CN102083457A - 天花dna疫苗及其引起免疫应答的抗原 - Google Patents

Abstract

本发明涉及能够在哺乳动物中产生抗天花病毒的保护性免疫应答的DNA疫苗，其包含至少一种能够表达多种VACV MV抗原的DNA质粒，以及至少一种能够表达多种VACV EV抗原的DNA质粒。本发明还涉及在哺乳动物中诱导产生抗天花病毒的、包括中和抗体应答在内的保护性免疫应答的方法，其包括向所述哺乳动物的组织中注射所述DNA疫苗。

Description

天花DNA疫苗及其引起免疫应答的抗原

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2008年5月28日递交的美国临时申请No.61/056,687和2008年12月9日递交的美国临时申请No.61/121,054的优先权，其内容以引用的方式整体并入本文。

有关联邦政府资助的研究的声明

美国政府有本发明的已付费证，并且根据美国国防部授权的HDTRA1-07-C-0104合同条款在有限范围内有权要求专利持有人以合理条件向他人授权。

技术领域

本发明涉及天花病毒共有抗原、编码所述抗原的核酸质粒和由此制备的产生抗天花病毒的免疫应答的疫苗、以及利用这些产品保护哺乳动物避免天花病毒的方法。

背景技术

在上世纪最后25年间，几乎没有公众或者学术界的注意力集中于与天花或者天花疫苗有关的问题上。但是由于当前生物恐怖主义的相关事件，通过故意释放从而引起天花爆发的潜在危胁已成为真正的担忧。有几种因素使得天花成为恐怖武器的选择。天花可以大量产生，在贮存和运输时稳定，并且可以以浮粒形式产生，在暴露的未免疫个体中具有30％的致死率。天花的传染性很高，10-20个或者更多病例可以归因于起源自一个被感染个体。相应地，存在巨大担忧，即如果在恐怖袭击中释放天花，许多美国民众将有感染、患病和死亡的危险。

应用有限的商业许可天花疫苗是经确认的Dryvax疫苗和Acambis疫苗。该惠氏(Wyeth)生产的疫苗是来源于小牛淋巴之活牛痘病毒(VACV)的冻干制备品。惠氏在1983年停止向公众发售天花疫苗。Acambis疫苗是适于活组织培养的疫苗储存液，其仍然对人类有严重不利的影响。过去存在对Dryvax相关风险的担忧。这些担忧由于最近临床研究中的不利事件而加剧。主要的担忧是存在大量的免疫受损人群(被HIV感染的个体)并且老年群体比1970年大很多。此外，在北美生活的孕妇、静脉注射药物使用者、移植受体和服用免疫抑制药物的个体都是潜在的疫苗受种者，并且其处于原始Dryvax和近期Acambis活疫苗方案的风险增加。在北美，主要担心的是无法承受之数量的人可能会由于严重的并发症而入院治疗。许多人可能仅死于疫苗，或者在利用天花进行生物恐怖袭击时，由于对疫苗相关之健康状况的担忧，可能存在部署较慢或者不服从的情况。虽然最近的天花疫苗项目旨在防御生物恐怖事件，但是对自然发生之痘病毒疾病的担忧也在不断增长，因为具有由VACA所诱导的免疫的人数已经在减少。

西多福韦(Cidofovir)，一种用于治疗AIDS患者巨细胞病毒性视网膜炎的许可药物，具有抵抗几乎所有DNA病毒的广谱活性。最近，西多福韦在小鼠中显示出抵抗包括天花和猴痘(MPXV)等多种痘病毒的体外活性和体内活性。如果在暴露后几天内开始进行药物治疗，那么单次剂量的西多福韦即显示出保护小鼠免受致死呼吸感染以及牛痘的高效性。

但是目前的治疗也有其局限性。利用目前储备的疫苗来应对比二十世纪六十年代明显高的并发症率很可能是无效的，因为随着近期天花病毒的进化，其可能已不符合要求并且药效降低。免疫受损或者虚弱的人还有前述安全问题的担忧。DNA疫苗的可行性被认为是有潜力的疫苗平台，但是目前还需要在人体中证明其是成功的。此外，由于天花病毒是高度复杂的DNA病毒，其编码超过200种基因，具有两种感染形式，成熟粒子(MV)和包膜粒子(EV)均有其自身独特的膜糖蛋白体系和不同的侵入条件，因此用于研发出有效DNA疫苗的候选抗原难以确定。

仍然需要安全并且有效的现有天花疫苗之替代品。此外，需要耐受性良好、可以提供广泛免疫保护并且能够在生物恐怖威胁时及时大量生产的天花疫苗。

发明内容

本发明的一个方面涉及能够在哺乳动物中产生抗天花病毒的保护性免疫应答的DNA疫苗。该DNA疫苗包含至少一种能够表达多种VACVMV抗原的DNA质粒、以及至少一种能够表达多种VACV EV抗原的DNA质粒。优选该DNA疫苗还包含能够表达A4L抗原的DNA质粒。本发明的另一个方面涉及在哺乳动物中诱导抗天花病毒的、包括中和抗体应答在内的保护性免疫应答的方法，包括：向所述哺乳动物的组织中注射DNA疫苗，所述疫苗包含至少一种能够表达多种VACV MV抗原的DNA质粒、至少一种能够表达多种VACV EV抗原的DNA质粒以及能够表达A4L抗原的DNA质粒。优选该方法还包括利用电穿孔量的电能对所述组织进行电穿孔的步骤。

附图简述

本领域技术人员以附图作为参考可以更好地理解本发明的多种目的和优势，其中：

图1示出多种天花病毒质粒基产品的表格及其物理和化学特性的总结。

图2示出表达A4L抗原的pGX4001质粒图谱，其中包括共有序列、经人类密码子优化的A4L(编码如SEQ ID NO.：1所示的DNA序列)。

图3示出表达A27L抗原的pGX4002质粒图谱，其中包括共有序列、经人类密码子优化的A27L(编码如SEQ ID NO.：3所示的DNA序列)。

图4示出表达B5R抗原的pGX4003质粒图谱，其中包括共有序列、经人类密码子优化的B5R(编码如SEQ ID NO.：5所示的DNA序列)。

图5示出表达A33R抗原的pGX4004质粒图谱，其中包括共有序列、经人类密码子优化的A33R(编码如SEQ ID NO.：7所示的DNA序列)。

图6示出表达A56R抗原的pGX4005质粒图谱，其中包括共有序列、经人类密码子优化的A56R(编码如SEQ ID NO.：9所示的DNA序列)。

图7示出表达F9L抗原的pGX4006质粒图谱，其中包括共有序列、经人类密码子优化的F9L(编码如SEQ ID NO.：11所示的DNA序列)。

图8示出表达H3L抗原的pGX4007质粒图谱，其中包括共有序列、经人类密码子优化的H3L(编码如SEQ ID NO.：13所示的DNA序列)。

图9示出表达L1R抗原的pGX4008质粒图谱，其中包括共有序列、经人类密码子优化的L1R(编码如SEQ ID NO.：15所示的DNA序列)。

图10示出在兔中进行预试验的事件时间轴。

图11示出3个不同组的兔中B5R抗体应答的柱形图。

图12示出3个不同组的兔中H3L抗体应答的柱形图。

图13示出3个不同组的兔中A27L抗体应答的柱形图。

图14示出3个不同组的兔中L1R抗体应答的柱形图。

图15示出在食蟹猴(cynomolgus macaques)(非人灵长类动物)中进行预试验的事件时间轴。

图16示出3组灵长类动物ELISpot结果的柱形图。

图17示出在兔中进行皮内(ID)或者肌内(IM)抗原注射之比较性研究的事件时间轴。

图18示出对A至J组中每只兔给予多种质粒的电穿孔和递送条件的表格。

图19示出在多种IM或者ID情况下抗体效价(HA抗原)的柱形图。

图20示出在多种IM或者ID情况下抗体效价(B5R抗原)的柱形图。

图21示出在多种IM或者ID情况下抗体效价(A27L抗原)的柱形图。

图22示出兔IM或者ID疫苗接种方案的时间轴。

图23示出对A至J组中每只兔给予多种质粒的电穿孔和递送条件的表格。

图24示出多组兔中A27L抗原之抗体应答的柱形图。

图25示出多组兔中B5R抗原之抗体应答的柱形图。

图26示出多组兔中A4L抗原之抗体应答的柱形图。

图27示出多组兔中H3L抗原之抗体应答的柱形图。

图28示出多组兔中A33R抗原之抗体应答的柱形图。

图29示出多组兔中L1R抗原之抗体应答的柱形图。

图30示出第42天4种质粒的组合物抗A27L抗原之终点ELISA曲线的线形图。

图31示出第42天8种质粒的组合物抗A27L抗原之终点ELISA曲线的线形图。

图32示出第84天4种质粒的组合物抗A27L抗原之终点ELISA曲线的线形图。

图33示出第84天8种质粒的组合物抗A27L抗原之终点ELISA曲线的线形图。

图34每次接种中ID和IM递送后的增强型抗体和细胞应答。在第0、28和56天对食蟹猴进行接种：图34a示出每种抗原相对于pVAX1对照组之抗体应答的柱形图；图34b示出每次接种中ID和IM递送后细胞应答的柱形图(每次接种后从经免疫的食蟹猴个体中分离PBMC并将其集中。用每种抗原的肽库刺激PBMC，随后进行IFN-γELISPOT试验)。

图35a示出攻击后经接种的食蟹猴中病毒血症水平的图。利用定量TaqMan3’-小沟结合物(minor groove binder)PCR对每毫升血液中猴痘病毒基因组量进行测定。检测的较低限值是5000基因组/毫升血液。示出平均值和±S.E.M.。

图35b1示出所示组中一只猴的手和躯体痘疮的图。

图35b2示出痘疮总量的柱形图，以显示静脉攻击猴痘病毒后痘疮的发展情况。

图36示出攻击前和攻击后经接种的食蟹猴中抗VACV结合抗体的终点效价的图。终点效价以具有阳性活性＞阴性对照血清平均O.D.值加上3倍S.D.之血清最大稀释度的倒数表示。＞V表示接种天数；C表示攻击日。

图37示出猴痘病毒攻击前和攻击后中和抗体应答的图。所示为每个受试组的PRNT50中和抗体效价。V表示接种天数；C表示攻击天数。

图38示出VACV中和抗体效价与痘疮最大数量的Spearman等级相关性的图。

图39示出免疫后抗原特异性T细胞功能的图。第3次免疫后2周时分离PBMC并用A27或者B5总肽库的混合物于体外刺激5小时。对细胞进行染色，以观察IFNγ、TNFα和IL-2的产生以及CD107a的脱颗粒作用。还检测了CD4+(图39a)和CD8+细胞(图39b)的功能性表型。堆叠式柱形图显示每个免疫组对A27(灰色)和B5(黑色)之所有功能性应答的平均数值。

图40示出CD4+和CD8+细胞增殖能力的图。于第3次免疫后4周时分离的新鲜PBMC用CFSE染色，并用抗原特异性肽于体外刺激5天，以测定抗原特异性(图40a)CD4+和(图40b)CD8+T细胞的增殖能力。结果以堆叠式组显示为平均应答±SEM。由于预免疫样品中的背景应答很高，对A4L的应答未显示。

发明详述

提供了下列缩写的或者简略的定义，用以帮助理解本发明的优选实施方案。此处所提供的缩写定义并不完全，也不与本领域所理解的定义或者工具书中的意义相矛盾。此处提供缩写定义是为了补充或者更清楚地限定本领域已知的定义。

定义

本文使用的术语“核酸质粒”是指包含编码蛋白之核苷酸序列的DNA或者RNA分子。编码序列或者“编码核酸序列”可以包括与调控元件可操作性地连接的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸分子的个体细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸信号。

本文使用的术语“可表达形式”是指包含与编码序列(其编码蛋白)可操作性地连接之必需调控元件的核酸质粒，当其存在于个体细胞中时，编码序列将会表达。

本文使用术语“恒定电流”来定义在传递至组织的电脉冲持续时间内，由所述组织或者限定所述组织的细胞接受或者经受的电流。电脉冲从本文所描述的电穿孔设备中发出并用于本文所描述的质粒和疫苗。该电流在电脉冲周期内于所述组织中保持恒定的电流强度，因为本文所提供的电穿孔设备具有反馈元件，优选能够瞬时反馈。该反馈元件可以测定脉冲持续时间内组织(或者细胞)的电阻并使电穿孔设备改变其电能输出(例如增加电压)，因而使相同组织中的电流在电脉冲内(微秒级)和脉间保持恒定。在一些实施方案中，该反馈元件包括控制器。

术语“反馈”或者“电流反馈”互换使用，是指所提供的电穿孔设备的积极响应，其包括测定电极间组织中的电流以及为了保持电流处于恒定水平而相应地改变EP设备的能量输出。所述恒定水平在脉冲序列或者电处理开始前由使用者预设。优选由电穿孔设备的电穿孔组件(例如控制器)进行反馈，因为其中的电路能够持续监测电极间组织中的电流，将所监测的电流(或者组织中的电流)与预设电流相比较并且能够持续调节能量输出以保持所监测的电流处于预设水平。在一些实施方案中，反馈环路是瞬时的，因为其是模似闭环反馈。

术语“电穿孔”、“电通透”或者“电动力强化”(“EP”)在本文中互换使用，是指利用跨膜电场脉冲来诱导生物膜中的微观途径(孔)；其存在使得生物分子(例如质粒、寡核苷酸、siRNA)、药物、离子和/或水能够穿过细胞膜的一面至另一面。

本文使用术语“分散电流”来定义由本文所描述之电穿孔设备的多个针电极阵列所发出的电流形式，其中该形式使得经电穿孔之组织的任何区域上出现电穿孔相关之热应力的机率最小化或者优选使其消除。

本文使用的术语“反馈机制”是指由软件或者硬件(或者固件)进行的过程，其接收目标组织的电阻抗(在发出能量脉冲之间、期间和/或之后)，将其与现有数值(优选电流值)相比较，并且调整所发出的能量脉冲以达到预设值。在一个优选的实施方案中，“反馈机制”由模拟闭环电路进行。

本文使用的术语“佐剂”是指添加到本文所描述的DNA疫苗中的任何分子，用以增强由DNA质粒和下文所描述之核酸序列编码的VACV抗原的抗原性。

本文使用的术语“保护性免疫应答”是指抗体应答和细胞免疫应答的组合，优选由免疫本文所描述的DNA疫苗而引起的中和抗体应答。

术语“共有”或者“共有序列”或者“共有抗原”互换使用以描述本发明的优选抗原，其是指基于特定病毒的现代分离株而产生的合成序列。该共有序列可能在基因上比任何特定的天然病毒分离株更接近于当前流行的病毒株。但是，由于全球测序一般是利用慢性感染期取样的病毒而非急性感染期取样的病毒进行，因此针对大多数情况下已经逃避的表位进行开发共有疫苗应答可能是不利的。为了使这种不利最小化，疫苗设计的一个有益方案是将早期递质序列考虑在内。共有序列成为了使疾苗株和当前流行的病毒之间序列差异度最小化的一种有效方法，即制备这些病毒核心的人工序列。一个设计方案是利用共有序列，其来源于序列比对中每个位置最常见的氨基酸。该共有序列可以随后刺激产生广谱的免疫应答，用以抵抗多种天然病毒分离株以及在任何天然病毒中未发现的多态型。

本发明的一个方法包括能够在哺乳动物中产生抗痘病毒的保护性免疫应答的DNA疫苗。优选所述痘病毒是天花病毒。该DNA疫苗包含至少一种能够表达多种VACV MV抗原的DNA质粒、以及至少一种能够表达多种VACV EV抗原的DNA质粒。优选该DNA疫苗还包含一种能够表达A4L抗原的质粒。所述抗原均可以由单个DNA质粒(包含多个编码序列)或者不同的DNA质粒表达。优选不同的抗原均将由不同的DNA质粒表达。VACV MV抗原包括：A27L、F9L、H3L或者L1R，而VACV EV抗原包括：A33R、A56R或者B5R。优选DNA质粒均包含编码所述抗原的共有DNA序列。编码VACV MV抗原的共有DNA序列包括：SEQ ID NO：3(A27L)、SEQ ID NO：11(F9L)、SEQ ID NO：13(H3L)或者SEQ ID NO：15(L1R)。编码VACV EV抗原的共有DNA序列包括：SEQ ID NO：5(B5R)、SEQ ID NO：7(A33R)或者SEQ ID NO：9(A56R)。编码A4L的共有DNA序列包括SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，能够表达多种VACV MV抗原的DNA质粒包含编码包含序列SEQ ID NO：4(A27L)、SEQ ID NO：12(F9L)、SEQ ID NO：14(H3L)或者SEQ ID NO：16(L1R)的蛋白的编码序列，能够表达多种VACV MV抗原的DNA质粒包含编码包含序列SEQID NO：6(B5R)、SEQ ID NO：8(A33R)或者SEQ ID NO：10(A56R)的蛋白的编码序列，以及能够表达A4L抗原的DNA质粒包含编码具有序列SEQ ID NO：2的蛋白的编码序列。优选DNA疫苗包含多个不同的DNA质粒，所述质粒分别包含SEQ ID NO：1(A4L)、SEQ ID NO：3(A27L)、SEQ ID NO：5(B5R)、SEQ ID NO：7(A33R)、SEQ ID NO：9(A56R)、SEQ ID NO：11(F9L)、SEQ ID NO：13(H3L)以及SEQ ID NO：15(L1R)的编码DNA序列。在另一个优选的实施方案中，DNA疫苗包含多个不同的DNA质粒，所述质粒分别包含编码具有序列SEQ ID NO：2(A4L)、SEQID NO：4(A27L)、SEQ ID NO：6(B5R)、SEQ ID NO：8(A33R)、SEQ IDNO：10(A56R)、SEQ ID NO：12(F9L)、SEQ ID NO：14(H3L)以及SEQ ID NO：16(L1R)的蛋白的编码DNA序列。在一些优选的实施方案中，共有编码序列是经人类密码子优化的。

在另一个优选的实施方案中，DNA疫苗包含DNA质粒pGX4001、pGX4002、pGX4003、pGX4004、pGX4005、pGX4006、pGX4007或者pGX4008、或其组合。

本发明的另一个方面涉及在哺乳动物中诱导抗痘病毒的、包括中和抗体应答在内的保护性免疫应答的方法，包括：向所述哺乳动物的组织中注射DNA疫苗，所述疫苗包含至少一种能够表达多种VACV MV抗原的DNA质粒、至少一种能够表达多种VACV EV抗原的DNA质粒以及能够表达A4L抗原的DNA质粒。优选所述痘病毒是天花病毒。在优选的实施方案中，注射步骤包括皮内注射或者肌内注射。诱导保护性免疫应答的方法还可以包括利用电穿孔量的电能对所述组织进行电穿孔的步骤。优选电穿孔步骤包括向所述组织递送恒定电流。更优选电穿孔步骤包括递送0.2A的电流。在一些实施方案中，诱导保护性免疫应答的方法包括重复所述注射步骤。在一个优选的实施方案中，递送步骤包括递送8种不同的DNA质粒。

本文所描述的DNA疫苗利用具有高浓度DNA的DNA质粒制剂来配制。高浓度DNA可以是浓度为5mg/mL或者更多、6mg/mL或者更多、7mg/mL或者更多、8mg/mL或者更多、9mg/mL或者更多、10mg/mL或者更多、11mg/mL或者更多、12mg/mL或者更多、13mg/mL或者更多、14mg/mL或者更多、15mg/mL或者更多。在一些实施方案中，质粒DNA可以是浓度为5-15mg/mL、5-14mg/mL、5-13mg/mL、5-12mg/mL、5-11mg/mL、5-10mg/mL、5-9mg/mL、5-8mg/mL，浓度为6-15mg/mL、6-14mg/mL、6-13mg/mL、6-12mg/mL、6-11mg/mL、6-10mg/mL、6-9mg/mL、6-8mg/mL，浓度为7-15mg/mL、7-14mg/mL、7-13mg/mL、7-12mg/mL、7-11mg/mL、7-10mg/mL、7-9mg/mL、8-15mg/mL、8-14mg/mL、8-13mg/mL、8-12mg/mL、8-11mg/mL、8-10mg/mL、9-15mg/mL、9-14mg/mL、9-13mg/mL、9-12mg/mL、9-11mg/mL、10-15mg/mL、10-14mg/mL、10-13mg/mL、10-12mg/mL、11-15mg/mL、11-14mg/mL、11-13mg/mL、12-15mg/mL、12-14mg/mL或者13-15mg/mL。利用高浓度DNA质粒制剂配制DNA疫苗时，多种不同DNA质粒的混合物中可以在混合的同时保持每种DNA质粒的高剂量。在一些实施方案中每种不同的DNA质粒以高剂量存在，所述剂量是大于50μg、大于60μg、大于70μg、大于80μg、大于90μg、大于100μg、大于110μg、大于120μg、大于130μg、大于140μg、大于150μg、大于160μg、大于170μg、大于180μg、大于190μg、大于200μg、大于210μg、大于220μg、大于230μg、大于240μg或者大于250μg。优选高剂量是大于120μg，更优选是大于125μg。在一个优选的实施方案中，DNA病毒包括剂量是125μg的DNA质粒。

在本发明的一些实施方案中，DNA疫苗还可以包含佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂选自由下列物质组成的组：α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮性胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、IL-28、MHC、CD80、CD86、信号序列缺失以及可选地包括IgE信号肽的IL15。可用作佐剂的其他基因包括编码下列物质的基因：MCP-1、MIP-1α、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-1、IL-8的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、Caspase ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、Inactive NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能性片段。在一些优选的实施方案中，佐剂选自IL-8、IL-12、IL-15、IL-18、IL-28、MCP-1、MIP-1、MIP-1p、RANTES、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、CTACK、TECK或者MEC、或其组合。更优选佐剂是IL-12、IL-15、IL-28或者RANTES。

痘病毒是痘病毒科中高度复杂的病毒，其包括VACV和天花病毒(天花)。已知4种痘病毒属可以感染人类，包括正痘属、副痘属、yatapox和molluscipox。原痘属：天花病毒、vaccinia病毒、牛痘病毒、猴痘病毒、天花病毒(已灭绝)；副痘属：羊痘病毒、伪牛痘病毒、牛丘疹性口炎病毒；Yatapox：塔纳痘病毒、雅巴猴肿瘤病毒；Molluscipox：传染性软疣病毒(MCV)。其他痘病毒包括正痘病毒属例如骆驼痘病毒、牛痘病毒、小鼠痘病毒、猴痘病毒、浣熊痘病毒、臭釉痘病毒、大沙鼠痘病毒、UasinGishu病毒、variola病毒、Volepox病毒，副痘病毒属例如Ausdyk病毒、牛丘疹性口炎病毒、羊痘病毒、伪牛痘病毒、赤鹿病毒、海豹副痘病毒，羊痘病毒属例如绵羊痘病毒、山羊痘病毒、疙瘩皮肤病病毒(lumpyskinvirus)，猪痘病毒属例如猪痘病毒，兔痘病毒属例如粘液瘤病毒、纤维瘤病毒、野兔纤维瘤病毒、松鼠纤维瘤病毒、西部松鼠纤维瘤病毒，禽痘病毒属的多个种，Yatapoxvirus例如Tantpox病毒、Yabapoxvirus，Mulluscipoxvirus例如传染性软疣病毒、macropox痘病毒、鳄鱼痘病毒以及其他。除了本文所描述的DNA疫苗对天花病毒的高度交叉反应性(广谱性保护)以外，由于痘病毒之间存在高度的一致性，可以预期本发明的DNA病毒还将提供不同痘病毒之间的交叉保护。

施用途径包括但不限于肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉、动脉、眼内和口服、以及局部、透过表皮、吸入或者栓剂或者至粘膜组织(例如通过灌注至阴道、直肠、尿道、面颊和舌下组织)。优选施用途径包括肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。基因质粒的施用方法包括但不限于传统注射器、无针注射设备、“微粒轰击基因枪”或者其他物理学方法，例如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或者超声波。

电穿孔设备和优选用于递送本发明之DNA疫苗的电穿孔方法的示例包括Draghia-Akli等的美国专利No.7,245,963和Smith等提交的公开号为2005/0052630的美国专利中所描述的，因此其内容以引用的方式整体并入本文。还优选共同未决申请且共同拥有的美国专利申请序列No.11/874072中所描述的电穿孔设备和用于递送DNA疫苗的电穿孔方法，该申请于2007年10月17日递交，根据35U.S.C.§119(e)，其要求享有2006年10月17递交的美国临时申请序列No.60/852,149和2007年10月10日递交的60/978,982的优先权，所有这些均以引用的方式整体并入本文。

下述是本发明优选实施方案的实例，其在上述参考专利中描述得更为详细：电穿孔设备可以被配置成能够递送能量脉冲至哺乳动物的目标组织，产生与使用者预设电流接近的恒定电流。电穿孔设备包括电穿孔组件和电极装置或者把手装置。所述电穿孔组件可以包括和包含一个或者多个不同的电穿孔设备元件，包括：控制器、电流波形发生器、电阻抗检测器、波形记录器、输入元件、状况报告元件、通讯端口、记忆元件、电源和电源开关。电穿孔组件可以具有电穿孔设备之一个元件的功能，其他元件是与电穿孔组件通讯的分离元件(或者组件)。在一些实施方案中，电穿孔组件可以具有电穿孔设备之多于一个元件的功能，其可以与与电穿孔组件分离的其他电穿孔设备元件通讯。本发明不限于作为电机或者机械设备的部分而存在的电穿孔设备元件，因为元件可以具有一个设备或者与另一个元件通讯之分离元件的作用。电穿孔组件能够递送在目标组织中产生恒定电流的电能脉冲，并且包括反馈机制。电极装置包括具有空间排列之多个电极的电极阵列，其中电极装置接收从电穿孔组件发出的能量脉冲，并通过电极将其递送至目标组织。在能量脉冲递送过程中，多个电极中的至少一个是中央电极，其测定目标组织的电阻抗并且将电阻抗传送至电穿孔组件。反馈机制可以接收所测得的电阻抗并且能够调整电穿孔组件所递送的能量脉冲，以保持恒定电流。

在一些实施方案中，多个电极可以以分散方式递送电能脉冲。在一些实施方案中，多个电极可以通过电极的程式化序列控制以分散方式递送电能脉冲，所述程式化序列由使用者输入至电穿孔组件中。在一些实施方案中，程式化序列包括以序列递送的多个脉冲，其中多个脉冲中的每个脉冲由至少两个有源电极以及一个测定电阻抗的中央电极递送，其中多个脉冲中的后续脉冲由至少两个有源电极中的另外一个以及一个测定电阻抗的中央电极递送。

在一些实施方案中，反馈机制由硬件或者软件进行。优选反馈机制由模拟闭环电路进行。优选所述反馈每50μs、20μs、10μs或者1μs发生一次，但是优选是实时反馈或者瞬时反馈(例如通过利用合适的技术测定响应时间从而确定其基本是瞬时的)。在一些实施方案中，中央电极测定目标组织中的电阻抗并将其传送至反馈机制，反馈机制响应于电阻抗并调整能量脉冲，以保持数值与预设电流接近的恒定电流。在一些实施方案中，反馈机制在能量脉冲递送过程中持续地和瞬时地保持恒定电流。

药学上可接受的赋形剂可以包括例如媒介、辅料、载体或者稀释剂的功能性分子，其是公众已知并且可获得的。优选药学上可接受的赋形剂是一种辅料或者转染促进剂。在一些实施方案中，核酸分子或者DNA质粒与寡核苷酸功能增强子或者基因疫苗促进剂(或者转染促进剂)一起递送至细胞中。寡核苷酸功能增强子描述于美国专利序列号5,593,972、5,962,428和1994年1月26日递交的国际申请序列号PCT/US94/00899中，其并入本文作为参考。基因疫苗促进剂描述于1994年4月1日递交的美国专利序列号021,579中，其通过引用的方式并入本文。转染促进剂可以以与核酸分子混合物的方式与核酸分子一起施用，或者在核酸分子施用前或者施用后单独或同时施用。转染促进剂的示例包括表面活性剂(例如免疫刺激复合物(ISCOMS))、Freunds不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酸类脂A、胞壁肽)、醌类似物和媒介(例如鲨烯)，透明质酸也可以与基因质粒一起施用。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗还可以包括一种转染促进剂，例如脂类、脂质体(包括卵磷脂脂质体或者本领域已知的其他脂质体，以DNA-脂质体混合物的形式(例如参见WO 9324640))、钙离子、病毒蛋白、多聚阴离子、多聚阳离子或者纳米颗粒，或者其他已知的转染促进剂。优选转染促进剂是多聚阴离子、多聚阳离子(包括多聚L-谷氨酸(LGS))或者脂类。

在一些优选的实施方案中，DNA质粒与佐剂一起递送，所述佐剂是编码进一步增强抗靶蛋白免疫应答的蛋白的基因。该基因的实例是编码其他细胞因子和淋巴因子的基因，所述因子例如α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MHC、CD80、CD86和IL-15(包括信号序列缺失以及可选地包含IgE信号肽的IL15)。可用的其他基因包括编码下列物质的基因：MCP-1、MIP-1α、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、Caspase ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、Inactive NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能性片段。

根据本发明的DNA质粒疫苗所包含的DNA量是从大约1微克至大约10毫克、大约10微克至大约10毫克、大约100微克至大约10毫克、大约200微克至大约10毫克、大约300微克至大约10毫克、大约400微克至大约10毫克、大约500微克至大约10毫克、大约1微克至大约1毫克、大约10微克至大约1毫克、大约100微克至大约1毫克、大约200微克至大约1毫克、大约300微克至大约1毫克、大约400微克至大约1毫克、大约500微克至大约1毫克、大约100微克至大约1毫克、大约200微克至大约1毫克、大约300微克至大约1毫克、大约400微克至大约1毫克或者大约500微克至大约1毫克。优选疫苗中的DNA量是从大约100微克至大约1毫克。

根据本发明的DNA质粒疫苗依照所使用的施用形式而制备。当DNA质粒疫苗是可注射的组合物时，其是无菌的和/或无致热原的和/或无微粒的。优选使用等渗制剂。一般来说，用于等渗的添加剂可以包括氯化钠、右旋葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，优选例如磷酸缓冲液的等渗溶液。稳定剂包括凝胶和白蛋白。在一些实施方案中，向制剂中添加血管收缩剂。在一些实施方案中，向制剂中加入使制剂于室温或者环境温度中在较长时间内保持稳定的稳定剂，例如LGS或者其他多聚阳离子或者多聚阴离子。

在一些实施方案中，在哺乳动物中引起抗共有天花病毒抗原的免疫应答的方法包括诱导粘膜免疫应答的方法。所述方法包括对哺乳动物施用CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白以及其功能性片段或者其可表达的编码序列中的一种或者多种，同时施用包括上述共有天花病毒抗原的DNA质粒。CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白以及其功能性片段中的一种或者多种可以在施用本文所提供的DNA质粒天花疫苗之前、同时或者之后施用。在一些实施方案中，对哺乳动物施用一种核酸分子，其编码一种或者多种选自由下列物质组成的组：CTACK、TEK、MEC及其功能性片段。

实施例

本发明在下列实施例中进一步阐述。应当理解，当描述本发明优选的实施方案时，这些实施例仅仅是举例说明。从上面的讨论和这些实施例中，本领域技术人员可以确定本发明的基本特性，并且在不偏离其精神和范围的前提下可以对本发明进行多种变化和修饰，以使其适于多种用途和情形。因此，除本文所示和所描述的之外，从上面的描述中，本发明的多种修饰对于本领域技术人员来说将是清楚的。这些修饰也落入所附权利要求的范围内。

优选本文所描述的肌肉或者皮肤EP设备中所用的DNA制剂具有高浓度DNA，优选浓度是在向皮肤递送的最佳小体积(优选小注射体积，优选25-200微升(μL))中包含微克至几十毫克量的DNA，优选毫克量的DNA。在一些实施方案中，DNA制剂具有高浓度DNA，例如1mg/mL或者更多(mg DNA/体积制剂)。更优选DNA制剂中的DNA浓度是200μL配方中提供公克量的DNA，更优选100μL配方中提供公克量的DNA。

本发明的EP设备中所用的DNA质粒可以利用已知设备和技术的组合来制备或者生产，但是优选其利用经优化的质粒制备技术来制备，所述技术描述于2007年5月23日递交的共同拥有且共同未决的美国临时申请美国序列No.60/939,792中。在一些实施例中，研究中所用的DNA质粒可以制备为浓度大于或者等于10mg/mL。制备技术还包括或者包含本领域普通技术人员通常已知的多种设备和步骤，以及美国序列No.60/939792中所描述的，包括2007年7月3日公布的共有专利美国专利No.7,238,522中所描述的。本文所描述的皮肤EP设备和递送技术中所用的高浓度质粒使得可以在合理小的体积中向ID/SC空间内施用质粒，并且有助于增强表达和免疫的效果。共有申请和专利，即美国序列No.60/939,792和美国专利No.7,238,522分别通过引用的方式整体并入。

方法

下列方法用于以下实施例中，其可应用于实施例中并且特定实施例中未提供另外的特定方法。

DNA表达质粒的克隆。VACV基因、A4L、A27L、A33R、A56R、B5R、F9L、H3L以及L1R(来源于Western Reserve株)由合成的寡核苷酸化学合成，经人类密码子优化并修饰，以使其在DNA序列的5’端包含Kozak共有序列和IgE前导序列并且3’端包含HA表位标签。利用常规克隆技术由GENEART(Burlingame，CA)将每个经修饰的基因盒克隆到真核表达质粒pVAX1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。每个基因的表达由CMV启动子调控。合成的A4L和B5R基因盒克隆到HindIII和XhoI位点中，以分别制备表达质粒pGX4001和pGX4003。为了制备A33R的表达质粒(pGX4004)和A56R的表达质粒(pGX4005)，合成的基因盒克隆到HindIII和XbaI限制性位点中。pGX4007和pGX4008通过将合成的H3L和L1R基因克隆到HindIII和BamHI限制性位点中制备。其余的表达质粒pGX4006和pGX4002通过将合成的A27L和F9L基因盒分别克隆到KpnI/XhoI和EcoRI/XbaI限制性位点中制备。克隆后，所有抗原通过测序验证。

疫苗的制备和免疫。利用Hebel等在US7,238,522中所描述并且经改进的生产步骤来制备高浓度质粒并且纯化。该方法能够产生无内毒素(≤10EU/mg)并且质粒浓度非常高的质粒制剂，适用于疫苗的生物制药学递送。所有的质粒制备品均在无菌水中用经HPLC纯化的低分子量多聚L-谷氨酸(LGS，平均分子量10,900)以1％重量/重量配制和制备。使所有的质粒(pGX4001至pGX4008)组合来制备单个疫苗制备品，其中用于ID施用的0.1mL总体积中或者用于IM施用的0.5mL总体积中含有每种质粒125μg。

用盐酸克他命(10-30mg/kg)对动物进行肌内麻醉。对大腿部施用疫苗(每个大腿1个注射位点，施用1支疫苗)并且通过ID或者IM以及利用

2000设备(批准用于人类的设备；VGX Pharmaceuticals，Blue Bell，PA)进行EP以递送至半膜肌中。注射后立即利用恒定电流0.2A、脉宽52ms和脉间1s的2×2脉冲进行ID施用，以及恒定电流0.5A、脉宽52ms和脉间1s的3次脉冲进行IM施用。在第1、28和56天进行免疫，并在免疫日收集血清以测定抗体应答。

样品收集和PBMC分离。接种期间每2周和攻击后每3周对食蟹猴进行采血。用盐酸克他命(10-30mg/kg)对动物进行肌内麻醉。血液收集于EDTA管中。利用标准Ficoll-Hypaque密度梯度离心从全血中分离PBMCs，重悬于完全培养基(含有2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640中添加10％热灭活FBS、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和55μM β-疏基乙醇)中。

用于抗原特异性ELISA之抗原的制备。利用含有合适的限制性酶切位点的基因特异性引物从VACV的Western Reserve株中PCR扩增得到每种抗原的开放读码框，并将其克隆到原核表达载体pEt219a(+)(EMDChemicals，Gibbstown，NJ)中。3’端寡核苷酸设计为可以与pEt219a(+)中的6×组氨酸标签融合。蛋白利用标准的镍柱纯化方法(Abgent，Inc.，San Diego，CA)进行纯化。

抗原特异性ELISA。为了测定IgG抗体应答，通过将50ng稀释于PBS中的经纯化抗原(A4L、A27L、A33R、A56R、B5R、F9L、H3L或者L1R)覆盖于MaxiSorp Immuno 96孔板(Nunc，Rochester，NY)上，进行ELISA。于4℃孵育过夜后，用添加了0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)清洗板，随后用添加了3％BSA的PBS于室温封闭1小时。从食蟹猴个体中收集的血清用添加了0.5％BSA和0.05％Tween 20的PBS稀释，并与50μL经稀释的血清于4℃孵育过夜。孔用PBS-T清洗，并随后与HRP偶联的并且以1∶10,000稀释于添加了0.5％BSA和0.05％Tween 20之PBS中的第二抗体羊抗兔IgG(100μL/孔)孵育。孔于室温孵育1小时并清洗。依照厂商建议(KPL，Gaithersburg，MD)向每孔中加入TMB底物和终止液。

利用Lumistar Galaxy板读取仪(BMG Labtech)在450nm下测定吸光度。终点效价以所产生的阳性活性大于阴性对照血清两倍的血清最大稀释度的倒数表示。

VACA ELISA。经多聚甲醛固定和经蔗糖浓度梯度离心纯化的VSCVWR株(Advanced Biotechnologies，Inc.)以0.6μg/mL的浓度覆盖于微量滴定板上，并于4℃孵育过夜。滴定板用添加了5％脱脂奶粉的PBS-T(PBS-TM)于37℃封闭2小时。用PBS-T清洗孔8次，并且与猴血清的系列稀释液于37℃孵育2小时。清洗后，细胞与第二抗体即辣根过氧化物酶偶联的羊抗猴IgG(KPL)和ABTS底物(Sigma-Aldrich)孵育。加入100μL的10％SDS使反应停止，并利用Molecular Devices SpectraMax Plus384在405nm下读数。

终点效价以所产生的阳性活性＞阴性对照血清平均O.D.值加上3倍S.D.的血清最大稀释度的倒数表示。

合成的肽。研究中所用的肽来源于VACV WR株A4L、A27L、A33R、A56R、B5R、F9L、H3L和L1R的编码区。合成A4L、A27L、A33R、A56R、B5R、F9L、H3L和L1R的总抗原肽文库。所有的肽均为15肽，其中有9个氨基酸(对于A27L来说)、11个氨基酸(对于A4L、A33R、A56R、F9L、H3L和L1R来说)或者6个氨基酸(对于B5R来说)是重叠的。A27L文库由Invitrogen制备。所有其他的文库由GenScript Corporation(Piscataway，NJ)制备。肽文库制备为相应的肽库，其在DMSO中的浓度为10mg/mL。

IFN-γELISPOT试验。进行了非人灵长类动物的ELISpot试验(参见Boyer，J.D.等.J.Med.Primatol.34，262-270(2005))。通过用含有肽的孔中的空斑数量减去阴性对照孔中的空斑数量，测定抗原特异性应答。结果以3个孔的平均值(空斑/百万个脾细胞)表示。

羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)的偶联和PBMCs的流式细胞分析。细胞沉淀后，用以1∶2000稀释于PBS中的1ml羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)(Molecular Probes，Eugene，OR)重悬。细胞于37℃孵育10分钟。细胞用完全培养基清洗，重悬至浓度为1×10⁶个细胞/100μL，并且置于含有100μL总肽库的96孔圆底板中。5μg/ml ConcavalinA(阳性)和完全培养基(阴性)用作对照。培养基孵育5天。细胞首先用Vivid紫色染料(活/死细胞标记物)于37℃染色10分钟。细胞用PBS清洗一次，随后用人CD3-APC Cy7抗体(SP34-2克隆)(BD Pharmingen)、人CD4-PerCP Cy5.5(L200克隆)、人CD8-APC抗体(SK1克隆)于4℃染色1小时。细胞随后用PBS清洗2次，并用1％多聚甲醛固定。利用LSRII流式细胞仪(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)收集数据。流式细胞数据用FlowJo软件(Tree Star，Ashland，OR)分析，以CD3⁺淋巴细胞设门。由于预免疫样品中的背景应答很高，对A4L的应答未显示。

细胞内细胞因子染色。抗体试剂：直接偶联的抗体得自下列出处：BDBiosciences(San Jose，CA)：IL-2(PE)，CD3(APC Cy7)，CD8(APC)，IFN-γ(Alexa Fluor 700)，以及TNF-α(PE Cy7)，CD95(PE Cy5)和CD4(PerCPCy5.5)。CD28(ECD)得自Beckman Coulter。

细胞刺激和染色。将PBMC用完全RPMI重悬至1×10⁶个细胞/100μL，并且置于含有100μL以1∶200稀释之A27L和B5R刺激肽的96孔板中。每次试验中包括未刺激的对照和阳性对照(葡萄球菌(Staphylococcus)肠毒素B，1μg/mL；Sigma-Aldrich)。细胞于37℃孵育5小时。孵育后，清洗细胞(PBS)并用表面抗体染色。清洗细胞并依照说明书用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Pharmingen，San Diego，CA)进行固定。固定后，细胞用perm缓冲液清洗2次，并用抗细胞内标记物的抗体染色。染色后，清洗细胞、固定(含有1％多聚甲醛的PBS)并在分析前贮存于4℃。

流式细胞术。用经改进的LSR II流式细胞仪(BD ImmunocytometrySystems，San Jose，CA)对细胞进行分析。每个样品收集5万个CD3⁺细胞。利用FlowJo 8.6.3版(TreeStar，San Carlos，CA)进行数据分析。初始的设门用正向散射区域(FSC-A)对高度(FSC-H)作图，以去除双峰。利用FSC-A对SSC图对细胞进行淋巴细胞设门。利用活细胞/死细胞对CD3⁺图鉴定活的T细胞。随后相继进行CD8⁺和CD4^-细胞对IFN-γ的设门，以解释下调原因。鉴定CD8⁺T细胞后，利用提供最佳分离效果的组合对每种单独的功能进行设门。对每种功能进行设门后，我们利用Boolean设门平台建立可能之组合的全阵列，当测试4种功能时等同于15种应答模式。经背景校正后报道数据。由于预免疫应答很高，分析中未包括1个pVAX1动物(#4384)的应答。

病毒的增殖和制备。猴痘病毒Zaire株V79-I-005(猴痘病毒Master SeedNR-523)从National Institutes of Health Biodefense和Emerging InfectionsResearch Resources Repository获得。该Zaire株最初从1979年刚果致死感染的人中获得(由世界卫生组织天花病毒和其他痘病毒合作中心(WorldHealth Organization Collaborating Center for Smallpox and Other Poxvirus)在美国疾病控制和防御中心(US Center for Disease Control and Prevention)分离)。通过在鸡胚成纤维细胞中对病毒进行传代并且利用标准蔗糖浓度梯度离心沉降使其纯化，以制备接种物。其在鸡胚成纤维细胞中增殖并纯化。

猴痘病毒攻击。最后一次免疫(第91天)后4周，食蟹猴利用本文所描述的方法麻醉，并利用23号蝶式针通过静脉注射2×10⁷pFU的猴痘病毒NR-523至隐静脉中。为了确定实际递送剂量，利用标准的空斑试验技术对攻击接种物进行回滴定。

实时PCR检测猴痘病毒基因组。利用QIAamp DNA试剂盒(Qiagen)从冷冻的血液样品中提取DNA。依照厂商说明，用QuantitativePan-orthopox HA PCR试验(Applied Biosystem)进行实时PCR，其中包括下列用于扩增血球凝集素基因的引物：OPHA F89：5’-ATGTACTATCTCAACGTAGTAG-3’(SEQ ID NO.：17)和OPHA R219：5’-CTGCAGAACATAAAACTATTAATATG-3’(SEQ ID NO.：18)。TaqMan探针(OPHA P143S-MGB：6FAM AGTGCTTGGTATAAGGAG MGBNFQ(SEQ ID NO.：19和SEQ ID.：20))在5’端具有FAM标记并且包含非荧光淬灭基团。用LightCycler 1.5(Roche)进行病毒基因组复制。

VACV中和抗体的测定。研究期间收集猴血清，使其热灭活(56℃30分钟)并利用传统的空斑减少中和试验评估VACV中和抗体的存在。每次试验包括经FDA生物评估和研究中心(Center for Biologics Evaluation andResearch at the FDA)批准的FDA标准参照牛痘Ig(Cangene)作为阳性对照。阴性对照包括未经免疫之食蟹猴的血清。在完全培养基中制备1至4个血清系列稀释液，并一式三份加入至Vero E6细胞的24孔板中(100％铺满)。24孔板的每个孔中加入4.5×10⁵PFU的Zaire 79株。每孔加入200μL预热的甲基纤维素半固体覆盖膜(包含添加了4％FBS、4mM L-谷氨酸和1％甲基纤维素的等体积4％MEM)。板于37℃在5％CO2下孵育72小时。用250μL的0.1％结晶紫染色液(于20％乙醇中制备)对细胞单层进行染色。

进行空斑计数并相对于无抗体时的空斑数量计算中和百分比。效价以使空斑数量减少50％的最大稀释度的倒数表示。

全血细胞计数分析。全血细胞计数(CBC)利用HevaVet 950FSHematology Analyzer(Drew Scientific)进行。在接种过程中每个采血时间点和攻击的第0、6、12、21和27天进行CBC。血液学参数包括：血细胞比容、血红蛋白、白细胞总数以及不同淋巴细胞的数量(嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、血小板数量、血细胞平均体积、血细胞平均血红蛋白量、平均微粒和血红蛋白浓度。

数据分析。利用Student’配对t-test进行所涉及的比较。数据以平均数±s.e.m.表示，并且认为P＜0.05时(双尾配对T-Test)具有统计学显著性差异。利用Spearman等级相关性(非参数的)评估中和抗体效价(通过PRNT试验测定)和痘疮数量之间的相关性。

实施例1

质粒表达之天花病毒抗原的克隆、体外表达和生产

每种基因由GeneArt Inc.(Toronto，ON)从寡核苷酸合成地构建和制备。来源于天花病毒Western Reserve(WR)株的寡核苷酸经密码子优化，并且利用标准的克隆方法克隆到pVAX1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。分别编码经优化之A4L和B5R基因的DNA疫苗质粒pGX4001和pGX4003通过将合成地构建的片段克隆到HindIII和XhoI限制性位点中制备。pGX4004(编码A33R)和pGX4005(编码A56R)通过将DNA片段克隆到HindIII和XbaI限制性位点中制备。pGX4007和pGX4008通过将分别编码H3L和L1R的DNA片段克隆到HindIII和BamHI限制性位点中制备。对于编码F9L的质粒(pGX4006)和编码A27L的质粒(pGX4002)，分别将DNA片段克隆到EcoRI/XbaI和KpnI/XhoI限制性位点中。为了使蛋白表达更高效，每个基因的5’端加入Kozak共有序列和IgE前导序列。此外，为了辅助定位和进行表达分析，基因的3’端加入HA表位标签。

克隆后，所有抗原经测序验证，并且检测插入片段的表达。随后，利用Hebel等在US7,238,522中所描述并且经改进的部分生产步骤来生产质粒，使得可以产生质粒浓度较高、适用于疫苗生物制药学递送的质粒制剂(示例性目的参见图1)。利用此方法，生产出包含VACV抗原A4L、A27、A33R、A56R、B5R、F9L、H3L和L1R的天花多价DNA疫苗。疫苗产品显示出高纯度，其中未检出RNA、蛋白和内毒素，于-80℃贮存1年后的平均浓度为10.7±0.7mg/mL，超螺旋率为94.5±1.1％。疫苗制备品中的每种抗原在小鼠或者兔中均能够诱导产生强效抗体和细胞免疫应答(数据未显示)。

还显示了编码天花病毒抗原的一些质粒(图2-9)。

表1.所克隆的疫苗抗原的总结

在本文所描述的所有实验中，无内毒素的质粒制备品稀释于无菌水中，并且依照之前Draghia-Akli R，Khan AS，Pope MA，Brown PA.Innovative electroporation for therapeutic and vaccination applications.Gene Therapy &Molecular Biology；9：329-38(2005)所描述，用经高效液相色谱(HPLC)纯化的低分子量多聚L-谷氨酸(LGS，平均分子量10,900)以1％重量/重量配制。

为了使这些基于质粒的治疗方法有效地转用于人类，优选使小制剂体积中(体积与传统疫苗的体积接近)含有较大量的质粒。此外，转基因产品应当由靶器官高效分泌、可以检出并且具有活性。

实施例2

质粒的施用和电穿孔

应用于ID的恒定电流电穿孔设备(

VGXPharmaceuticals，Inc.，Blue Bell，PA)扩展成具有置于可消毒的一次性塑料阵列上的微电极，所述塑料阵列是与患者皮肤实际接触的唯一组件(以防止交叉污染)。将经浓缩、高纯度的小体积疫苗制剂(体积与传统疫苗的体积接近，例如50和300μL，更优选在50-100μL之间或者100-200μL之间)递送至所选区域即靶区域，随后靶区域被微阵列包围。微电极插入至皮肤中。塑料阵列在插入至皮肤中的微电极周围产生均匀的压力，有助于EP过程中在靶区域中产生均匀的电场。

实施例3

利用天花病毒表达质粒免疫兔

在预实验中，在兔组中(n＝3/组)分析了对天花病毒抗原的免疫应答，所述抗原由实施例1的质粒疫苗和体内恒定电流电穿孔递送(参见图10的时间轴)。兔随意喂养食物和水，并且在Stillmeadow，Inc.(Sugarland，TX)依照IUCUC标准和操作饲养。施用DNA疫苗前，刮净注射位点并彻底清洗，以去除多余的毛发和碎片。DNA注射当天，对兔进行称重，用克他命/赛拉嗪(xylazine)麻醉，采血，并在处理期间保存于异荧烷(isofluorane)(2％)中。

通过单次肌内(IM)注射800μg(每次注射每种抗原100μg和/或空载体至800μg)的下列组合物来施用质粒：第1组兔用表达不同天花病毒抗原(A13L、A14L、A27L、A33R、B5R、D8L、H3L、L1R)之8种质粒的组合物进行免疫；第2组兔用4种不同抗原(A27L、B5R、D8L、L1R)的组合物进行免疫；第3组兔用表达单个抗原(B5R)的单个质粒进行免疫。所有质粒均施用至半膜肌，随后利用

设备(VGXPharmaceuticals，Blue Bell，PA)进行电穿孔，在0.6安培下进行3次脉冲，52ms/脉冲，脉间1s。在不同的时间点从兔中收集血清，并且通过蛋白ELISA用其测定抗体应答。

不论所递送的抗原数量多少，2个经免疫组中的抗体应答均增强了。还用ELISpot测定了多种抗原的体液应答：B5R(图11)、H3L(图12)、A27L(图13)、L1R(图14)。收集每组动物的血清并以1∶50释释。第1组和第2组显示出对A27L和L1R的显著应答(与第3组相比*p＜0.05)，而且当施用4种或者8种抗原时，对单个疫苗的免疫应答未受到影响。

实施例4

利用天花病毒表达质粒免疫非人灵长类动物

对少量食蟹猴(6只)进行初始的预实验，以检测DNA注射以及其后的电穿孔(EP)是否能够引起强烈的免疫应答。实验利用

设备进行。2只猴的组(n＝2/组)通过肌内(IM)注射入剂量逐渐增加的质粒，所述质粒编码1种病毒抗原：经优化的A4L(或者A4Lopt)、A27Lopt和B5Ropt(参见上面实施例1中的质粒)。

在第0、28和56天穿过未受痘疮的皮肤对动物分别注射每种质粒0.03、0.1和0.3mg(于0.5mL无菌水+0.01mg/mL LGS中)至半膜肌，并且随后进行电穿孔，其条件为0.6安培，脉宽52ms，脉间1s。在第84天，所有动物均进行加强免疫。在基线处、第28、56、84和112天时测定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答(图16)。如图16所示，第1次免疫后2周的ELISpot结果显示，接受IM注射以及电穿孔组中产生干扰素-γ(IFNγ)的细胞数量平均是仅接受IM注射组的2.5倍。

实施例5

通过测定动物中所产生的抗体应答水平对包含几种不同天花病毒抗原的联合疫苗进行评估，以确定该联合疫苗的效果。此外，通过将皮内(ID)或者肌内(IM)递送相比较，对DNA递送方法的效果进行评估。DNA利用恒定电流设备递送。

动物：利用ELISA评估新西兰白兔(每组中n＝3或者4)的抗体免疫应答。兔随意喂养食物和水，并且在Stillmeadow，Inc.(Sugarland，TX)依照IUCUC标准和操作饲养。施用DNA疫苗前，刮净注射位点并彻底清洗，以去除多余的毛发和碎片。

DNA注射当天，对兔进行称重，用克他命/赛拉嗪麻醉，采血，并且在处理期间保存于异荧烷(2％)中。皮内(ID)(100μl)或者肌内(IM)(500μl)施用(第0、21和35天)包含编码多种天花病毒抗原之质粒的DNA疫苗，对每只兔施用所包含的全部质粒总量为1mg的每种疫苗。疫苗中所用的质粒组合物包括：流感病毒H5血球凝集素表达质粒(H5HA)(用作试验的阳性对照)以及3种天花病毒抗原的组合物(A4L、A27L和B5R；参见上面实施例1)。每种DNA疫苗制剂于1％LGS中制备。

所有的DNA疫苗施用至半膜肌，随后利用

恒定电流设备在如图18所示的多种条件下进行电穿孔。A组至D组接受100μl的ID注射，在0.2安培下进行电穿孔并且接受2次脉冲(A组)、3次脉次(B组)、4次脉冲(C组)、6次脉冲(D组)。E组接受ID注射，但不进行电穿孔。F组、G组和I组以肌内方式(IM)施用500μl DNA疫苗制剂，在0.5安培下进行电穿孔并且接受3次脉冲，每次脉次分别包含80、4、4和10-15秒的停滞期。J组不进行电穿孔(IM，500μl)。H组接受1000μl的肌内注射，并且进行电穿孔，条件为0.5安培、4秒停滞和3次脉冲。恒定电流设备的程序设定为递送52ms/脉冲和脉间为1s。在不同的时间点从兔中收集血清，并且通过蛋白ELISA用其测定抗体应答(结果见图19-21)。

实施例6

利用ELISA对8至9周龄的新西兰白兔的抗体免疫应答进行评估。兔随意喂养食物和水，并且在Stillmeadow，Inc.(Sugarland，TX)依照IUCUC标准和操作饲养。施用DNA疫苗前，刮净注射位点并彻底清洗，以去除多余的毛发和碎片。DNA注射当天，对兔进行称重，用克他命/赛拉嗪麻醉，采血，并且在处理期间保存于异荧烷(isofluorane)(2％)中。

编码多种天花病毒抗原的质粒(参见上面实施例1)通过皮内(ID)或者肌内(IM)施用(第0、21、42和84天)，施用体积分别为100μl和500μl，每只兔施用的质粒总量为1mg(每次注射每种抗原125μg和/或空载体至1mg)。图22和23详细地显示了接种方案和接种参数。利用下列组合进行免疫并随后进行电穿孔(A组至J组)：A组和F组的兔用表达单个抗原(B5R)的单个质粒进行免疫；B组和G组用4种不同抗原(A27L、B5R、H3L和L1R)的组合进行免疫；C组和H组用表达多种抗原(A4L、A27L、A33R、A56R、B5R、F9L、H3L和L1R)之8种质粒的组合进行免疫；D组和I组作为抗体应答的阴性对照，用空载体pVAX1(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行免疫；以及E组和J组接种相同的8种质粒组合，但是不进行电穿孔。每种抗原制剂于1％LGS中制备。

所有质粒施用至半膜肌，并随后利用

恒定电流设备进行电穿孔(除了第5组)。对于IM注射，电穿孔条件为0.5安培、3次脉冲、52ms/脉冲、脉间1s；对于ID注射，电穿孔条件为0.2安培、4次脉冲、52ms/脉冲、脉间1s。在不同的时间点从兔中收集血清，并且通过蛋白ELISA用其测定抗体应答(图24至图33)。

ELISA抗原制备：用于ELISA的抗原由Abgent，Inc.(San Diego，CA)制备。编码基因的ORF利用基因特异性引物经PCR扩增得到，所述引物包含用于克隆的合适的限制性位点。寡核苷酸的3’端设计为可以与原核表达载体pEt21a(+)中的6×组氨酸标签融合。蛋白利用标准的镍柱纯化方法进行纯化。

ELISA试验。为了测定IgG应答，通过将50ng稀释于PBS中的抗原(A4L、A27L、A33R、B5R、H3L或者L1R)覆盖于MaxiSorp Immuno 96孔板(Nunc，Rochester，NY)上，进行ELISA试验，并于4℃孵育过夜。用添加了0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)清洗后，板用添加了3％BSA的PBS封闭，并于室温孵育1小时。兔血清用添加了0.5％BSA和0.05％Tween 20的PBS稀释，并于4℃孵育(50μl)过夜。用PBS-T清洗后，孔与HRP偶联的并且以1∶10,000稀释于添加了0.5％BSA和0.05％Tween 20之PBS中的第二抗体羊抗兔IgG(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)(100μL/孔)孵育。将孔于室温孵育1小时并随后清洗。依照厂商建议(KPL，Gaithersburg，MD)向每孔中加入TMB底物和终止液。利用Lumistar Galaxy板读取仪(BMG Labtech，Durham，NC)在450nm下测定吸光度。

ELISpot试验。MultiScreen^TM-Ip 96孔板用以1∶100稀释于PBS中的猴IFN-γ单克隆抗体(mAB)(GZ-4)覆盖，并于4℃孵育过夜。用PBS清洗5次后，板用完全培养基(添加了10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640)于室温封闭2小时。一式三份加入PBMC，其输入的细胞数量为100μl完全培养基中的2×10⁵个细胞。肽用完全培养基稀释至终浓度为25μg/ml，每孔加入100μl稀释液。伴刀豆球蛋白A(ConA，5μg/ml；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)用作阳性对照，仅重悬于完全培养基的细胞用作阴性对照。于37℃孵育24小时后，板用PBS清洗5次，随后与经生物素化并且以1∶1000稀释于PBS中的猴IFN-γ检测mAb(7-B6-1)(100μl/孔)于4℃孵育过夜。清洗板，加入以1∶1000稀释于PBS中的链霉亲和素碱性磷酸酶(100μl/孔)，并于室温孵育1小时。随后清洗孔，每孔加入100μl底物液(BCIP/NBT，Sigma-Aldrich)。室温下10分钟后，用自来水清洗几次，使比色反应终止。使板风干，并利用自动化ELISpot读取系统(CTL分析仪，Cleveland，OH)和

软件对空斑进行计数。3个孔中空斑的平均数调整至1×10⁶个脾细胞。ELISpot数据以平均数±S.D.表示。

用响应于用于刺激的相应肽所形成的空斑数减去对照培养基中的空斑数，来计算抗原特异性IFN-γ应答。还在利用CD8去除珠(Miltenyi Biotec，Gladbach，Germany)去除CD⁸⁺淋巴细胞后，进行ELISpot试验。

实施例7

兔中皮内接种高浓度多价DNA之电穿孔条件的优化

EP条件的优化是蛋白表达的关键因素。利用高度浓缩的联合疫苗在兔中进行了优化EP条件的实验。表2显示了所研究的EP条件。

表2  兔中B5R、A27L和A4L EP条件的优化和其效价

用阳性对照流感病毒H5血球凝集素表达质粒(HA)(Laddy，D.J.et al.Heterosubtypic protection against pathogenichuman and avian influenzaviruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNAantigens.Plos.ONE.3，e2517(2008))，以及B5R、A27L和A4L的组合物在不同ID-EP参数下对动物进行接种。结果显示，2×2皮下EP脉冲形式提供了较强的应答，其对血球凝集素的抑制最强，响应于两种天花病毒抗原的抗体效价最高。第三种天花病毒抗原在3次脉冲形式下产生了较好的结果。利用“多数决定原则”标准，将2×2EP条件用于随后的非人灵长类动物研究中。

实施例8

用多价疫苗免疫非人灵长类动物

DNA多价疫苗引起强烈的抗体应答

食蟹猴购自Three Springs Scientific(Perkasie，PA)，并放置和饲养于Southern Research Institute(Birmingham，AL)。总共24只猴(14只雌性和10只雄性)单独笼养并且基于其体重和性别的相似性分配到每组中。经测试，所有的猴均为SIV、STLV、SRV和HBV阴性。收到后立即使所有动物隔离，使其适应研究室环境。在隔离和研究期间，猴喂养Teklad 2050CDiet。所提供的食物量大约为一勺食物(6至10块饼干)，每天两次。实验依照IACUC of Southern Research Institute，the Guide forthe Care and Use ofLaboratory Animals，7th Edition(Institute of Animal Resources，Commissionon Life Sciences，National Research Council；National Academy Press；Washington，DC；1996)和the U.S.Department ofAgriculture通过the AnimalWelfare Act(Public Law 99-198)所提出的原则进行设计。

用包含8种VACV Western Reserve株基因(A4L、A27L、A33R、A56R、B5R、F9L、H3L和L1R)的多价DNA疫苗对4组食蟹猴免疫3次。一组(n＝6)通过皮内(ID)途径接受高剂量(HD)的DNA(250μg/抗原)，而另一组(n＝6)以相同途径接受低剂量(LD)的DNA(125μg/抗原)。此外，2组猴(n＝4)还通过肌内(IM)途径用高剂量或者低剂量的疫苗进行免疫。1组经pVAX1免疫的动物用作阴性对照。第3次免疫后1个月，用致死剂量的猴痘病毒Zaire株(通过静脉递送，引入2×10⁷PFU)攻击动物。

利用ELISA试验评估多价DNA疫苗中每种抗原的抗体特异性应答(表3a)。表3的图表描述可见于图34a所示的柱形图中。

表3a通过ELISA测定的每种抗原的抗体应答。

所示为通过ELISA测定的每种抗原的平均O.D.值(450nm)和S.E.M.。抗体应答在第70天测定。

*表示统计学显著性。各个处理组和pVAX1之间的P＜0.05(具有等同差异的双尾T-Test)。

**表示超过pVAX1 O.D.数值的增加倍数。

最后一次种后2周检测抗体应答。不论哪种接种剂量和途径，多价疫苗中的所有抗原均引起不同程度的抗体应答。在ID高剂量(HD，250μg/质粒)施用的抗原中观察到了剂量效应，其在大多数情况下比低剂量(LD，125μg/质粒)效果更好。对于IM免疫，施用两种剂量时均观察到了抗原特异性应答，但无剂量效应。在应答方面，对于HD疫苗，以ID途径递送比以IM途径递送效果更好，除了B5R效果相同之外。对于ID-HD递送途径，我们观察到诱导产生了14倍(A27L和A33R)和9倍(H3L)的抗体应答。当使用IM-HD途径时，我们观察到对A27L和A33R的应答分别比对照增加了10.6倍和13.3倍。

此外，还测定了抗原特异性抗体的效价。不论哪种接种剂量和途径，多价疫苗中的大部分抗原均引起不同程度的抗体应答。结果见下面表3b。

表3b抗原特异性抗体的效价

在大多数情况下，ID-HD施用抗原时所观察到的剂量效应比ID-LD疫苗更好。对于IM接种，施用两种剂量时均观察到了抗原特异性应答，但无剂量效应。在应答方面，对于HD疫苗，以ID途径递送比以IM途径递送效果更好。所有的免疫组均未能产生对L1的大量抗体应答。

B.非人灵长类动物中细胞介导之免疫的诱导

还评估了由多价疫苗诱导产生的细胞免疫应答(图34b)。对于ID-EP，LD和HD之间应答水平的微小差异并不显著，而IM-EP注射后则发现剂量效应非常明显。ID和IM注射后总体的细胞免疫明显增加，并且第2次和第3次HD注射接种后产生了强烈的免疫应答(图34b)。ID-HD递送时效果更加明显，细胞应答总体增加了8倍(687±31.5对5675±38.1/10⁶SFU，P＜0.03)。IM-HD递送时也观察到了相似的效果。在第1次和第2或者第3次IM-HD接种之间，我们观察到细胞应答增加了3倍(分别为2388±199对8028±719或者7098±87/10⁶SFU，P＜0.02)。

C.T细胞功能和增殖结果

通过细胞内细胞因子染色，对几种T细胞功能进行了测定，所述细胞因子包括：IFNγ、IL-2和TNFα的产生以及用作脱颗粒作用替代标记物的CD107a。由于费用和样品的限制，分析了对两种抗原A27和B5的功能性T细胞应答。对A27和B5的功能性应答的总量在CD4⁺T细胞部分比CD8⁺T细胞部分要高。ID-HD组的CD4⁺T细胞应答最高，其平均值为0.3±0.6％，所有动物均响应于两种抗原中的至少一种(图39a)。经IM免疫的动物具有较低的平均应答，尽管高剂量组和低剂量组之间的应答没有显著差异(分别为0.2±0.08％和0.2±0.1％)。ID-LD组的CD4⁺应答最低(0.13±0.03％)。与CD4⁺应答相比，对A27和B5的CD8⁺应答在数值上稍低(图39b)。IM-LD组的应答比ID-HD组稍高(分别为0.18±0.08％和0.15±0.04％)。ID-LD组和IM-HD组具有中度CD8⁺T细胞应答(分别为0.07±0.02％和0.08±0.05％)。

利用Boolean设门(gating)，我们检测了细胞应答的多功能性质。一般来说，相应的动物产生单功能性应答，其中CD107a是主要功能，仅有IM-LD组的1只动物对B5产生了3种功能性的CD8⁺T细胞应答(数据未显示)。

细胞免疫应答的另一个参数是经疫苗诱导之T细胞应答的增殖能力。第3次免疫后分离PBMCs，并在体外进行刺激，随后利用CFSE稀释液测定增殖情况。ID-HD组中CD4⁺T细胞增殖最多(10.2±6.2％)(图40a)。ID-LD和IM-HD中CD4⁺T细胞应答较低，分别为1.7±0.67％和1.4±1.1％。IM-LD中的应答不比背景高。在CD8⁺T细胞部分也看到了相似的结果，其中ID-HD的应答最高(6.7±5.4％)(图40b)。ID-LD、IM-HD和IM-LD组具有相似的CD4⁺T细胞增殖水平(分别为1.6±0.69％、1.9±1.1％和1.8±1.6％)。

利用ELISpot在非人灵长类动物的研究中观察到强烈的IFNγ应答；经IM比经ID免疫的组显示出较高的总体IFNγ应答。而且，与其他免疫组相比，ID-HD组显示出较好的CD4⁺T和CD8⁺T细胞增殖。对A27和B5经疫苗诱导之免疫应答的多功能性分析显示，ID-HD接种所诱导产生的总体CD4⁺T细胞应答较高，而IM-LD接种产生较高的CD8⁺T细胞应答。但是，不论哪种接种途径或者剂量大小，CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞主要是单功能性的，其可能与杀死(killing)表型有关。尽管没有动物对A27和B5产生4种功能性的应答，但是基于对HIV抗原进行电穿孔的经验(如本领域所报道的)，本研究中观察到的经疫苗诱导之免疫应答的功能性图谱很可能是抗原特异性现象。

实施例9

攻击：经接种的非人灵长类动物以及猴痘病毒Zaire 79的攻击

A.多价DNA疫苗保护非人灵长类动物免受严重猴痘疾病的侵害

为了全面评估应答效力，用猴痘病毒Zaire 79株NR-523的分离物攻击动物。不论使用哪种施用途径，多价疫苗均提供了保护作用(表4)。

表4.用猴痘病毒进行静脉攻击后痘疮的发展情况

TNTC＝太多而无法计数，RE＝记录错误。*第15天复查4389的图片后，发现一些痘疮很明显，因此不应计为0个痘疮。这明显是记录错误(RE)。但是，第18天的任何图片中都没有痘疮痕迹，尽管并非显示了所有的区域。**第24天复查4384的图片后，没有发现TNTC的证据，而其后第21天仅有2个痘疮。由于痘疮在该时间点明显消除了，痘疮总数量为TNTC是不可能的，因此似乎第24天的TNTC是记录错误。

此数据可以图表显示于图35b2中。

与经pVAX1处理的对照组中所记录的无数痘疮和75％的致死率相比，该疫苗大体上使痘疮数量减少，并且在低剂量和高剂量时均100％地保护动物不致死亡。在痘疮数量峰值时，经pVAX1处理的4只动物中的3只具有无数痘疮；该疾病导致第4只动物死亡。对照组中仅有1只猴在攻击中存活下来，但是其痘疮在观察期末期(攻击后第27天)仍然存在。在经接种的动物中，第15天时痘疮开始消退，其效果在接受了ID-HD注射的动物中更为显著：在第21天，6只动物中仅有1只有痘疮(仅观察到4个痘疮)。在观察期的最后1天(第27天)，所有动物均没有猴痘痘疮的标记。ID-LD处理使得6只猴中的3只在第21天无痘疮，第27天所有动物的痘疮均完全消除了。当用IM-EP处理非人灵长类动物时，在稍早期具有明显的治疗效果。在第21天，4只猴中的3只无痘疮。攻击末期时1只猴有2个痘疮。IM-LD处理也是有效的，4只猴中的1只在第18天时无痘疮。在第21天，4只猴中的3只无痘疮，而1只有8个痘疮。在观察期末期，IM-LD组中的所有4只候均无痘疮。

B.由多价疫苗引起的病毒血症水平的降低

所有猴均显示确实被猴痘病毒感染，并且其病毒血症水平在攻击后6-9天达到峰值(图35a)。pVAX1对照组动物出现猴痘病的典型症状，其中4只动物中的3只由于病情严重而被实施安乐死。经pVAX1接种的动物中的病毒血症水平分别在攻击后第9天和第12天达到峰值(log 7.5和log 8.5之间)。在攻击中存活的猴(#4384)似乎具有一些水平的对照病毒血症。在第21天，经HD接种之动物的病毒血症水平小于log 1。相比而言，经接种之动物的病毒血症水平明显降低，其中在第9天降低至少log 3(P＜0.05，单因素方差)，而在研究末期未检出(每ml＜5000拷贝)。在第15天，ID-HD组中6只动物中的4只以及IM-HD组中的所有动物均未检出病毒血症，而两种LD接种中50％的动物未检出。在第18天，两种HD接种组中仅有1只动物具有可检出水平的病毒血症。因此，这些发现表明该DNA疫苗在控制猴痘病毒病毒血症和防止严重疾病发生中具有保护性效力。

C.由多价疫苗诱导的抗VACV抗体的产生

通过ELISA，以经纯化的灭活全VACA作为包被抗原，对由DNA疫苗和猴痘病毒攻击诱导产生的抗体进行检测(图36)。第28天在接种DNA疫苗的动物中检测到低水平效价的病毒特异性VACV特异性抗体，其中对于接种组和接种剂量，所有动物均具有1∶100的终点效价。此后抗体效价开始增加，在第91天ID-HD递送途径和IM-HD递送途径的平均终点效价分别为1∶633和1∶300，不同剂量间差异不显著。经接种的猴受到攻击后，抗VACV的抗体效价明显增加。经接种的猴受到攻击后6天(第97个研究天数)，经接种的猴中的效价比经pVAX1接种的猴增加将近100倍，其中经HD接种的猴中终点效价将近1∶10,000。经LD接种的动物中具有较低或者相似的终点效价，其中ID注射和IM注射的平均终点效价分别为1∶3600±1867和1∶8800±2400。相比而言，经pVAX1处理的动物直到攻击后第12天才显示出强烈应答，其平均最大终点效价为1∶800。在攻击中存活的对照组猴在攻击后18天的最大终点抗体效价仅为1∶1600。

D.由多价疫苗诱导的中和抗体效价

已经鉴定出全VACV的结合抗体。利用体外功能性PRNT试验对所述抗体中和猴痘病毒的能力进行了研究，以确定疫苗诱导产生的抗体在体内保护免受猴痘病毒攻击中的作用。测定了不同组中猴痘病毒中和抗体的效价(见表5)。

表5.攻击前和攻击后抗猴痘病毒中和抗体的效价。

*效价以PRNT₅₀数值表示。在第0、28和56天对动物进行接种并在第91天(第0个攻击日)用病毒攻击。第97、103、109和118天分别对应于第6、12、18和27个攻击日。

从经pVAX1处理的对照动物中收集的血清在攻击前不能中和病毒。但是，攻击后第6天(第97个研究天数)所有猴开始显示出可检出水平的效价。在攻击中存活的对照组猴具有最高的中和抗体效价。相比而言，不论哪种接种途径或者剂量大小，经多价疫苗接种的动物在第2次免疫后2周(第42天)开始显示出中度的中和抗体应答。结果图表可见于图37。正如所预期的，在所有的时间点，HD疫苗均比LD疫苗引起较强的抗体应答(表5)。

此外，还分析了中和抗体效价和痘疮数量之间的相关性(Spearman等级相关性，非参数性P＜0.008-见图38)。

实施例10

猴痘病毒攻击后的临床观察

在急性感染期，经pVAX1处理的动物明显体重减轻、体温升高、抑郁并且嗜睡。在攻击后第12天，当痘痘疮和病毒血症水平达到峰值时，体重减轻得最多(表6)。

表6.用猴痘病毒进行静脉攻击后的体重变化

*第6至第27个攻击日栏中的数值以相对于第0天的体重变化百分比(％)表示。体重在第0天栏中给出。

在第12个攻击日，体重平均减少8.73％(与攻击前体重相比，体重减少5.6至11.1％)。对照组中存活的那只猴(#4384)最终体重回升，但是是在直到攻击后第21天。相比而言，经接种的动物受到攻击后体重并未明显减轻。经LD疫苗处理的动物比经HD接种的动物体重减轻得更为显著。对于经ID-HD疫苗处理的动物，攻击后第12天的体重变化比攻击前体重平均减少1.34％。在同一天，以IM途径接种之动物的体重比攻击前体重增加了1.7％。经LD疫苗接种的动物比经HD接种的动物体重减轻较多。对于ID和IM接种，体重减少的平均值±SEM分别为2.9％±1.3和6.0％±2.38。

对于经pVAX1处理的动物，至攻击后第12天均观察到其体温上升(数据未显示)。攻击后第3天体温增加最多，其平均体温为103.1°F(从101.5至104.4°F)。攻击中存活的对照组猴在第27天具有正常体温。正如所预期的，不论哪种接种途径以及剂量大小，经接种之猴的体温在攻击期间一直波动。但是，经接种之动物的平均体温在攻击期间保持在正常体温范围内(从99至102°F)。

临床参数：研究期间的全血细胞计数(CBC)监测显示，在猴痘病毒攻击期间血液学参数变化不显著。由于猴痘病而被实施安乐死的对照动物中在第12天当病毒血症水平达到峰值时，白细胞(WBC)与攻击前水平相比上升了58.2％(#4403，11,500对18,200/μL)、65.6％(#4392，6100对10,100/μL)和121％(#4393，8,600对19,000/μL)。第12天时经接种之动物的WBC数量也上升至相同程度，与攻击前水平相比，ID-LD、ID-HD、IM-LD、IM-HD的平均增长百分比分别为69.4±15.8、68.8±15.6、80.9±17.2、70.0±28.0。

Claims (30)

1.一种能够在哺乳动物中产生抗痘病毒的保护性免疫应答的DNA疫苗，其包含：

至少一种能够表达多种VACV MV抗原的DNA质粒，以及

至少一种能够表达多种VACV EV抗原的DNA质粒。

2.如权利要求1所述的DNA疫苗，还包含能够表达A4L抗原的DNA质粒。

3.如权利要求1至2中任一项所述的DNA疫苗，其中所述抗原均由不同的DNA质粒表达。

4.如权利要求1至3中任一项所述的DNA疫苗，其中所述VACV MV抗原包括：A27L、F9L、H3L或者L1R。

5.如权利要求1至4中任一项所述的DNA疫苗，其中所述VACV EV抗原包括：A33R、A56R或者B5R。

6.如权利要求1至5中任一项所述的DNA疫苗，其中所述DNA质粒包含编码所述抗原的共有DNA序列。

7.如权利要求6所述的DNA疫苗，其中所述编码VACV MV抗原的共有DNA序列包括：SEQ ID NO：3(A27L)、SEQ ID NO：11(F9L)、SEQID NO：13(H3L)或者SEQ ID NO：15(L1R)。

8.如权利要求1至7中任一项所述的DNA疫苗，其中所述能够表达多种VACV MV抗原的DNA质粒包含编码包含序列SEQ ID NO：4(A27L)、SEQ ID NO：12(F9L)、SEQ ID NO：14(H3L)或者SEQ ID NO：16(L1R)的蛋白的编码序列。

9.如权利要求6所述的DNA疫苗，其中所述编码VACV EV抗原的共有DNA序列包括：SEQ ID NO：5(B5R)、SEQ ID NO：7(A33R)或者SEQ ID NO：9(A56R)。

10.如权利要求1至9中任一项所述的DNA疫苗，其中所述能够表达多种VACV EV抗原的DNA质粒包含编码包含序列SEQ ID NO：6(B5R)、SEQ ID NO：8(A33R)或者SEQ ID NO：10(A56R)的蛋白的编码序列。

11.如权利要求6所述的DNA疫苗，其中所述编码A4L的共有DNA序列包括：SEQ ID NO：1或者编码具有序列SEQ ID NO：2的蛋白的DNA序列。

12.如权利要求1至11中任一项所述的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗包含多个不同的DNA质粒，所述质粒分别包含SEQ ID NO：1(A4L)、SEQ ID NO：3(A27L)、SEQ ID NO：5(B5R)、SEQ ID NO：7(A33R)、SEQ ID NO：9(A56R)、SEQ ID NO：11(F9L)、SEQ ID NO：13(H3L)以及SEQ ID NO：15(L1R)的编码DNA序列。

13.如权利要求1至12中任一项所述的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗包含多个不同的DNA质粒，所述质粒分别包含编码具有序列SEQ IDNO：2(A4L)、SEQ ID NO：4(A27L)、SEQ ID NO：6(B5R)、SEQ ID NO：8(A33R)、SEQ ID NO：10(A56R)、SEQ ID NO：12(F9L)、SEQ ID NO：14(H3L)以及SEQ ID NO：16(L1R)的蛋白的编码DNA序列。

14.如权利要求1至13中任一项所述的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗包含DNA质粒pGX4001、pGX4002、pGX4003、pGX4004、pGX4005、pGX4006、pGX4007或者pGX4008、或其组合。

15.如权利要求1至14中任一项所述的DNA疫苗，其中所述DNA质粒均以大于50μg的剂量存在。

16.如权利要求15所述的DNA疫苗，其中所述DNA质粒均以125μg的剂量存在。

17.如权利要求1至16中任一项所述的DNA疫苗，还包含佐剂，所述佐剂选自IL-8、IL-12、IL-15、IL-18、IL-28、MCP-1、MIP-1、MIP-1p、RANTES、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、CTACK、TECK或者MEC、或其组合。

18.如权利要求17所述的DNA疫苗，其中所述佐剂是IL-12、IL-15、IL-28或者RANTES。

19.如权利要求1至18中任一项所述的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗能够在哺乳动物中产生抗天花病毒的保护性免疫应答。

20.一种在哺乳动物中诱导抗痘病毒的包括中和抗体应答在内的保护性免疫应答的方法，其包括：

向所述哺乳动物的组织中注射DNA疫苗，所述疫苗包含至少一种能够表达多种VACV MV抗原的DNA质粒、至少一种能够表达多种VACVEV抗原的DNA质粒、以及能够表达A4L的DNA质粒。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述注射步骤包括皮内注射或者肌内注射。

22.如权利要求20至21中任一项所述的方法，还包括利用电穿孔量的电能对所述组织进行电穿孔的步骤。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送恒定电流至所述组织。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括递送0.2A的电流。

25.如权利要求20至24中任一项所述的方法，还包括重复所述注射步骤。

26.如权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述DNA质粒包含具有序列SEQ ID NO：1(A4L)、SEQ ID NO：3(A27L)、SEQ ID NO：5(B5R)、SEQ ID NO：7(A33R)、SEQ ID NO：9(A56R)、SEQ ID NO：11(F9L)、SEQ ID NO：13(H3L)或者SEQ ID NO：15(L1R)的编码DNA序列。

27.如权利要求20至26中任一项所述的方法，其中所述DNA质粒包含编码具有序列SEQ ID NO：2(A4L)、SEQ ID NO：4(A27L)、SEQ ID NO：6(B5R)、SEQ ID NO：8(A33R)、SEQ ID NO：10(A56R)、SEQ ID NO：12(F9L)、SEQ ID NO：14(H3L)或者SEQ ID NO：16(L1R)的蛋白的编码序列。

28.如权利要求26至27中任一项所述的方法，其中所述递送步骤包括递送8种不同的DNA质粒。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述8种不同的DNA质粒包括：pGX4001、pGX4002、pGX4003、pGX4004、pGX4005、pGX4006、pGX4007以及pGX4008。

30.如权利要求20至29中任一项所述的方法，其中所述方法在哺乳动物中诱导抗天花病毒的保护性免疫反应。

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