CN117756949A - 一种正痘病毒属融合抗原及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种正痘病毒属融合抗原及应用，所述融合抗原是在正痘病毒属M1R和A35R两种保守抗原组成的多价融合抗原基础上，通过引入糖基突变或采用特定原核表达系统去除抗原蛋白天然的N糖基修饰后制备获得。相比于单一抗原或天然糖基修饰型融合抗原，该糖基修饰缺失型融合抗原在联合铝佐剂和/或分子内佐剂MT3后，可激发针对正痘病毒属更为高效的免疫反应，在单针免疫下即可保护小鼠免受致死剂量的正痘病毒属鼠痘病毒攻击，有望成为一种高效、低成本、可及性较强的正痘病毒属重组蛋白疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合抗原，属于多肽技术领域。
背景技术
正痘病毒属（Orthopoxvirus）包括猴痘病毒（monkeypox virus，MPXV）、天花病毒（variola virus，VARV）、牛痘病毒（cowpox virus，CPXV）和痘苗病毒（vaccinia virus，VACV）、鼠痘病毒（ectromelia virus，ECTV）等，是一类重要生物危害病原体，对人类健康构成严重威胁（Sig Transduct Target Ther. 2022. 7， 373）。尤其是2022年以来，多国猴痘病毒疫情案例出现激增，给全球公共卫生带来危机。
截至2023年12月，全球已有116个国家（地区）报告了9.3万例猴痘确诊病例，包含171例死亡病例。目前可用于应对猴痘等正痘病毒引起疫情的疫苗主要包括ACAM2000和MVA-BN等，均为减毒活痘苗病毒疫苗，尚未有更加安全的亚单位疫苗品种获批（Nat RevImmunol.2022. 22， 597–613）。此外，由于减毒活痘苗病毒疫苗产量限制，其分配存在较大的不平衡性，非洲等发展中国家虽然具有高流行风险，却只获得了较为有限的供应（BMJ.2022. 378：o1971）。
目前，由于正痘病毒基因组较大（>200K）、表达蛋白种类复杂（>190 ORF），且具有两种主要的感染性颗粒，即成熟病毒粒子(MVs)和包膜病毒粒子(EVs)，靶标免疫原尚未得到完全确认，限制了其重组疫苗的研发。正痘病毒在基因组水平上具有显著的同源性，并在免疫原方面彼此密切相关。已有研究显示正痘病毒的M1R（L1R）、A35R（A27R）、B6（B5）、A29L（A27L）等具有一定免疫保护效力，可被应用于天花病毒、猴痘病毒等的重组疫苗设计（Vaccine. 2010 Sep 14：28(40)：6627-36.；Front. Immunol. 2023. 14：1203410.）。但目前正痘病毒疫苗抗原主要采用哺乳动物细胞、昆虫细胞等真核表达系统制备，并以单一组分的形式联合铝佐剂等使用，其免疫效力存在一定不足，且成本较高、可及性较差。本发明的目的就是提供一种针对正痘病毒属尤其是猴痘病毒的高效，且低成本、具有较高可及性的重组疫苗抗原。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种正痘病毒属融合抗原，所述融合抗原是由正痘病毒属M1R抗原和A35R抗原融合而成，所述M1R抗原的序列如SEQ ID NO.1所示，所述A35R抗原的序列如SEQ ID NO.2所示，所述M1R抗原和A35R抗原以柔性多肽连接，所述正痘病毒属融合抗原的序列如SEQ ID NO.3所示。在本发明中具有该氨基酸序列的正痘病毒属融合抗原被命名为“M1R-A35R”。
在另一个优选的实施方案中，所述的正痘病毒属融合抗原还具有N糖基修饰的缺失。
在一个更为优选的实施方案中， N糖基修饰的缺失为在M1R抗原发生的N73Q和N140Q的突变。
更为优选地，所述M1R抗原和A35R抗原以柔性多肽连接。
又为优选地，所述正痘病毒属融合抗原的序列如SEQ ID NO.5所示。在本发明中具有该氨基酸序列的正痘病毒属融合抗原被命名为“M1R-A35R-Ndel”。
在一个优选的实施方案中，所述正痘病毒属融合抗原为原核表达系统可溶性表达，其中，原核表达系统中的表达载体表达硫氧化还原蛋白，宿主细胞具有trxB和gor基因突变，所述正痘病毒属融合抗原的序列如SEQ ID NO.7所示。在本发明中具有该氨基酸序列的正痘病毒属融合抗原被命名为“p-M1R-A35R”。
更为优选地，所述表达载体为pTig质粒，所述宿主细胞为大肠杆菌Origami(DE3)。
在又一个优选的实施方案中，所述正痘病毒属融合抗原还与金属硫蛋白3融合，所述正痘病毒属融合抗原的序列如SEQ ID NO.9所示。在本发明中具有该氨基酸序列的正痘病毒属融合抗原被命名为“p-MT3-M1R-A35R”。
更为优选地，所述表达载体为pTig质粒，所述宿主细胞为大肠杆菌Origami(DE3)。
其次，本发明提供了一种编码上述的正痘病毒属融合抗原的多核苷酸，所述多核苷酸的序列为：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8或者SEQ ID NO.10。其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的融合抗原M1R-A35R的编码序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的融合抗原M1R-A35R-Ndel的编码序列如SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的融合抗原p-M1R-A35R的编码序列如SEQ ID NO.8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的融合抗原p-MT3-M1R-A35R的编码序列如SEQ ID NO.10所示。
第三，本发明提供了一种含有上述多核苷酸的表达载体。在本发明的一个具体实施方案中，含有序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示的多核苷酸的载体为pcDNA3.1真核表达载体，在本发明的另一个具体实施方案中，含有序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10所示的多核苷酸的载体为pTig质粒。
第四，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。在本发明的一个具体实施方案中，含有所述pcDNA3.1真核表达载体的宿主细胞为Expi293F细胞，在本发明另一个具体实施方案中，含有所述pTig质粒的宿主细胞为大肠杆菌Origami (DE3)。
最后，本发明提供了上述的正痘病毒属融合抗原在制备正痘病毒属疫苗中的应用。
在一个优选的实施方案中，所述正痘病毒属包括猴痘病毒、天花病毒、鼠痘病毒、马痘病毒、痘苗病毒和牛痘病毒。
在另一个优选的实施方案中，所述疫苗包括重组蛋白疫苗、核酸疫苗和病毒载体疫苗。
本发明公开了一种正痘病毒属融合抗原，更进一步地，公开了一种正痘病毒属糖基修饰缺失型融合抗原及应用，所述糖基修饰缺失型融合抗原，是在由正痘病毒属M1R和A35R两种保守抗原组成的多价融合抗原基础上，通过引入糖基突变或采用特定表达系统可溶性表达去除抗原蛋白天然的N糖基修饰后制备获得。相比于天然糖基修饰型融合抗原，该糖基修饰缺失型融合抗原在联合铝佐剂和/或分子内佐剂MT3后，可激发针对正痘病毒属更为高效的免疫反应，在单针、低剂量免疫下100%保护小鼠免受致死剂量的鼠痘病毒攻击，有望成为一种高效、低成本、可及性较强的正痘病毒属重组蛋白疫苗。
相比于现有技术正痘病毒属重组疫苗，本发明所提供的融合抗原包含了正痘病毒属中两种重要的保守抗原，并通过缺失糖基修饰在免疫效力方面得到了显著的提升，且具有成本较低、单针起效、可及性更强等优势，具有较好的推广应用潜力。
1）免疫谱更广泛
本发明提供的融合抗原包含了正痘病毒属M1R和A35R这两种重要保守抗原，分别位于成熟病毒颗粒（MVs）和包膜病毒颗粒（EVs）。通过结构建模确定了M1R与A35R的连接顺序，即M1R抗原位于融合蛋白的N端，A35R位于融合蛋白的C端，以柔性连接肽相连，所获得双价融合抗原M1R-A35R构象更为稳定，且两个抗原蛋白间表位相互遮蔽影响较少，可同时激发针对两种类型病毒颗粒的免疫应答，免疫谱更加广泛。
2）免疫效力更强
通过对M1R-A35R双价融合抗原进行糖基质谱鉴定，首次鉴定到两个关键N糖基修饰位点（N73、N140），通过引入突变氨基酸（N73Q、N140Q），去除这两个关键N糖基修饰，获得了真核细胞中表达制备的N糖基修饰缺失型融合抗原M1R-A35R-Ndel。相比于天然糖基修饰型融合抗原，该糖基修饰缺失型融合抗原抗原在联合铝佐剂后，可激发针对正痘病毒属更为高效的免疫反应（特异性抗体水平增强4-12倍）。
3）成本更低、单针起效、可及性更强
为了获得N糖基修饰缺失型融合抗原，首先尝试采用了常规原核表达系统大肠杆菌BL21和常规表达载体pET进行p-M1R-A35R融合蛋白的表达，发现无法获得可溶性、正确构象的N糖基修饰缺失型融合抗原，全部为包涵体形式，无法实现预期目的。
选择利用特定原核表达系统即大肠杆菌Origami (DE3)作为宿主细胞，该宿主细胞在trxB和gor基因上同时含有突变，菌株能够更加高效地在胞内生成二硫键，有助于表达含二硫键的、无N糖基化修饰的活性蛋白。同时，采用原核表达载体pTig，该载体带有硫氧化还原蛋白可辅助目的蛋白正确折叠，获得了原核细胞中可溶性表达的N糖基修饰缺失型融合抗原p-M1R-A35R。相比于天然糖基修饰型融合抗原，该糖基修饰缺失型融合抗原在联合铝佐剂后，可激发针对正痘病毒属更为高效的免疫反应。进一步，将分子内佐剂MT3与融合抗原联合，所获得的联合抗原p-MT3-M1R-A35R可产生更强的免疫效力，在单针免疫下即可保护小鼠免受致死剂量的正痘病毒属鼠痘病毒攻击，可及性较好，成本更低。
附图说明
图1. 正痘病毒属M1R、A35R氨基酸序列同源性分析；
图2. 多价融合抗原M1R-A35R设计与真核系统表达鉴定；
图3. 多价融合抗原M1R-A35R糖基修饰质谱分析；
图4. 糖基修饰缺失型融合抗原M1R-A35R-Ndel设计与真核系统表达鉴定；
图5. 多价融合抗原M1R-A35R与M1R-A35R-Ndel免疫血清抗体检测；
图6. 糖基修饰缺失型融合抗原p-M1R-A35R设计与原核系统表达鉴定；
图7. 联合MT3佐剂的糖基修饰缺失型融合抗原p-MT3-M1R-A35R设计与原核系统表达鉴定；
图8. 糖基修饰缺失型融合抗原p-M1R-A35R与p-MT3-M1R-A35R免疫血清抗体检测；
图9. 糖基修饰缺失型融合抗原p-M1R-A35R与p-MT3-M1R-A35R免疫血清中和抗体与攻毒保护性评价；
图10. 糖基修饰缺失型融合抗原p-MT3-M1R-A35R单针免疫血清抗体与攻毒保护性评价。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。除非特别说明，本发明所采用的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。
实施例1. 多价融合免疫原M1R-A35R、M1R-A35R-Ndel的设计与真核系统表达
本实施例选取在正痘病毒属多个病毒种中均保守、且分别位于成熟病毒颗粒（MVs）和包膜病毒颗粒（EVs）的M1R和A35R作为抗原靶点。通过多序列比对分析，确定这两种抗原在正痘病毒属代表性毒株（猴痘病毒：ON563414.3：天花病毒：VARCG；牛痘病毒：NC_003663；痘苗病毒：NC_006998；马痘病毒：BK013341；鼠痘病毒：NC_004105）中的氨基酸同源性可达90%以上(图1) ，保守性较好，预期具有良好的交叉免疫效力，因此本实施例选择以正痘病毒属猴痘病毒M1R和A35R抗原为代表开展设计与评价，该方法也适用于其他同源抗原。
将序列如SEQ ID NO.1所示的猴痘病毒M1R的编码序列（URK20517.1，1-183）与序列如SEQ ID NO.2所示的A35R的编码序列（URK20584.1， 58-181）通过柔性连接肽（3×G4S）进行连接。通过Alphafold软件对蛋白结构进行模拟，将M1R的C末端与A35R的N末端连接，在N端增加分泌性信号肽tPA（MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSNS），在C端添加以及His纯化标签（HHHHHH），设计获得氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的多价融合免疫原M1R-A35R（图2，棕色标记为M1R蛋白，黄色标记为A35R蛋白）。经哺乳动物细胞密码子人工优化，综合考虑密码子使用频率、密码子对使用频率、mRNA结构稳定性、CpG含量等因素，在启动密码子ATG的前碱基序列做设计和调整，使其符合Kozak规则（GCCACCATGG），在3’端加上翻译终止密码子TGA，设计获得核酸序列（SEQ ID NO：4）。合成后通过EcoRI（GAATTC）和HindIII（AAGCTT）酶切位点将基因连接至pcDNA3.1真核表达载体，获得重组质粒。
转染Expi293F细胞，在37°C、8% CO2的条件下摇床培养72小时后收集细胞培养上清，使用GE公司His-trap亲和层析柱进行蛋白纯化，获得目的蛋白M1R-A35R，使用SDS-PAGE实验对纯化蛋白进行鉴定（图2），蛋白条带分子量符合预期。
通过质谱技术首次对M1R-A35R蛋白进行糖基修饰鉴定。首先用二硫苏糖醇（DTT）还原蛋白样品，并用碘乙酰胺（IAA）烷基化。利用胰蛋白酶对蛋白进行酶解，对酶切后的肽段进行液相色谱联用质谱（LC-MS/MS）分析，采用 ETD/HCD/CID 联合碎裂的方式，获得尽可能丰富的肽段二级碎裂信息。通过对糖基化修饰肽段二级图谱的软件分析以及人工鉴定，首次鉴定获得M1R-A35R蛋白中N糖基化位点及其修饰程度的详细信息（图3），显示该蛋白存在两个关键的N糖基化修饰位点（N73、N140）。
经对抗原蛋白结构和表位进行分析，发现N糖基修饰可能对蛋白免疫原性具有重要影响，设计通过引入突变氨基酸（N73Q、N140Q），去除全部两个关键的N糖基修饰，以获得真核细胞中表达制备的N糖基修饰缺失型融合抗原M1R-A35R-Ndel（图4，棕色标记为M1R蛋白，黄色标记为A35R蛋白，N糖基修饰突变位点以文字标注），氨基酸序列如SEQ ID：5所示，核酸序列如SEQ ID：6所示。参见上述真核系统蛋白表达与制备过程，成功获得该目的蛋白，蛋白条带分子量符合预期（图4）。使用相同的真核系统分别表达M1R和A35R抗原。
实施例2. 融合抗原M1R-A35R与M1R-A35R-Ndel免疫效力评价
对真核系统表达的M1R-A35R融合免疫原，或糖基修饰缺失型融合抗原M1R-A35R-Ndel进行小鼠免疫评价。选择6-8周的雌性BALB/c小鼠，每组6只，通过肌肉注射方式，每只小鼠在第0天接种100μL体积（5μg抗原，50μg铝佐剂）免疫。第14d对小鼠进行尾静脉采血，获得小鼠血清用于特异性抗体检测。
免疫评价结果显示，相比单独M1R或A35R，融合抗原M1R-A35R可以同时激发针对两种猴痘免疫原M1R和A35R的特异性抗体水平，而糖基修饰缺失型融合抗原M1R-A35R-Ndel可同时激发针对两种猴痘免疫原M1R和A35R更高水平的特异性抗体，在14d针对M1R的特异性抗体滴度即可达到1：2805，是单独M1R激发特异性抗体滴度（1：32）的88倍，是带有糖基修饰的融合抗原M1R-A35R激发特异性抗体滴度（1：232）的12倍（图5）。类似的，糖基修饰缺失型融合抗原M1R-A35R-Ndel在14d针对A35R的特异性抗体滴度即可达到1：539，是单独A35R以及带有糖基修饰的融合抗原M1R-A35R激发特异性抗体滴度（1：125）的4倍（图5）。该结果证实，M1R-A35R双价融合抗原可激发针对两种抗原的高水平特异性免疫反应。而进一步引入突变获得的N糖基修饰缺失型融合抗原M1R-A35R-Ndel，相比于天然糖基修饰型融合抗原，可激发针对正痘病毒属更为高效的免疫反应（4-12倍）。
实施例3. 糖基修饰缺失型融合抗原p-M1R-A35R设计与原核系统表达
实施例1、2中首次发现真核表达的正痘病毒属融合蛋白具有较为明显的N糖基修饰，且此类糖基修饰对免疫原效力造成一定影响，通过引入突变去除蛋白糖基修饰显著提高了免疫效力。本实施例进一步采用原核表达系统，表达糖基修饰缺失型融合抗原p-M1R-A35R（图6，棕色标记为M1R蛋白，黄色标记为A35R蛋白）。首先尝试采用了常规原核表达系统大肠杆菌BL21和常规表达载体pET进行M1R-A35R融合蛋白的表达，发现无法获得可溶性、正确构象的N糖基修饰缺失型融合抗原，全部为包涵体形式。
随后选择利用特定原核表达系统即大肠杆菌Origami (DE3)作为宿主细胞，该宿主细胞在trxB和gor基因上同时含有突变，菌株能够更加高效地在胞内生成二硫键，有助于表达含二硫键的、无N糖基化修饰的活性蛋白。同时，采用原核表达载体pTig，该载体带有硫氧化还原蛋白可辅助目的蛋白正确折叠。将融合免疫原p-M1R-A35R的氨基酸编码序列（如SEQ ID：7所示），经大肠杆菌密码子人工优化，综合考虑密码子使用频率、密码子对使用频率、mRNA结构稳定性、CpG含量等因素，设计获得核酸序列（SEQ ID NO：8），合成后克隆到pTig质粒。将构建好的质粒转化表达于Origami (DE3)大肠杆菌中。IPTG诱导后SDS-PAGE检测可见高效的融合蛋白可溶性表达。破碎菌体取上清，使用GE公司His-trap亲和层析柱进行蛋白纯化，获得目的蛋白p-M1R-A35R，使用SDS-PAGE实验对纯化蛋白进行鉴定，蛋白条带分子量符合预期（图6）。
实施例4. 联合MT3佐剂的糖基修饰缺失型融合抗原p-MT3-M1R-A35R设计与原核系统表达
针对p-M1R-A35R融合免疫原，为了进一步提升其免疫效力，设计在其末端连接分子内佐剂MT3。通过Alphafold软件对蛋白结构进行模拟，将MT3的C末端与p-M1R-A35R的N末端连接（图7，绿色标记为MT3分子内佐剂，棕色标记为M1R蛋白，黄色标记为A35R蛋白）。人源MT3蛋白的编码序列通过柔性连接肽（3×G4S）与p-M1R-A35R融合免疫原连接，获得p-MT3-M1R-A35R融合蛋白，其氨基酸编码序列如SEQ ID NO：9，核酸序列如SEQ ID：10所示。参见上述原核系统蛋白表达与制备过程，成功获得该目的蛋白，蛋白分子量大小符合预期（图7）。
实施例5. 糖基修饰缺失型融合抗原p-M1R-A35R与p-MT3-M1R-A35R免疫效力评价
为评价原核系统表达的糖基修饰缺失型融合抗原免疫效力，本实施例比照真核系统表达的带有糖基修饰的M1R-A35融合抗原（M1R-A35），对原核系统表达的p-M1R-A35R、p-MT3-M1R-A35R融合蛋白进行小鼠免疫，并检测其引起的免疫应答反应。选择6-8周的雌性BALB/c小鼠，每组6只，通过肌肉注射方式，每只小鼠分别在第0天、第14天接受两次疫苗免疫，每次接种100μL体积（5μg免疫原，50μg铝佐剂）。第14d、28d、56d对小鼠进行尾静脉采血，获得小鼠血清用于后续特异性抗体和鼠痘病毒中和抗体检测。第120d使用致死剂量（200PFU）的鼠痘病毒对小鼠进行攻击，观察小鼠存活情况。
免疫评价结果显示，相比真核系统表达的多价融合抗原蛋白M1R-A35R，相同剂量的原核表达免疫原蛋白p-M1R-A35R与p-MT3-M1R-A35R免疫小鼠可产生更高水平的M1R和A35R特异性抗体，在单针免疫后14d，p-M1R-A35R与p-MT3-M1R-A35R融合蛋白即可快速的同时激发针对两种猴痘免疫原M1R和A35R的高水平特异性抗体，抗体滴度均超过1：10000，是真核系统表达的融合免疫原蛋白的10倍以上（图8）。同时，原核系统表达的融合免疫原p-M1R-A35R与p-MT3-M1R-A35R的鼠痘病毒中和抗体水平也均优于带有糖基修饰的M1R-A35R融合抗原，分别为2.9倍、21倍（图9）。在致死剂量的鼠痘病毒攻毒模型中，原核表达的两种糖基修饰缺失型融合抗原蛋白p-M1R-A35R、p-MT3-M1R-A35R均100%完全保护了小鼠，相比于真核系统表达的融合免疫原蛋白具有更为优越的保护效力（图9）。该结果证实，原核表达系统制备的糖基修饰缺失型融合抗原，可显著增加正痘病毒属抗原的抗体诱导能力与保护效力。
进一步，为评价原核系统表达的糖基修饰缺失型融合抗原p-MT3-M1R-A35R单针免疫下的效力，本实施例比照真核系统表达的带有糖基修饰的M1R-A35融合抗原，对原核系统表达的p-MT3-M1R-A35R融合蛋白进行小鼠单针免疫，并检测其引起的免疫应答反应。选择6-8周的雌性BALB/c小鼠，每组6只，通过肌肉注射方式，单针免疫组每只小鼠在第0天接受1次疫苗免疫，双针免疫组在第0天、第14天接受两次疫苗免疫，每次接种100μL体积（5μg免疫原，50μg铝佐剂）。第14d、28d对小鼠进行尾静脉采血，获得小鼠血清用于后续特异性抗体检测。第120d使用致死剂量（200PFU）的鼠痘病毒对小鼠进行攻击，观察小鼠存活情况。
免疫评价结果显示，单针免疫p-MT3-M1R-A35R即可快速的同时激发针对两种猴痘免疫原M1R和A35R的高水平特异性抗体，在28d抗体滴度均超过1：10000，与真核系统表达的带有糖基修饰的M1R-A35R融合抗原两针免疫后抗体滴度相当（图10）。同时，在致死剂量的鼠痘病毒攻毒模型中，原核表达的糖基修饰缺失型融合抗原蛋白p-MT3-M1R-A35R单针即可保护约80%的小鼠（图10）。该结果证实，原核表达系统制备的糖基修饰缺失型融合抗原抗原在联合分子内佐剂MT3后，可激发针对正痘病毒属高效的免疫反应，在单针免疫下即可保护小鼠免受致死剂量的鼠痘病毒攻击。
综上所述，本发明公开了一种正痘病毒属糖基修饰缺失型融合抗原、制备方法及应用，所述糖基修饰缺失型融合抗原，是在由正痘病毒属M1R和A35R两种保守抗原组成的多价融合抗原基础上，通过引入糖基突变或采用特定原核表达系统去除抗原蛋白天然的N糖基修饰后制备获得。相比于相比于单一抗原或天然糖基修饰型融合抗原，该糖基修饰缺失型融合抗原抗原在联合铝佐剂和/或分子内佐剂MT3后，可激发针对正痘病毒属更为高效的免疫反应，在单针免疫下即可保护小鼠免受致死剂量的鼠痘病毒攻击，有望成为一种高效、低成本、可及性较强的正痘病毒属重组蛋白疫苗。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并非用以限定本发明，其他的任何未违背本发明的精神实质与原理下所作的改动和修饰，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1. 一种正痘病毒属融合抗原，其特征在于，所述融合抗原是由正痘病毒属M1R抗原和A35R抗原融合而成，所述M1R抗原和A35R抗原以柔性多肽连接，所述正痘病毒属融合抗原的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的正痘病毒属融合抗原，其特征在于，所述的正痘病毒属融合抗原还具有N糖基修饰的缺失。
3.根据权利要求2所述的正痘病毒属融合抗原，其特征在于，N糖基修饰的缺失为在M1R抗原发生的N73Q和N140Q的突变。
4. 根据权利要求3所述的正痘病毒属融合抗原，其特征在于，所述正痘病毒属融合抗原的序列如SEQ ID NO.5所示。
5. 根据权利要求2所述的正痘病毒属融合抗原，其特征在于，所述正痘病毒属融合抗原为原核表达系统可溶性表达，其中，原核表达系统中的表达载体表达硫氧化还原蛋白，宿主细胞具有trxB和gor基因突变，所述正痘病毒属融合抗原的序列如SEQ ID NO.7所示。
6. 根据权利要求5所述的正痘病毒属融合抗原，其特征在于，所述表达载体为pTig质粒，所述宿主细胞为大肠杆菌Origami (DE3)。
7. 根据权利要求5所述的正痘病毒属融合抗原，其特征在于，所述正痘病毒属融合抗原还与金属硫蛋白3融合，所述正痘病毒属融合抗原的序列如SEQ ID NO.9所示。
8. 根据权利要求7所述的正痘病毒属融合抗原，其特征在于，所述表达载体为pTig质粒，所述宿主细胞为大肠杆菌Origami (DE3)。
9.一种编码权利要求1-8任一所述的正痘病毒属融合抗原的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列为：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8或者SEQ ID NO.10。
10.一种含有权利要求9所述多核苷酸的表达载体。
11.一种含有权利要求10所述表达载体的宿主细胞。
12.权利要求1-8任一所述的正痘病毒属融合抗原在制备正痘病毒属疫苗中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述正痘病毒属包括猴痘病毒、天花病毒、鼠痘病毒、马痘病毒、痘苗病毒和牛痘病毒。
14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述疫苗包括重组蛋白疫苗、核酸疫苗和病毒载体疫苗。
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