DE3854213T2 - Analoge der Untereinheit des von rekombinanter DNS abgeleiteten Bordetella-Toxins. - Google Patents
Analoge der Untereinheit des von rekombinanter DNS abgeleiteten Bordetella-Toxins.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Expression auf hohem Niveau von Untereinheitsanalogen von S1, S2, S3, S4, und S5 von Bordetella-Exotoxin in E. coli ohne Gebrauch zu machen von Fusionen mit Teilen von heterologen Proteinen. Genauer gesagt sehen gentechnologisch vorgenommene Modifikationen der Untereinheiten eine Klasse von Bordetella-Toxinanalogen vor, die die Fähigkeit aufweisen, toxinneutralisierende Antikörpertiter hervorzurufen und im wesentlichen frei von reaktogenen Komponenten zu sein.
- Der Begriff Bordetella-Exotoxin kennzeichnet eine Gruppe von Toxinen, die durch die Genome verschiedener Arten von Bordetella, wie z.B. B. pertussis, B. parapertussis und B. bronchiseptica, codiert sind. Andere Begriffe, die gemeinhin verwendet werden, um Bordetella-Exotoxin zu bezeichnen, sind Pertussistoxin ("PTX"), lymphocytosis-promoting factor ("LPF"), und islet-activating Protein ("IAP").
- Keuchhusten bleibt eine Hauptursache von Morbidität und Mortalität von Kindern in vielen Teilen der Welt. Bordetella pertussis-Ganzzellimpfstoffe haben ein wirksames Mittel zum Kontrollieren dieser Krankheit geliefert. Die Verwendung derartiger Impfstoffe, ist jedoch direkt mit schwachen Nebenwirkungen korreliert und zeitweise mit schlimmeren, und gelegentlich tödlichen, neurologischen Vorfällen in Zusammenhang gebracht worden.
- Umfangreiche Bemühungen sind unternommen worden bei einem Versuch, die nachteiligen Nebenwirkungen, von denen man wußte, daß sie mit den derzeitigen Impfstoffen verbunden sind, zu eliminieren. Dies hat zur Herstellung und zum Testen von Zellfreien Impfstoffen geführt, und in der Grundlagenforschung zu einem Versuch, sicherere rekombinante Produkte zu entwickeln. Ein kritischer erster Schritt in Richtung Klonierung und Entwicklung eines von rekombinanter DNA abgeleiteten Impfstoffes bestand darin, das Pertussistoxin-Operon zu sequenzieren und anschließend die Aminosäuresequenzen der einzelnen Untereinheiten herzuleiten (Locht, C. and Keith, J.M., 1986, Science 232: 1258-1264; Locht et al., 1986, Nucl. Acids Res. 14: 3251- 3261; und Nicosia et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4631-4635).
- Nicosia et al. (1987, Infect. Immun., 55: 963-967) zeigte, daß mRNA, die jede der Untereinheiten S1, S2, S3, S4 und S5 von Bordetella pertussis codierte, von den in E. coli klonierten Genen effizient transkribiert werden konnte. Obwohl sie vorgaben, Transkription der polycistronischen nativen Pertussistoxin-Informationen auf hohem Niveau zu zeigen, war die Menge an durch direkte Expression produzierten Proteinen sehr gering oder nicht nachweisbar. Weiterhin waren Fusionsproteine, die nachfolgend synthetisiert wurden, nicht in der Lage, irgendeine neutralisierende oder schützende Immunantwort hervorzurufen.
- Barbieri et al. (1987, Infect. Immun., S5: 1321-1323) zeigte die Expression der S1-Untereinheit als ein Fusionsprotein in E. coli. Dieses Fusionsprotein enthält die ersten sechs Aminosäuren von beta-Galactosidase, fünf Aminosäuren, die durch den pUC18-Polylinker codiert werden, gefolgt von Aminosäuren 2 bis 235 der S1-Untereinheit. Das in geringen Mengen produzierte S1-Fusionsprotein wies nur etwa 25% der ADP-Ribosyltransferaseaktivität des authentischen oder nativen Pertussistoxins auf.
- Locht et al. (Abstract, Modern Approaches to New Vaccines, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, Sept. 9-14, 1986) waren in der Lage, ein Fusionsprotein zu exprimieren, das die Aminosäuren 2 bis 187 der S1-Untereinheit enthielt. Sie sagten voraus, daß das Konstrukt keine toxische Aktivität aufweisen würde, da sie glaubten, daß ihm die mit der ADP-Ribosyltransferase verbundene NAD-Bindungsstelle fehlen würde, jene enzymatische Aktivität, von der geglaubt wurde, daß sie für die Reaktogenität des Toxins verantwortlich sei. Nachfolgende Experimente mit diesem Molekül zeigten, daß diese verkürtzte Form über im wesentlichen unveränderte Enzymaktivität verfügte. Keine der Untereinheiten oder Untereinheitsanalogen des Standes der Technik weisen die Fähigkeit auf, toxinneutralisierende Antikörpertiter hervorzurufen und im wesentlichen von mit Reaktogenität verbundener Enzymaktivität frei zu sein.
- Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Reihenfolge der Cistrons des PTX-Operons (Stand der Technik Locht und Keith, siehe oben) Die mit S1, S2, S4, S5 und S3 bezeichneten Regionen zeigen die vorgeschlagenen offenen Leserahmen für jede dieser PTX-Untereinheiten an. Der ausgefüllte Bereich unmittelbar vor jedem Cistron bezeichnet die mutmaßliche Signalsequenz. Die unmittelbar stromabwärts eines jeden cistronischen Elements gelegene Restriktionsenzymstelle zeigt die stromabwärts gelegene Restriktionsstelle an, die beim Subklonieren desjenigen Cistrons in den Expressionsvektor verwendet wurde. Die Restriktionsenzymstelle, die sich gerade noch in jeder Signalsequenzregion befand, wurde als die stromaufwärts gelegene Restiktionsstelle für die Subklonierung des Cistrons in seiner ganzen Länge in den Expressionsvektor verwendet mit einem geeigneten Oligodeoxynucleotidlinker, um die unreife PTX-Untereinheit mit ihrer intakten Signalsequenz herzustellen. Die gerade noch in jedem offenen Leserahmen einer reifen PTX-Untereinheit gelegene Restriktionsenzymstelle wurde zusammen mit einem geeigneten Oligodeoxynucleotidlinker als die stromaufwärts gelegene Restriktionsstelle für das Subklonieren des Cistrons ohne seine codierte Signalsequenz verwendet, um eine Methionyl-reife PTX-Untereinheit herzustellen.
- Fig. 2 stellt ein SDS-Polyacrylamidgel und Western-Blot rekombinanter PTX-Untereinheiten dar. Tafel A links zeigt ein mit Coomassie Brilliant Blue gefärbtes Gel der in meßbaren Mengen produzierten rekombinanten PTX-Untereinheiten; Tafel A rechts ist ein Western-Blot eines Parallelgels unter Verwendung eines polyklonalen anti-PTX-Hyperimmunserums von Kaninchen. PTX kennzeichnet die Spuren, die Pertussistoxin von kommerziell erhältlichem Reinheitsgrad enthalten. Diese Ergebnisse zeigen, daß rekombinante (r) S1, S2, S3 und S5 in merklichen Mengen produziert wurden. Der Western-Blot zeigt, daß rS1 vollständig aus seiner Prä-Proteinform prozessiert wurde, rS2 und rS5 sind teilweise prozessiert, und rS3 ist unter den Fermentationsbedingungen nicht wesentlich prozessiert; rS4 wurde nicht in ausreichender Menge produziert, als daß es sichtbar wäre. Tafel B zeigt die Expressionsprodukte als Methionyl-reife rekombinante (rm) Untereinheiten. Die Untereinheiten werden mit Ausnahme von rmS1 (nicht gezeigt) in merklichen Mengen hergestellt.
- Fig. 3 ist ein Western-Blot, der die Wirkung von stromaufwärts gelegenen nicht codierenden Sequenzen auf die Expression von rS2 zeigt. Die Details der Figur werden im Text angegeben.
- Fig. 4 ist ein Autoradiogramm eines SDS-Polyacrylamidgels, das die ADP-Ribosyltransferaseaktivität von rekombinantem S1 zeigt. Man ließ rekombinantes S1 (500 ng), gereinigtes natives Pertussistoxin (1 ug) und Reaktionspuffer einzeln mit Rindertransducin in Gegenwart von [³²P]NAD reagieren, wie im wesentlichen beschrieben durch Manning et al. 1984, J. Biol. Chem. 259:749-756; West et al. 1985, J Biol. Chem. 260:14428- 14430). Die Proben wurden mit kalter 10 %iger Trichloressigsäure gefällt, die Niederschläge einer SDS-PAGE und anschließender Autoradiographie unterworfen. Die radioaktive Bande bei 39 Kd ist die Transducinuntereinheit, die ribosyliert worden ist. Spur A, Reaktionspufferkontrolle; Spur B, natives PTX; Spur C, rS1.
- Fig. 5 ist ein Diagramm von Radioimmunoassays, das die Immunogenität von rS1- und rS4-Untereinheiten bei Mäusen zeigt. Mäuse wurden mit rekombinantem S1, Methionyl-rS4, nativem Pertussistoxin (PTX), kommerziellem Pertussisimpfstoff, oder Bindemittel (NMS) hyperimmunisiert; einige Präparationen enthielten vollständiges Freudsches Adjuvanz (CFA). Sera wurden gesammelt und Verdünnungen wurden auf ihren anti-PTX-Titer mit einem Festphasenradioimmunoassay untersucht.
- Fig. 6 ist ein Diagramm, das das immunprotektive Potential von rS1 und rS4 bei Mäusen im i.c. Immunitätstests mit B. pertussis zeigt. Details der Figur werden im Text angegeben.
- Fig. 7 ist die abgeleitete Aminosäureseguenz der rS1-Mutante, erhalten durch Expression von pPTXSL (6A-3/4-1).
- Fig. 8A und 8B sind Diagramme von ADP-Ribosyltransferase- und NAD-Glycohydrolaseaktivität von rekombinantem Analogen S1.
- Fig. 9 ist ein Autoradiogramm eines SDS-Polyacrylamidgels von gereinigten S1-Untereinheitsproteinen.
- Fig. 10 ist ein Autoradiogramm eines nativen, nicht- reduzierenden, nicht-denaturierenden Polyacrylamidgels von Holotoxinen aus der Kombination von nativem B-Oligomer entweder mit rekornbinantem S1/1 oder rekombinatem S1/1-4.
- Fig. 11 ist eine Photographie von Zellmonolayern, die auf die Anwesenheit von Zellclustern mittels Lichtmikroskopie untersucht wurden.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, das wenigstens einen Teil umfaßt, welcher die Untereinheit S1 von Bordetella-Exotoxin, oder ein Fragment oder ein Derivat besagten Teils codiert, wobei besagter Teil oder Fragment oder Derivat ein Polypeptid codiert, das eine biologische Aktivität aufweist, die (a) toxinneutralisierende Antikörpertiter hervorrufen kann und (b) im wesentlichen frei von reaktogenen Komponenten ist. Das Polypetid S1-Untereinheit oder Untereinheitsanaloge davon, umfaßt ein Hauptepitop, von dem bekannt ist, daß es wichtig ist bei der Verleihung von Immunschutz gegen Pertussistoxizität. Die toxinneutralisierenden Antikörpertiter verleihen Immunschutz gegen Pertussistoxizität. Ortsspezifische Mutagenese führt zu einem Analogen der S1-Untereinheit, das im wesentlichen enzymatisch inaktiv ist.
- Die gentechnologisch hergestellte S1-Untereinheit von Bordetella-Exotoxin, und die Analogen dieser Untereinheit, liefern von rekombinanter DNA abgeleitete Impfstoffmaterialien zur Verwendung bei der Prävention von Pertussiskrankheit. Die S1- Untereinheit und ihre Analogen können Impfstoffprodukte liefern, entweder alleine oder in Kombination mit den Untereinheiten S2, S3, S4 und S5, und Mischungen davon. Untereinheiten S2, S3, S4 und S5 können aus B. pertussis gereinigt werden oder rekombinant als Fusions- oder Nicht-Fusionsprodukte gewonnen werden. Rekombinante Expression der Untereinheiten S2, S3, S4 und S5 von Bordetella-Exotoxin auf hohem Niveau sind auch in E. coli durch direkte Nicht-Fusionsverfahren erhalten worden. Alternative rekoinbinante Wirte, einschließlich Hefe z.B. S. cerivisiae, und bakterielle Organismen, z.B., Salmonella typhimurium oder typhi, Bacillus sp., und Viren, z.B. Vaccinia, können für die Expression dieser Untereinheitsanalogen verwendet werden.
- Die vorliegende Erfindung betrifft direkte rekombinante Expression aller PTX-Untereinheiten auf hohem Niveau, die für die Impfstoffherstellung notwendig sind. Weiterhin liefern S1- Untereinheitsanaloge biologische Aktivität, die in höchstem Maße immunogen und frei von reaktogenen Komponenten ist, wobei solche Komponenten enzymatische Aktivitäten des Toxinmoleküls sind, die mit seiner Toxizität und Reaktogenität verbunden sind, und Fremdkomponenten von B. pertussis darstellen (z.B. Endotoxin), die mit aus B. pertussis-Zellen extrahierten Impfstoffmaterialien gefunden werden würden und von denen bekannt ist, daß sie reaktogen sind. Die alleine, oder in Kombination mit anderen Untereinheiten von PTX verwendeten S1-Analogen können Impfstoffprodukte liefern, die wirksam sind und in hohem Maße die Wahrscheinlichkeit von Nebeneffekten durch reaktogene Komponenten verringern, die in nicht-modifizierten nativen Untereinheiten oder nicht-modifizierten Untereinheiten auf rekombinanter Basis existiert.
- Die einzelnen Untereinheiten S1, S2, S3, S4 und S5 von Bordetella pertussis-Exotoxin wurden jeweils subkloniert und direkt einzeln in E. coli exprimiert. Die Signalsequenz scheint bei der Expression von rekombinantem S1 (rS1) eine wichtige Rolle zu spielen. Beim Fehlen eines Signalpeptids wurden unwesentliche Mengen von rS1 in E. coli exprimiert. Wenn entweder der native Leader der S1-Untereinheit oder ein synthetischer Leader am Prä-Protein vorhanden ist, wird Expression auf hohem Niveau, im Bereich von 10 bis 30 % des Gesamtzellproteins, erhalten. Die Fermentation von rS1-Expressorzellen im Produktionsmaßstab in einem 10 Liter-Fed-Batch-Fermenter (bei einem nicht optimierten Expressionsniveau von 8 mg S1/OD-L) führte zu fast vollständigem proteolytischen Prozessieren von rS1 zu seiner natürlichen Form, wie in Fig. 2 gezeigt. Fermentation von Expressorzellen in einem Labormaßstab führte zu unvollständig prozessiertem S1; man stellte fest, daß sowohl Prä- Protein als auch reifes Protein dem logarithmischen Zellwachstum folgt. Das Scheitern einer synthetischen durch E. coli spaltbaren Sequenz, um Signalprozessierung zu erhöhen, legt nahe, daß unvollständige Spaltung nicht das Ergebnis inkompatibler Erkennung von proteolytischen Spaltungsstellen von B. pertussis durch E. coli-Leaderpeptidasen ist. Das Scheitern, das Prozessierungshemmnis entweder durch Verstärken der Signalpeptidasesynthese unter Verwendung von Zellen, die mit einem Plasmid co-transformiert waren, das E. coli-Leaderpeptidase auf hohem Niveau exprimierte, oder durch Verringerung des Niveaus der S1-Expression durch die Verwendung eines Vektors mit geringer Kopienzahl, zu überwinden, zeigt an, daß das Problem nicht in der Sättigung des Spaltungsweges begründet liegt. Diese Ergebnisse zeigen, daß posttranslationale Prozessierung fremder Proteine in E. coli durch wenig verstandene Mechanismen kontrolliert sein kann, die mit dem physiologischen Zustand der wachsenden Zelle verbunden sind.
- PTX-Untereinheiten S2, S3, S4 und S5 wurden in ähnlicher Weise in E. coli wie in Fig. 2 gezeigt exprimiert. Wie rekombinantes S1, schienen die rS2-, rS3-, und rS5-Untereinheiten unvollständige Prozessierung bei Fermentation im Labormaßstab aufzuweisen. Da rS1 im Produktionsmaßstab vollständig prozessiert werden konnte, können ähnliche Fermentationsbedingungen verwendet werden, um die anderen Untereinheiten in vollständig prozessierter Form zu erhalten. Im Gegensatz zu rS1 konnte die rS4-Untereinheit auf hohem Niveau als ein reifes Methionyl- Polypeptid exprimiert werden, war aber nicht nachweisbar, wenn es mit seiner natürlichen Leaderpeptidsequenz exprimiert wurde. Untereinheiten S2, S3, S4, und S5 sind nun alle als Methionyl-reife Polypeptide exprimiert worden. Aminosäureanalyse dieser Moleküle zeigte, daß der heterologe (nicht-native) Methionylrest im wesentlichen von jeder Form (mit Ausnahme Von S4) durch zelluläre Methionin-Aminopeptidase entfernt wird, wodurch ein vollständig reines Protein nativer Sequenz entsteht. Der Methionylrest wird aufgrund der Inkompatibilität der aminoterminalen Erkennungssequenz für das zelluläre Enzym nicht wesentlich von rekombinantem S4 entfernt. All die rekombinanten Proteine wurden als Einschlußkörper aus lysierten Zellen gewonnen. Es wurde gefunden, daß die Untereinheiten Wanderungsmuster in SDS-PAGE aufwiesen, die im wesentlichen identisch mit den authentischen nativen Untereinheiten sind oder die in Western-Blots mit monoklonalen oder polyklonalen Antitoxinseren reagieren. Wie in Fig. 2 gezeigt, wird Expression der Untereinheiten S1, S2, S3, S4 und S5 auf hohem Niveau in E. coli durch direkte Nicht-Fusionsmittel erreicht.
- Obwohl alternative Verfahren und Materialien bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien unten beschrieben. Alle im folgenden zitierten Literaturstellen werden hierin durch Bezugnahme einbezogen.
- Materialien. DNA-modifizierende Enzyme wurden gekauft von New England Biolabs, (Beverly, MA), Bethesda Research Laboratories, (Gaithersburg, MD), Boehringer Mannheim Biochemicals, (Indianapolis, IN), und International Biotechnologies, Inc., (New Haven, CT); Enzyme wurden entsprechend den Herstellerempfehlungen verwendet. Alle Chemikalien und Biochemikalien waren vom Analysenreinheitsgrad. Gereinigtes Pertussistoxin (PTX) wurde von List Biological Laboratories, Inc. (Campbell, CA) gekauft. Synthetische Oligonucleotide wurden synthetisiert nach Caruthers (1982, in H.G. Gussen und A. Lang [eds] Chemical and enzymatic synthesis of gene fragments, Verlag Chemie, Weinheim FRG, pp 71-79). Kaninchenantiseren gegen vollständiges PTX wurden bei Antibodies, Inc. (Davis, CA) und dem NIAID Rocky Mountain Laboratory produziert. Monoklonale Antikörper gegen Untereinheiten von nativem PTX wurden nach Standardverfahren (Kohler und Milstein, 1975, Nature 256:495-497; Nowinski et al., 1979, Virology 93:111-126> hergestellt. Radiojodiertes Protein A und Kaninchen-anti-Maus IgG wurden von New England Nuclear (Wilmington, DEL) gekauft. Anti-S1 monoklonaler Antikörper IB7 (wie beschrieben bei Sato et al., 1987, Infect. Immun. S5:909-915) war ein Geschenk von H. Sato, NIH, an Keyo, Japan.
- Plasmide und Bakterienstämme. Plasmid pPTX42, das das PTX-Operon enthält, ist beschrieben worden (siehe Locht und Keith, siehe oben und Locht et al., siehe oben). Expressionsplasmide pCFM1036, pCFM1146, pCFM1152, und pCFM1156 wurden bei Amgen gewonnen.
- Eine detaillierte Beschreibung des Expressionsvektorsystems von Amgen ist in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 0 136 490 beschrieben und hierin durch Bezugnahme einbezogen. Solche Plasmide können einen induzierbaren Promotor, eine synthetische Ribosomenbindungsstelle, einen Klonierungscluster, Plasmidreplikationsursprung, einen Transkriptionsterminator, Gene, die die Plasmidkopienzahl regulieren, und ein Kanamycinresistenzgen enthalten. Die gewonnenen Plasmide unterscheiden sich untereinander in mehrerer Hinsicht. Das Plasmid pCFM1036 kann aus pCFMS36 (europäische Patentanneldung #136490 gewonnen werden, indem die DNA-Sequenz zwischen den einzigen AatII-und EcoRI-Restriktionsstellen, die den synthetischen PL-Promoter enthält, durch das folgende Oligonucleotid ersetzt wird:
- Das Plasmid enthält keinen induzierbaren Promotor, der dem Restriktionscluster vorangeht. Das Plasmid pCFM1146 kann aus pCFM836 gewonnen werden, indem die kurze DNA-Sequenz zwischen den einzigen ClaI- und XbaI-Restriktionsstellen durch das folgende Oligonucleotid ersetzt wird:
- und durch Zerstören der zwei endogenen NdeI-Restriktionsstellen durch Auffüllen der Enden mit T4-Polymeraseenzym, gefolgt von Ligation der glatten Enden. Das Plasmid enthält keine synthetische Ribosomenbindungsstelle, die unmittelbar dem Restriktionscluster vorangeht. Das Plasmid pCFM1156 kann aus pCFM1146 gewonnen werden, indem die kurze DNA-Sequenz zwischen den einzigen XbaI- und KpnI-Restriktionsstellen durch das folgende Oligonucleotid ersetzt wird:
- Das Plasmid pCFM11S2 kann aus pCFM1156 gewonnen werden, indem das BGlII- bis BglII-DNA-Fragment (248 Basenpaare), das den copB-Promotor enthält und einen Teil des copB-Gens codiert, durch das entsprechende DNA-Fragment aus dem Plasmid pCFMS12 (europäische Patentanmeldung #136 490) ersetzt wird. Dieses Plasmid weist eine geringere Kopienzahl als pCFM1156 auf.
- Plasmide pBR322, pUC18, pUC19, und Phagen-DNA M13mp18 und M13mp19 wurden von Bethesda Research Laboratories gekauft. Das Plasmid pTD125, das das Gen für E. coli-Leaderpeptidase (Dale, T. 1983, J. Bacteriol. 143:76-83) enthält, war ein Geschenk von W. Wickner (UCLA). E coli FM5-Zellen wurden bei Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, aus dem Stamm E. coli K-12 von C.F. Morris (Bachmann et al., 1976, Bacteriol. Rev. 40:116-167) gewonnen und enthält das integrierte Lambdaphagenrepressorgen, CI&sub8;&sub5;&sub7; (Sussman, et al., 1962, C.R. Acad Sci. 254:1517-1579). Konstruktion der einzelnen Untereinheitsexpressionsplasmide ist hierin beschrieben. Vektorproduktion, Zelltransformation, und Kolonieselektion wurden nach Standardverfahren (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Springs Harbor Laboratory, NY) vorgenommen.
- Analysenverfahren. DNA-Sequenzierung wurde mittels des Primer- Verlängerungs-, Ketten-Abbruchs-Verfahren (Sanger et al., 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:S463-S467; Heidecker et al., 1980, Gene 10:69-73) vorgenommen. Proteinsequenzanalyse wurde durch automatisierten Edman-Abbau in einem ABI 470A Gasphasenmikrosequenator (Hewick et al., 1981, J. Biol. Chem. 256:7990-7997; Hunkapillar et al., 1983. Meth. Enzymol. 91:399-413) durchgeführt. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde durchgeführt wie bei Laemmli (1970, Nature 227:680-685) beschrieben, Elution von Polypeptiden aus Polyacrylamidgelen erfolgt nach dem Verfahren von Hunkapillar et al., (1983, Meth. Enzymol. 91:227-236) und Durchführungen von Western-Blots erfolgte wie von Burnette (1981, Analyt Biochem. 112:195-203) beschrieben. Das Verhältnis von rekombinantem Protein zu gesamtem Zellprotein oder gesamtem Einschlußkörperprotein wurde durch SDS-PAGE von Ganzzellysaten oder Einschlußkörperpräparationen bestimmt, gefolgt von Färbung mit Coomassie Brilliant Blue R250 und nachfolgendem Scannen des Gels mittels integrativer Densitometrie. Tests auf NAD-Glycohydrolase und ADP-Ribosyltransferase wurden durchgeführt wie vor kurzem beschrieben (Katada et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3129-3133; Lim et al., 1985, J. Biol. Chem 260:2585-2588). Verringerung der morphologischen Antwort von CHO-Zellen auf PTX (Hewlett et al., 1983, Infect. Immun. 40:1198-1203) mit Antisera gegen verschiedene rekombinante Untereinheitspräparationen wurde nach dem Verfahren von Gillenius et al., (1985, J. Biol. Stand. 13:61-66) durchgeführt.
- Konstruktion von Expressionsplasmiden. Alle Plasmide wurden aus einer Reihe allgemeiner E. coli-Expressionsvektoren konstruiert, die sich wie zuvor beschrieben unterscheiden. Die einzelnen Gensegmente von Pertussistoxinuntereinheiten wurden isoliert unter Verwendung der Restriktionsstellen, die als Stand der Technik in Fig. 1 gezeigt sind; die stromaufwärts gelegene Restriktionsstelle befand sich gerade innerhalb des Initiationscodons für die Expressionen der das Signalpeptid enthaltenden Form der Untereinheit oder gerade innerhalb des Codons für den aminoterminalen Rest der reifen, prozessierten Form der Untereinheit für Expression der Methionyl-reifen Form des Untereinheitsanalogen. Co-Expression des gesamten B-Oligomers verwendete, in einem Fall, das Fragment, das die stromaufwärts gelegene nicht-codierende Region von S2 bis zum Ende von S3 enthält und überging die synthetische Ribosomenbindungsstelle des E. coli-Expressionsvektors; im anderen Fal wurde die stromaufwärts gelegene nicht-codierende Region von S2 deletiert und die synthetische E. coli-Ribosomenbindungsstelle inseriert. Synthetische Oligonucleotidlinker wurden verwendet, um die Insertion der Gensegmente in die Expressionsplasmide in einer optimalen Entfernung stromabwärts des synthetischen Promotors und der Ribosomenbindungsstelle zu bewirken. Die stromaufwärts gelegenen Linker stellten den Leserahmen eines jeden Gens wieder her, entweder zurück zum authentischen Initiationscodon, im Falle von Konstruktionen von Prä-Untereinheiten, oder zum ersten Codon des reifen Aminoterminus; die letztgenannten Oligonucleotide enthielten ein Methionylinitiationscodon. In einigen Fällen wurde die Codonverwendung modifiziert, um das Potential für Sekundärstruktur nahe dem 5'-Ende der resultierenden mRNAs zu verringern. Zum Beispiel wurde das Cysteincodon an Position 3 in der Signalregion der S1-Untereinheit (Locht und Keith, siehe oben) durch das Codon für Serin substituiert, um die Möglichkeit schädlicher Disulfidwechselwirkungen auszuschließen.
- Nach Transformation von E. coli FM5-Zellen mit den verschiedenen Plasmidkonstrukten und Ausplattieren auf Kanamycin-haltigem Agar wurden geeignete Zahlen von Kolonien ausgewählt, mittels Replikatechnik platiert, als kleine Flüssigkulturen gezogen ("minipreps"), und bei 42ºC für 4 Stunden induziert. Die minipreps wurden dann mittels Lichtmikroskopie auf die Anwesenheit von Einschlußkörpern in den bakteriellen Zellen durchgesehen. Präparationen, die offensichtliche Einschlüsse aufwiesen, wurden identifiziert und passende Kolonien von den Replika-Platten einer Laborfermentation im Kolbenmaßstab (1 Liter) bei der Induktionstemperatur unterzogen; einige Präparationen wurden später Fed-Batch-Fermentationen in industriellen 10 Liter-Fermentern unterzogen. Proben wurden aus der Fermentation zu verschiedenen Zeiten nach der Induktion gezogen und hinsichtlich des Auftretens der geeigneten PTX-Untereinheit durch SDS-PAGE untersucht, gefolgt von sowohl Coomassie Brilliant Blue-Färbung als auch Durchführung eines Western- Blots; die Blots ließ man zuerst mit einem geeigneten monoklonalen Antikörper reagieren, durch Autoradiographie untersuchen, und dann mit einem polyklonalen anti-PTX-Serum reagieren, gefolgt von weiterer Autoradiographie. Die Struktur des Plasmids von jedem Expressionsklon wurde durch Restriktionskartierung des isolierten Plasmids bestätigt und durch DNA- Sequenzierung der Verknüpfungsregionen verifiziert.
- Expression von rekombinantem S1. Wenn das S1-Expressionsplasmid (pPTXS1/1) enthaltende E. coli-Zellen bei 42ºC in einem 10 Liter Fed-Batch-Fermenter im Produktionsmaßstab induziert wurden, produzierten sie ein intrazelluläres Hauptprotein von etwa 26000 Daltons (Fig. 2A links, Spur rS1), das in SDS-PAGE zusammen mit dem authentischen PTX S1 wanderte. Teilweise Aminosäuresequenzanalyse (5 Zyklen) wies nach, daß dieses Polypeptid die aminoterminale Sequenz aufwies, die für die reife S1-Untereinheit vorhergesagt wurde (Locht und Keith, siehe oben) . Das Protein wurde immunchemisch als S1 identifiziert aufgrund seiner Reaktivität mit einem Maus-anti-S1-monoklonalen Antikörper in einem Western-Blot (Fig. 2A rechts, Spur rS1).
- Es sollte festgehalten werden, daß Laborfermentation der S1- Expressorzellen im 1 Liter-Kolbenmaßstab zu unvollständiger Spaltung des rS1-Signalpeptids führte, einem Phänomen, das auch bei der Expression der anderen PTX-Untereinheiten in E. coli beobachtet wurde (siehe unten). Bemühungen wurden unternommen, um das im Kolbenmaßstab beobachtete molekulare Hindernis beim Prozessieren des Signals zu identifizieren durch eine Reihe von Experimenten, die dazu bestimmt waren, den Umfang von Prä-Proteinspaltung zu erhöhen: Insertion des S1-Gens in einen Expressionsvektor mit geringer Kopienzahl, Substitution des authentischen S1-Signalpeptids durch eine synthetische von E. coli spaltbare Signalsequenz (Picker et al., 1983, Infect. Immun. 42:269-275), und Co-Transformation der Untereinheitexprimierenden Zellen mit einem Expressionsplasmid, das das Gen für E. coli-Leaderpeptidase (Date, siehe oben) enthält, um das konstitutive Niveaus dieses Enzyms zu erhöhen. Keiner dieser Ansätze führte zu einer signifikanten Veränderung bei der Signalspaltung. Jedoch führte Modifikation der Fermentationsbedingungen hin zu einem Fed-Batch-Prozeß zum im wesentlichen vollständigen Prozessieren von Prä-S1 zu seiner reifen Form.
- Der Erfolg beim Exprimieren der S4-Untereinheit als ein reifes Methionylpolypeptid (unten) führte zur Anwendung derselben Strategie bei rS1. Anders als rS4-Expression in E. coli war die Expression reifen Methionyl-S1 jedoch so gering, daß ein Western-Blot zu seinem Nachweis benötigt wurde. Im Gegensatz dazu ergab die Expression von rS1 unter Verwendung seiner authentischen Signalsequenz das vollständig prozessierte Polypeptid auf einem Niveau von 10 bis 30 % des gesamten Zellproteins. Wie Später beschrieben, kann Verkürzen des reifen Aminoterminus von rsl durch rekombinante Mittel zu Expression auf sehr hohem Niveau führen. Tatsächlich führt Substitution von so wenig wie der ersten zwei Reste der reifen S1-Sequenz (Asp- Asp) durch Metval verglichen mit der Methionyl-reifen Form zu signifikanter Expression.
- Expression von S2 S3 S4 und S5. Um die Durchführbarkeit zu testen, wurde die PTX-S4-Untereinheit zuerst als ein reifes Methionylprotein ohne sein natives Leaderpeptid exprimiert und, wie oben beschrieben, auf hohem Niveau in E. coli produziert (Fig. 2B links, Spur rmS4) . Obwohl seine Wanderung in SDS-PAGE relativ zu der von S4 aus Präparationen vollständigen Toxins etwas verzögert war, wies es die vorhergesagte S4-Aminosäuresequenz auf. Mittels HPLC aus B. pertussis gereinigtes S4 weist dieselbe Verzögerung bei Gelelektrophorese auf (Locht et al., siehe oben). Rekombinantes S4 reagiert gut mit polyklonalen Antiseren in Western-Blots (Fig. 28 rechts, Spur rmS4), weist aber verringerte Reaktivität mit einem S4-monoklonalen Antikörper auf.
- Im Gegensatz zu den mit S1 erhaltenen Ergebnissen führte Expression von S4 mit seiner nativen Leaderpeptidsequenz (Locht und Keith, siehe oben) zu nicht nachweisbaren Mengen von Protein (nicht gezeigt). Es sollte jedoch festgehalten werden, daß Nicosia et al., (siehe oben) einen anderen, weiter stromaufwärts gelegenen Translationsstartpunkt vorhersagt; es ist möglich, daß die Verwendung dieser zusätzlichen Sequenz im S4- Leaderpeptid zu einer Expression auf weit höherem Niveau führen würde. Rekombinantes S2, S3 und S5 wurden jeweils mit ihren nativen Leadersequenzen exprimiert (Fig. 2A, Spuren rS2, rS3 bzw. rS5); keine dieser Untereinheiten wurde während Fermentation im Labormaßstab vollständig prozessiert, obwohl vorläufige Fermentationsexperimente im Produktionsmaßstab unter Verwendung des Fed-Batch-Prozesses mit deutlicher Verbesserung der Prozessierung von S2 und S5 einhergeht. S2, S3, und S5 wurden auch jeweils in E. coli in einer Methionyl-reifen Form auf einem Niveau exprimiert, das vergleichbar ist jenem mit ihrem nativen Leaderpeptiden (Figur 2P, Spuren rmS2, rmS3 bzw. rmS5). Wie oben festgehalten, werden die heterologen Methioninreste von S2, S3 und S5 durch zelluläre Methionin-Aminopeptidase prozessiert, um vollreife Polypeptide nativer Sequenz zu ergeben.
- Das gesamte polycistronische Segment, das die B-Oligomeruntereinheiten (S2-S4-S5-S3) darstellt, wurde unter Kontrolle des Promotors PL exprimiert. Fig. 3 zeigt die Auswirkungen der stromaufwärts gelegenen nicht-codierenden Region auf die Produktion der S2-Untereinheit. In einem Fall behielt das Expressionsplasmid den gesamten intercistronischen Bereich zwischen dem Terminationscodon von S1 und dem Initiationscodon von S2 (Locht und Keith, siehe oben), aber ohne die synthetische Ribosomenbindungsstelle, die in all den anderen Expressionsplasmiden verwendet wurde. Dies führte zur Synthese von rekombinantem S2, das bei Untersuchung in einem Western-Blot mit einem anti-S2-monoklonalen Antikörper (Fig. 3, Spuren D und E) vollständig prozessiert zu sein schien; obwohl nicht gezeigt, legte eine polyklonale Antikörperanalyse nahe, daß die anderen B-Oligomeruntereinheiten ebenfalls vollständig zu ihren reifen Formen prozessiert wurden. Substitution des nicht-codierenden intercistronischen Segmentes durch die synthetische Shine-Delgarno-Sequenz führte zu einer Synthese von rS2 auf einem weit höherem Niveau (Fig. 3, Spuren B und C); dieses Material ist jedoch unvollständig prozessiert. Die Syntheseeffizienz eines jeden Cistrons scheint direkt mit seiner Nähe zum 5'-Ende der Information korreliert zu sein, d.h., S2> S4> S5> S3. Ein vorläufiger Versuch, bei dem der Rest des operons stromabwärts des stark exprimierten S1-Konstruktes (siehe oben) plaziert wurde, führte zu Synthese auf sehr niedrigem Niveau und unvollständiger Prozessierung einer jeden Untereinheit, einschließlich S1.
- Eigenschaften rekombinanter PTX-Untereinheiten. Sehr wenige, wenn überhaupt welche, der prozessierten PTX-Untereinheiten scheinen aus den E. coli-Zellen sekretiert zu werden, obwohl es einige Hinweise gibt, daß vollständig prozessiertes rS1 in begrenztem Umfang im periplasrnatischen Raum gefunden werden kann. Die Masse einer jeden Untereinheit wurde in der Form von Einschlußkörpern gefunden und bildete 10 bis 30 % des gesamten zellulären Proteins. Zellyse durch French Press und Zentrifugation bei geringen Geschwindigkeiten führte zu Pelletfraktionen, bei denen bis zu 65 % ihres Proteins aus den einzelnen Untereinheiten bestand.
- Alle PTX-Untereinheiten waren in Western-Blots mit einem polyklonalen Kaninchenantitoxinserum nachweisbar (Fig. 2). Wie oben festgestellt, reagierten Untereinheiten rS1 und rS2 gut mit spezifischen monoklonalen Antikörpern in Western-Blots. Rekombinantes S4, in Form eines Methionylpolypeptids hergestellt, wies verringerte Reaktivität mit einem anti-S4- monoklonalen Antikörper auf. Monoklonale Antikörper gegen Untereinheiten S3 und S5 waren nicht verfügbar, obwohl rS3 auf einem Western-Blot mit anti-S2-monoklonalem Antikörper aufgrund seiner nahen Sequenzhomologie mit S2 nachgewiesen werden (Locht und Keith, siehe oben) konnte.
- Wenn Rohpräparationen von rekombinantem rS1 in Gegenwart von [³²P]NAD mit von CHO-Zellen isolierten Membranen inkubiert wurden, wurde ein Protein von etwa 41000 Daltons ADP-ribosyliert, das identisch ist mit demjenigen, das durch natives vollständiges PTX ribosyliert wird; von diesem Molekül nimmt man an, daß es das Membranregulationsprotein Ni des Adenylatcyclase- Komplexes ist (Bokoch et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:2072- 2075; und Hsia et al., 1983, J. Biol. Chem. 259:1086-1090). Für Routinetestzwecke kann Rindertransducin als ein Substrat für die Ribosylase (Fig. 4) verwendet werden, welches ein Molekül ist, von dem gezeigt wurde, daß es ein Akzeptor von durch Pertussistoxin katalysiertem ADP-Ribosetransfer von NAD ist. (Manning et al., siehe oben; West et al., supra). Dieses Ergebnis bestätigt die Lokalisierung der ADP-Ribosyltransferaseaktivität auf dem Prctomer A (S1-Untereinheit) des Toxins und legt nahe, daß das rekombinante B. pertussis-Protein in E. coli in eine Form gefaltet wird, die seiner nativen dreidimensionalen Struktur nahekommt. Weiterhin wies das rekombinante S1 NAD-Glycohydrolaseaktivität auf, die auch mit dem Protomer A identifiziert wurde. Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion einer unaufgearbeiteten Einschlußkörperpräparation von rS1 oder mit gereinigtem rekombinanten Methionyl-S4 immunisiert und aufgefrischt. Das verwendete rsl-Untereinheitsmaterial enthielt sowohl vollständig prozessiertes Polypeptid als auch unprozessiertes Prä-Protein in einem ungefähren Verhältnis von 1:2; die relative Immunogenität der zwei rS1-Formen ist nicht bekannt. Serumproben wurden in einem Festphasen- RIA auf die Anwesenheit von Antitoxinantikörpern getestet (Fig. 5). Tiere, die rekombinantes S1 erhielten, zeigten eine signifikante Antitoxinantwort, ob die Immunisierungsdosen nun mit vollständigem Freudschen Adjuvanz oder nicht formuliert waren. Rekombinantes S4, das nur in Adjuvanzform gegeben wurde, war auch sehr immunogen verglichen mit dem vollständigen PTX in Adjuvanzform und kommerziellen Pertussisimpfstoffen.
- Behandlung kultivierter CHO-Zellen mit vollständigem Pertussistoxin führte zu einer "geclusterten" Morphologie (Hewlett et al., siehe oben), die mit Antitoxinsera aufgehoben werden kann (Gellenius et al., siehe oben). In vorläufigen Versuchen war Mausserum gegen rS1 oder rS4, das wie oben beschrieben hergestellt wurde und über vergleichsweise hohe Titer von Antitoxinantikörpern verfügte, routinemäßig nicht in der Lage, die Antwort von CHO-Zellen auf natives Toxin zu neutralisieren.
- Immunschutz von Mäusen mit rekombinantem S1. Mäuse, die mit unaufgearbeitetem rekombinanten S1, gereinigtem rekombinanten S4 und geeigneten Kontrollmaterialien (siehe oben) immunisiert wurden, wurden einem intracerebralen (i.c.) Immunitätstest mit dem mausvirulentem B. pertussis-Stamm 18323 unterzogen und Mortalität über einen Zeitraum von 45 Tagen nach dem Immunitätstest bewertet (Figur 6). Mäuse wurden mit 50 ug des Testgegenstandes (100 ul einer 1:35 Verdünnung für kommerzielle Pertussis-Impfstoffe) durch intraperitoneale Injektion immunisiert; sie wurden mit einer identischen Menge 21 Tage nach Inokulierung aufgefrischt und 7 Tage später mittels i.c. Immunitätstest mit lebendem B. pertussis-Stamm 18323 (3 x 10&sup4; Organismen pro Tier) immungetestet. Obwohl wegen des Fehlens aktiven Holotoxins in den rekombinanten Präparaten Schutz nicht erwartet wurde, war es erstaunlich, eine Zunahme der Überlebenszeit für rS1-immunisierte Tiere verglichen mit den nichtimmunisierten Kontrollen zu beobachten. Darüber hinaus zeigt sich eine Anzahl von Mäusen, die rS1 in Adjuvanzform erhalten hatten, im Immunitätstest vollständig geschützt; Mäuse, die mit rS4 in Adjuvanzform immunisiert wurden, waren nicht besser als nicht-immunisierte Mäuse geschützt, obwohl sie eine gute Antikörperantwort aufwiesen (siehe Figur 5). In einem weiteren vorläufigen Versuch schien rS1 in Adjuvanzform dosisabhängigen Schutz im Immunitätstests hervorzurufen. Unvollständiger Schutz im i.c. Immunitätstest mag seine Ursache in einem Fehlen aktiven Holotoxins im Immunisierungsmaterial haben; nichtsdestotrotz zeigt in dieser vorläufigen Studie erhaltener Schutz, daß rekombinantes S1-Protein ein Potential als Untereinheitsimpfstoffmaterial aufweist. Spätere Studien haben Immunschutz im intracerebralen Immunitätstest mit mausvirulentem B. pertussis-Stamm 18323 nicht bestätigt.
- Verkürzte S1-Analoge wurden unter Verwendung von Techniken des Protein Engeneerings und ortsspezifischer Mutagenese hergestellt. Man stellte fest, daß die durch Valin 7 und Prolin 14 begrenzte Region eine für ADP-Ribosyltransferaseaktivität des S1-Moleküls notwendige Region darstellt. Ein Antigenepitop, das einen monoklonalen Antikörper bindet, der Mäuse passiv gegen Toxinaktivität schützt (d.h., ein Epitop, das beim Hervorrufen einer Schutzantwort beteiligt ist) liegt mindestens teilsweise innerhalb der durch Valin 7 und einschließlich Prolin 14 begrenzten Region. Mutagenese des S1-Moleküls in der durch Valin 7 und einschließlich Prolin 14 begrenzten Region lieferte S1-analoge Moleküle, denen enzymatische Aktivität fehlt, während das schützende Epitop beibehalten wird. Das schützende Epitop ist wichtig für die Verleihung von Immunschutz gegen Pertussistoxizität. Modifikationen der Region Valin 7 bis Prolin 14, einschließlich Substitution und/oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren, führt zu S1-analogen Produkten, die toxinneutralisierende Antikörpertiter hervorrufen können und im wesentlichen frei von reaktogenen Komponenten sind.
- Subklonieren des PTX S1-Gens in pUC18. Plasmid pPTX42, das das gesamte Operon für das Bordetella pertussis-Toxin (PTX) enthält, wurde von J. Keith (NIAID, Rocky Mountain Laboratory) als transformierte JM109-Zellen erhalten. Die Bakterien wurden in L-Brühe, die Ampicillin enthielt, kultiviert und das Plasmid mittels Standardmethoden gewonnen und gereinigt (Maniatis et al., siehe oben). Ein 792 bp-DNA-Fragment, das einen Teil des PTX S1-Gens (Cistrons) enthält (Locht und Keith, siehe oben) wurde aus pPTX42 durch Verdauung des Plasmids mit Restriktionsenzymen AvaI und XbaI isoliert, gefolgt von Acrylamidgelelektrophorese und nachfolgender Elution des DNA-Fragmentes aus dem Gel. Dieses DNA-Fragment beginnt an der AvaI- Stelle gerade innerhalb des offenen Leserahmens für das Prä-S1-Protein und endet an einer XbaI-Stelle am Terminationscodon für S1. Der standardmäßige Klonierungsvektor pUC18 wurde auch mit AvaI und XbaI verdaut und der Verdau mit Phosphatase behandelt. Eine Ligierungsreaktion wurde mit dem pUC18-Vektor, dem 792 bp-DNA-Fragment (Avai-XbaI) von pPTX42 und T4-DNA-Ligase bei Standardbedingungen vorgenommen. Frische kompetente DH52α-Zellen wurden mit der Ligationsmischung transformiert und Transformanten wurden auf Agarplatten aus L-Brühe selektioniert, die Ampicillin und "Blue-gal" (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) enthielten. Zwölf weiße Kolonien wurden selektioniert, Replika platiert und als 2 ml-Flüssigkulturen kultiviert. Minipreps der Zellen wurden nach einem standardmäßigen alkalischen Lyseverfahren hergestellt, die DNA mit AvaI und XbaI verdaut, und der Verdau Acrylamidgelelektrophorese unterworfen.
- Konstruktion von rPTXS1-Expressionsolasmid pPTXS1/1. Ein AvaI- XbaI-Fragment von 792 bp wurde aus Plasmid pPTX42 wie zuvor beschrieben isoliert. Das Escherichia coli-Expressionsplasmid pCFM1156 und pCFM1036 wurden von Charles F. Morris, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA erhalten. Plasmid pCFM1156 wurde mit Restriktionsenzymen SstI und NdeI verdaut und ein 1,8 kb-DNA- Fragment wurde aus einem Agarosegel durch Elektroelution auf NA45-Papier (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.) isoliert.
- Plasmid pCFM1036 wurde mit SstI und XbaI verdaut und ein 2,8 Kb-DNA-Fragment wurde auf gleiche Weise isoliert. Zwei komplementäre Stränge eines Oligodeoxynucleotidlinkers, der den deletierten Teil des offenen Leserahmens von S1 wiederherstellte, wurde nach der Aminophosphinchemie von Caruthers et al., (siehe oben) synthetisiert. Während die authentische Aminosäuresequenz beibehalten wurde, wurde die Sequenz des synthetischen Fragmentes hinsichtlich der Codonverwendung modifiziert, um eine potentielle Sekundärstruktur in der Boten-RNA zu verringern; eine Ausnahme davon war die Substitution des Cysteincodons bei Aminosäureposition Nr. 2 in der Prä-Proteinsignalsequenzfolge durch ein Serincodon, um jegliche Disulfidwechselwirkungen zwischen dem Prä-Proteinsignal und den zwei Cysteinresten an Position 41 und 199 des reifen Proteins auszuschalten. Dieser Oligodeoxynucleotidlinker wies eine NdeI- Stelle auf, die kohäsiv zu der in pCFM1156 war, und ein AvaIkohäsives Ende für Ligation an die AvaI-Stelle des 792 bp-DNA- Fragmentes des S1-Gens. Die Sequenz dieses Oligodeoxynucleotids war:
- Eine Ligationsreaktion wurde aufgesetzt mit dem 2,8 Kb-DNA- Fragment von pCFM1036, dem 1,8 Kb-DNA-Fragment von pCFM1156, dem 792 bp-DNA-Fragment, das das S1-Gensecment enthielt, dem oligodeoxynucleotidlinker und T4-DNA-Ligase. Nach Ligation wurden FM6-Zellen (erhalten von C.F. Morris, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) mit der Ligationsmischung transformiert und auf Kanamycin-haltigem L-Broth-Agar platiert. Kolonien wurden selektiert und sowohl mittels Replikatechnik platiert als auch minipreps von ihnen nach dem alkalischen Verfahren (Maniatis et al., siehe oben) hergestellt. DNA-Proben aus minipreps wurden einer Restriktionskartierung unterzogen und man stellte fest, daß sie über die erwarteten DNA-Restriktionsfragmente verfügten. Die Region vom Anfang des synthetischen Linkers bis in den offenen Leserahmen des authentischen S1-Gens wurde durch DNA-Sequenzanalyse bestimmt. Nachfolgende Induktion dieses Plasmids führte zu Expression des rekombinanten S1-Proteins auf hohem Niveau.
- Konstruktion von rPTXS1-Expressionsplasmid pPTXS1/2. Ein DNA- Fragment von 181 bp wurde durch Verdauung mit AccI und SphI aus Plasmid pPTXS1/1 isoliert; nachfolgende Reinigung des DNA- Fragmentes erfolgte auf einem Polyacrylamidgel. Dieses DNA- Fragment ist ein interner, linker Teil des S1-Gens. Unter Verwendung derselben Verfahren wurde ein 564 bp-DNA-Fracment, das den verbleibenden rechten Teil des Gens darstellte, aus PTXS1 isoliert, das in pUC18 kloniert wurde. Dies wurde erreicht durch Verdauung des Plasmids mit SphI und BamHI, wobei das letztgenannte Enzym stromabwärts der S1-Klonierungsstelle (XbaI) schnitt, an der BamHI-Stelle innerhalb des pUC18-Klonierungsclusters. DNA-Fragmente von 1,8 Kb und 2,8 Kb wurden aus dem Expressionsvektor pCFM1156 durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen NdeI, SstI und BamHI isoliert, gefolgt von Isolierung mittels Agarosegelelektrophorese und Elektroelution der DNA-Fragmente. Ein Oligodeoxynucleotidlinker wurde synthetisiert; dieser doppelsträngige Linker wies NdeI- und AccI- kohäsive Enden und die folgende Sequenz auf:
- Eine Ligation wurde nach Standardverfahren (Maniatis et al., siehe oben) unter Verwendung der 181 bp-(AccI-SphI) und 564 bp-(SphI-BamHI)-DNA-Fragmente aus pPTXS1/1, den 1,8 Kb-(NdeI- SstI) und 2,8 Kb-(SstI-BamHI)-DNA-Fragmenten aus pCFM1156, dem Oligodeoxynucleotidlinker und T4-DNA-Ligase vorgenommen. Nach der Ligation wurde die Mischung verwendet, um frische, kompetente FM5-Zellen zu transformieren. Kanamycin-resistente Transformanten wurden erhalten, Restriktionsenzymanalysen von mittels minipreps gewonnener Plasmid-DNA vorgenommen und die Struktur der Verknüpfungsstellen durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt.
- Bal31-Verdauung von DPTXS1/2 und Konstruktion von Vektoren mit verkürzten S1-Genen. Um wichtige antigene Epitope und enzymatisch aktive Stellen nahe dem aminoterminalen Ende des reifen Sl-Moleküls zu bewerten, wurden verkürzte Versionen dieses Proteins hergestellt. Das Expressionsplasmid pPTXS1/2 wurde mit NdeI verdaut, mit Exonuclease Bal31 (IBI) unter Standardbedingungen behandelt, und Aliquots nach verschiedenen Zeiten bis zu 110 Minuten entfernt. Nach Inaktivierung von Bal31 für 15 Minuten bei 65ºC wurden Proben hinsichtlich Steigerungen der elektrophoretischen Wanderung durch Elektrophorese auf Agarosegelen analysiert. Proben der Aliquots nach 100 Minuten und 110 Minuten wurden vereinigt (Fraktion A) und die verbliebenen Proben wurden vereinigt und gereinigt und mit zusätzlichem Bal31 verdaut; Aliquots wurden nach verschiedenen Zeiten bis zu 180 Minuten entfernt. Nach Abkühlen der Reaktion wurden Aliquots wieder hinsichtlich Steigerungen der elektrophoretischen Wanderung untersucht und vier zusätzliche Fraktionen (B, C, D, und E) wurden zurückbehalten. Jede der fünf Fraktionen wurde einzeln mit SstI verdaut und DNA-Fragmente von 3 bis 3,5 Kb wurden aus Agarosegelen durch Elektroelution isoliert.
- Expressionsvektor pCFM1156 wurde mit SstI und HpaI verdaut, und ein 1,8 Kb-DNA-Fragment auf ähnliche Weise isoliert. Die einzelnen 3 bis 3,5 Kb-DNA-Fragmente (Bal31 glatt-SstI) aus pPTXS1/2 wurden jeweils mit dem 1,8 Kb-DNA-Fragment (SstI- HpaI) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei Standardbedingungen ligiert. Frische, kompetente FMS-Zellen wurden mit jeder einzelnen Ligationsmischung transformiert und Kanamycin-resistente Transformanten isoliert. Transformanten von jeder Verkürzungsfraktion A und B wurden aufgenommen, minipreps bei 42ºC induziert und die Präparationen unter dem Lichtmikroskop auf die Anwesenheit von Einschlußkörpern untersucht. Von Einschluß-positiven Präparationen wurden minipreps angelegt, mit XbaI verdaut, und die inserierten DNA-Stücke hinsichtlich Größe durch Agarosegelelektrophorese untersucht. Proben, deren Größe 600 bis 650 bp betrug, wurden zur DNA-Sequenzierung ausgewählt, um die Struktur der Verkürzungen zu bestätigen. Nachfolgende Analysen der exprimierten rekombinanten Proteine zeigten, daß eine für ADP-Ribosyltransferaseaktivität notwendige Region des S1-Moleküls und ein Epitop, das beim Hervorrufen einer schützenden Antwort beteiligt ist (d.h. ein antigenes Epitop, das einen monoklonalen Antikörper bindet, der Mäuse passiv gegen Toxinaktivität schützt), in einer einschließlich durch Valin 7 und Prolin 14 begrenzten Region (für vollständige Aminosäureseguenz, siehe Locht und Keith, siehe oben) des reifen Moleküls liegt. Diese verkürzten Versionen des S1-Moleküls beginnen dank der Vektorkonstruktion an ihren N-Termini alle mit Methionylvalyl, gefolgt von der verkürzten Sequenz.
- Mutagenese von S1. Um die Feinkartierung der durch Valin 7 und Prolin 14 begrenzten Region vorzunehmen und um S1-analoge Moleküle herzustellen, denen enyzmatische Aktivität fehlt, während das schützende Epitop in dieser Region beibehalten wird, wurde das rekombinante S1-Gen einer Mutagenese unterzogen. Beibehaltung des schützenden Epitops ist durch Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper 1B7 definiert. Dies wurde erreicht, indem die authentische Region, die die Reste Valin 7 bis Prolin 14 codiert, durch synthetische Oligodeoxynucleotidsegmente ersetzt wurde. Diese Segmente enthielten Einzel- oder Doppelcodon-Substitutionen, um die authentische Aminosäuresequenz zu modifizieren. Modifikationen können erhalten werden durch Deletion und/oder Substitution. Es liegt innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, eine einzelne Base zu modifizieren, um die erwünschten Eigenschaften des S1-Analogen zu erhalten. Eine einzelne Base kann modifiziert werden, um die Aminosäuresequenz zu modifizieren. Es ist jedoch den Fachleuten bekannt, daß die statistische Wahrscheinlichkeit einer genotypischen Reversion zum Wildtyp größer ist, wenn eine einzelne Base modifiziert wird, verglichen mit Modifikation von mindestens zwei Basen. Deshalb betraf in einer bevorzugten Ausführungsform jeder dieser Codonwechsel die Substitution von mindestens zwei Basen in jedem Codon, um die Wirksamkeit von Reversionen zu verringern. Die Oligodeoxynucleotidlinker wurden mit AccI- und BspMII-kohäsiven Enden synthetisiert und enthielten die authentische S1-Sequenz mit Ausnahme der Codonwechsel, die in den Beschreibungen der Linker in Tabelle 1 festgestellt sind: TABELLE 1 Konstrukt: Codonwechsel: Sequenz des Oligonucleotidlinkers: Konstrukt: Codonwechsel: Sequenz des Oligonucleotidlinkers:
- Für die Konstruktion von Expressionsplasmiden wurden die folgenden DNA-Fragmente durch Elektroelution aus Agarosegelen isoliert:
- 1) ein 1824 bp-DNA-Fragment (AccI bis SstI) aus pPTXS1 (6A), ein Plasmid, das wie zuvor beschrieben konstruiert wurde, das ein rekombinantes S1-analoges Molekül exprimierte, bei dem Aspartat 1 und Aspartat 2 deletiert sind und mit Methionylvalyl substituiert ist;
- 2) ein 3,56 Kb-DNA-Fragment (SstI bis BspMII) aus pPTXS1 (338), ein Plasmid, das wie zuvor beschrieben konstruiert wurde, das ein rekombinantes S1-Analoges exprimierte, das die ersten 14 Aminosäurereste deletiert und ein Methionylvalyl substituiert hat. Bei dieser speziellen Genkonstruktion schuf die Ligation glatter Enden, die zu diesem verkürzten Molekül führte, eine neue BspMII-Stelle. Diese nicht im nativen cistronischen Element von S1 vorhandene Restriktionsstelle erlaubte die Verwendung von vergleichsweise kurzen Oligonucleotidlinkern mit AccI-und BspMII-kohäsiven Enden, um die Mutagenese zu bewirken.
- Diese zwei DNA-Fragmente wurden mit den oben beschriebenen einzelnen oligodeoxynucleotidfragmenten unter Standardligationsbedingungen ligiert. Diese Ligationen führten zu neu konstruierten S1-Genen: Ein Teil von pPTXS1 (6A), der die stromaufwärts gelegenen Codons bis zum Punkt der AccI-Restriktionsstelle lieferte, die synthetischen Fragmente, die die verschiedenen Mutationen von Codons zwischen der Acci-Stelle und der BspMII-Stelle lieferten, und ein Teil von pPTXS1 (338), der den Rest der S1-codierenden Region stromabwärts der neuen BspMII-Restriktionsstelle lieferte. Nach der Ligation wurde jede Mischung verwendet, um eine eigene Präparation frischer, kompetenter FM5-Zellen zu transformieren. Transformanten wurden aufgenommen, als minipreps kultiviert, induziert um rekombinantes Protein zu bilden und Einschlußkörper-positive Proben unter dem Lichtmikroskop identifiziert. Diese Proben wurden in einem größeren Maßstab (1 bis 6 Liter) bei der Induktionstemperatur fermentiert, um größere Mengen eines jeden rekombinanten Analogproteins herzustellen. Die isolierten Zellmassen wurden in einer French Press nach Resuspension in destilliertem H&sub2;O mit 1 mM DTT lysiert. Einschlußkörper wurden aus diesen Lysaten durch einfache Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit isoliert. Diese Einschlußkörperproteinpräparationen enthielten so wenig wie 30 % und soviel wie 80 % der rekombinanten Proteine. Jede Präparation wurde hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, in einem Western Blot-Ansatz monoklonalen Antikörper B2F8 zu binden (Burnette, siehe oben), der gegen ein dominantes, in unseren Studien mit verkürzten S1-Analogen identifiziertes Epitop gerichtet ist, und monoklonalen Antikörper 1B7 zu binden, von dem bekannt ist, daß er Mäuse passiv beim intracerebralen Immunitätstest mit virulentem B. pertussis (Sato et al., siehe oben) schützt. Die Proben wurden auch hinsichtlich ADP-Ribosyltransferaseaktivität bewertet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 Probe Bindungen von Antikörper ADP-RTase-Aktivität keine PTX (kommerziell)
- Das S1-Analoge 4-1 (Arg9TLys) wies geringe oder keine Transferaseaktivität auf, während Reaktivität mit neutralisierendem mAb 1B7 beibehalten wurde. Nur äußerst geringe Mengen enzymatischer Aktivität konnten durch Erhöhen der Menge von 4-1-Protein im Test entdeckt werden (Fig. 8A); wiederholte Bestimmungen zeigten, daß die spezifische ADP-Ribosyltransferaseaktivität des S1-Analogen um einen Faktor von mindestens 5.000 verringert war. Messungen der mit der Einzelrestsubstitutionsmutante verbundenen NAD-Glycohydrolaseaktivität (Figur 8B) zeigte ein Muster ähnlich demjenigen, das aus der Evaluation von ADP-Ribosyltransferaseaktivität erhalten wurde. Das S1-Analoge 4-1 wies geringe oder nicht-nachweisbare Glycohydrolaseaktivität auf, was eine Verringerung in der Größenordnung dieser Aktivität um einen Faktor von mindestens 50 bis 100 anzeigt.
- Aufgrund seiner Fähigkeit, Bindung an einen passiv schützenden monoklonalen Antikörper beizubehalten (d.h. Beibehalten eines schützenden Hauptepitopes) und einen Hauptmarker von Toxinaktivität (ADP-Ribosyltransferase) nicht aufzuweisen, finden das durch Klon pPTXSL (6A-3/4-1) produzierte rekombinante S1-analoge Molekül, wie in Fig. 7 gezeigt und Modifikationen davon, Anwendung als sichere, ökonomische Untereinheitsimpstoffe, entweder alleine oder in Verbindung mit anderen PTX-Untereinheiten. Das durch Klon pPTXS1 (6A-3/4-1) produzierte S1-Analoge, wobei Arginin 9 durch Lysin ersetzt ist, ist beispielhaft für rS1-Analoge, die die erwünschten Eigenschaften aufweisen, die notwendig sind für sichere Untereinheitsimpfstoffe. Andere Analoge von 6A-3/4-1 könnten z.B. Aspartylaspartyl-Reste an Position 1 und 2, Methionylaspartylaspartyl-Reste an Positionen 0, 1 und 2, und Methionylvalylaspartyl-Reste an Positionen 0, 1 und 2 einschließen.
- Derzeitige nicht-zelluläre Impfstoffe enthalten S1-, S2-, S3-, S4-, und S5-Untereinheiten. Die durch Pertussistoxin bei kultivierten Säugerzellen bedingten morphologische Anderung wurde vor kurzem als eine Eigenheit der S1-Untereinheit nachgewiesen (Burns et al., 1987, Infect. Immun. 55:24-28), obwohl dieser Effekt nur in der Gegenwart des B-Oligomers gezeigt worden ist. Vorläufige hierin beschriebene Studien zeigten die Machbarkeit eines Einzeluntereinheitsimpfstoffes unter Verwendung von rS1-Analogen, die ein schützendes Hauptepitop beibehalten, denen aber toxische Aktivität fehlt. S1-Analoge finden auch Anwendung in Kombination mit Untereinheiten S2, S3, S4 und S5. Diese Untereinheiten können die Immunantwort gegen S1 steigern und können selbst schützende Epitope aufweisen. Es ist innerhalb des Umfanges dieser Erfindung, daß Impfstoffe, die S1- analoge Untereinheiten enthalten, weiterhin mindestens eine der besagten Untereinheiten von Bordetella-Exotoxin S2, S3, S4, S5, und Mischungen davon, enthalten können. Die S2, S3, S4, S5 können aus B. Pertussis gewonnene Untereinheiten, oder gentechnologisch erzeugte Untereinheiten und ihre Analogen sein. Gentechnologisch erzeugte Untereinheitsprodukte können Fusionsproteine und Nicht-Fusionsprotein einschließen.
- Zum Zwecke der im folgenden Abschnitt beschriebenen Experimente modifizierten wir das Expressionssystem, um eine S1-analoge Untereinheit (S1/1-4) zu produzieren, die über die Substitution Lysin-statt-Argenin-9 verfügt, die aber auch über die nativen Aspartylaspartat-Reste an ihrem Aminoterminus verfügt.
- Rekombinantes S1-Protein mit nativer Sequenz (S1/1) und Analoges S1/1-4 (wie oben beschrieben, enthält die Arg9TLys-Substitution und die aminoterminalen Aspartylaspartat-Reste der nativen Sequenzen) wurden einzeln aus den E. coli-Produzentenzellen durch ein Verfahren isoliert, welches Zellaufschluß, Zentrifugation, Harnstoffsolubilisierung, Ionenaustauschchromatographie, und Gelfiltrationschromatographie einschloß. Die Zellmassen wurden in 25 mM Tris-Puffer, pH 8,5, suspendiert und durch Hochdruckaufschluß (French Press) lysiert. Die Lysate wurden zentrifugiert und die unlöslichen Pellets, die die rekombinanten S1-Proteine enthielten, wurden in 8 M Harnstoff, 25 mM Tris, pH 8,5 solubilisiert. Nach der Zugabe von CuSO&sub4; bis zu einer Konzentration von 50 uM wurden die Mischungen über Nacht gerührt, um Bildung von Disulfidbrücken in den rekombinanten S1-Proteinen zu erlauben. Die Mischungen wurden mit einem identischen Volumen von 8 M Harnstoff, 25 mM Natriumcitrat, ph 3,8, verdünnt und auf S-Sepharose ("fast-flow") aufgetragen, die bei ph 3,8 mit 8 M Harnstoff äquilibriert war. Die Säulen wurden mit linearen NaCl-Gradienten (0 bis 0,5 M) in 8 M Harnstoff, 12,5 mM Natriumcitrat, pH 3,8, eluiert. Breite Peaks wurden von jeder Säule gesammelt und auf ph 7,5 titriert. Diese Pools chromatographischer Fraktionen wurden getrennt auf Sephacryl S-200-Säulen aufgetragen, die mit 2 M Harnstoff, 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,5, äquilibriert waren, und Pools von Elutionsmaterial wurden gesammelt, die oxidierte, monomere rekombinante S1-Proteine einer jeden Spezies (S1/1 und S1/1-4) darstellten. Gereinigte S1-Untereinheiten- Proteine wurden mittels SDS-PAGE analysiert, gefolgt von Silberfärbung der Proteine im Gel (Fig. 9). Gele (12 % Acrylamid) liefen unter reduzierenden Bedingungen. Spur 1, Mokekulargewichtsstandard (Pharmacia). Spur 2, 2 ug von B. pertussis-Holotoxin (List Biological Laboratories). Spur 3, 0,2 ug von B. pertussis-S1-Untereinheitsprotein (List Biological Laboratories). Spur 4, 0,2 ug rekombinantes S1/1. Spur 5, 0,2 ug rekombinantes S1/1-4. Spur 6, freibleibend. Spur 7, 0,4 ug S1- Untereinheitsprotein (List). Spur 8, 0,4 ug rekombinantes S1/1. Spur 9, 0,4 ug rekombinantes S2/1-4. Bei diesem Präparationsschritt waren die rekombinanten S1-Formen zu mehr als 90 % rein.
- Um die biologische Aktivität der S1-ArgTLys-Mutation zu bewerten, war es notwendig, die Assoziation des mutierten Analogen und des rekombinanten S1-Proteins mit nativer Sequenz zu Pertussisholotoxin-Form zu erreichen. Hochreines B-Oligomer von Pertussistoxin (eine pentamere Struktur der Toxinuntereinheiten S2, S3, S4, und S5) wurde geliefert von D. Burns, Center for Biologics Evaluation and Research, Food and Drug Administration. Man ließ zwei verschiedene Formen der S1-Untereinheit einzeln mit dem B-Oligomer assoziieren, um Holotoxinmoleküle (die entweder S1/1 oder S1/1-4 enthielten) gemäß dem folgenden Verfahren zu bilden. Äquimolare Mengen von rekombinanter S1-Form und B-Oligomer wurden in Lösungen aus 2 M Harnstoff, 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,5, kombiniert und für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Holotoxinbildung wurde durch Elektrophorese in nativen Acrylamidgelen bewertet (Fig. 10). Gel 1, rekombinantes S1/1 und natives Oligomer. Gel 2, rekombinantes S1/1-4 und natives B Oligomer. Gel 3, natives B-Oligomer. Gel 4, natives B. pertussis-Holotoxin. Gel 5, rekombinantes S1/1. Die Gele zeigen, daß Holotoxinformen aus der Kombination von nativem B-Oligomer mit entweder rekombinantem S1/1 oder rekombinantem S1/1-4 zusammengesetzt wurden.
- Halb-rekombinante Holotoxine (B-Oligomer plus entweder S1/1 oder Analoges S1.1-4) wurden dann hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, bei Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen in vitro eine Clusterbildungs-Reaktion hervorzurufen; von dieser Antwort ist gezeigt worden, daß sie ein Maß für die Cytopathizität von Pertussistoxin darstellt. Versuchsproben und geeignete Kontrollproben wurden in CHO-Zellkulturmedium (Dulbecco Modified Eagle Medium mit 10 % fötalem Rinderserum) verdünnt, durch Ultrafiltration sterilisiert, und weiter verdünnt durch serielle Überführung in Plastikkulturschalen mit 96-Näpfen. Etwa 5-7 x 10³ frisch trypsinierte CHO-Zellen (American Type Culture Collection CCL 61, CHO-Kl-Zellen) wurden zu jedem einzelnen Napf gegeben und die Schalen bei 37ºC in 5 % CO&sub2; für 48 bis 72 Stunden inkubiert. Die Zellmonolayer wurden mit phosphatgepufferter Saline gewaschen, mit Kristallviolett gefärbt, und auf das Vorhandensein von Zellclustern mittels Lichtmikroskopie untersucht.
- Fig. 11 zeigt die Ergebnisse solcher Analysen; von besonderem Interesse sind die Ergebnisse der Tafeln G, H und J, die das S1/1-4 Analoge betreffen. Das S1/1-4-Analoge alleine und die Verdünnung 1/1600 des aus S1/1-4-Analogem und B-Oligomer gebildeten Holotoxins zeigt ein Ausbleiben von Bildung von Zellclustern, wobei die Verdünnung 1/200 einen zu vernachlässigenden Umfang an Clusterbildung aufweist. Tafel A zeigt Zellen, die nur mit einer Pufferverdünnung von 1/200 behandelt sind. Platte B stellt Behandlung nur mit Oligomer B dar, bei einer Verdünnung von 1/200; ein geringer Umfang an Clusterbildung ist bei dieser Verdünnung sichtbar und wird kontaminierender nativer S1-Untereinheit zugeschrieben, die nach Reinigung verbleibt. Tafel B kann mit einem weiteren Feld desselben Napfes (Platte I) verglichen werden, das eindeutig Clusterbildungsaktivität der B-Oligomerpräparation bei einer Verdünnung von 1/200 zeigt. Tafel C zeigt Zellen, die mit nativer S1-Untereinheit kommerziell erhältlichen Reinheitsgrades (List Biologicals) bei einer Verdünnung von 1/2000 behandelt wurden. Tafel D zeigt natives Pertussisholotoxin kommerziell erhältlichen Reinheitsgrades (List Biologicals) bei einer Verdünnung von 1/2000, wobei der dramatische zytopathische Effekt von Pertussistoxin auf CHO-Zellen in Kultur demonstriert wird. Tafel E zeigt rekombinante S1-Untereinheit von nativer Sequenz (S1/1) bei einer Verdünnung von 1/2000. Tafel F zeigt S1/1 kombiniert mit B-Oligomer und 1/2000 verdünnt; der Effekt auf clusterbildung von CHO-Zellen scheint ebenso dramatisch zu sein wie mit nativem Holotoxin und untermauert die physikalischen Gelergebnisse (oben), die Holotoxinassoziation mit B- Oligomer und dem rekombinantem S1-Protein zeigt. Tafel G veranschaulicht, daß Arg9TLys-Mutante S1/1-4 selbst keinen Effekt auf die CHO-Zellen aufweist. Tafel H zeigt das Ausbleiben von Clusterbildung von CHO-Zellen bei einer Verdünnung von Holotoxin von 1/1600, das aus dem S1/1-4- Analogen und B-Oligomer gebildet wurde. Bei einer Verdünnung von 1/200 (Tafel J) kann eine geringe Clusterbildung durch das S1/1-4-enthaltende Holotoxin gesehen werden; jedoch erscheint der Beitrag durch die Form des S1-Analogen zum Clusterbildungseffekt unwesentlich, verglichen mit dem durch B-Oligomer selbst bei derselben Verdünnung (Tafel I).
- Erste Experimente wurden unternommen, um die wirksame Konzentration der verschiedenen Pertussistoxinformen zu quantifizieren, die benötigt werden, um das Phänomen der Clusterbildung von CHO-Zellen hervorzurufen. Vorläufige Ergebnisse zeigen, daß sowohl kommerzielles Pertussistoxin als auch Holotoxin, das rekombinantes S1/1 enthält, Clusterbildung von Zellen bei Konzentrationen von nur 0,25 bis 0,30 ng/ml verursachen kann; im Gegensatz dazu wird Holotoxin, das das S1/1-4-Analoge enthält, in Konzentrationen von mindestens 10 bis 25 ng/ml benötigt, um den Clusterbildungseffekt zu induzieren.
- Diese Ergebnisse bestätigen, daß der zytotoxische Effekt von Pertussistoxin in seiner S1-Untereinheitshälfte begründet liegt und daß er direkt mit seinen enzymatischen Aktivitäten verbunden ist. Noch wichtiger ist, daß diese Experimente zeigen, daß ein vergleichsweise nicht-toxisches Pertussistoxinmolekül gebildet werden kann aus spezifischen rekombinanten Toxinuntereinheiten, die durch ortsspezifische Mutagenese gewonnen wurden.
- Es ist beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung all jene Modifikationen und Verbesserungen einschließt, wie sie im Umfang der vorliegenden beanspruchten Erfindung erfolgen.
- Die in der vorhergehenden Beschreibung, in den folgenden Ansprüchen und/oder in den beigefügten Zeichnungen offenbarten Merkmale können sowohl einzeln als auch in irgendwelcher Kombination davon Gegenstand der Umsetzung der Erfindung in ihre verschiedenen Formen sein.
Claims (25)
1. Ein DNA-Molekül, das für ein Polypeptidanaloges der
S1-Untereinheit des Bordetella-Exotoxins codiert, wobei das
Peptidanaloge eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von der
natürlicherweise vorkommenden Sequenz der S1-Untereinheit durch
einen oder mehrere Aminosäurereste in der durch Valin 7 und
einschließlich Prolin 14 begrenzten Region unterscheidet,
wobei das Molekül ein Analogen codiert, das (a)
toxinneutralisierende Antikörpertiter hervorrufen kann und (b) frei von
Enzymaktivität ist, die mit Toxinreaktogenität verbunden ist.
2. Das DNA-Molekül nach Anspruch 1, das auch für ein
Hauptepitop codiert, das wichtig ist beim Verleihen von Immunität
gegen Bordetella-Toxizität.
3. Das DNA-Molekül nach Anspruch 1, das an der neunten
Position der Aminosäuresequenz des Analogen eine andere Aminosäure
als Arginin codiert.
4. Das DNA-Molekül nach Anspruch 3, wobei Arginin 9 durch
Lysin ersetzt worden ist.
5. Das DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei besagtes Bordetella-
Exotoxin aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Exotoxinen von
B. pertussis, B. parapertussis und B. bronchiseptica besteht.
6. Ein Polypeptidanaloges der S1-Untereinheit des Bordetella-
Exotoxins, wobei das Polypeptidanaloge eine Aminosäuresequenz
aufweist, die sich von der natürlicherweise vorkommenden
Sequenz der S1-Untereinheit durch einen oder mehrere
Aminosäurereste in der durch Valin 7 und einschließlich Prolin 14
begrenzten Region unterscheidet, wobei das Polypeptidanaloge
toxinneutralisierende Antikörpertiter hervorrufen kann und (b)
frei von Enzymaktivitäten ist, die mit Toxinreaktogenität
verbunden sind.
7. Das Analoge nach Anspruch 6, das ein Hauptepitop umfaßt,
das wichtig ist bei dem Verleihen von Immunität gegen
Bordetella-Toxizität.
8. Das Analoge nach Anspruch 6, wobei besagte
toxinneutralisierende Antikörpertiter Immunität gegen Bordetella-Toxizität
verleihen.
9. Das Analoge von Anspruch 6, das an der neunten Position der
Aminosäuresequenz einen anderen Aminosäurerest als Arginin
enthält.
10. Das Analoge nach Anspruch 9, wobei Arginin 9 durch Lysin
ersetzt worden ist.
11. Das Analoge nach Anspruch 6, wobei besagtes Bordetella-
Exotoxin aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Exotoxinen von
B. pertussis, B. parapertussis und B. bronchiseptica besteht.
12. Das Analoge nach Anspruch 6, wobei das Aminoende besagten
Analogen eine Methionylvalylsequenz umfaßt.
13. Ein Analoges von Bordetella-Exotoxin Untereinheit S1,
wobei besagtes Analoge eine Aminosäuresequenz umfaßt, wie in
Fig. 7 offenbart.
14. Ein verbesserter Impfstoff zur Immunisierung gegen
Bordetella pertussis, welcher ein Polypeptidanaloges der
S1-Untereinheit des Bordetella-Exotoxins umfaßt, wobei das
Polypeptidanaloge eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von der
natürlicherweise vorkommenden Sequenz der S1-Untereinheit
durch einen oder mehrere Aminosäurereste in der durch Valin 7
und einschließlich Prolin 14 begrenzten Region unterscheidet,
wobei das Polypeptidanaloge (a) toxinneutralisierende
Antikörpertiter hervorrufen kann und (b) frei von Enzymaktivität ist,
die mit Toxinreaktogenität verbunden ist.
15. Der verbesserte Impfstoff nach Anspruch 14, wobei besagtes
Analoge mindestens ein Hauptepitop zum Verleihen von Immunität
gegen Bordetella-Toxizität umfaßt.
16. Der verbesserte Impfstoff nach Anspruch 14, wobei besagte
toxinneutralisierende Antikörpertiter Immunität gegen
Bordetella-Toxizität verleihen.
17. Der verbesserte Impfstoff nach Anspruch 14, dadurch
gekennzeichnet, daß besagtes Analoge an der neunten Position der
Aminosäuresequenz einen anderen Aminosäurerest als Arginin
enthält.
18. Der verbesserte Impfstoff nach Anspruch 17, wobei Arginin
9 durch Lysin ersetzt worden ist.
19. Der verbesserte Impfstoff nach Anspruch 14, wobei besagtes
Bordetella-Exotoxin aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus
Exotoxinen von B. pertussis, B. parapertussis und B.
bronchiseptica besteht.
20. Der verbesserte Impfstoff nach Anspruch 15, der weiterhin
mindestens eine der besagten Bordetella-Exotoxinuntereinheiten
S2, S3, S4 und S5, und Mischungen davon, umfaßt.
21. Der verbesserte Impfstoff nach Anspruch 19, wobei
mindestens eine der besagten Bordetella-Exotoxinuntereinheiten S2,
S3, S4 und S5, und Mischungen davon, gentechnologisch erzeugt
ist.
22. Der verbesserte Impfstoff nach Anspruch 21, wobei besagte
gentechnologisch erzeugte Untereinheiten S2, S3, S4 und S5 als
Nicht-Fusionsproteine in rekombinanten Wirten exprimiert
werden, die aus den Gruppen ausgewählt werden, die aus E. coli,
S. cerivisiae, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi,
Baccillus sp. und vaccinia ausgewählt sind.
23. Ein Verfahren zur Herstellung eines DNA-Moleküls, wobei
das Verfahren Herstellen eines DNA-Moleküls, das ein
Polypeptidanaloges der S1-Untereinheit des Bordetella-Exotoxins
codiert, durch ortsspezifische Mutagenese des S1-Untereinheit-
DNA-Moleküls in der durch Valin 7 und einschließlich Prolin 14
begrenzten Region umfaßt, wobei das Molekül ein Analoges
codiert, das (a) toxinneutralisierende Anitkörpertiter
hervorrufen kann und (b) frei von enzymatischer Aktivität ist, die
mit Toxinreaktogenität verbunden ist.
24. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptidanalogen der
S1-Untereinheit des Bordetella-Exotoxins, wobei das Verfahren
ortsspezifische Mutagenese eines DNA-Moleküls, das die
S1-Untereinheit codiert, in der durch Valin 7 und einschließlich
Prolin 14 begrenzten Region umfaßt, wobei das
Polypeptidanaloge (a) toxinneutralisierende Antikörpertiter hervorrufen kann
und (b) frei von enzymatischen Aktivitäten ist, die mit
Toxinreaktogenität verbunden sind.
25. Ein Verfahren zur Herstellung eines verbesserten
Impfstoffes zur Immunisierung gegen Bordetella pertussis, welches
Herstellen eines Impfstoffes, der ein Polypeptidanaloges der S1-
Untereinheit des Bordetella-Exotoxins umfaßt, durch
ortsspezifische
Mutagenese eines DNA-Moleküls, das die S1-Untereinheit
codiert, in der durch Valin 7 und einschließlich Prolin 14
begrenzten Region umfaßt, wobei das Polypeptidanaloge (a)
toxinneutralisierende Antikörpertiter hervorrufen kann und (b)
frei von enzvmatischer Aktivität ist, die mit
Toxinreaktogenität verbunden ist.
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