sequenz des Gens des 74,5 kDa Antigens, der das
entsprechende TGA-Codon umfaßt, substituiert. Auf diese Weise kann ein
Expressionsvehikel hergestellt werden, das das die
vollständige Länge aufweisende 74,5 kDa Antigen ohne eine weitere
DNA-Sequenz mit Kodierung für eine t-RNA, die an das
TGA-Codon im Wirtorganismus bindet, exprimiert.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird
ein Expressionsvehikel bereitgestellt, das mindestens eine
DNA-Sequenz mit Kodierung für mindestens ein
Mycoplasma-Protein umfaßt, wobei die mindestens eine DNA-Sequenz aus
mindestens einer DNA-Sequenz gebildet worden ist, die
mindestens ein Codon mit Kodierung für eine erste Aminosäure
eines derartigen Proteins aufweist, wobei das mindestens eine
Codon zu mindestens einem Codon oder zu Codons mit Kodierung
für eine Aminosäure oder Aminosäuren, die sich von der
ersten Aminosäure unterscheiden, mutiert worden ist. Die DNA-
Sequenz eines derartigen Expressionsvehikels kann ferner ein
Codon oder Codons umfassen, die durch Mutieren eines Codons
oder von Codons für eine Aminosäure, das (die) als Stopcodon
durch den zu transformierenden Wirtorganismus erkannt wird
(werden), zu einem Codon für die Aminosäure, das nicht als
Stopcodon erkannt wird, gebildet wurden. Andererseits kann
ein derartiges Expressionsvehikel neben der oben
beschriebenen mindestens einen DNA-Sequenz mindestens eine DNA-Sequenz
mit Kodierung für eine t-RNA umfassen, die an ein Stopcodon
im zu transformierenden Wirtorganismus bindet, wenn ein
derartiges Stopcodon vorhanden ist, und in das naszierende
Mycoplasma-Protein eine Aminosäure insertiert, wodurch die
Beendigung der Proteinsynthese verhindert wird.
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Ein Beispiel für eine derartige rekombinante Variante ist
die r116-Variante der 74,5 kDa Antigens, die durch E. coli
gemäß der im folgenden dargestellten Beschreibung exprimiert
werden kann.
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Zwischen dem 74,5 kDa Antigen und dem E. coli-dnaK-Protein
wurde eine umfangreiche Sequenzhomologie festgestellt. Zwei
erwähnenswerte Unterschiede in den Aminotermini bestehen
darin, daß die Valinreste in den Positionen 17 und 27 des
74,5 kDa M. hyopneumoniae-Antigens, bezogen auf das E.
colidnaK-Protein, signifikant den vorausgesagten
T-Zellen-Erkennungscharakter dieser Bereiche des Antigens verringern.
Derartige Proteindomänen stehen mit der wirksamen Übergabe
(presentation) des Antigens an das Immunsystem in
Verbindung. Durch die Verwendung einer stellengerichteten
Mutagenese können die Valinreste in den Positionen 17 und 27 durch
Cystein bzw. Arginin ersetzt werden. Diese beiden
Veränderungen stellen die beiden Regionen der vorausgesagten
amphipatischen Helizität, die in dem E. coli-dnaK-Protein
vorhanden sind, wieder her. Ein Gen oder Gene für ein
Denvat, das die beiden Aminosäurerestsubstitutionen enthält,
kann in einen E. coli-Expressionsvektor transferiert werden.
Ein Beispiel für ein derartiges exprimiertes rekombinantes
Protein ist als die r116-Variante des 74,5 kDa M.
hyopneumoniae-Antigens gemäß der folgenden Beschreibung bekannt.
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Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden
Beispiele weiter veranschaulicht. Der Umfang der vorliegenden
Erfindung wird hierdurch jedoch nicht beschränkt. In den
Beispielen erfolgten - sofern nicht anders angegeben - die
Reinigungen, Verdauungen und Ligationen gemäß der Beschreibung
von Maniatis und Mitarbeitern, Cold Spring Harbor Laboratory
(1982) in "Molecular doning, a laboratory manual". In den
folgenden Beispielen erfolgten - sofern nicht anders
angegeben - die Transformationen nach dem Vorgehen von Cohen und
Mitarbeitern, PNAS 69 2110 (1973).
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Sofern nicht anders angegeben, wurden die in den folgenden
Beispielen verwendeten M. hyo.-Antigene von dem in der am
28. September 1988 veröffentlichten EP-A-0 283 840
beschriebenen M. hyo. erhalten.
Beispiel 1: 74,5 kDa M. hyo.-Antigen
Herstellung von M. hyopneumoniae-DNA
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Der Stamm P-57223 (erhalten von Dr. Charles Armstrong,
Purdue University) wurde in 1 l Friis-Medium zu einer Dichte
von etwa 10&sup9; bis 10¹&sup0; farbändernden Einheiten pro ml
gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in
2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert,
wodurch ein Gesamtvolumen von 3,25 ml erhalten wurde. Die
Suspension wurde anschließend mit einer Lösung aus 24,53 g
Cäsiumchlorid in 19,75 ml 10 mmol Tris eines pH-Werts von 8,0,
1 mmol EDTA vermischt, worauf 1,53 10 mg/ml Ethidiumbromid
zugegeben wurden. Diese Mischung wurde mit einer Lösung aus
3,87 g Cäsiumchlorid in 2,15 ml 10 mmol Tris eines pH-Werts
von 8,0, 1 mmol EDTA, 8,9% Sarkosyl vermischt. Die erhaltene
Suspension wurde 10 min bei 65ºC inkubiert, um eine
vollständige Lyse der Zellen zu erreichen. Die DNA wurde durch
Gleichgewichtsschwebedichtezentrifugation in einem Sorvall-
TV850-Rotor 18 h bei 43.000/min abgetrennt und mit einer 18
Gauge-Nadel entnommen. Diese DNA wurde zwei weiteren
Schwebedichtezentrifugationen in einem Sorvall-TV865-Rotor
während 7 bzw. 18 h bei 55.000/min unterzogen, wobei jedesmal
die Bande der genomischen DNA mit einer 18 Gauge-Nadel
entfemt wurde. Die erhaltene DNA-Lösung wurde mit mit
Cäsiumchlorid gesättigtem Isopropanol extrahiert, um
Ethidiumbromid zu entfernen, worauf ausgiebig gegen 10 mmol Tris
eines pH-Werts von 8,0, 1 mmol EDTA dialysiert wurde, um das
Isopropanol und Cäsiumchlorid zu entfernen.
Herstellung der genomischen Bibliothek
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Eine präparative Verdauung von 200 µg genomischer DNA von
Mycoplasma hyopneumoniae P-57223 erfolgte unter Verwendung
von 200 Einheiten EcoRI in einem Gesamtvolumen von 1 ml,
wobei nach G min, 25 min, 42 min und 63 min 250 µl Aliquote
entfernt wurden.
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Die vier präparativen Proben der teilweise verdauten
Mycoplasma-DNA wurden anschließend vereinigt (200 µg) und auf
einen exponentiellen Saccharosegradienten aufgetragen. Der
Gradient wurde in einem Sorvall-AH627-Rotor 21 h bei 15ºC
und 26.000/min zentrifugiert.
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Der Gradient wurde anschließend langsam vom Boden her durch
Sammeln von 15 Tropfen-Fraktionen (insgesamt 90 Fraktionen)
fraktioniert. 20 µl einer jeden Fraktion wurden anschließend
auf einem 1% Agarosegel gemäß der obigen Beschreibung
laufengelassen. Die DNA-Fragmente von weniger als 18 kbp und
mehr als 15 kbp enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt
(Fraktionen 32 bis 40) und gegen TE (10 mmol Tris.HCl eines
pH-Werts von 7,5, 1 mmol EDTA eines pH-Werts von 8,0) zur
Entfernung der Saccharose dialysiert. Die DNA (3,5 ml) wurde
anschließend mit Ethanol gefällt und auf etwa 15 µl (1
mg/ml) resuspendiert und bei -20ºC aufbewahrt.
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EcoRI-Arme des Bakteriophagen lamda-dash wurden von Vector
doning Systems (StrataGene) erhalten und in einer
Konzentration von 200 µg/ml mit Mycoplasma-Target-DNA in einer
Konzentration von 25 µg/ml in einem Gesamtvolumen von 10 µl
unter Verwendung von T&sub4;-Ligase (Boehringer GmbH) in einer
Konzentration von 100 Einheiten/ml ligiert. Die Ligations
reaktion wurde bei Raumtemperatur während 2 h inkubiert. 4
µl der Ligation wurden anschließend in lambda-Teilchen unter
Verwendung des in-vitro-Packungskits Gigpack (Stratagene)
gepackt. Die Phagen wurden anschließend auf einem E. coli-
Stamm P2392 (Stratagene) titriert, wobei festgestellt wurde,
daß es 7,75 x 10&sup5; pfu/ml (3,1 x 10&sup5; pfu/µg lambda-dash)
waren.
Antiserum:
1. Kaninchenantiserum:
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Ein New-Zealand-White-Kaninchen wurde mit etwa 10¹¹
farbändernden Einheiten des M. hyopneumoniae-Stamms J (ATCC 25934)
in vollständigem Freund'schem Adjuvans (Sigma, St. Louis)
immunisiert. Eine Verstärkungsinjektion desselben Antigens
in unvollständigem Freund'schem Adjuvans (Sigma) wurde 2
Wochen nach der ersten Injektion verabreicht. Es zeigte sich
durch 1-D-Gel-Western-Blot-Analyse, daß das hyperimmune
Serum mit mehr als 30 Mycoplasmaproteinen reagiert. Ferner
zeigte sich durch 2-D-Western-Blot-Analyse, daß es mit zwei
Proteinen von etwa 74,5 kDa reagiert.
2. Mäuseantiseren:
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Monospezifisches Serum wurde wie oben beschrieben
hergestellt, mit der Ausnahme, daß DBA/2 Mäuse mit etwa 10 µg
eines elektrophoretisch reinen 74,5 kDa Antigens vom Stamm P-
57223 (Dr. C. Armstrong, Purdue University), gefolgt von
einer gleichen Dosis Verstärkungsimmunisierung, immunisiert
wurden. Das 74,5 kDa Antigen wurde, wie in der am 28.
September 1988 veröffentlichten EP-A-0 283 840 beschrieben,
erhalten. Es zeigte sich durch 1-D-Western-Blot-Analyse, daß
die hyperimmunen Seren mit einem einzelnen Mycoplasma-74,5-
kda-Protein reagieren. Ferner zeigte sich durch
2-D-Gel-Western-Blot-Analyse, daß sie mit zwei 74,5 Proteinen reagie
ren. Das 74,5 kDa Antigen wurde gemäß der EP-A-0 284 840
hergestellt.
3. Schweineantiseren:
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Purdue-Minischweine wurden mit 100 µg eines
elektrophoretisch reinen 74,5 kDa Antigens in unvollständigem
Freund'schem Adjuvans (Sigma) immunisiert. Eine identische
Verstärkungsinjektion wurde 2 Wochen nach der ersten
Injektion verabreicht. Es zeigte sich durch 1-D- und
2-D-Gel-Western-Blot-Analyse, daß die hyperimmunen Seren mit einem
einzelnen Mycoplasma-74,5-kDa-Protein reagieren. Dieses
Protein ist mit einem der beiden durch das hyperimmune
Mausserum erkannten Protein identisch. Diesen Schweinen wurde
durch die Impfung eine Möglichkeit zum Schutz vor
Mycoplasmapneumonie gegeben.
Screenen der Bibliothek
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Die Bibliothek wurde mit Kaninchen-anti-M.
hyopneumoniae-Serum (das immunologisch das 74,5 kDa Antigen neben anderen
Mycoplasmaoberflächenproteinen erkennt) gescreent. Etwa 200
Rekombinanden wurden durch das anfängliche Screenen
ausgewählt, da sie immunologisch mit dem Kaninchenantiserum
reagierten. Diese positiven Rekombinanden wurden nachfolgend
mit Mäuse-anti-74,5-kDa-Serum, das gegen elektrophoretisch
gereinigtes Antigen erzeugt worden war, gescreent. Zehn
Rekombinanden wurden ausgewählt, da sie Material in E. coli
lieferten, das immunologisch mit dem monospezifischen Serum
kreuzreagierte.
Klonieren des Gens für das 74,5 dDa Antigen
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Basierend auf einer teilweisen Aminosäuresequenz des 74,5
kDa Antigens wurden die im folgenden dargestellten
Oligonucleotidfamilien (COD 558 und COD 559) synthetisiert.
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DNA aus den 10 immunopositiven Rekombinanden wurde
hergestellt, mit EcoRI verdaut, durch Gelelektrophorese
analysiert, wobei jeweils gezeigt wurde, daß Teile des
M.hyopneumoniae-Genoms, bestehend aus mehreren
EcoRI-Restriktionsfragmenten enthalten sind. Die Hybridisierbedingungen
waren die folgenden:
Hybridisierung:
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6 X NET
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5 X Denhardts
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2 X 10&sup6; cpm "kinasierte" Sonde (kinased probe)
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37ºC
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18 h.
Waschen:
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6 X NET
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0,1% SDS
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3 X bei Raumtemperatur
-
2 X bei 37ºC.
6 X NET:
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1 mol NaCl
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90 mmol Tris eines pH-Werts von 7,6
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6 mmol EDTA
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Durch Southern-Blot-Analyse wurde gezeigt, daß sowohl COD
558 als auch COD 559 mit einem 7800 Basenpaare (7,8 kb)
EcoRI-Restriktionsfragment, das in 6 der 10 Rekombinanden
vorhanden ist, hybridisiert. Zum Subklonieren dieses
Fragments wurde eine das 7,8 kB Fragment (neben anderen
benachbarten Fragmenten) enthaltende Rekombinande als lambda
5-5-59 bezeichnet, ihre DNA hergestellt und mit EcoRI
verdaut, an mit EcoRI verdautes pWHAL4B ligiert und in den
E. coli-Stamm JM83 transformiert. Ein Transformant wurde als
pMYCO16 bezeichnet. Seine DNA wurde hergestellt und mit
einer Reihe von verschiedenen Restriktionsendonucleasen zur
Herleitung der in Fig. 1 dargestellten Restriktionskarte
verdaut.
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pWHA 148 wurde Insertieren von synthetischen
Oligonucleotiden in die HindIII-Stelle von pUC18 hergestellt. Die
aminoterminale Kodiersequenz des X-vervollständigenden Peptids
von B-Galactosidase ist in Fig. 3 dargestellt und enthält 8
weitere Restriktionsstellen gegenüber dem Eltern-pUC18. Das
Oligonudeotidinsert in pUC18 ist in Fig. 3 zwischen der
Sph1- und HindIII-Stelle dargestellt.
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Durch Southern-Blot-Analyse wurde gezeigt, daß sowohl COD
558 als auch COD 559 mit dem 0,6 kb
AccI-AsuII-Restriktionsfragment von pMYCO16 hybridisieren. Eine DNA-Sequenzanalyse
des 0,6 kb Fragments zeigte: 1) Es enthält einen
Homologiebereich zu COD 558 und COD 559 und 2) alle durch die DNA-
Sequenz des Fragments vorausgesagten Aminosäuren mit
Ausnahme von 3 passen zu der für das 74,5 kDa Antigen
bestimmten Proteinsequenz, wie im folgenden dargestellt ist.
Proteinsequenz:
Klonsequenz:
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Eine nachfolgende abermalige Analyse der tatsächlichen
Aminosäuresequenz zeigte, daß die drei nicht zusammenpassenden
Aminosäuren möglicherweise auf eine zweifelhafte
Aminosäureidentifizierung zurückzuführen sind.
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Auf der Restriktionskarte von pMYCO16 (Fig. 1) beginnt das
Gen mit dem 0,6 kb AccI-AsuII-Restriktionsfragment,
erstreckt sich in Uhrzeigerrichtung im 0,4 kb
AsuII-ClaI-Fragment, dem 1,2 kb ClaI-ClaI-Fragment und dem 1,4 kb ClaI-
HindIII-Fragment und endet nicht weit von der HindIII-
Stelle.
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Die DNA-Aminosäuresequenz des 74,5 kDa Gens ist in Fig. 2
dargestellt.
Expression des M. hyopneumoniae-74,5-kDa-Antigengens in E.
coli
-
DNA aus pMYCO16 wurde in den E. coli-Stamm CY15000
transformiert. Ein Transformant wurde ausgewählt, in L-Brühe bei
37ºC auf einen OD&sub5;&sub5;&sub0;-Wert von 2 wachsengelassen, worauf die
Zellen durch Zentrifugation geerntet wurden. Die Zellen
wurden durch Resuspendieren in M9-Puffer von kontaminierenden
Mediumkomponenten freigewaschen und abermals durch
Zentrifugation geerntet. Das erhaltene Zellpellet wurde in einem
Fünfzehntel des ursprünglichen Kulturvolumens in einer
Lösung aus 0,5 mg/ml Henneneiweißlysozym in 25 mmol Tris eines
pH-Werts von 8,0, 10 mmol EDTA resuspendiert, 10 min bei
25ºC inkubiert und 15 s bei 4ºC beschallt. Ein Teil des
erhaltenen Lysats wurde einer Polyacrylamidgelelektrophorese
unterzogen, wobei ein neues 43 kDa Protein identifiziert
wurde.
-
Durch Western-Blot-Analyse wurde gezeigt, daß das pMYCO16-
43-kDa-Expressionsprodukt mit dem gegen das 74,5-kDa-M.
hyopneumoniae-Antigen erzeugten Mäuseantiserum reagiert.
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Durch Western-Blot-Analyse zeigte sich, daß das pMYCO16-43-
kDa-Expressionsprodukt mit den gegen das 74,5-kDa-M.
hyopneumoniae-Antigen erzeugten Schweineantiseren reagiert.
Teilweise Reinigung des durch E. coli produzierten 74,5 kD
Antigenfragments
-
Ein E. coli-Stamm CY15000-Transformant wurde ausgewählt, in
1 l L-Brühe bei 37ºC auf ein OD&sub5;&sub5;&sub0;-Wert von 2
wachsengelassen, worauf die Zellen durch Zentrifugation geerntet wurden.
Die Zellen wurden durch Resuspendieren in M9-Puffer von
kontaminierenden Mediumkomponenten freigewaschen und abermals
durch Zentrifugation geerntet. Das erhaltene Zellpellet
wurde in 20 ml einer Lösung aus 0,5 mg/ml Henneneiweißlysozym
in 25 mmol Tris eines pH-Werts von 8,0, 10 mmol EDTA
resuspendiert, 10 min bei 25ºC inkubiert, in zwei Aliquote
aufgetrennt und jeweils 60 s bei 0ºC beschallt. Das erhaltene
Lysat wurde von unlöslichen Bruchstücken durch Zentrifugation
während 10 min bei 13.000 g und 4ºC geklärt. Nach Zugabe
einer ausreichenden Menge Ammoniumsulfat (4,52 g), um den
Überstand auf eine 40%ige Sättigung zu bringen, wurde das
unlösliche Protein durch Zentrifugation entfernt. Nach
anschließender ausreichender Zugabe von Ammoniumsulfat (1,2
g), um den 40%igen Überstand auf eine 50%ige Sättigung zu
bringen, wurde das unlösliche Protein durch Zentrifugation
geerntet und anschließend einer
Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen. Durch Western-Blot-Analyse (unter
Verwendung des wie oben beschrieben hergestellten
Miniaturschweineserums> wurde gezeigt, daß das
43-kDa-pMYCO16-Expressionsprodukt enthalten ist. Die angereicherte Antigenfraktion
wurde vor ihrer Verwendung als Impfstoff gegen PBS
dialysiert.
Beispiel 2
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Expression des die vollständige Länge aufweisenden M. hyo.-
74,5-kDa-Antigens in E. coli:
pMYCO16-DNA (Fig. 1) wurde mit AccI verdaut, mit
Mungobohnennudease zur Entfernung der einzelsträngigen
AccI-Schwänze behandelt, zur Deletion des 1,9 kb AccI-Fragments vor dem
74,5-kDa-Antigengen religiert und in den E. coli-Stamm JM83
transformiert. Ein Transformant wurde als pMYCO29
bezeichnet. Seine DNA wurde mit einer Reihe von verschiedenen
Restriktionsendonudeasen zur Herleitung der in Fig. 4
dargestellten Restriktionskarte verdaut.
-
pMYCO29 wurde einer DNA-Sequenzanalyse unterzogen. Dabei
zeigte sich, daß an der Ligationsverbindung eine spontane
Deletion stattgefunden hatte. Dabei wurden zwei Basen
deletiert und die PstI-Stelle beibehalten, wie im folgenden
dargestellt ist (lediglich ein Teil der 5'-3'-Stränge ist
dargestellt)
erwartet:
gefunden:
Konstruktion von pMYCO31 und Expression des
74,5-kDa-Antigenfragments
-
Da das Mycoplasmainsert von pMYCO29 von dem Lac-Promotor von
pWHA148 wegorientiert ist, war es wünschenswert, das Gen in
einen anderen Expressionsvektor pUC9 zu insertieren. Die
Zwei-Basen-Deletion gewährleistete, daß das Gen für das
74,5-kDa-Antigen in denselben Leserahmen wie das beta-
Galactosidasegen des E. coli-Vektors pUC9 eingesetzt werden
kann.
-
Um diese Konstruktion durchzuführen, wurde pMYCO29-DNA mit
PstI und EcoRI verdaut, das PstI-EcoRI-Fragment, das die
gesamte 74,5-kDa-Kodiersequenz enthielt, gereinigt, an den mit
PstI und EcoRI verdauten Vektor pUC9 ligiert und in den E.
coli-Stamm JM83 transformiert. Ein Transformant wurde als
pMYCO31 bezeichnet (Fig. 5). Seine DNA wurde hergestellt und
durch das Transformationsvorgehen von Beispiel 1 in den E.
coli-Stamm CY15000 transformiert.
Konstruktion von pMYCO32
-
Das Plasmid pCAM101 wurde von James Curran an der University
of Colorado, Boulder, Colorado als günstige Quelle des in
Fig. 6 dargestellten trpT176-Gens bezogen. Die DNA aus
pCAM101 wurde mit EcoRI verdaut, das 0,3 kb EcoRI-Fragment,
das das trpT176-Gen enthält, gereinigt, an mit EcoRI
verdauten pMYC031 ligiert und in den E. coli-Stamm CY15000
transformiert. Ein Transformant wurde als pMYCO32 bezeichnet.
Seine Restriktionskarte ist in Fig. 7 dargestellt.
Expression des M. hyopneumoniae 74,5 kDa Antigens in E. coli
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Ein CY15000 (pMYCO32)-Transformant wurde ausgewählt, in L-
Brühe wachsengelassen, wie oben beschrieben ein Lysat
hergestellt und ein Teil einer Polyacrylamidgelelektrophorese
unterzogen. Durch Gelelektrophorese wurden neue 75-kDa- und
43-kDa-Proteine identifiziert. Sie bildeten etwa 5% bzw.
0,1% des gesamten E. coli-Proteins. Durch
Western-Blot-Analyse zeigte sich, daß das pMYCO32-75-kDa-Protein mit den
zuvor beschriebenen, gegen das 74,5-kDa-M.
hyopneumoniae-Antigen erzeugten Schweineantiseren reagiert.
Beispiel 3
Verwendung der rekombinanten Form des Mycoplasma
hyodneumoniae 74.5 kDa Antigens als Impfstoff
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Ein CY15000 (pMYCO32)-Transformant von Beispiel 2 wurde
ausgewählt, in M-9 Minimalmedium in einem 14 l
Chemap-Gärbottich auf eine Zelldichte von 110 O.D. 600 wachsengelassen,
worauf 120 g (Naßgewicht) Zellen durch Zentrifugation aus
500 ml geerntet wurden. Eine Suspension wurde aus 2,3 g
Zellen pro 10 ml PBS, das 12 mmol EDTA, 0,5 mg/ml Lysozym
enthielt> hergestellt. Die Suspension wurde 15 min bei 25ºC
inkubiert, 2 min in 30 s Serien auf Eis beschallt, 10 min bei
4ºC und 13.000 g zentrifugiert, worauf die lösliche Fraktion
als Produkt zurückbehalten wurde. Ein Teil des Produkts
wurde einer Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen. Die
rekombinante Form des 74,5 kDa Antigens machte etwa 25% des
löslichen Proteins aus, wobei die Dosierungen, bezogen auf
die Menge des 74,5 kDa Antigens in der Zubereitung, in PBS
in einer Menge von 200 und 1000 µg pro Dosis zubereitet und
auf Eis mit gleichen Volumina von unvollständigem
Freund'schem Adjuvans (Sigma) unmittelbar vor Verabreichung
an Tiere emulgiert wurden.
Beispiel 4: Exoression der r116-Variante des M.
hyopneumoniae 74,5 kDa Antigens in der E. coli-
Konstruktion von M13MYCO102
-
Das Plasmid pMYCO31 wurde als Quelle des Gens des 74,5 kDa
Antigens verwendet (vgl. Beispiel 2, Fig. 5). M13mp 18 RF
DNA (Bethesda Research Labs), ein 7253 Basenpaare großer
Phagenvektor (Fig. 8), wurde mit HindIII (Boehringer
Mannheim) und PstI (Bethesda Research Labs) verdaut, mit
T4-Ligase (Boehringer Mannheim) an mit HindIII, PstI verdauten
pMYCO31 ligiert und in den E. coli-Stamm JM103
transformiert. Die DNA aus einem Transformanten M13MYCO102 wurde mit
Restriktionsendonucleasen verdaut, um die in Fig. 9
dargestellte Restriktionskarte herzuleiten.
Konstruktion von M13MYCO107
-
Basierend auf der DNA-Sequenz des Gens des 74,5 kDa Antigens
wurde ein 96 Basen langes synthetisches Oligonucleotid COD
639 (vgl. im folgenden) geschaffen, wobei zwei Aminosäuren
im N-Terminus des Antigens durch stellengerichtete
Mutagenese&sub1; basierend auf den Verfahren von Taylor und Mitarbeitern
(1985), Nucl. Acid Res. 13: 8749-8764 und Taylor und
Mitarbeitern (1985), Nucl. Acid Res. 13: 8764-8785, verändert
wurden.
-
Die Mutagenese bei COD 639 verändert Val¹&sup7; zu Cys¹&sup7; unter
Zerstörung einer DdeI-Stelle und verändert Val²&sup7; zu Arg²&sup7;
unter Erzeugung einer ThaI-Stelle. Diese Veränderungen
stellen zwei Regionen der vorausgesagten amphipatischen
Helizität, die in dem E. coli-dnaK-Protein gemäß der obigen
Beschreibung vorhanden sind, wieder her.
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Als Matrize wurde in den in Fig. 10 dargestellten Stufen zur
Erzeugung des rekombinanten Kandidaten mit dem Namen
M13MYCO107 einzelsträngige DNA von M13MYCO102, hergestellt
gemäß K. Nakamaye und F. Eckstein (1986) Nucl. Acid Res.
14:9679-9698 verwendet. Seine DNA wurde hergestellt und mit
ThaI zur Verifizierung einer der erwarteten
Mutationsänderungen verdaut. Wie vorausgesagt, besitzt M13MYCO107
(Fig. 11) eine weitere ThaI-Stelle, die ein 2 kb Fragment in
zwei Fragmente von 0,4 bzw. 1,6 kb umwandelt. Eine
DNA-Sequenzanalyse von M13MYCO107 im Vergleich zu M13MYCO102
bestatigte beide Änderungen und legte die Vermutung nahe, daß
in den 70 Basenpaaren auf beiden Seiten von COD 639 keine
weiteren Veränderungen stattgefunden hatten.
Konstruktion von pMYCO116
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Gereinigte pMYCO32-DNA (vgl. Beispiel 2, Fig. 7) wurde mit
Pflmi (New England Biolabs) verdaut, mit
Kalbsdarmphosphatase
(CIP: Boehringer Mannheim) phosphatiert, mit PstI
(Promega Biotech) und AsuII (New York Biolabs) verdaut und
abermals mit CIP phosphatiert, an mit PstI, AsuII verdauten
M13MYCO107 mit T4-Ligase (Boehringer Mannheim) ligiert und
in den E. coli-Stamm JM83 transformiert. Ein Transformant
wurde als pMYCO116 bezeichnet. Seine DNA wurde gereinigt und
mit HindIII zur Verifizierung einer 2,2-kb-Insertstelle
verdaut. Gereinigte pMYCO116-DNA (vgl. Fig. 12) wurde zur
Transformation des E. coli-Stamms CY15000 verwendet. Eine
gereinigte Kolonie wurde in 100 µg pro ml Ampicillin
enthaltender L-Brühe wachsengelassen. Die Zellen wurden durch
kurze Zentrifugation geerntet, in 8% Saccharose, 0,5% Triton X-
100, 50 mmol EDTA, 10 mmol Tris eines pH-Werts von 8,3 und
0,66 mg/ml Henneneiweißlysozym (HEL: Sigma) resuspendiert
und anschließend kurz auf 100ºC erwärmt. Die Plasmid-DNA aus
dem Überstand wurde mit HindIII zur Verifizierung der
Anwesenheit des geeigneten Inserts verdaut. Aus den ThaI- und
DdeI-Verdauungen wurde die Anwesenheit der neuen ThaI-Stelle
und das Fehlen einer DdeI-Stelle unter Umwandlung von zwei
Fragmenten einer Länge von 0,26 bzw. 0,76 kb zu einem
einzelnen 1,0 kb großen Fragment verifiziert.
Expression des pMYCO116-Produkts
-
Die Zellen von CY15000 (pMYCO116) wurden geerntet,
gewaschen, 15 5 in 25 mmol Tris eines pH-Werts von 8,0, 10 mmol
EDTA und 0,5 mg/ml Henneneiweißlysozym beschallt und
anschließend 10 min zentrifugiert. 2 µl des Überstands
(lösliche Fraktion> wurden auf einem 12% Polyacrylamidgel
elektrophoresiert. pMYCO116 lieferte ein 74,5 kDa Protein, das etwa
10% des löslichen Proteins ausmachte und in der Größe dem
von pMYCO32 gebildeten Protein entsprach.
-
Die lösliche Fraktion aus einer 125 ml Kultur wurde wie
beschrieben hergestellt, worauf das 74,5 kDa Produkt
elektrophoretisch gereinigt wurde. Eine Aminosäuresequenzanalyse
der 31 aminoterminalen Reste bestätigte das konstruierte
Protein und stand mit der Veränderung von Val¹&sup7; zu Cys¹&sup7; im
Einklang. Cystein ist jedoch durch Proteinsequenzanalyse
infolge seines schwachen Signals nicht direkt verifizierbar.
Die Veränderung von Val²&sup7; zu Arg²&sup7; wurde durch Nachweis von
Arginin anstelle von Valin am Rest 27 bestätigt.
Beispiel 5: Herstellung und Verabreichung eines
Imofstoffs
Reinigung des pMYCO32-Produkts zur Verwendung
in einem Impfstoff
-
E. coli CYLSOOO (pMYCO32) wurde in einem mit Kaliumphosphat
gepufferten Minimalmedium in einem 14 l Chemap-Gärbottich
auf eine Zelldichte von 84 O.D. 600 wachsengelassen. 360 g
(Nettogewicht) Zellen wurden aus 4,2 l geerntet. 100 g der
Zellen wurden in 300 ml PBS, das 12 mmol EDTA enthielt,
suspendiert. Das Aufbrechen der Zellen erfolgte mit einem bei 5
bis 8000 psi Zuspeisdruck arbeitenden
Menton-Gaulin-Homogenisator. Bis zu 10 mol EDTA wurden pro 1 Erntematerial zur
Unterstützung der Homogenisierung zugegeben. Das
homogenisierte Material wurde anschließend durch Mikrofiltration
geklärt. 50 ml Filtrat wurden auf eine 100 ml Radialströmungs-
DEAB-Säule appliziert, worauf die Probe und die Säule mit 50
mmol NaPO&sub4; eines pH-Werts von 7,0, 2 mmol EDTA äquilibriert
und die nicht gebundene Fraktion als Produkt zurückbehalten
wurde. Dieses Material wurde steril filtriert. Unmittelbar
vor Verwendung können 100 µg/ml PBS zur Verwendung als
Impfstoff emulgiert werden. Eine Dosiseinheit entspricht 100 µg
des gereinigten Produkts.
Reinigung des DMYCO116-Produkts zur Verwendung in einem
Impfstoff
-
E. coli CY15000 (pMYCO116) wurde in mit Kaliumphosphat
gepuffertem Minimalmedium in einem 14 l Chemap-Gärbottich auf
eine Zelldichte von 84 O.D. 600 wachsengelassen. 360 g
(Naßgewicht) Zellen wurden aus 4,2 l geerntet. 100 g der
Zellen wurden in 300 ml PBS, das 12 mmol EDTA und 0,5 mg/ml
Henneneiweißlysozym enthielt, suspendiert, 15 min bei 25ºC
inkubiert, auf Eis während 2 min in 30sekündigem Serien
beschallt und 10 min bei 13.000 g und 4ºC zentrifugiert. Die
lösliche Fraktion wurde zurückbehalten. Eine
Polyacrylamidgelelektrophorese zeigte, daß das 74,5 kDa Antigen etwa 10%
der löslichen Fraktion oder etwa 2,5 g Produkt pro l
Fermentationskultur ausmachte. 50 ml der löslichen Fraktion wurden
auf eine 100 ml Radialströmungs-DEAE-Säule appliziert,
worauf die Probe und die Säule mit 50 mmol NaPO&sub4; eines pH-
Werts von 7,0, 2 mmol EDTA äquilibriert wurden und die nicht
gebundene Fraktion als Produkt zurückbehalten wurde.
Unmittelbar vor Verwendung können 100 µg Produkt/ml PBS zur
Verwendung als Impfstoff emulgiert werden. Eine Dosiseinheit
entspricht 100 µg des gereinigten Produkts.
Beispiel 6: Mutation des der Aminosäure 211 im 74,5-
kDa-Antigen entsdrechenden TGA-Codons
-
Die Aminosäure Tryptophan in der Position 211 des Gens des
74,5 kDa Antigens (vgl. Fig. 2, Translation des 74,5 kDa
Gens> wird durch TGA kodiert. Untersuchungen der durch
pMYCO31 und pMYCO32 gebildeten Proteine zeigten, daß das
TGA-Codon die Peptidkettenverlängerung in E. coli in
Abwesenheit des trpT176-Suppressors beendet. Es wurde
postuliert, daß eine Veränderung dieses Codons zu TGG durch
invitro-Mutagenese eine Peptidkettenverlängerung an der
Position 211 in Abwesenheit des trpT176-Suppressors erlauben
würde.
-
DNA aus pMYCO32 wurde mit HindIII verdaut, worauf das 2,2
kb Fragment, das das Gen des 74,5 kDa Antigens enthielt, an
den mit HindIII verdauten Vektor pUC9 unter Verwendung von
T4-Ligase ligiert wurde. Anschließend erfolgte eine
Transformation in den E. coli-Stamm JM83. Ein Transformant wurde
als pMYCO56 bezeichnet. Seine Restriktionskarte ist in
Fig. 13 dargestellt. Wie erwartet, liefert pMYCO56 ein
vorzeitig beendetes Fragment des 74 kDa Antigens.
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M13mp18 (Fig. 8) RF-DNA, ein 7253 Basenpaare großer
Phagenvektor, wurde mit HindIII und PstI verdaut, mit Hilfe von T4
Ligase an mit HindIII, PstI verdauten pMYCO31 ligiert und
anschließend in den E. coli-Stamm JM103 transformiert. Die
DNA aus einem Transformanden, M13MYCO102, (Fig. 9) wurde mit
Restriktionsendonucleasen verdaut, um die in Fig. 9
dargestellte Restriktionskarte herzuleiten.
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Basierend auf der DNA-Sequenz des Gens des 74,5 kDa Antigens
wurde ein 36 Basen langes synthetisches Oligonucleotid COD
693 (5. im folgenden) geschafften, bei dem das TGA durch
stellengerichtete Mutagenese gemäß den Verfahren von Taylor
und Mitarbeitern (1985) Nucl. Acid Res. 13:8749-8764 und
Taylor und Mitarbeitern (1985) Nucl. Acid Res. 13:8764-8785
verändert ist.
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Als Matrize in den in Fig. 10 dargestellten Stufen wurde
eine einzelsträngige DNA von M13MYCO102, hergestellt gemäß
K. Nakamaye und P. Eckstein in Nucl. Acid Res. Band 14, S.
9679-9698 (1986), verwendet, mit der Ausnahme, daß das
Oligonucleotid COD 693 lediglich eine Mutation enthält.
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Vier Plaques wurden aufgenommen, ihre DNA hergestellt, wobei
eine DNA-Sequenzanalyse bestätigte, daß jede die gewünschte
Veränderung von TGA nach TGG besaß. Das TGG-Codon kodiert
wie das TGA-Codon für Tryptophan. TGG wird jedoch anders als
TGA durch E. coli nicht als Stopcodon erkannt. Die RFDNA aus
allen vier Phagen wurde vereinigt und als M13MYCO79
bezeichnet. Die Restriktionskarte hiervon erwies sich als mit
M13MYCO102 identisch.
-
Um das normale Gen des 74,5 kDa
Antigens durch sein
TGG-Codongegenstück zu ersetzen, wurde pMYCO56-DNA mit StyI
verdaut, mit Kalbsdarmphosphatase behandelt, an mit StyI
verdauten M13YCO79 unter Verwendung von T4-Ligase ligiert und
in den E. coli-Stamm CY15000 transformiert. Ein Transformant
wurde als pMYCO87 bezeichnet. Seine Restriktionskarte erwies
sich als mit der von pMYCO56 identisch. Wie ein 74,5 kDa
Antigen gewährleistet pMYCO87 eine Peptidkettenverlängerung
an der Position 211 und liefert ein etwa 74 kDa großes
Protein.
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Um die Ampicillinresistenz von pMYCO87 durch eine
Tetracyclinresistenz zu ersetzen, wurde pMYCO87-DNA mit AflIII und
EcoRI verdaut, an das 2,5 kb AflIII-EcoRI-Fragment des
Tetracyclinresistenzkloniervektors pBR322 unter Verwendung von
T4-Ligase ligiert und in den E. coli-Stamm MH1
transformiert.
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Ein Transformant wurde als pMYCO91 (Fig. 14) bezeichnet.
Seine DNA wurde hergestellt und mit Restriktionsenzymen
verdaut, um die im folgenden dargestellte Karte zu erzeugen.
Wie erwartet, liefert pMYCO91 ein etwa 74 kDa großes
Protein. Eine Karte der funktionalen pMYCO91-Bereiche ist in
Fig. 15 dargestellt.
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Es sei darauf hingewiesen, daß sowohl pMYCO87 als auch
pMYCO91 für das 74,5 kDa Antigen in Abwesenheit eines TGA-
Suppressors kodieren.