CN109172818B - 一种蛋白牛痘疫苗及其效力检测方法 - Google Patents

一种蛋白牛痘疫苗及其效力检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及疫苗领域，公开了一种蛋白牛痘疫苗及其效力检测方法，该蛋白疫苗含有酵母表达且去除内毒素的纯度＞90%的病毒重组蛋白D8L，制备方法为：将酵母表达，纯度>90%的牛痘病毒重组蛋白D8L经过去除内毒素处理，得到内毒素含量<5 EU/ml的重组蛋白D8L溶液。效力检测方法为：将去除内毒素的重组蛋白D8L溶液经过两次皮下注射免疫小鼠，21天后在小鼠血清中可以检测到特异性的抗体和中和抗体，表明小鼠获得抗牛痘病毒的免疫保护。本发明的蛋白疫苗，无需额外疫苗佐剂，理论上可以替代传统的活体牛痘病毒疫苗，起到抗天花病毒等痘类病毒感染的作用。

Description

一种蛋白牛痘疫苗及其效力检测方法
技术领域
本发明涉及疫苗领域，尤其涉及一种蛋白牛痘疫苗及其效力检测方法。
背景技术
牛痘病毒属于痘病毒家族正痘病毒属的成员，痘病毒包括天花病毒，猴痘病毒，牛痘病毒和鼠痘病毒等。牛痘病毒有一个复杂庞大，高达200Kb的双链DNA基因组，,能编码病毒胞浆复制所需的大多数基因。牛痘病毒是痘病毒家族中研究得最多的，活体的牛痘病毒疫苗在上世纪70年代末就被用于免疫天花病毒。时至今日，虽然天花已经灭绝，然而牛痘疫苗接种率的下降，使恐怖分子有机会重新制造天花病毒，危害公共安全。广泛接种疫苗被认为是防范这一威胁的有效手段。然而，目前以活体牛痘苗为主的疫苗常伴有较高频率的严重副作用，尤其对于患有湿疹和免疫缺陷的病人。因此，迫切需要开发新的更加安全的疫苗，一方面是控制实质的天花感染，另一方面也是防止活体牛痘病毒制备的天花疫苗引起的潜在危害。传统的牛痘病毒疫苗主要是采用活体的牛痘病毒制备而成，相比之下，一种更安全的替代方法是使用高度纯化的重组蛋白疫苗。但是，许多重组蛋白激活宿主免疫应答的能力较弱，因此蛋白疫苗需要与佐剂共同使用来增强抗原的免疫原性。一般认为，佐剂的种类直接决定了免疫的效果和免疫反应的类型，但是其中的作用机制仍不清楚。改良疫苗和佐剂的组分以提升免疫效果是当务之急。对于牛痘病毒引起人体免疫应答的机制研究有助于发现新的具有免疫应答活性的病毒亚基组分，以此开发出更安全有效的病毒疫苗和抗病毒新药物。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种蛋白牛痘疫苗及其效力检测方法，本发明的蛋白疫苗，无需额外疫苗佐剂，理论上可以替代传统的活体牛痘病毒疫苗，起到抗病毒感染的作用。
本发明的具体技术方案为：一种蛋白牛痘疫苗，含有酵母表达且去除内毒素的纯度＞90%的病毒重组蛋白D8L。
D8L作为一种牛痘病毒的主要抗原已经被证实可以激活人和动物的体液免疫反应和在体外增强小鼠脾脏细胞的免疫应答反应，以往有研究证明将表达重组蛋白D8L的基因片段制备成DNA疫苗免疫小鼠，可以使小鼠获得部分免疫保护。DNA疫苗由于其潜在的遗传毒性和表达不可控性，其实际应用效果不如重组蛋白疫苗。但是一般的重组蛋白疫苗免疫原性较弱，因此需要与佐剂共同使用以增强抗原的免疫原性。例如，用三种大肠杆菌表达的重组蛋白疫苗A27L，B5R和D8L联合佐剂免疫可以使小鼠获得完全的免疫保护。本发明团队通过长期研究发现，D8L抗原具有TLR2的配体活力，因此可以同时引起宿主的先天免疫和体液免疫反应。无需使用佐剂，酵母表达的高纯度去除内毒素的牛痘病毒重组蛋白D8L单独免疫可使小鼠获得免疫保护。该方法获得的免疫效果优于含有D8L基因的DNA疫苗和以其他不具有TLR2配体活力的牛痘病毒重组蛋白（例如A33R）为基础制备的重组蛋白疫苗。以牛痘病毒重组蛋白D8L单一组分为基础制备蛋白疫苗，无需额外的疫苗佐剂，可以替代传统的活体牛痘病毒疫苗，有效预防天花病毒感染。
本发明涉及的病毒重组蛋白D8L是酵母中表达纯化的蛋白，纯度>90%，D8L为现有的蛋白，其氨基酸序列信息如下：
>tr|A0A2I2MC48|A0A2I2MC48_VACCW IMV membrane protein OS=Vacciniavirus (strain Western Reserve) OX=10254 GN=D8L PE=4 SV=1
MPQQLSPINIETKKAISNARLKPLDIHYNESKPTTIQNTGKLVRINFKGGYISGGFLPNEYVLSSLHIYWGKEDDYGSNHLIDVYKYSGEINLVHWNKKKYSSYEEAKKHDDGLIIISIFLQVLDHKNVYFQKIVNQLDSIRSANTSAPFDSVFYLDNLLPSKLDYFTYLGTTINHSADAVWIIFPTPINIHSDQLSKFRTLLSSSNHDGKPHYITENYRNPYKLNDDTQVYYSGEIIRAATTSPARENYFMRWLSDLRETCFSYYQKYIEENKTFAIIAIVFVFILTAILFFMSRRYSREKQN
所述蛋白牛痘疫苗，其制备方法包括以下步骤：
1）离心柱处理：对离心柱中树脂在首次使用及每次使用后进行再生和平衡；
2）蛋白样品准备：将酵母表达的纯度＞90%的病毒重组蛋白D8L溶于PBS中，得到蛋白溶液；
3）上样：揭去离心柱的顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入蛋白溶液，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中；
4）将离心柱在垂直混匀器中上下颠倒混匀；
5）松开离心柱新顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置于收集管中，离心处理，收集管中得到去除内毒素的病毒重组蛋白D8L溶液。
病毒重组蛋白D8L需要进一步用离心柱去除蛋白样品中的内毒素，以避免额外的免疫刺激。去除内毒素的病毒重组蛋白D8L作为蛋白疫苗用于免疫小鼠。免疫后用ELISA检测小鼠中特异性抗体的含量以及用流式法检测中和抗体的滴度，以检测蛋白疫苗的免疫效力。用去除内毒素的病毒重组蛋白A33R作为阴性对照。
其中，A33R为现有的蛋白，其信息如下：>sp|P68616|A33_VACCC Protein A33 OS=Vaccinia virus (strain Copenhagen) OX=10249 GN=A33R PE=1 SV=1
MMTPENDEEQTSVFSATVYGDKIQGKNKRKRVIGLCIRISMVISLLSMITMSAFLIVRLNQCMSANEAAITDAAVAVAAASSTHRKVASSTTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYQLFSDAKANCTAESSTLPNKSDVLITWLIDYVEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQEVRKYFCVKTMN。
作为优选，步骤2）中，所述蛋白溶液的浓度为0.15-0.25 mg/mL。
作为优选，步骤3）中，离心柱中加入400-600μL蛋白溶液。
作为优选，步骤4）中，将离心柱在0-6℃的垂直混匀器中上下颠倒混匀50-70min。
作为优选，步骤5）中，离心条件为400-600×g，40-80秒。
作为优选，步骤5）后，按步骤1）方法对离心柱中的树脂进行再生，然后储存于15-25wt%的乙醇溶液中，储存温度为2-8℃。
作为优选，步骤1）中，离心柱中树脂的再生和平衡的具体方法为：
1.1）将离心柱恢复到室温；
1.2）拧开离心柱底部开关，旋松顶部帽子，将离心柱放置于收集管中，离心处理，除去离心柱中的储存液，弃收集管中液体；
1.3）揭去顶帽，塞上底部塞子，在离心柱中加入0.15-0.25 N NaOH再生，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中，室温静止过夜；
1.4）松开顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置于收集管中，离心处理，弃去收集管中的液体；
1.5）揭去顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入1.5-2.5 M NaCl，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中；
1.6）松开顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置于收集管中，离心处理，弃去收集管中的液体；
1.7）揭去顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入无内毒素的超纯水，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中；
1.8）松开顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置在收集管中，离心处理，弃去收集管中的液体；
1.9）揭去顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入无内毒素的缓冲液，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中；
1.10）松开顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置于收集管中，离心处理，弃去收集管中的液体；
1.1）重复1.9）和1.10）步骤多次。
作为优选，步骤5）中所得的病毒重组蛋白D8L溶液中内毒素浓度不超过5 EU/mL。
上述蛋白牛痘疫苗的效力检测方法，包括以下步骤：
A）蛋白疫苗用于小鼠免疫：
取去除内毒素的病毒重组蛋白D8L和A33R，分别溶解于无内毒素的PBS中，溶解后浓度为0.15-0.25mg/mL；
C57BL/6小鼠分别通过皮下注射病毒重组蛋白D8L或A33R各一剂，10μg/剂，两周后用同样方法，注射第二剂相同剂量的同种蛋白；
在二次免疫后的21天收集小鼠的血清样本，用于抗体检测和中和抗体滴度测定；
B）免疫后小鼠血清中特异性抗体的含量测定：ELISA法测定小鼠血清中特异性抗体的浓度，分别测定IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3几种亚型的抗体含量；
C）免疫后小鼠血清中中和抗体滴度的测定：
用带有GFP荧光标记的重组牛痘病毒与不同浓度的血清中和后，根据按照MOI=0.25的比例感染HT1080细胞；
流式细胞仪检测每孔（包括阳性对照和阴性对照）GFP阳性的细胞比例；
根据GFP阳性的HT1080细胞数目，计算病毒滴度和中和抗体滴度；
与不用血清中和的条件进行数据相比。，
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
1.传统的重组蛋白疫苗免疫原性差，因此需要与佐剂共同使用以增强抗原的免疫原性。本发明团队通过研究发现，牛痘病毒重组蛋白D8L单独免疫小鼠可引起小鼠体内的免疫应答增强，以及产生具有特异性的保护抗体。以牛痘病毒重组蛋白D8L为基础制备蛋白疫苗，无需额外的疫苗佐剂，可以替代传统的活体牛痘病毒疫苗，有效预防天花病毒感染。
2.D8L具有TLR2配体活力，本发明用于动物免疫的重组蛋白疫苗为酵母中表达的重组蛋白D8L，纯度大于90%。并且经过去内毒素处理，内毒素含量小于5 EU/ml。配置合适剂量的重组蛋白溶液，经过两次皮下注射免疫小鼠，在免疫后第21天可以检测到特异性和滴度（IC50>200）较高的中和抗体。其免疫效果优于DNA疫苗和以不具有TLR2配体活力的牛痘病毒重组蛋白（例如A33R）为基础制备的蛋白疫苗。
附图说明
图1为实施例1中的重组的D8L刺激DC产生细胞因子和促进DC成熟，引起T细胞免疫反应增强的试验结果图；
图2为实施例1中的D8L诱导小鼠产生特异性的保护抗体的试验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种蛋白牛痘疫苗，含有酵母表达且去除内毒素的纯度＞90%的病毒重组蛋白D8L。
上述蛋白牛痘疫苗的制备方法包括以下步骤：
1）离心柱处理：对离心柱中树脂在首次使用及每次使用后进行再生和平衡，具体方法为：
1.1）将离心柱恢复到室温；
1.2）拧开离心柱底部开关，旋松顶部帽子，将离心柱放置于收集管中，离心处理，除去离心柱中的储存液，弃收集管中液体；
1.3）揭去顶帽，塞上底部塞子，在离心柱中加入0.15-0.25 N NaOH再生，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中，室温静止过夜；
1.4）松开顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置于收集管中，离心处理，弃去收集管中的液体；
1.5）揭去顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入1.5-2.5 M NaCl，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中；
1.6）松开顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置于收集管中，离心处理，弃去收集管中的液体；
1.7）揭去顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入无内毒素的超纯水，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中；
1.8）松开顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置在收集管中，离心处理，弃去收集管中的液体；
1.9）揭去顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入无内毒素的缓冲液，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中；
1.10）松开顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置于收集管中，离心处理，弃去收集管中的液体；
1.1）重复1.9）和1.10）步骤多次。
2）蛋白样品准备：将酵母表达的纯度＞90%的病毒重组蛋白D8L和A33R分别溶于PBS中，得到浓度为0.15-0.25 mg/mL的蛋白溶液。
3）上样：揭去离心柱的顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入400-600μL蛋白溶液，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中；
4）将离心柱在0-6℃的垂直混匀器中上下颠倒混匀50-70min。
5）松开离心柱新顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置于收集管中，离心处理（4-600xg，40-80秒），收集管中分别得到内毒素浓度不超过5 EU/mL的病毒重组蛋白D8L和A33R溶液。
6）按步骤1）方法对离心柱中的树脂进行再生，然后储存于15-25wt%的乙醇溶液中，储存温度为2-8℃。
上述蛋白牛痘疫苗的效力检测方法，其特征在于包括以下步骤：
A）蛋白疫苗用于小鼠免疫：
取去除内毒素的病毒重组蛋白D8L和A33R，分别溶解于无内毒素的PBS中，溶解后浓度为0.15-0.25mg/mL。
C57BL/6小鼠分别通过皮下注射病毒重组蛋白D8L或A33R各一剂，10μg/剂，两周后用同样方法，注射第二剂相同剂量的同种蛋白；
在二次免疫后的21天收集小鼠的血清样本，用于抗体检测和中和抗体滴度测定；
B）免疫后小鼠血清中特异性抗体的含量测定：ELISA法测定小鼠血清中特异性抗体的浓度，分别测定IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3几种亚型的抗体含量；
C）免疫后小鼠血清中中和抗体滴度的测定：
用带有GFP荧光标记的重组牛痘病毒与不同浓度的血清中和后，根据按照MOI=0.25的比例感染HT1080细胞；
流式细胞仪检测每孔（包括阳性对照和阴性对照）GFP阳性的细胞比例；
根据GFP阳性的HT1080细胞数目，计算病毒滴度和中和抗体滴度；
与不用血清中和的条件进行数据相比。
实施例1
一、病毒重组蛋白去内毒素步骤：
使用Thermo Scientific公司的“Pierce™ High Capacity Endotoxin RemovalSpin Columns, 0.25 mL”试剂盒进行内毒素去除，以下为具体操作程序：
1、 离心柱中树脂在首次使用及每次使用后都需要进行再生和平衡的步骤，具体操作为：
1.1、将离心柱恢复到室温。
1.2、拧开离心柱底部开关，旋松顶部帽子，将离心柱放置在收集管中，500xg离心1min，以除去离心柱中的储存液。弃收集管中液体。
1.3、揭去顶部帽子，塞上底部的塞子，在离心柱中加入0.2 N NaOH再生，套上新的顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中。室温静止过夜。
1.4、松开顶帽，去除底部塞子。将离心柱放置在收集管中，500xg离心1min，弃去收集管中的液体。
1.5、揭去顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入2 M NaCl，套上新的顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中。
1.6、松开顶帽，去除底部塞子。将离心柱放置在收集管中，500xg离心1min，弃去收集管中的液体。
1.7、揭去顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入无内毒素的超纯水，套上新的顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中。
1.8、松开顶帽，去除底部塞子。将离心柱放置在收集管中，500xg离心1min，弃去收集管中的液体。
1.9、揭去顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入无内毒素的缓冲液，套上新的顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中。
1.10、松开顶帽，去除底部塞子。将离心柱放置在收集管中，500xg离心1min，弃去收集管中的液体。
第1.9和1.10的步骤重复两次。
2、蛋白样品准备：将0.1mg酵母表达的重组蛋白样品（D8L和A33R，购买自MyBiosource公司）用500μl的PBS溶解。样品浓度为0.2 mg/ml。
3、上样：揭去顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入溶解好的500μl蛋白样品，套上新的顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中。
4、在4℃垂直混匀器中上下颠倒混匀1小时。
5、松开顶帽，去除底部塞子。将离心柱放置在新的干净的收集管中，500xg离心1min，收集管中为蛋白样品。
6、根据前述步骤1对树脂进行再生，并且储存在20%的乙醇中，放置在2-8℃。
注意事项：
1、操作过程中所有用到的容器，缓冲液和枪头必须为无内毒素级别。缓冲液用无内毒素水配制。操作过程注意戴手套。
2、树脂可以反复使用5次以上，不会对内毒素去除效率产生影响。
3、该试剂盒可去除含有10,000 EU/mL 的样品中99% 的内毒素。使用后，样品中的内毒素水平一般不超过5 EU/ml。
二、牛痘病毒蛋白用于小鼠免疫的方法，操作步骤如下：
1、取无内毒素的D8L和A33R蛋白各10 μg，分别溶解在50 μl 的无内毒素的PBS中（样品浓度0.2 mg/ml）。
2、C57BL/6小鼠分别通过皮下注射上述蛋白各一剂，10 μg/剂，两周后用同样方法，注射第二剂相同剂量的同种蛋白。
3、在二次免疫后的21天收集小鼠的血清样本。用于抗体检测和中和抗体滴度测定。
三、免疫后小鼠血清中特异性抗体的含量用ELISA法测定，操作步骤如下：
1、新的96孔板用1 μg/ml的重组D8L或A33R蛋白在4℃条件下包被过夜，包被缓冲液为0.1 M NaHCO3, pH 9.6。
2、每个孔用200 μl 含0.05% Tween 20的1×PBS (1×PBS/0.05% Tween 20)缓冲液洗三次。每次室温静置5 min。
3、每个孔用含10% FBS 的1×PBS 缓冲液饱和。室温静置15 min。
4、每个孔用含1×PBS/0.05% Tween 20洗三次。每次室温静置5 min。
5、用不同浓度梯度的血清样品室温孵育2小时。浓度梯度设置为：1:1000,1:3000,1:9000。每个梯度做3个平行副孔。
6、样品孔用1×PBS/0.05% Tween 20洗五次。每次室温静置5 min。
7、样品孔加入100 μl的生物素标记的山羊抗小鼠IgG1, IgG2 (包括IgG2a andIgG2b)和IgG3 (1/5000稀释; Southern Biotechnology Associates公司购买，货号107108，108308，109308，110308)，室温孵育1 h。
8、每个孔用1×PBS/0.05% Tween 20缓冲液洗三次。
9、加入HRP-偶联的链霉亲和素(稀释度 1/1000; BD Biosciences，货号550946)。室温孵育30 min。
10、每孔加入100 μl的底物溶剂(TMB; BD Biosciences，货号555214)，观察变色后，酶促反应用100 μl的2N HCl中止。
11、酶标仪测定450 nm的吸光度。
四、免疫后小鼠血清中中和抗体滴度的测定方法(Earl PL, Americo JL, MossB. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flowcytometric detection of green fluorescent protein. J Virol 2003;77:10684-10688.)，操作步骤如下：
用从D8L或A33R免疫的小鼠中分离血清；
将血清在56°C，30 min的条件下进行热灭活；
根据文献报道的方法制备表达EGFP的重组病毒VV-GFP(Wyatt LS, Earl PL,Moss B. Generation of Recombinant Vaccinia Viruses. Curr Protoc Microbiol2015;39:14A 14 11-18.)；病毒在TK-143B细胞中生长，并且用35%蔗糖垫通过离心法分离纯化(Zhu J, Martinez J, Huang X, Yang Y. Innate immunity against vacciniavirus is mediated by TLR2 and requires TLR-independent production of IFN-beta. Blood 2007;109:619-625.)；根据文献报道，通过TK-143B细胞空斑实验检测病毒滴度(Earl PL, Americo JL, Moss B. Development and use of a vaccinia virusneutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescentprotein. J Virol 2003;77:10684-10688.)，之后将病毒冻存在-80°C备用。制备得到的VV-GFP重组病毒，每管滴度应不低于1x107PFU/ml。
将小鼠血清用Spinner-2培养基按照两倍的稀释度依次稀释，获得8个浓度梯度的血清样品。每个稀释度做3个平行副孔。Spinner-2培养基配制方法为：MEM Spinner（Quality Biologicals，货号112-038-121）+2% FBS。
不同浓度的血清样品每份取50μl加入U底的96孔板中。
VV-GFP用Spinner-2培养基稀释至2.5x106 PFU/ml，每孔加入10μl，即2.5x104 PFU的病毒。
96孔板用水平混匀器900rmp旋转混匀5 min。接着在37℃的CO2培养箱中孵育1小时。
在病毒和血清孵育期间，将HT1080细胞用2,500 rpm离心1分钟，并用含有44μg/ml的阿拉伯糖苷(Cytosine arabinoside, Sigma-Aldrich，货号C1768 )的Spinner-2培养基重悬，调整细胞浓度至2.5x106细胞/ml，并暂存在37℃的CO2培养箱中。
病毒和血清孵育1小时后，在每孔加入40μl细胞悬液，使每孔中病毒PFU与细胞数的比例（MOI）达到0.25。基于这个MOI，在不感染的条件下，GFP阳性率约为20-30%。
在同一个96孔板中设置4个不感染病毒的阴性对照副孔和4个感染病毒但不加血清的阳性对照副孔。之后将96孔板重新放入CO2培养箱，37℃培养17小时。
96孔板用水平混匀器1000 rpm旋转混匀10到15min。之后每孔加入0.1 ml的2%PFA固定，继续旋转混匀10到15min。
用流式细胞仪检测每孔（包括阳性对照和阴性对照）GFP阳性的细胞比例，作为反映病毒复制能力的指标。每个样品收集5000个细胞。
与不用血清中和的条件相比，能使GFP表达比例降低50%，对应的血清稀释度为IC50。IC50可以根据EXCEL中的线性回归法计算得到。
实验结果
实施例1中的试验结果如图1、图2所示：
其中，在图1中，重组的D8L刺激DC产生细胞因子和促进DC成熟，引起T细胞免疫反应增强。从(A) C57BL/6 ，(B) 野生型C57BL/6 (WT), TLR2-/-, 以及MyD88-/-小鼠的骨髓细胞中分离DC，并用GM-CSF和IL-4刺激条件下培养5天。在第5天，DC用不同浓度重组D8L蛋白刺激18小时，同时在对照组加入重组A33R蛋白。用ELISA分析培养基上清中IL-6和TNF-α的分泌。结果用平均值± SD表示。(C)从C57BL/6小鼠骨髓细胞中分离的DC在GM-CSF和IL-4刺激下培养5天。在第5天，DC用D8L刺激18小时，A33R作为对照。CD11c阳性的DC用CD11c和CD80/86抗体染色，并用流式分析CD80/86的表达情况。CD11c阳性的DC表面CD80/86的表达水平用平均荧光强度(MFI)来反映，如图所示。(D) 共有2x104的纯化的初始OT-1 CD8+ T细胞(CD45.2+)与5×105 OVA多肽刺激的非成熟DC一起被过继转移到同类系的C57BL/6小鼠(CD45.1+)中。之后在受体小鼠皮下注射10 μg重组D8L，同时注射A33R作为对照。7天后，取小鼠脾脏以便分析转移后的细胞状况。脾脏细胞在体外用5 μg/ml brefeldin A 和 2 μg/ml OVA多肽(257SIINFEKL264)刺激6小时后，用anti-CD8抗体、anti-CD45.2抗体以及anti-IFN-γ抗体进行细胞内染色。总淋巴细胞中的克隆样OT-1 CD8+细胞的比例如图D（顶部）所示，CD8+ T淋巴细胞中IFN-γ阳性的克隆样细胞的比例如图D（底部）所示。选取三次独立的实验中的有代表性数据进行展示。
在图2中，D8L诱导小鼠产生特异性的保护抗体。C57BL/6小鼠用重组D8L或A33R（阴性对照）蛋白免疫，在最后一次免疫的第21天后，收集血清，用流式细胞术检测D8L特异性的IgG1(A)，IgG2 (B)，IgG3(C)以及中和抗体的滴度（IC50）(D)。（A-C）纵坐标为OD450，横坐标为稀释度，结果表明，D8L免疫的小鼠血清中IgG1，IgG2和IgG3的含量随不同稀释度增高而降低，而A33R免疫小鼠并没有诱导特异性的保护抗体。(D)纵坐标为IC50，即血清稀释度，可以看到，D8L诱导产生的中和抗体的IC50约为200，而A33R并没有诱导产生中和抗体。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.病毒重组蛋白D8L在制备蛋白牛痘疫苗中的应用，其特征在于：所述蛋白牛痘疫苗含有酵母表达且去除内毒素的纯度＞90%的病毒重组蛋白D8L，所述蛋白牛痘疫苗以病毒重组蛋白D8L为单一组分，且不含佐剂；
所述蛋白D8L的氨基酸序列如下所示：
MPQQLSPINIETKKAISNARLKPLDIHYNESKPTTIQNTGKLVRINFKGGYISGGFLPNEYVLSSLHIYWGKEDDYGSNHLIDVYKYSGEINLVHWNKKKYSSYEEAKKHDDGLIIISIFLQVLDHKNVYFQKIVNQLDSIRSANTSAPFDSVFYLDNLLPSKLDYFTYLGTTINHSADAVWIIFPTPINIHSDQLSKFRTLLSSSNHDGKPHYITENYRNPYKLNDDTQVYYSGEIIRAATTSPARENYFMRWLSDLRETCFSYYQKYIEENKTFAIIAIVFVFILTAILFFMSRRYSREKQN；
所述去除内毒素是指病毒重组蛋白D8L溶液中内毒素浓度不超过5 EU/mL。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白牛痘疫苗的制备方法包括以下步骤：
1）离心柱处理：对离心柱中树脂在首次使用及每次使用后进行再生和平衡；
2）蛋白样品准备：将酵母表达的纯度＞90%的病毒重组蛋白D8L溶于PBS中，得到蛋白溶液；
3）上样：揭去离心柱的顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入蛋白溶液，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中；
4）将离心柱在垂直混匀器中上下颠倒混匀；
5）松开离心柱新顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置于收集管中，离心处理，收集管中得到去除内毒素的病毒重组蛋白D8L溶液。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤2）中，所述蛋白溶液的浓度为0.15-0.25mg/mL。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤3）中，离心柱中加入400-600μL蛋白溶液。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤4）中，将离心柱在0-6℃的垂直混匀器中上下颠倒混匀50-70min。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤5）中，离心条件为400-600×g，40-80秒。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤5）后，按步骤1）方法对离心柱中的树脂进行再生，然后储存于15-25wt%的乙醇溶液中，储存温度为2-8℃。
8.如权利要求2或7所述的应用，其特征在于：步骤1）中，离心柱中树脂的再生和平衡的具体方法为：
1.1）将离心柱恢复到室温；
1.2）拧开离心柱底部开关，旋松顶部帽子，将离心柱放置于收集管中，离心处理，除去离心柱中的储存液，弃收集管中液体；
1.3）揭去顶帽，塞上底部塞子，在离心柱中加入0.15-0.25 N NaOH再生，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中，室温静止过夜；
1.4）松开顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置于收集管中，离心处理，弃去收集管中的液体；
1.5）揭去顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入1.5-2.5 M NaCl，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中；
1.6）松开顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置于收集管中，离心处理，弃去收集管中的液体；
1.7）揭去顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入无内毒素的超纯水，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中；
1.8）松开顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置在收集管中，离心处理，弃去收集管中的液体；
1.9）揭去顶帽，塞紧底部塞子，在离心柱中加入无内毒素的缓冲液，套上新顶帽，将离心柱颠倒混匀数次，直至离心柱中的树脂完全悬浮在液体中；
1.10）松开顶帽，去除底部塞子，将离心柱放置于收集管中，离心处理，弃去收集管中的液体；
1.1）重复1.9）和1.10）步骤多次。
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