TW202241499A - 具有提升免疫原性之經修飾副痘病毒（三） - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種具有提升免疫原性的經修飾副痘病毒，優選為一種副痘病毒載體、一種含有所述經修飾副痘病毒的生物細胞、一種含有所述經修飾副痘病毒載體和/或所述生物細胞的醫藥組成物，優選為一種疫苗，以及一種所述經修飾副痘病毒的新用途。

Description

具有提升免疫原性之經修飾副痘病毒(三)
本發明係關於一種具有提升免疫原性的經修飾副痘病毒，優選為一種副痘病毒載體、一種含有所述經修飾副痘病毒的生物細胞、一種含有所述經修飾副痘病毒載體和/或所述生物細胞的醫藥組成物，優選為一種疫苗，以及一種所述經修飾副痘病毒的新用途。
經修飾的病毒，例如病毒載體，在生物科學、醫學和製造工程中具有多種應用。例如，基於病毒載體的疫苗有望引發對任何種類抗原胜肽的細胞和體液免疫反應。在痘病毒科的副痘病毒屬內，羊傳染性膿皰病毒 (Orf virus；ORFV) D1701-V病毒株具有各種特別有利於載體平臺技術開發的特性，並被證明有助於各種疫苗接種方法。
然而，在經修飾病毒或病毒載體的技術領域中，可以發現的一個問題是其免疫原性低。低免疫原性降低了基於病毒載體的疫苗的有效性。目前解決這一問題的策略是使用免疫調節因子，或將病毒載體與可改善疫苗免疫反應的藥理學或免疫學藥物聯合使用。然而，這些方法尚未完全成功。一些病毒載體的包裝能力有限，且免疫調節因子的表現經常使病毒無法操作。此外，佐劑通常會對接種疫苗的生物體造成毒性，這也就是為什麼基於病毒載體的疫苗接種往往與副作用有關。
在此背景下，本技術領域有必要提供新型經修飾病毒，特別是病毒載體，其可用於有效生產基於病毒載體的疫苗和其它應用，從而減少甚至避免本技術領域中已知的問題。
因此，本發明的一個目的是分別提供這種經修飾的病毒或病毒載體，其特徵在於不需要摻雜免疫調節因子或使用含有佐劑的載體配方，便可提升其免疫原性。
本發明藉由提供一種經修飾的副痘病毒，優選為副痘病毒載體，來滿足這些和其它需求，該載體包括至少一個位在編碼「錨蛋白重複蛋白-1 (Ankyrin Repeat 1，ANK-1)」病毒開放閱讀框 (ORF) 中的功能性突變，其中該載體與未含有該功能性突變的同一載體相比，具有提升的免疫原性。
根據本發明，「副痘病毒」是痘病毒科和脊索病毒亞科中的病毒屬。像痘病毒科的所有成員一樣，它們是橢圓形的，且為相對較大的雙股去氧核糖核酸病毒。副痘病毒具有獨特的螺旋外鞘，可將其與其他痘病毒區分開來。副痘病毒感染脊椎動物，包括多種哺乳動物和人類。根據本發明，各種副痘病毒都是合適的，然而，羊傳染性膿皰病毒 (Orf病毒) 是優選的。
根據本發明，「經修飾的」副痘病毒是指由副痘病毒衍生的病毒，其在對應的野生型病毒上進行技術性修飾。
根據本發明，「副痘病毒載體」是指基於副痘病毒基因組或由副痘病毒基因組所組成的載體或質體，其被配置用於生物細胞的轉染，優選為哺乳動物和人類細胞，並且還優選用於將轉殖基因或外源基因運送到生物細胞中及/或將轉殖基因或外源基因在生物細胞中進行表現。
根據本發明，「錨蛋白重複蛋白-1 (ANK-1)」是屬於一群由兩個被環（loop）相隔的α螺旋所組成的蛋白質基序，首次在酵母菌Cdc10和果蠅Notch的訊息傳遞蛋白中發現。然而，錨蛋白重複蛋白 (ANK) 在整個生物界中無所不在，儘管如此，除了痘病毒科之外，特別是脊索痘病毒，錨蛋白重複蛋白不存在於大多數的病毒之中。該蛋白質基序是由串接重複共通結構域所組成，這些結構域對於促進蛋白質相互間的交互作用至關重要，並且存在於由羊傳染性膿皰病毒株D1701-V所編碼的四個蛋白質中 (ORF123、ORF126 (ANK-1)、ORF128 (ANK-2) 和ORF129 (ANK-3))。雖然許多的細胞性錨蛋白重複蛋白被描述為參與細胞間的訊息傳導、細胞骨架完整性、轉錄和細胞周期的調節、發炎反應或蛋白質運輸，但對於痘病毒錨蛋白重複蛋白的功能知之甚少。過去已經證明了這四個蛋白質含有類F-box基序，該基序可以透過受質結合結構域將特定的受質招募到SCF1泛素連接酶，藉此利用細胞內的泛素-蛋白酶體機制。所述四個蛋白質中的其中一個蛋白質，即由ORF126所編碼的錨蛋白重複蛋白-1 (ANK-1)，已被證明其可透過必要的錨蛋白重複蛋白重複序列8和重複序列9與粒線體共同定位。然而，其生理上的結果尚未得到證實。此外，最近的一項研究報導了羊傳染性膿皰病毒所編碼的錨蛋白重複蛋白對缺氧誘導因子 (Hypoxia-inducible factor，HIF) 訊息途徑的影響。雖然該途徑在調節細胞對缺氧的反應上扮演著至關重要的角色，但是其下游標的例如血管生成和抗凋亡程式是有利於病毒發病。過去已經證實了在受羊傳染性膿皰病毒感染時，缺氧誘導因子的抑制因子 (factor inhibiting HIF，FIH) 會被ANK蛋白封存，進而導致缺氧誘導因子活性增強。
根據本發明，「功能性突變」是指基因和編碼蛋白質的基因改變，與非突變的野生型相比，其會導致活性和/或功能的變化。功能性突變包括但不限於剔除、點突變、刪除、框移突變、取代突變等，這些突變均會導致ANK-1功能改變，無論是導致ANK-1失能的結果，或是ANK-1的表現分別被抑制、減少或避免。
根據本發明，「免疫原性」是指副痘病毒載體在人類動物體內引發免疫反應的能力，即誘導體液和/或細胞介導免疫反應的能力。免疫原性可以透過本領域技術人員所熟知的各種方法來測量。有關這些方法的概述可以在Madhwa等人於2015年發表的「生物治療產品的免疫原性評估: 檢測及其效用的概述」文獻中找到，其刊載在「生物製劑」期刊第43卷，第5期，第298-306頁（Madhwa et al. (2015), Immunogenicity assessment of biotherapeutic products: An overview of assays and their utility, Biologicals Vol. 43, Is. 5, pp. 298-306）。
發明人認識到，具有功能性突變的副痘病毒載體，優選是失活的ANK-1，其特徵在於: 與非突變的對應載體或野生型病毒相比，其具有特定持續且較高的免疫原性。該載體能夠活化周邊血液單核細胞或在體外誘導抗原特異性免疫反應的能力，藉此證明了其免疫原性增加。同時，發明人發現，根據本發明經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體仍表現出優異的生長行為，並具有表達轉基因或外源基因的能力。藉由發明人所進行的分析證實，在設計基於載體的疫苗方面具有很大的潛力。
有鑑於已識別的增強免疫原性，根據本發明經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體也適用於其它應用，例如溶瘤病毒或載體、免疫刺激劑、用於基因治療的工具或滅活病毒。
發明人的發現令人驚訝，是本領域技術人員無法預料的。可以假設編碼ANK-1的開放閱讀框 (ORF) 對於功能和可複製性或副痘病毒基因組至關重要或至少是有利的，因此對於基於副痘病毒的載體而言，同樣是至關重要或至少是有利的。換句話說，可以假設在副痘病毒載體中，編碼ANK-1的開放閱讀框 (ORF) 是不可或缺的。此外，病毒開放閱讀框 (ORF) 中的功能性突變通常會導致免疫原性喪失，並且我們可以預期，當副痘病毒中編碼ANK-1的開放閱讀框 (ORF) 發生突變時，會有相同的效果。因此，本技術領域所指向的方向，是與本發明所指出的方向相反。
本發明所蘊含的問題在此可完全被實現。
在本發明的實施例中，相對於非突變的ANK-1，功能性突變會導致ANK-1的活性降低。
本實施例包括位在編碼ANK-1開放閱讀框 (ORF) 中的任何類型的基因改變，其導致ANK-1的功能喪失 (功能喪失型突變)，或者與野生型對應物相比，ANK-1的表現或活性顯著降低。因此，該實施例包括ANK-1功能的抑制，其不需要完全失活。然而，在本發明的實施例中，優選的是將ANK-1完全失活或減少到零。突變包括但不限於剔除、點突變、刪除、移碼突變、取代突變等，這些突變均導致ANK-1功能失活，無論是導致ANK-1功能失調的結果，或是ANK-1的表現分別被抑制、減少或避免。
在本發明的實施例中，經修飾的副痘病毒是羊傳染性膿皰病毒 (Orf病毒，ORFV)，或副痘病毒載體是羊傳染性膿皰病毒 (Orf病毒，ORFV) 載體。
羊傳染性膿皰病毒或Orf病毒 (ORFV) 是副痘病毒屬的原型，屬於痘病毒科。羊傳染性膿皰病毒 (ORFV) 是複雜的雙股去氧核糖核酸包膜病毒，其形態上類似於羊毛球，平均大小約為260 x 160 奈米。它們包含一個具有高GC含量且約130至150千鹼基對(kbp)大小的線性去氧核糖核酸基因組，其中心區域由位在其兩側的ITR區域 (「末端反向重複序列」) 所界定，並且末端有髮夾結構，其將兩個單股去氧核糖核酸相互共價連接。在基因組的中心區域，主要包含對病毒複製和形態發生至關重要的基因，並且在痘病毒中高度保守。相比之下，在ITR區域中，存在所謂的非保守致病基因，這些基因顯著地決定了宿主範圍、致病性和免疫調節，因此可以表徵病毒的特性。
羊傳染性膿皰病毒 (ORFV) 具有多種特性，這使其對於重組疫苗的生產變得有趣，並且比其他技術更受歡迎。與正痘病毒相比，羊傳染性膿皰病毒 (ORFV) 的特徵在於非常狹窄的天然宿主向性，其中包括綿羊和山羊。因此，幾乎可以排除在人體內由自然感染所引起對載體的抑制性「前免疫」，因為其可在最常見的牛痘和腺病毒載體中觀察到。此外，透過極為微弱且短暫的羊傳染性膿皰病毒特異性載體免疫性，可允許以基於羊傳染性膿皰病毒的疫苗作為非常有效的提升劑和/或刷新疫苗接種或免疫接種，且這些疫苗可以對抗其他的病原體。
在本發明的另一實施例中，該羊傳染性膿皰病毒是D170 1病毒株，優選為D1701-V病毒株。
該方案的優點是，採用這種被減弱且在宿主中僅引起漸近感染的病毒或載體。根據本發明，涵蓋了D1701的所有變體，包括D1701-B和D1701-V，而後者是優選的。病毒株D1701-V的特徵公開在Rziha等人於2019年發表的文章中（Rziha et al. (2019； l.c.)）。
在另一個實施例中，該ANK-1是由病毒開放讀取框126 (ORF126) 所編碼，優選地，該開放閱讀框 (ORF) 是位於核苷酸22,055 ± 100至核苷酸23,546 ± 100之間的核苷酸位置。
透過該方案，特定的開放讀取框是被提供作為失活的標的，在羊傳染性膿皰病毒株D1701中，該開放讀取框可編碼ANK-1。因此，本領域技術人員便可得知突變位置的詳細資訊。在這種情況下，指出的核苷酸位置是指含有31,805個核苷酸的序列，其包含由羊傳染性膿皰病毒株D1701-V基因組右側部分所編碼的去氧核糖核酸序列，經Rziha, H.-J.所確定，如圖2B中未發表的數據所示。
在另一實施例中，根據本發明，經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體還包括: (1) 至少一個編碼轉基因的核苷酸序列，以及 (2) 至少一個控制該編碼轉基因核苷酸序列表現的啟動子。
根據本發明，「轉基因」或同義的外源基因，是指非源自於副痘病毒基因組的基因或開放閱讀框 (ORF)。
根據本發明，「啟動子」是指這種核酸片段，其允許調節本發明副痘病毒載體中轉基因的表現。優選地，它是指羊傳染性膿皰病毒啟動子，例如: 存在於野生型羊傳染性膿皰病毒基因組中的啟動子或衍生自其的啟動子，或人工啟動子，例如痘病毒啟動子、巨細胞病毒啟動子等。
這種方案的優點是，本發明的病毒或載體可被用作生產任何外來蛋白質 (例如抗原) 的遺傳工具。搭配載體優異的免疫原性特性，這種實施例提高了本發明的病毒或載體作為疫苗組成物的活性物質或組成分的適用性。
在本發明的又一實施例中，該轉基因編碼核苷酸序列是被插入到該ANK-1編碼病毒開放閱讀框中，和/或可選地，該ANK-1編碼病毒開放閱讀框是被該轉基因編碼核苷酸序列所取代。
根據本發明，「被插入到ANK-1編碼病毒開放閱讀框」是指ANK-1編碼序列或是開放閱讀框分別在任何位置被刪除或打開，並且插入轉基因編碼序列及其啟動子。ANK-1編碼序列的片段可以透過上述程序去除，也可以不被去除。根據本發明，「被轉基因編碼核苷酸序列所取代」是指整個ANK-1編碼病毒開放閱讀框從病毒或載體中去除，並且由序列間隙接收轉基因編碼核苷酸序列及其啟動子。該實施例的優點是，插入轉基因編碼核苷酸序列提供了ANK-1的功能性突變或失活。
在另一個實施例中，根據本發明經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體包括多個轉基因編碼核苷酸序列，優選地，該轉基因編碼核苷酸序列的數量是選自於由2個、3個、4個或更多個所組成的群組。
在該實施例中，轉基因或轉基因編碼序列都可各自位於ANK-1編碼病毒開放閱讀框中。然而，或者是各種的轉基因編碼序列也可分別位於病毒或載體基因組或構建體中其他相同或不同的位置。在每個插入的基因座中，可以表現多個外源基因，優選是2個、3個、4個或更多個。例如，在羊傳染性膿皰病毒株D1701或D1701-V中，優選地，轉基因編碼序列可以位於病毒開放閱讀框112、119、126等任何一個之中。
該方案的優點是，透過本發明的單個經修飾副痘病毒或副痘病毒載體，可以表現多個外源基因或轉基因。該實施例特別適用於生產可同時針對許多抗原結構的多價疫苗。
在另一實施例中，根據本發明經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體，其啟動子是早期開放閱讀框啟動子，優選為包括選自於以下序列的核苷酸序列: SEQ ID NO: 1 (eP1)、SEQ ID NO: 2 (eP2)、SEQ ID NO: 3 (「優化早期」)、SEQ ID NO: 4 (7.5 kDa啟動子) 和SEQ ID NO: 5 (VEGF)。
該方案的優點是，使用這些啟動子可以使轉基因具有較高的表現水平，並對其表現進行靶向控制。啟動子eP1和eP2是由發明人所開發，並發表在Rziha, H.-J.等人的文獻中（Rziha, H.-J., et al. (2019; l.c.).）。其餘的啟動子是源自於痘苗病毒，並在其他的文獻中有所描述，例如: Davidson和Moss於1989年發表的「痘苗病毒晚期啟動子結構」文獻，刊載在「J. Mol. Biol.」期刊，第210卷，第771-784頁（Davidson and Moss (1989), Structure of Vacciniavirus late promoters, J. Mol. Biol., Vol. 210, pp- 771-784,）、Yang等人於2011年發表的「對痘苗病毒早期mRNAs的5端和3端的全基因組分析，描繪出註釋和異常轉錄本的調控序列」文獻，刊載在「J. Virology」期刊，第85卷，第12期，第5897-5909頁（Yang et al. (2011), Genome-wide analysis of the 5' and 3' ends of Vaccinia Virus early mRNAs delineates regulatory sequences of annotated and anomalous transcripts, J. Virology, Vol. 85, No. 12, pp. 5897-5909, Broyles (2003)），以及Broyles於2003年發表的「痘苗病毒轉錄」文獻，刊載在「J. Gene. Virol.」期刊，第84卷，第9期，第2293-2303頁（Broyles (2003), Vaccinia virus transcription, J. Gene. Virol., Vol. 84, No. 9, pp. 2293-2303）。根據發明人的發現，與啟動子eP1相比，啟動子eP2可引起顯著增加的表現強度。這是令人驚訝的，因為啟動子eP1與痘苗病毒的共通序列是完全相對應，而非啟動子eP2。「最佳」痘苗病毒啟動子 (正痘) 在羊傳染性膿皰病毒 (副痘) 中的低表現是矛盾且令人驚訝的。同樣令人驚訝的是，啟動子eP2可引起強烈的表現。
在另一實施例中，根據本發明經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體，其轉基因是選自於下列抗原群組: -   病毒抗原，優選地， 嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2) 抗原，包括刺突(S)、包膜(E)和核衣殼(N)蛋白； 狂犬病病毒抗原，包括糖蛋白 (RabG)； A型流感抗原，包括核蛋白(NP)、血球凝集素(HA)、神經胺酸酶(NA)； -   腫瘤抗原，優選為病毒腫瘤抗原，包括人類乳突病毒（HPV）選擇性病毒腫瘤抗原； -   腫瘤相關抗原，包括病毒腫瘤相關抗原，包括人類乳突病毒選擇性病毒腫瘤相關抗原； -   寄生抗原，優選為瘧原抗原（plasmodium antigen）； -   細胞激素； -   源自或衍生自哺乳動物的蛋白質，優選為來自哺乳動物接受者。
該方案的優點是，可透過本發明經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體來表現特別重要的抗原，尤其是用於疫苗的生產。
本發明的另一主題標的涉及一種生物細胞，優選為哺乳動物細胞，進一步優選為綠猴腎(Vero)細胞、HEK 293細胞或抗原呈現細胞，其含有根據本發明修飾的副痘病毒或副痘病毒載體。
根據本發明，Vero細胞和HEK 293細胞目前是用於生產經修飾的病毒或載體。然而，在宿主中，病毒是被抗原呈現細胞所吞噬。
本發明的另一主題標的涉及一種組成物，優選為醫藥組成物，其含有本發明經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體和/或本發明的生物細胞，以及醫藥上可接受的載體。該醫藥組成物，優選地，可以是疫苗，進一步優選為多價疫苗、免疫刺激劑、用於基因治療的工具等。
醫藥上可接受的載體是本技術領域所公知的。它們包括但不限於穩定劑、粘合劑、稀釋劑、鹽類、佐劑、緩衝劑、脂質等。概述可以在製藥出版社於2020年出版，由Rowe著作的「藥用賦形劑手冊」，第9版（Rowe (2020), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 9th edition, Pharmaceutical Press）中找到。
根據本發明，經修飾副痘病毒或副痘病毒載體的特性、優點、特徵和進一步發展，均可透過相對應的方式應用於本發明的生物細胞和組成物。
本發明的另一主題標的涉及一種經修飾副痘病毒或副痘病毒載體的用途，該病毒或載體包含至少一個位於編碼ANK-1病毒開放閱讀框 (ORF) 中的滅活突變，該用途是用於誘導生物體的免疫反應，優選為哺乳動物或人類。
根據本發明，經修飾副痘病毒或副痘病毒載體的特性、優點、特徵和進一步發展，均可透過相對應的方式應用於本發明的用途。
需要理解的是，先前提及的特徵和接下來要解釋的那些特徵，不僅可以在各種情況下所示的組合形式中使用，還可以在不脫離本發明範圍下，以其它組合形式或單獨使用。
1. 初步說明
本發明涉及經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體的用途，以其作為工具，用於誘導生物體中增強的免疫反應，並且在進一步發展中，用於轉基因或外源基因的表現。為了允許將多個轉基因插入到單一副痘病毒載體中，本發明還涉及編碼「ANK-1」開放閱讀框 (ORF) 的適用性，例如: 在羊傳染性膿皰病毒株D1701和D1701-V中，ORF126可作為轉基因表現的插入位點。關於新穎的刪除型突變體的特徵進行了詳細鑑定，包括: 經插入的AcGFP報導基因構建體的遺傳穩定性、突變體的生長行為及其在體外不同目標細胞中誘導轉基因表現的能力。此外，透過在體外和體內活化周邊血液單核細胞和抗原呈現細胞，或誘發抗原特異性免疫反應的能力，藉此分析突變體的免疫原性。綜上所述，根據所進行的這些分析，證實了藉由將ANK-1編碼開放閱讀框的敲除突變整合到副痘病毒基因組中，對於設計多價單一載體疫苗具有很大的潛力。因此，將開放閱讀框與報導基因GFP進行置換，不僅能有效地複製表現所需轉基因的穩定載體，而且還能使新生成的重組物具有顯著的免疫原性。 2. 導言
羊傳染性膿皰病毒株D1701-V是從經牛腎細胞株BK-KL3A適應培養而成的病毒株D1701-B中所獲得，並且其在非洲綠猴細胞株Vero細胞中適應培養生長後，進而具有若干基因體重組（Cottone, R., et al. (1998), Analysis of genomic rearrangement and subsequent gene deletion of the attenuated Orf virus strain D1701, Virus Research 56(1), p. 53-67; Rziha, H.J., et al. (2000), Generation of recombinant parapoxviruses: non-essential genes suitable for insertion and expression of foreign genes, Journal of Biotechnology 83(1), p. 137-145）。這些基因體重組包括刪除對該病毒株複製非必要且被證明適用於轉基因表現的基因，例如: 被刪除區域D (D基因座)；請參照Rziha, H.-J.等人的文獻（Rziha, H.-J., et al. (2019; l.c.).）。此外，血管生成因子VEGF-E被預測為誘發綿羊血性病變的主要致病決定因素，請參照Rziha, H.-J.等人的文獻（Rziha, H.-J., et al. (2019; l.c.).），因而被用作為插入位點，藉以產生可觸發具有高保護功效持久免疫力的羊傳染性膿皰病毒重組物，以對抗不同宿主中的一些病毒性疾病。除了這些已被成功使用的插入位點外，在D1701-V基因組的末端還鑒定出其他可能適用於轉基因表現的基因。由於痘病毒的中心區域通常編碼與位置、間距和方向相關的保守必要基因，因此這些區域是對毒力、致病機制或宿主範圍的影響因子進行編碼，並被認為對於體外生長是可有可無的。雖然預測這些因子會干擾由宿主觸發的細胞和體液免疫反應的最佳誘導，但是刪除這些免疫調節基因可進一步提升D1701-V載體的免疫原性。因此，本研究的重點是將編碼「ANK-1」的基因刪除，並將其作為轉基因表現的插入位點。 ANK-1 (ANK-1) - ORF126
「ANK-1 (ANK-1)」是屬於一群由兩個被環相隔的α螺旋所組成的蛋白質模體，首次在酵母菌Cdc10和果蠅Notch的訊息傳遞蛋白中發現。然而，錨蛋白重複蛋白 (ANK) 在整個生物界中無所不在，儘管如此，除了痘病毒科之外，特別是脊索痘病毒，錨蛋白重複蛋白不存在於大多數的病毒之中；請參見Herbert, M.H.等人於2015年發表的「痘病毒的錨蛋白重複蛋白」文獻，刊載在「Viruses」期刊，第7卷，第2期，第709-738頁（Herbert, M.H. et al. (2015), Poxviral ankyrin proteins. Viruses 7(2): p. 709-38）。該蛋白質基序是由串接重複共通結構域所組成，這些結構域對於促進蛋白質相互間的交互作用至關重要，並且存在於由羊傳染性膿皰病毒株D1701-V所編碼的四個蛋白質中 (ORF123、ORF126 (ANK-1)、ORF128 (ANK-2) 和ORF129 (ANK-3))；請參見Rziha, H.-J., et al. (2019), Genomic Characterization of Orf Virus Strain D1701-V (Para-poxvirus) and Development of Novel Sites for Multiple Transgene Expression. Viruses 11(2): p. 127；以及 Rziha, H.J., et al. (2003), Relatedness and heterogeneity at the near-terminal end of the genome of a parapoxvirus bovis 1 strain (B177) compared with para-poxvirus ovis (Orf virus). J. Gen. Virol. 84(Pt 5): p. 1111-6。雖然許多的細胞性錨蛋白重複蛋白被描述為參與細胞間的訊息傳導、細胞骨架完整性、轉錄和細胞周期的調節、發炎反應或蛋白質運輸（Mosavi, L.K., et al. (2004), The ankyrin repeat as molecular architecture for protein recognition. Protein Sci. 13(6): p. 1435-48），但對於痘病毒錨蛋白重複蛋白的功能知之甚少。過去已經證明了這四個蛋白質含有類F-box基序，該基序可以透過受質結合結構域將特定的受質招募到SCF1泛素連接酶，藉此利用細胞內的泛素-蛋白酶體機制；請參見Sonnberg, S., et al. (2008), Poxvirus ankyrin repeat proteins are a unique class of F-box proteins that associate with cellular SCF1 ubiquitin ligase complexes. Proc Natl Acad Sci U S A 105(31): p. 10955-60。所述四個蛋白質中的其中一個蛋白質，即由ORF126所編碼的ANK-1 (ANK-1)，已被證明其可透過必要的錨蛋白重複蛋白重複序列8和重複序列9與粒線體共同定位。然而，其生理上的結果尚未得到證實；請參見Lacek, K., et al. (2014), Orf virus (ORFV) ANK-1 protein mitochondrial localization is mediated by ankyrin repeat motifs. Virus Genes 49(1): p. 68-79。此外，最近的一項研究報導了羊傳染性膿皰病毒所編碼的錨蛋白重複蛋白對缺氧誘導因子 (HIF) 訊息途徑的影響；請參見Chen, D.Y., et al. (2017), Ankyrin Repeat Proteins of Orf Virus Influence the Cellular Hypoxia Response Pathway. J. Virol. 91(1)。雖然該途徑在調節細胞對缺氧的反應上扮演著至關重要的角色，但是其下游標的例如血管生成和抗凋亡程式是有利於病毒發病機制；請參見Cuninghame, S., R. et al. (2014), Hypoxia-inducible factor 1 and its role in viral carcino-genesis. Virology 456-457: p. 370-83。Chen等人在他們的研究中已經證實了在受羊傳染性膿皰病毒感染時，抑制缺氧誘導因子的因子 (FIH) 會被錨蛋白重複蛋白隔離，進而導致缺氧誘導因子活性增強；請參照Chen等人（Chen et al. (2017; l.c.)）。 3. 材料和方法 新型 Del 位點重組物的生成與特徵
為了生成用於本研究的ORFV重組物，將Invitrogen所合成獲得的轉基因複製到轉移質體中。在細胞核轉染並接續感染Vero細胞後，藉由轉移質體與親本病毒基因組DNA之間的同源重組，使轉基因穩定地整合到ORFV的基因組中。 轉移質體的生成
使用相同的限制性內切酶對DNA插入片段以及質體載體進行酶切，並對感興趣的片段進行純化和連接。隨後，利用已連接的質體對細菌進行轉化，並挑選菌落以生產轉移質體。為了進行驗證，使用限制性內切酶進行對照酶切，之後以瓊脂糖凝膠電泳進行分析，而利用插入片段特異性引子進行DNA定序，藉此驗證轉基因正確地插入到質體載體中。下表總結了被生成的轉移質體，而質體圖和相對應的序列 (SEQ ID NO: 7)，如圖1所示。
轉移質體 DNA插入片段 質體載體 限制性內切酶
pDel126-2-AcGFP pD12- AcGFP pDel126 Mlu I/Spe I/(937及3411 bp)
轉染經羊 傳染性膿皰病毒感染的 Vero 細胞
重組ORFV的生成是依照兩個步驟: Vero細胞先用轉移質體進行轉染，再用羊傳染性膿皰病毒進行感染。轉染是透過一種基於電穿孔的轉染方法進行，稱為細胞核轉染。基於轉移質體和ORFV基因組上的同源序列，插入片段可以藉由同源重組而被整合到ORFV基因組中。為此，使用胰蛋白酶將Vero細胞進行分離，接著用5毫升的NF停止溶液進行重新懸浮並計數。對於每個轉染批次，將2.5 × 10 6個細胞轉移到1.5毫升的Eppendorf離心管中，並以63 rcf轉速進行10分鐘的離心。將細胞團塊重新懸浮在100微升的轉染溶液中 (Amaxa轉染試劑組中的轉染補充劑和CLB轉染緩衝液以1:4.5的比例進行混合)，再加入2微克的質體DNA，並轉移到轉染小管中。使用CLB轉染裝置進行轉染。接著，將經細胞核轉染的細胞重新懸浮在NF停止溶液中，並用巴斯德移液管將其轉移到T25細胞培養瓶中，培養瓶內含有6毫升已預熱的Vero細胞培養基。在37°C和5% CO 2條件下，將細胞立即以親本病毒 (MOI 1) 進行感染4小時，再用6毫升已預熱的PBS進行洗滌，接著在37°C和5% CO 2條件下，以新鮮的Vero細胞培養基進行培養72小時。當可以觀察到病毒噬斑或細胞病變效應 (CPE) 時，將細胞分別在-80°C和37°C水浴進行三次的反覆冷凍及解凍處理，藉以破壞細胞並釋放病毒子代。 ORFV 重組物的挑選
同源重組是發生在轉移質體的插入片段與ORFV基因組中的目標區域之間，其事件發生率大約為1:10000的機率。在如此罕見的事件之下，為了挑選並將重組ORFV與親本病毒分離，可以使用不同的挑選方法來進行。 透過螢光活化細胞分選 (FACS) 來挑選 ORFV 重組物
螢光活化細胞分選 (FACS) 是根據螢光標記物 (例如: GFP或mCherry) 的訊號有無來進行挑選。為此，將3 x 10 5個Vero細胞接種在含有3毫升Vero細胞培養基的6孔盤中。轉染裂解物透過連續稀釋，在37°C和5% CO 2條件下進行感染20~24小時。為了確保最佳挑選過程，先收集低感染率 (約1~5%) 的細胞，並在400 rcf轉速下離心5分鐘。隨後，用1毫升PBE洗滌細胞三次，最終將細胞重新懸浮在500微升的PBE中。使用BD FACSjazz (Biosciences) 進行單細胞FACS分選，將細胞分選到含有150微升Vero細胞培養基的96孔盤中，每孔內有10 4個Vero細胞。在37°C和5% CO 2條件下培養72小時後，挑選顯示有重組ORFV單一病毒噬斑的孔，以便進一步的擴增和分析。 透過限制性稀釋來挑選 ORFV 重組物
在利用螢光活化細胞分選(FACS)或磁珠細胞分選(MACS)進行挑選後，透過限制性稀釋，進一步挑選和純化病毒重組物。為此，將懸浮在25毫升Vero細胞培養基中的2 x 10 6個Vero細胞分配到12孔移液儲器中，其中第一個孔和其餘的孔分別含有3毫升或2毫升的細胞溶液。第一個孔加入3 x 10 5個從磁珠細胞分選出來的細胞或50~100 µl（微升）的病毒裂解物，並從第一個孔到最後一個孔以1:3的比例分別進行稀釋。將每個稀釋液中的150微升轉移到96孔盤的相對應孔內，並在37°C和5% CO 2條件下培養72小時。在72小時後，挑選含有單一病毒噬斑的孔，以便透過(螢光)顯微鏡做進一步的處理。 透過連續繼代來確認遺傳穩定性
為了研究螢光團編碼位點的遺傳穩定性，針對各個ORFV重組物進行10次連續繼代。為此，將5 x 10 5個Vero細胞接種在含有3毫升Vero細胞培養基的6孔盤中。首先，針對在限制性稀釋中顯示單一噬斑的病毒裂解物，透過連續稀釋，在37°C和5% CO 2條件下進行感染2小時。用PBS洗滌細胞兩次，接著在37°C和5% CO 2條件下，將其培養在3毫升Vero細胞培養基中72小時。利用Eclipse Ti2顯微鏡 (Nikon)，藉由螢光噬斑計數來確認顯示100~200個噬斑的孔。接下來，將細胞在-80°C下冷凍，且在室溫下解凍，並依照上述的方法，使用50微升的病毒裂解物來感染新接種的Vero細胞。 從捐贈的血液中分離出周邊血液單核細胞
周邊血液單核細胞 (PBMCs) 可以從圖賓根捐血中心所獲得的捐贈血液中分離出來。首先，將血液用PBS稀釋至總體積為100毫升。接下來，在4個含有15毫升Ficoll的50毫升離心管中分別加入25毫升的稀釋血液，使稀釋血液覆蓋於Ficoll上，並在室溫下以700g轉速進行離心20分鐘。將白血球 (可藉由密度梯度離心後所形成的白色層加以識別) 轉移到兩個50毫升離心管中，並在每個離心管中加入PBS至總體積為50 ml（毫升）。在室溫下以400g轉速進行離心10分鐘，之後將細胞團塊重新懸浮在50毫升的PBS中，並在室溫下以300g轉速進行離心10分鐘。將周邊血液單核細胞收集合併，加入PBS至總體積為50毫升，並進行細胞計數。 從周邊血液單核細胞中分離出單核細胞
從周邊血液單核細胞中分離單核細胞的原理是取決於單核細胞所表現的CD14。因此，在室溫下，將周邊血液單核細胞以300g轉速離心10分鐘，並將細胞團塊重新懸浮在4毫升的PBE和100微升的α-CD14微珠中。將懸浮液在4°C下培養15分鐘，並裝載到用PBE預平衡的LS管柱上。用3毫升的PBE洗滌管柱三次，然後用5毫升的PBE將CD14陽性單核細胞從管柱中洗脫出來，並進行細胞計數。 單核細胞分化為 moDC
在37°C和5% CO 2條件下，使用86 ng/ml GM-CSF及10 ng/ml IL-4針對經純化的單核細胞進行刺激5天，使其分化為樹突細胞（moDC）。 流式細胞技術
利用BD LSRFortessa流式細胞技術系統 (BD Biosciences) 來分析存活率和感染率，以及表面分子和細胞內分子的表現。利用螢光標記抗體在96孔U形底盤中進行樣品製備和細胞染色，並在4°C和400g轉速下進行離心5分鐘。為了測定感染率，將細胞用200微升的PFEA洗滌兩次，並將其重新懸浮在50微升的PFEA中，或可選地將其進行固定以便於螢光活化細胞分選分析。 抑制 Fc 受體
為了防止非特異性的抗體結合，根據製造商的指示，在染色程序之前，將表現Fc受體的細胞先用Fc-block進行處理。 多聚體染色
多聚體常用於鑑定和定量抗原特異性T細胞。四聚體是由四個重組主要組織相容性複合體(MHC)分子所組成，該重組主要組織相容性複合體分子是與經螢光標記鏈霉親和素複合物偶聯。相比之下，Dextramer是由帶有多個螢光團和MHC分子的糊精骨幹所組成。多聚體可以加載感興趣的肽，以便形成可被特異性T細胞辨識的肽-MHC複合物，進而透過流式細胞技術進行檢測。為此，將細胞用200微升PBS洗滌兩次，並分別重新懸浮在50微升的四聚體溶液或PBS中。在用50微升四聚體溶液進行染色之前，先將PE偶聯的HLA四聚體與四聚體緩衝液以1:50的比例混合，並以13,000g轉速離心10分鐘。按照相同的步驟，將Dextramer與PBS以1:10的比例混合，再用Dextramer進行染色。在室溫下，避光培養30分鐘。 細胞存活率的測定
細胞存活率是透過Zombie Aqua染色來測定。Zombie Aqua是一種胺反應性螢光染料，其無法穿透活細胞，但可進入細胞膜受損的細胞。因此，它可用來區別活的哺乳動物細胞和死的哺乳動物細胞。關於Zombie Aqua染色，將細胞用200微升PBS洗滌兩次，並重新懸浮在50微升預先與PBS以1:400比例稀釋的Zombie Aqua溶液中，在4°C下，避光培養30分鐘。 細胞外抗體染色
為了分析表面分子的表現，將細胞用200微升PFEA洗滌兩次，並重新懸浮在50微升新鮮配製在PFEA中的抗體混合物，在4°C下，避光培養30分鐘。 細胞內細胞激素染色
為了檢測細胞內細胞激素，將細胞用10微克/毫升的Brefeldin A進行處理，以防止蛋白質分泌，並用相對應的合成肽進行刺激12~14小時。在進行細胞內細胞激素染色之前，將細胞用200微升PFEA洗滌兩次，並使用50微升的Cytofix / Cytoperm在4°C下避光培養30分鐘進行細胞透化。接下來，將細胞重新懸浮並用200微升Permwash洗滌兩次，然後用50微升配製在Permwash中的抗體混合物，在4°C下，避光染色30分鐘。 細胞固定
為了使保存超過4小時，將細胞進行固定。為此，將細胞用200微升PFEA洗滌兩次，並重新懸浮在50微升含有1%甲醛的PFEA中，在4°C下避光保存。在10天內進行樣品分析。 小鼠免疫接種
從查爾斯河(德國查爾斯河實驗室)取得10隻至少6周齡的遠交品系CD1小鼠，並將其安置在德國圖賓根大學內生物安全第1級的動物房中。所有動物都嚴格遵照優良動物規範進行處理，並遵守當地動物實驗和倫理委員會的指導方針 - 實驗是在專案許可證 (Nr. IM 1/20G) 下進行的。將10 7PFU的羊傳染性膿皰病毒重組物以肌肉注射方式 (i.m.)，注射在小鼠的前脛骨進行兩次免疫，每次免疫間隔兩週。在增強免疫接種後兩週，透過眼窩採血收集用於體液免疫分析的血液樣品。在增強免疫接種後兩週，動物經人道安樂死後，依照標準程序收集並分離用於細胞免疫分析的脾細胞。 IFN-γ 酶聯免疫斑點分析法 (ELISPOT)
根據製造商的指示，利用老鼠IFN-γ ELISpot PLUS (ALP) 試劑組進行酶聯免疫斑點分析 (ELISPOT) (試劑組目錄型號為3321-4APW-10，Mabtech，瑞典)。針對每孔中2 × 10 5個脾細胞，使用最終濃度為2 μg/ml的重疊S1肽池進行刺激21小時 (目錄型號為130-127-041，Miltenyi，德國)。透過ImmunoSpot S5分析儀 (Cellular Technology Limited，美國) 和ImmunoSpot軟體自動計數所形成的斑點。 4. 結果 新型 Del 位點重組物的生成
在成功生成轉移質體後，依照上述方法來生成新型ORFV重組物。因此，透過細胞核轉染，將質體pDel126-2-AcGFP轉移到Vero細胞中，隨後用親本病毒V12-Cherry感染Vero細胞。基於ORFV基因組和轉移質體中插入片段兩側區域的同源序列，透過同源重組將羊傳染性膿皰病毒D1701-V基因組中的ORF126穩定地置換為GFP (如圖2所示)。ORF126是位於含有31,805個核苷酸的D1701-V DNA序列之右側部分 (Rziha, H.-J.未發表的數據，如圖2B)，其確切位置如下表所示:
基因 / 開放閱讀框 ORF126
核苷酸位置 (Rziha, H.-J.未發表的數據) 22,055 ~ 23,546
接下來，透過FACS分選和限制性稀釋將會表現GFP和mCherry的經感染Vero細胞挑選出來，藉此將新型ORFV重組物分離出來。將DNA分離後，透過插入片段和基因座特異性PCR分型，可以監測經純化ORFV重組物的遺傳同質性，如圖3所示。在此，126和d126 PCR證實了ORF126已被刪除，且由GFP編碼序列所置換。隨後，如前所述，將新型ORFV重組物進行大量增殖。
重組ORFV刪除型突變體也可透過僅刪除ORF126但不插入GFP而生成，因此，與親本病毒相比，ORF126基因產物的功能喪失可以使其免疫原性提升。相對應的轉移質體和序列如圖4及SEQ ID NO: 8所示。 GFP 被穩定地插入到新型 Del 位點重組物中
為了研究被插入到新型Del位點中之GFP的穩定性，分別用新型Del位點重組物VCh126GFP和對照病毒VChD12GFP感染Vero細胞，並進行20次連續繼代。在整個實驗過程中，Vero細胞被新型Del位點重組物感染後，透過螢光顯微鏡，可在經感染生成的單一噬斑中觀察到GFP和mCherry螢光，如圖5所示。
此外，分別在經過1次、5次、10次、15次和20次繼代後，從經感染的Vero細胞中分離出病毒DNA，並透過刪除基因特異性和基因座特異性PCR，以便檢驗Del-基因座的完整性。如圖所示，在20次連續繼代期間，並未在126 PCR分析中檢測到ORF126特異性的273 bp片段 (如圖3A)，然而，在d126 PCR分析中，刪除位點則顯示有一插入到Del126基因座的GFP特異性1360 bp片段 (如圖3B)。
最後，針對三個ORFV D1701-V重組物的生物複製品 (病毒殖株)，在10次連續繼代期間，對插入到新型Del位點中的轉基因穩定性進行檢驗。在感染72小時後，透過螢光顯微鏡觀察含有100~200個噬斑的孔，藉此確定同時表現GFP和mCherry螢光團的單一噬斑數量，或僅表現GFP或mCherry其一的單一噬斑數量。圖6顯示了在10次連續繼代期間僅表現一個螢光團的噬斑百分比。
結果證實了使用VCh126GFP進行感染，僅表現GFP或mCherry的單一噬斑的頻率小於1%。綜上所述，結果表明了GFP可在經新型Del位點重組物感染的Vero細胞中穩定表現，並且在20次連續繼代期間，可在預測的基因組位點上被檢測到。此外，透過研究在10次連續繼代中受感染Vero細胞的螢光，分別驗證了GFP和mCherry在新型Del位點或vegf基因座中的遺傳穩定性。因為在經每個新型Del位點重組物感染的全部裂解噬斑中，經過10次繼代後，至少99%的裂解噬斑都會同時表現GFP和mCherry，這些結果表明了受檢驗基因組位點的遺傳穩定性。 新型 Del 位點重組物生長行為的特性
為了研究將基因刪除引入到新型Del位點重組物中，與對照病毒VChD12GFP相比是否會改變經羊傳染性膿皰病毒感染的Vero細胞（ORFV permissive Vero cells）之體外（ in vitro）生長特性，故進行了一步生長曲線實驗。為此，將Vero細胞以新型Del位點重組物VCh126GFP進行感染，達到24小時後的感染率約為20~25%。在吸附後2小時 (指定為0小時) 或在感染後6小時、24小時、48小時、72小時、96小時和120小時，將經感染的細胞進行洗滌並收集。用Vero細胞進行病毒裂解物的滴定，以確定感染性顆粒的數量，亦即每毫升所含有的噬斑形成單位 (PFU/ml)。對每個新型Del位點重組物進行三次實驗，結果如圖7所示。
新型Del位點重組物VCh126GFP的生長特性與對照病毒VChD12GFP的生長特性相類似，在感染後的120小時，可達到約10 7PFU/ml可相比的最終濃度。值得注意的是，VCh126GFP生長曲線顯示其所使用的病毒輸入量是低於VChD12GFP生長曲線，並且在整個實驗過程中，其最終病毒濃度與對照組相比僅略微降低 (如圖7所示)。儘管如此，這些結果表明了VCh126GFP是具有複製能力的，因為它能夠在經感染的Vero細胞中產生傳染性後代。 使用新型 Del 位點的表現強度分析
為了研究新型Del位點重組物對轉基因表現的潛力，在利用ORFV感染Vero細胞、單核細胞株THP-1和人類初代單核細胞衍生的樹突細胞 (moDCs) 後，將經整合到ORF126的報導基因GFP和經插入到vegf基因座的mCherry加以比較兩者的表現強度。為此，將細胞進行接種，並用新型Del位點重組物VCh126GFP和對照病毒VChD12GFP進行感染24小時或48小時。隨後進行FACS分析，以測定GFP和mCherry在細胞中表現的幾何平均螢光強度 (MFI)。為了分析人類初代單核細胞衍生的樹突細胞，使用來自於數個捐贈者的細胞進行實驗，以評估個體之間的差異。將從新型Del位點重組物感染所測得的幾何平均螢光強度，與在同個實驗中VChD12GFP的幾何平均螢光強度平均值進行歸一化校正。從Vero細胞、THP-1細胞及單核細胞衍生的樹突細胞所獲得的結果分別顯示於圖8、圖9及圖10中。
對於Vero細胞，以二重複進行了三個獨立實驗。如圖8所示，在感染24小時後，與對照病毒VChD12GFP相比，VCh126GFP所誘發的GFP水平顯著提高。
對於單核細胞THP-1，在感染後24小時和48小時，分別以3至6個複製品進行四個獨立實驗，和以3個複製品進行二個獨立實驗，藉此分析GFP和mCherry在單核細胞中的表現強度。在此，於感染後48小時，與經對照病毒感染的THP-1細胞相比，在經VCh126GFP感染的THP-1細胞中，可以檢測到mCherry的表現顯著增加 (如圖9A所示)。此外，在感染後24小時和48小時，與VChD12GFP相比，VCh126GFP可顯著地加速GFP的表現 (如圖9B所示)。與VChD12GFP相比，可注意到這些轉基因的表現水平相對升高，故刪除ORF126似乎有助於被整合到vegf基因座中轉基因的表現，而在單核細胞THP-1中，與D基因座所編碼的轉基因相比，被插入到ORF126中的轉基因有更強的表現水平。
為了研究轉基因在初代細胞中的表現，因此製備單核細胞衍生的樹突細胞（moDC），並進行感染，藉此與對照病毒VChD12GFP做比較。針對3位捐贈者，在感染後24小時和48小時，藉由FACS分析6個技術複製品中GFP和mCherry的平均螢光強度。如圖10所示，在經VCh126GFP感染的moDC中，在感染後24小時，GFP的表現顯著增加，且在感染後48小時，其表現顯著上升。因此，與D基因座的表現水平相比，經VCh126GFP感染的moDC有更強的表現水平。
綜上所述，藉由表現強度的分析，表明了將ORFV D1701-V所編碼的特定開放閱讀框刪除並用gfp加以置換，可改變被插入到vegf基因座中轉基因的表現。特別是將編碼ANK-1的開放閱讀框126刪除似乎會影響經插入轉基因的表現動力學。雖然大多數新型Del位點重組物所誘導的螢光報導基因GFP和mCherry的表現似乎有所下降，但是在THP-1細胞和moDC中，用VCh126GFP進行感染仍可以達到相當或更高的表現水平。 透過感染新型 Del 位點重組物以活化樹突細胞
先前Müller等人 (2019年，準備中) 能夠證實: 藉由吞噬編碼不同轉基因的ORFV重組物D1701-V，可以改變抗原呈現細胞的活化，例如周邊血液單核細胞中的樹突細胞或單核細胞。為了説明將ORF126刪除引入ORFVD1701-V基因組中的影響，使用VCh126GFP及對照病毒VChD12GFP感染moDC，並以未受感染的細胞作為陰性對照組。在感染24小時後，收集細胞，針對一位捐贈者中顯示有最多感染率的mCherry表現細胞，藉由FACS分析其活化標記CD40、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表現。經LPS處理及未受感染的細胞作為陰性對照組，而其活化標記的表現則是在mCherry陰性細胞中進行測量。
總體來説，針對從10位健康捐贈者中取得的受感染moDC，對其活化標記的表現進行測定。圖11A顯示來自於不同捐贈者的moDC，其感染率是介於5%至20%之間，平均而言是介於10%至15%之間。受感染的moDC其平均存活率與感染率之間並無關聯，存活率大約為60%。為了比較這些數據，將活化標記的表現與未受感染細胞的幾何平均螢光強度進行歸一化校正。圖12A和圖12B所顯示的結果表明，使用對照病毒VChD12GFP或VCh126GFP進行感染，活化標記 CD40及CD80的相對表現並沒有顯著差異。然而，如圖12C、圖12D和圖12E所示，在VCh126GFP感染moDC後，其CD83、CD86和HLADR的表現顯著增加。總結而言，將ORFV重組物D1701-V的ORF126刪除會對上述所分析之表面活化標記表現產生正面的影響。 SARS-CoV-2 ORFV 重組物的體內免疫原性
在兩次肌內注射(i.m.)免疫接種後，將編碼刺突蛋白(S1)和編碼核蛋白(N)的SARS-CoV-2 ORFV重組物在遠交品系CD1小鼠中的免疫原性進行比較。在增強免疫接種後，在所有疫苗組中均可檢測到高濃度的核蛋白和刺突蛋白抗原特異性結合抗體 (如圖13所示)。雖然將ORF126敲除的ORFV重組物所誘導的SARS-CoV-2核蛋白和刺突蛋白特異性結合抗體濃度與對照組的ORFV相當 (如圖13A和圖13B所示)，但是與其他兩組相比，使用ORF126敲除突變體進行初次-加強免疫接種的小鼠卻可產生最多可製造IFN-γ的T細胞 (如圖13C所示)。 5. 總結
綜上所述，根據對新型Del位點重組物所進行的分析，證實了藉由將ORF126的敲除突變整合到ORFVD1701-V基因組中，對於設計多價單一載體疫苗具有很大的潛力。將ORF126刪除和同時將報導基因GFP整合到各自的Del位點中，不僅能有效地複製表現所需轉基因的穩定載體，而且還能使新生成的重組物具有顯著的免疫原性。此外，結果證實: 缺少編碼ANK-1的ORF126之刪除型突變體能夠在體外刺激moDC增強活化標記表現，並且與對照突變體相比，能夠在體內引起類似的體液免疫反應以及較優異的細胞免疫反應。再者，就插入到Del位點126中的GFP而言，其表現動力學可引起最強的報導基因表現水平，表明了其適用於強力的轉基因表現。因此，本研究的結果使得生產具有有利特性的ORFVD1701-V載體疫苗變得可能，透過將ORF126刪除且同時藉由vegf基因座及Del位點126表現數種抗原和免疫調節因子的重組物，可以誘發強大、持久和有效的細胞和體液免疫反應。 6. 序列 SEQ ID NO 1: eP1啟動子的核苷酸序列 SEQ ID NO 2: eP2啟動子的核苷酸序列 SEQ ID NO 3: 「優化早期」啟動子的核苷酸序列 SEQ ID NO 4: 7.5 kDa啟動子的核苷酸序列 SEQ ID NO 5: VEGF啟動子的核苷酸序列 SEQ ID NO 6: D1701-V ORF125 - 126 - 127的核苷酸序列 (核苷酸1至2380) 開放閱讀框125 (ORF125): 核苷酸1至519 開放閱讀框126 (ORF126): 核苷酸629至2119 開放閱讀框127 (ORF127): 核苷酸2204至2758 SEQ ID NO 7: pDel 126-2-AcGFP的核苷酸序列 (核苷酸1至2057) HL (同源左臂) ORF125: 核苷酸1至447 早期啟動子 eP2: 核苷酸632至668 AcGFP: 核苷酸700至1416 HR (同源右臂) ORF127: 核苷酸1488至2057 SEQ ID NO 8: pDel 126的核苷酸序列 (核苷酸1至1132) HL (同源左臂) ORF125: 核苷酸1至447 HR (同源右臂) ORF127: 核苷酸563至1132
無
本發明現在藉由實施例來進一步解釋本發明的附加特徵、特性和優點。實施例純屬說明性質，並不限制本發明的範圍或廣度。在具體實施例中提到的特徵即是本發明的特徵，可以被視為一般性特徵，其不僅可適用於具體實施例中，亦可單獨適用於本發明中任何實施例的上下文中。請參閱所附的圖式，其顯示了以下內容。 圖1：pDel126-2-AcGFP質體圖。 圖2：將ORF126從D1701-V基因組中刪除的圖解說明。其中，圖2A顯示了Rziha等人 (2019; l.c.) （Rziha et al. (2019; l.c.)）最近發表的羊傳染性膿皰病毒株D1701-V的基因組圖譜。圖2B是由基因組右側部分所編碼的開放閱讀框 (ORF)；其中，包含31,805個核苷酸的DNA序列是由Rziha, H.-J.未發表的數據所確認。圖2C是基因組中各個基因刪除所在位置的放大圖。相對應的序列顯示在SEQ ID NO: 6。 圖3：GFP被穩定地插入至Del126中。Vero細胞中的VCh126GFP經過1、5、10、15和20次繼代後，126 PCR結果顯示基因126被穩定地刪除，如圖3A所示；而d126 PCR結果顯示具有1360個鹼基對的GFP特異性片段被插入至Del126基因座中，如圖3B所示。1%瓊脂糖凝膠；ni是指來自於未經感染的Vero細胞的DNA；M是指即用型1 kb Ladder, Nippon Genetics。 圖4：pDel126質體圖。 圖5：新型Del位點重組物VCh126GFP誘導GFP和mCherry在Vero細胞中進行表現。在感染新型Del位點重組物VCh126GFP和對照病毒VChD12GFP五天後，利用螢光顯微鏡觀察單一噬斑的形成。圖片分別顯示亮視野顯微鏡下的影像、單一GFP影像、mCherry channels影像，以及合併後的影像，而比例尺是代表500 µm（微米）。 圖6：轉基因gfp和mcherry在Del位點重組物VCh126GFP中的遺傳穩定性。在10次連續繼代中 (P1-P10)，感染後72小時，藉由單一噬斑計數來確認經感染Vero細胞中螢光團的表現。透過96孔限制性稀釋，以獲得每個Del位點重組物的3個病毒殖株（clone），圖6A顯示表現GFP單一噬斑的頻率、圖6B顯示表現mCherry單一噬斑的頻率，以及圖6C顯示表現螢光單一噬斑的總頻率。表現螢光單一噬斑的平均總頻率經計算後繪製於圖6D中。 圖7：Del位點重組物VCh126GFP的一步生長曲線。經感染的細胞 (MOI 1) 在吸附後2小時 (0 hpi) 和感染後指定的時間 (hpi) 進行洗滌和收集，而用Vero細胞對總細胞裂解物進行滴定，以確定病毒濃度 (PFU/毫升)。在120小時後，重組物VCh126GFP的病毒生長曲線達到了相當於對照組VChD12GFP的病毒濃度。 圖8：Vero細胞中GFP和mCherry表現的比較。在Vero細胞感染新型Del位點重組物VCh126GFP和對照病毒VChD12GFP後24小時和48小時，進行收集。藉由FACS分析來確定GFP的幾何平均螢光強度 (MFI)，並與VChD12GFP的幾何平均螢光強度進行歸一化校正。顯示的是三個獨立重複實驗的數據。使用信賴區間為95%的不成對t檢驗 (unpaired t-test) 進行統計分析: ns = p ≥ 0.05，* = p ＜ 0.05，** = p ＜ 0.01，*** = p ＜ 0.001。 圖9：單核細胞THP-1中GFP和mCherry表現的比較。在THP-1細胞感染新型Del位點重組物VCh126GFP和對照病毒VChD12GFP後24小時和48小時，進行收集。藉由FACS分析來確定mCherry(圖9A)和GFP(圖9B)的幾何平均螢光強度 (MFI)，並與VChD12GFP的幾何平均螢光強度進行歸一化校正。使用信賴區間為95%的不成對t檢驗 (unpaired t-test) 進行統計分析，以計算每個獨立實驗的平均值: ns = p ≥0.05，* = p ＜0.05，** = p ＜0.01，*** = p ＜0.001。 圖10：單核細胞衍生的樹突細胞中GFP和mCherry表現的比較。在單核細胞衍生的樹突細胞感染新型Del位點重組物VCh126GFP和對照病毒VChD12GFP後24小時和48小時，進行收集。藉由FACS分析來確定GFP的幾何平均螢光強度 (MFI)，並與VChD12GFP的幾何平均螢光強度進行歸一化校正。使用信賴區間為95%的不成對t檢驗 (unpaired t-test) 進行統計分析: ns = p ≥ 0.05，* = p ＜ 0.05，** = p ＜ 0.01，*** = p ＜ 0.001。 圖11：人類單核細胞衍生之樹突細胞的感染率及存活率。使用新型Del位點重組物VCh126GFP和對照病毒VChD12GFP感染10位不同捐贈者的單核細胞衍生之樹突細胞。分別透過mCherry的表現及Zombie Aqua染色來測定受感染細胞的百分比 (如圖11A所示) 及存活細胞的百分比 (如圖11B所示)。圖中顯示的是5個獨立進行的實驗數據及其平均值。使用信賴區間為95%的成對t檢驗 (paired t-test) 進行統計分析: ns = p ≥ 0.05，* = p ＜ 0.05，** = p ＜ 0.01，*** = p ＜ 0.001。 圖12：新型Del位點重組物VCh126GFP活化人類單核細胞衍生之樹突細胞。使用新型Del位點重組物VCh126GFP和對照病毒VChD12GFP感染5位不同捐贈者的單核細胞衍生之樹突細胞。受感染細胞的百分比是藉由mCherry的表現來確定，透過流式細胞技術來分析CD40 (如圖12A)、CD80 (如圖12B)、CD83 (如圖12C)、CD86 (如圖12D) 和 HLA-DR (如圖12E) 的表現，並將其與未受感染細胞進行歸一化校正，進而分析單核細胞衍生之樹突細胞的相對活化情形。圖中所示為在5個獨立進行的實驗中，各個表現強度的變化及其平均值。使用信賴區間為95%的成對t檢驗 (paired t-test) 進行統計分析: ns = p ≥ 0.05，* = p ＜ 0.05，** = p ＜ 0.01，*** = p ＜ 0.001。 圖13：經SARS-CoV-2羊傳染性膿皰病毒重組物刺激所引發的體液和細胞免疫反應。以間隔兩週的方式，對CD1小鼠分別以10 7PFU的表現N-或S1-SARS-CoV-2蛋白的對照羊傳染性膿皰病毒重組物或含有ORF126刪除突變的羊傳染性膿皰病毒載體，進行兩次免疫接種。如圖13A及圖13B所示，在第二次免疫接種後，利用ELISA對羊傳染性膿皰病毒載體所誘導的N和S1特異性結合抗體IgG總量進行分析。圖13C所示為利用IFN-γ酶聯免疫斑點法 (ELISPOT) 對羊傳染性膿皰病毒載體所引起的S1特異性細胞免疫反應進行分析。採用Dunnett多重比較測試的單因素方差分析 (ONE-WAY ANOVA)，用以評估與對照組羊傳染性膿皰病毒相比，二者間之結合抗體終點效價或IFN-γ斑點形成單位 (SFU) 的差異。
無
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004

Claims (15)

  1. 一種經修飾的副痘病毒，包括至少一個功能性突變，該功能性突變是位在編碼錨蛋白重複蛋白-1（Ankyrin Repeat 1，ANK-1）的病毒開放閱讀框中，其中，與未含有該功能性突變的相同載體相比，該病毒具有提升的免疫原性。
  2. 如請求項1所述之經修飾的副痘病毒，其中該功能性突變導致ANK-1的活性低於非突變的ANK-1。
  3. 如請求項1或2所述之經修飾的副痘病毒，其中該副痘病毒是一副痘病毒載體。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體，其中該副痘病毒是羊傳染性膿皰病毒（ Parapoxvirus ovis、 Orfvirus、ORFV），或該副痘病毒載體是羊傳染性膿皰病毒載體（ORFV vector）。
  5. 如請求項4所述之經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體，其中該ORFV是D1701病毒株，優選為D1701-V病毒株。
  6. 如前述請求項中任一項所述之經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體，其中該ANK-1是由病毒開放閱讀框126（ORF 126）所編碼，優選地，該ORF 126是位在介於核苷酸22,055 ± 100至核苷酸23,546 ± 100之間的核苷酸位置。
  7. 如前述請求項中任一項所述之經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體，還包括： (1)   至少一個轉基因編碼核苷酸序列，以及 (2)   至少一個控制該編碼轉基因之核苷酸序列的表現的啟動子。
  8. 如請求項6所述之經修飾的副痘病毒或副痘病毒，其中該轉基因編碼核苷酸序列是被插入到該ANK-1編碼病毒開放閱讀框中，或/及其中，該ANK-1編碼病毒開放閱讀框是被該轉基因編碼核苷酸序列所取代。
  9. 如請求項6至8中任一項所述之副痘病毒載體，包括多於一個的轉基因編碼核苷酸序列，優選地，轉基因編碼核苷酸序列的數量是選自於由2個、3個、4個或更多個所組成的群組。
  10. 如請求項6至9中任一項所述之經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體，其中該啟動子是一早期ORFV啟動子。
  11. 如請求項10所述之經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體，其中該早期ORFV啟動子包括一核苷酸序列，該核苷酸序列是選自於由SEQ ID NO 1 (eP1)、SEQ ID NO 2 (eP2)、SEQ ID NO 3 (早期優化)、SEQ ID NO 4 (7.5 kDa啟動子) 及SEQ ID NO 5 (VEGF)所組成的群組。
  12. 如前述請求項中任一項所述之經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體，其中該轉基因是選自於下列抗原的群組: -      病毒抗原，優選地， 嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2) 抗原，包括刺突(S)、包膜(E)和核衣殼(N)蛋白； 狂犬病病毒抗原，包括糖蛋白 (RabG)； A型流感抗原，包括核蛋白(NP)、血球凝集素(HA)、神經胺酸酶(NA)； -      腫瘤抗原，優選為病毒腫瘤抗原，包括人類乳突病毒(HPV)選擇性病毒腫瘤抗原； -      腫瘤相關抗原，包括病毒腫瘤相關抗原，包括HPV選擇性病毒腫瘤相關抗原； -      寄生抗原，優選為瘧原抗原（plasmodium antigen）； -      細胞激素； -      源自或衍生自哺乳動物的蛋白質，優選為來自哺乳動物接受者（mammal recipient）。
  13. 一種生物細胞，包含前述請求項中任一項所述之經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體，其中該生物細胞優選為哺乳動物細胞，進一步優選為綠猴腎（Vero）細胞、HEK 293細胞或抗原呈現細胞。
  14. 一種醫藥組成物，包含請求項1至12中任一項所述之經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體，或/及請求項13所述之生物細胞，以及醫藥上可接受的載體，其中該醫藥組成物優選為一疫苗。
  15. 一種經修飾的副痘病毒或副痘病毒載體的用途，該副痘病毒或該副痘病毒載體包括至少一個功能性突變，該功能性突變是位在編碼ANK-1編的病毒開放閱讀框中，該用途係用於誘發活體中的免疫反應，優選為哺乳動物或人類。
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