CN101535492A - 表达含有二硫键的蛋白质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在原核宿主中表达真核蛋白质的方法，特别是为了保持生物活性需要形成二硫键的真核蛋白质。各种方法被使用，包括融合成硫氧还蛋白、二硫键异构酶的细胞质表达、硫氧还蛋白和/或谷胱甘肽还原酶的缺陷、蛋白酶缺陷和其类似。该方法适合表达具有生物活性的单体和二聚体形式的真核蛋白质，例如单体和二聚体形式的解联蛋白或解联蛋白结构域。包括载体、表达蛋白质的宿主细胞、表达的蛋白质和使用该蛋白质的方法。

Description

表达含有二硫键的蛋白质的方法

政府资助声明

【0001】本发明全部或部分地由美国陆军(the United States Army)和美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)的资金资助。美国政府可以拥有本发明的某些权利。

发明背景

【0002】本发明涉及在重组宿主中表达蛋白质的方法，而且更特别地是在微生物宿主中表达为了维持生物活性所需要形成二硫键的异源真核蛋白质。

【0003】各种蛋白质是已知的，其具有商业和医疗的应用，且其特征在于具有由二硫键稳定的复杂分子结构。一种这样类别的蛋白质，解联蛋白，包括富含半胱氨酸的蛋白质种类，其是整合素的已知最有效的可溶性配体(Gould.Polokoffet al.1990；Niewiarowski，McLane et al.1994)。三肽基序RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp)，在大部分单体解联蛋白中，是保守的(Niewiarowski，McLaneet al.1994)。RGD序列在柔性环，即整合素-结合环的端部，其由二硫键稳定并且从肽链的主体中突出出来。解联蛋白结合到纤维蛋白原受体αIIbβ3，其使得纤维蛋白原-依赖性的血小板凝聚受到抑制(Savage，Marzec et al.1990)。除了裂解素(barbourin)，其为含有KGD的解联蛋白，它对于αIIbβ3整合素来说是相对特异性的配体(Scarborough，Rose et al.1991)，其它解联蛋白是相对非特异性的，而且能阻断或干扰与其它β3整合素以及β1整合素的功能相关的信号通路(McLane，Marcinkiewicz et al.1998)。

【0004】Contortrostatin(CN)是从亚种南美铜头蝮(Agkistrodon contortrixcontortrix)(南铜头蝮)毒液中分离出来的解联蛋白(Trikha，Rote et al.1994)。CN在其整联蛋白-结合环里，呈现典型的RGD基序。不像其它的单体解联蛋白，CN是同型二聚体，如质谱所显示，对于完整分子，具有的分子量(molecular mass(Mr))为13,505；以及对于还原性链，为6,750(Trikha，Rote et al.1994)。

【0005】迄今所鉴别出的CN受体，包括：整联蛋白α II bβ3、αvβ3、ανβ5和α5β1(Trikha，De Clerck et al.1994；Trikha，Rote et al.1994；Zhou，Nakada et al.1999；Zhou，Nakada et al.2000)。CN与整联蛋白之间的相互作用全部为RGD-依赖性。作为抗癌剂，CN已经在体外基于细胞的功能试验和体内动物模型中，显示出其是高效的抗血管生成和抗转移性分子(Trikha，De Clerck et al.1994；Trikha，Rote et al.1994；Schmitmeier，Markland et al.2000；Zhou，Hu et al.2000；Markland，Shieh et  al.2001；Swenson，Costa et al.2004)。CN也具有直接吸引(连接，engage)肿瘤细胞、并且以细胞抑制的方式(in a cytostatic manner)抑制它们的生长的能力(Trikha，DeClerck et al.1994；Trikha，Rote et al.1994；Schmitmeier，Markland et al.2000)。CN的抗肿瘤活性基于其与癌细胞和新生血管内皮细胞上的整联蛋白α5β1、αvβ3和αvβ5具有高的亲和作用(Trikha，De Clerck et al.1994；Zhou，Nakada et al.1999；Zhou，Nakada et al.2000；Zhou，Sherwin et al.2000)。这种多样性的作用机理使得CN具有比许多抗血管生成试剂显著的优势，这些抗血管生成试剂仅阻断单一抗血管通道和/或不能直接靶向肿瘤细胞。

【0006】CN全长DNA前体已经被克隆并测序(Zhou，Hu et al.2000)。CN，作为2027bp的多结构域前体，产生于在蛇毒腺，其具有1449bp的开放阅读框(编码蛋白质原(proprotein)、金属蛋白酶和解联蛋白结构域)，CN经过蛋白水解加工，可能自身催化加工，产生成熟CN。CN解联蛋白结构域，编码分子量相当于CN亚单元分子量的65个氨基酸。该CN全长DNA前体的mRNA序列，能使用登陆代码——AF212305，在基因银行数据库(GeneBank database)中获得。编码CN的该65个氨基酸的解联蛋白结构域的核苷酸序列，在mRNA中表现为从1339到1533的片段。编码CN全长基因的质粒，已经被描述(Zhou，Hu et al.2000)；并且可以从南加利福尼亚大学(University of Southern California)的Francis S.Markland实验室得到。

【0007】在结构上，CN是富含半胱氨酸的蛋白质(每个单体10个半胱氨酸)，其没有呈现二级结构，并且如同其它解联蛋白，具有复杂的折叠形式，其依赖多个二硫键(四个链内二硫键和两个链间二硫键)来稳定其三级结构(Zhou，Hu et al.2000)。通过在由多个二硫键锁住的紧凑结构中的折叠，CN，如同许多其它的毒素蛋白，具有生存优势：不易受到蛋白水解攻击而且能更好地装备，以在更严酷的细胞外的微环境中生存。其高度交联的结构和独特的生物活性，是采用重组表达系统产生生物学功能性CN(或其它解联蛋白结构域蛋白)的障碍。更进一步的困难是从二聚体CN衍生的多结构域前体的CN去整合结构域，没表现出二级结构，已知该特征是有利于大部分初生蛋白质正确折叠(Moiseeva，Swenson et al.2002)的一个特征。天然CN的结晶结构还没有被阐明。CN的折叠模式推定为：与已经经过研究的其它毒蛇二聚体解联蛋白一样复杂(Calvete，Jurgens et al.2000；Bilgrami，Tomar et al.2004)。到目前为止，尝试表达蛇毒解联蛋白，例如CN和功能性天然构象异构体，以及在真核和原核系统内适合大规模生产的高水平表达，一直是令人沮丧的(例如参见Moura-da-Silva，Linica et al.1999)。

发明概述

【0008】提供了在原核宿主内表达真核蛋白质的方法，尤其对于具有多个二硫键的真核蛋白质。该方法特别适合于表达真核蛋白质，其中生物活性依赖于一个或多个二硫键(链内和链间)的形成。在一些情况下，该方法应用于表达活性真核蛋白质，其需要多个二硫键(链内和链间)的形成；并且形成很少的二级结构，以至无二级结构。

【0009】在一种方法中，宿主细胞内真核蛋白质的表达，是依照与融合伙伴(fusion partner)在一起的基因融合物，表达蛋白质来实现的。该融合伙伴可以是细菌硫氧还蛋白(bacterial thioredoxin)，例如硫氧还蛋白A(Thioredoxin A(TrxA))。这是通过将编码真核蛋白质的序列克隆到编码硫氧还蛋白的序列的下游(即3’)而实现的。编码融合蛋白质的序列可以包含在合适的表达载体内，处于合适的调节控制序列的控制之下，例如启动子、任选的增强子、阻遏物和类似物的控制下。在一种实施方式中，载体是pET32a。在其它实施方式中，载体是pET32a/pCDFDuet-1组合物。用编码硫氧还蛋白/真核蛋白质的表达载体转移的宿主细胞被培养，以产生含真核蛋白质的融合蛋白质。

【0010】在还有另一实施方式中，原核宿主细胞被工程化，以便胞质表达二硫键异构酶，其通常靶向细菌内的周质空间。在一实施方式中，二硫键异构酶是DsbC。在另一实施方式中，该细胞被工程化，以胞质表达氧化还原催化剂，例如细菌巯基-二硫键互换蛋白质DsbD的α-结构域。DsbC或DsbD的α-结构域的胞质定位，可以通过表达不含信号序列的成熟蛋白质来实现。宿主细胞也可以被修饰，以便以胞质方式表达DsbC以及DsbD的α-结构域。

【0011】在进一步的实施方式中，具有异构酶活性增加的二硫键异构酶的活性位点突变体，可以被宿主细胞胞质表达，以替代野生型异构酶。举例来说，大肠杆菌(E.coli)里的野生型DsbC的活性位点，其中序列CGYC被CGFC或CTFC替代，结果产生突变体酶，其具有增加的异构酶活性。

【0012】在另一个实施方式中，宿主细胞可以含有突变体trxB基因和/或突变体gor基因，使得细胞缺乏硫氧还蛋白还原酶活性和/或谷胱甘肽还原酶活性。这些突变可以单独使用，或与本文所述的任何其它宿主细胞结合使用。

【0013】在进一步的实施方式中，宿主细胞被制成缺乏一个或多个蛋白酶。示例性的这样的蛋白酶包括那些由ompT和lon基因编码的蛋白酶。举例来说，大肠杆菌(E.coli)宿主细胞AD494(DE3)pLysS缺乏trxB基因，以及ompT和lon。大肠杆菌(E.coli)菌株Origami B(DE3)pLysS和Rosetta-gami B(DE3)pLysS缺乏trxB、gor、ompT和lon基因产物。这些突变可以与本文所述的任何其它宿主细胞变异结合使用。因此，ompT和lon突变可以与缺乏trxB和/或gor的宿主细胞结合使用，以及可以与被修饰以胞质表达DsbC(野生型蛋白质或活性位点突变体)和/或DsbDα-结构域的宿主细胞结合使用。

【0014】由本文所公开的方法表达的真核蛋白质包括：生物活性依赖于至少一个二硫键形成的那些酶。在另一实施方式中，真核蛋白质的生物活性依赖于至少两个二硫键的形成。在还有另一的实施方式中，真核蛋白质的生物活性依赖于至少三个二硫键的形成。在进一步的实施方式中，真核蛋白质的生物活性依赖于至少四个二硫键的形成。在还有进一步的实施方式中，真核蛋白质的生物活性依赖于至少五个二硫键的形成。在还有进一步的实施方式中，真核蛋白质的生物活性依赖于至少10个二硫键或至少15个二硫键的形成。

【0015】如本文所使用，术语“真核蛋白质(eukaryotic protein)”涉及由真核细胞天然表达的蛋白质。术语真核蛋白质也包括：在天然表达的真核蛋白质氨基酸序列中的变异，只要该蛋白质保留与天然表达真核蛋白质相关的至少一个活性，而且该真核蛋白质的序列不同于任何原核蛋白质。在优选的实施方式中，真核蛋白质依照本文所述被表达，使得它们保留天然蛋白质所特有的至少一个活性或功能。优选地，表达的蛋白质保留天然蛋白质的活性或功能之全部或基本上保留天然蛋白质的活性或功能。在其它优选的实施方式中，表达的蛋白质保留天然蛋白质所特有的至少一个活性或功能，其活性和功能依赖于至少一个或多个二硫键的形成。除非另有说明，如本文所使用，术语“基本上”意思是加上或者减去10％。

【0016】蛋白质的活性或功能(即其生物活性)反映的是其一级氨基酸序列和/或二级和/或三级结构引起的蛋白质的特征。举例来说，真核酶的生物活性包括催化特定酶反应的能力。结构真核蛋白质的生物活性可以包括这种蛋白质在细胞里形成合适的亚细胞结构的能力。评估生物活性的方法在本领域是已知的。

【0017】可如本文所述被表达的真核蛋白质包括：单体或多聚体(例如二聚体)蛋白质，和不同种类的蛋白质，例如ADAM蛋白质、解联蛋白、毒素、包括细菌或病毒蛋白质的疫苗成分、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteases(MMPs))、包括抗体和T细胞受体胞外结构域的免疫球蛋白、属于细胞粘合分子的免疫球蛋白超家族(the immunoglobulin superfamily of cell adhesion molecules(IgCAMs))的粘合蛋白、细胞因子、趋化因子、干扰素、生长因子和纤溶酶原激活物。示例性蛋白质包括contortrostatin、jararhagin、解联蛋白schistatin、蛇金属蛋白酶纤溶酶(snake metalloproteinase fibrolase)、人白细胞介素-2-前体、人干扰素-γ、人转化生长因子β2、人肝脏表达趋化因子(human liver expression chemokine(LEC，CCL16))，ω-芋螺毒素CVID前体(omega-conotoxin CVID precursor)、蝎氯毒素、人ADAM 9前体、人血管内皮因子A(human vascular endothelial factor A(VEGF-A))和人组织型纤溶酶原激活前体(human tissue-type plasminogenactivator precursor(t-PA))。

【0018】真核蛋白质的活性片段也可以用本发明的方法进行表达。举例来说，在蛇毒素解联蛋白前体(例如品种PII和PIII)的情况下，其是包括几个生物活性结构域(金属蛋白酶、解联蛋白、类解联蛋白和/或富含半胱氨酸)的多结构域蛋白质，表达的产物可以是全长前蛋白(全长度前体)或生物活性片段，以下面的可能性为代表：金属蛋白酶结构域、解联蛋白结构域、类解联蛋白结构域、和富含半胱氨酸结构域，或者单独地，或者与其它结构域组合(例如一起表达的解联蛋白结构域和富含半胱氨酸结构域)。解联蛋白的其它片段也是可能的。其它片段是可能的。在抗体的情况下，示例性的片段包括F(ab′)2片段、Fab片段、Fv片段或单链Fv片段和Fc片段。其它的抗体片段也是可能的。

【0019】在一个实施方式中，在硫氧还蛋白与真核蛋白质之间，切割位点被基因工程化，以便能够：在表达之后，从融合蛋白质中分离出真核蛋白质。在另一个实施方式中，切割位点是蛋白水解切割位点。在另一实施方式中，切割位点是化学切割位点。优选地，切割位点位于硫氧还蛋白与真核蛋白质之间(例如，硫氧还蛋白序列的下游和含有二硫键的真核蛋白质的N-末端的上游)，以便得到没有硫氧还蛋白的真核蛋白质。

【0020】在一个实施方式中，含有内部切割位点的表达的融合蛋白质，可基本上从其它污染分子中得到纯化。为了有助于纯化，融合蛋白质可以包括编码配体或受体的序列，或包括能络合金属离子的氨基酸序列(即标签)。标签序列可以是任何的配体/受体对的任意一个，其本质是肽。在一个实施方式中，标签序列包括组氨酸-标签(His-tag)(poly His(多聚组氨酸))序列。标签序列优选地位于含有二硫键的真核蛋白质的N-端或C-端，和更优选地位于含有二硫键的真核蛋白质的N-端，以及在任何切割位点的上游。

【0021】通过本文方法表达的含有二硫键的真核蛋白质可以包括功能上有用的序列，其是从相同结构类别的其它蛋白质中截取或模拟的。这些功能序列，非原产于真核蛋白质，可以位于真核蛋白质的任意一个末端或者真核蛋白质内部，如这种加成对真核蛋白质生物功能的影响所限制的。这种功能序列包括位于单体或二聚体解联蛋白一级序列的大多数C-端Cys残基之下游的氨基酸残基。举例来说，生物活性的解联蛋白结构域可以包括位于其C-端的序列，其指导结合到特定类型的整联蛋白上。举例来说，CN全长度解联蛋白前体或其解联蛋白结构域可以以C-端延长结构来表达，HKGPAT(三字母密码：His-Lys-Gly-Pro-Ala-Thr)，其代表锯鳞血抑肽(echistatin)的C-端氨基酸序列，锯鳞血抑肽是一种其天然状态为单体的解联蛋白。在CN的C-端加入HKGPAT，可被用于增加表达的重组CN解联蛋白结构域对α5β1整联蛋白的亲和力。这种C-端融合，也能有利于新生重组CN整联蛋白结构域在该分子的C-端半个部分中的正确折叠，其中存在整联蛋白-结合环的关键结构元素。

【0022】在还有的进一步的实施方式中，含二硫键的真核蛋白质是解联蛋白，其可以被表达为在C-末端带有HKGPAT序列的嵌合融合蛋白质。含有N-端与HKGPAT序列相连结的contortrostain结构域的融合蛋白质，被称为vicrostain(VN)。

【0023】在进一步的实施方式中，对于编码真核蛋白质的核苷酸序列，其密码子的使用可以被优化，以便在特定宿主内表达。举例来说，大肠杆菌(E.coli)密码子的使用可以被操作，以使解联蛋白的表达最优化，这是通过借助用于转化这些表达宿主的基因工程质粒编码的tRNA种类，来补充表达宿主的tRNA产量。对于硫氧还蛋白或二硫键异构酶编码序列——其不是宿主细胞内生的，密码子的使用也可以通过选择更适合宿主细胞的密码子而被最优化。

【0024】在进一步的方法中，真核蛋白质也可以被直接表达，而没有上游的硫氧还蛋白序列。真核蛋白质可以包含上面所述的另外的序列。用编码没有被融合到硫氧还蛋白上的真核蛋白质的载体所转化的宿主细胞，可以含有上面所讨论的修饰的任何组合。

【0025】根据上面的任何方法，含有真核蛋白质的融合蛋白质的表达水平至少为1-3mg/L，更优选地4-6mg/L，甚至更优选地7-9mg/L，还有甚至更优选地8-10mg/L或更多，11-14mg/L或更多，15-19mg/L或更多，或20mg/L或更多。

【0026】还提供了由本文所述的任何一种方法所生产的基本上纯化的真核蛋白质(被融合到硫氧还蛋白或从硫氧还蛋白中分离)。

【0027】进一步提供融合蛋白质，其包括编码硫氧还蛋白的N-端片段和编码真核蛋白质的C-端片段；所述真核蛋白质，就生物学活性而言，需要至少形成两个链内或链间的二硫键。优选地，该真核蛋白质包括解联蛋白。该融合蛋白质可以被切割，以产生真核蛋白质，其基本上不含有硫氧还蛋白。该融合蛋白质可以是基本上纯化的。

【0028】还进一步提供包括所产生的真核蛋白质(或融合蛋白质)和原核物质的组合物。组合物中的原核物质可从用作表达宿主的原核细胞中得到。本文所使用的原核物质涉及蛋白质、脂蛋白、脂类、核酸、碳水化合物，或者任何其它的在原核细胞内存在、但在真核细胞内不存在或与真核细胞内存在的分子不同的分子。

【0029】另外提供由本文所述方法的任何一个得到的表达载体和含有此类表达载体的原核宿主细胞。例如，提供表达载体，其含有编码融合到解联蛋白或解联蛋白结构域上的硫氧还蛋白的表达盒，以及用这种表达载体转化的宿主细胞。

【0030】也提供单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域，其包括非源于解联蛋白或解联蛋白结构域的C-端序列，即编码功能整联蛋白-结合环的C-端序列。在一个实施方式中，整联蛋白结合环选自αIIbβ3、αvβ3、αvβ5或α5β1。在一个实施方式中，整联蛋白结合环C-端序列包括HKGPAT。在进一步的实施方式中，整联蛋白结合环被至少一个分子内二硫键稳定化。在还有另一个实施方式中，单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域来自contortrostain。单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域，可以通过如上所述在宿主细胞内表达而得到。表达之后，可以以基本上纯化的形式得到单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域。

【0031】另外提供抑制表达整联蛋白受体的细胞和一种或者多种整联蛋白之间的结合的方法，所述整联蛋白受体特异于选自αIIbβ3、αvβ3、ανβ5和α5β1的一种或者多种整联蛋白，所述一种或者多种整联蛋白选自αIIbβ3、ανβ3、ανβ5和α5β1，该方法包括将该细胞与单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域相接触，其中所述单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域包括非源于解联蛋白或解联蛋白结构域的C-端序列，所述的C-端序列编码功能整联蛋白-结合环(functional integrin-bindingloop)。在优选的实施方式中，整联蛋白受体是玻连蛋白受体。

【0032】还进一步提供抑制体内血小板聚集、细胞生长、细胞粘着、转移、或新血管形成的方法，该方法包括给予需要这种治疗的个体有效量的单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域，其包括非源于解联蛋白或解联蛋白结构域的C-端序列，所述的C-端序列编码功能整联蛋白-结合环。

附图简述

【0033】图1描述在大肠杆菌周质内(E.coli periplasm)的氧化途径(来自Collet和Barwell 2002)。

【0034】图2描述在大肠杆菌周质内的异构化途径(来自Collet和Barwell2002)。

【0035】图3显示DsbC的结晶结构，以及将DsbDα停靠(dock)在DsbC裂缝(cleft)中之后揭示出的DsbC-DsbDα相互作用(来自Haebel，Goldstone et al.2002)。

【0036】图4显示二硫键形成的模型，由在大肠杆菌周质内的各种Dsb折叠酶催化。

【0037】图5显示在大肠杆菌细胞质内的硫氧还蛋白和谷氧还蛋白的途径(来自Raina and Missiakas 1977)。TrxA：硫氧还蛋白(thioredoxin)；TrxB：硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase)；Grx：谷氧还蛋白(glutaredoxin)；Gor：谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase)。

【0038】图6显示pET32a载体图(来自Novagen)。

【0039】图7显示将trimestain单体解联蛋白停靠在整联蛋白αvβ3结合袋(binding pocket)之中之后推定的trimestain-受体相互作用(来自Fujii，Okuda et al.2003)。

【0040】图8描述可溶性总蛋白组分(total protein fraction，TPF)的SDS-PAFGE考马斯(Coomassie)染色凝胶，所述TPF是从用各种Trx融合构建物转化的OrigamiB(DE3)pLys E.coli宿主收集的。1L培养液的转化和未转化的Origami B E.coli被用1mM IPTG诱导，并且在250rpm的摇瓶内于37℃或25℃生长3小时。可溶性总蛋白组分(total protein fraction，TPF)被收集在4ml pH7.5的20mM的Tris-HCl中，其中10μl被加载、且在非还原性条件下进行分析。从左至右的泳道：来自在37℃下生长和诱导的Trx-VN-表达细胞的TPF，来自在37℃下生长和诱导的非转化细胞的TPF，来自在37℃下生长和诱导的Trx-rCN-表达细胞的TPF，来自在25℃下生长和诱导的非转化细胞的TPF，宽范围预染蛋白质标准(Bio-Rad)，来自在25℃下生长和诱导的Trx-VN-表达细胞的TPF，和来自在25℃下生长和诱导的Trx-rCN-表达细胞的TPF。

【0041】图9显示Vicrostatin(VN)、rCN构建物和天然CN对ADP-诱导的血小板聚集的抑制效应。不同浓度的天然CN、Vicrostatin(VN)、rCN构建物用富含血小板的血浆温育。加入ADP诱导血小板聚集；VN、rCN构象异构体或天然CN，先于ADP一分钟被加入。天然CN和VN两者都抑制聚集，其IC₅₀为～60nM，表明VN与血小板发生相互作用，与天然CN与血小板发生相互作用相同。rCN构建物显示：在毫摩尔范围、但不是在纳摩尔范围内抑制血小板活性。

【0042】图10显示对MDA-MB-435乳腺癌细胞附着到固定化纤连蛋白(fibronectin，Fn)或玻连蛋白(vitronectin，Vn)的抑制。用各种浓度(0-1000nM)的天然CN或VN对MDA-MB-435细胞(图面A)预处理30min(分钟)，抑制MDA-MB-435细胞(100μl的细胞，10⁵细胞数/ml)对固定化的纤连蛋白(fibronectin，Fn)的粘附。用各种浓度(0-1000nM)的CN或VN对MDA-MB-435细胞(图面B)预处理30min，抑制MDA-MB-435细胞(100μl的细胞，10⁵细胞数/ml)对固定化的玻连蛋白(vitronectin，Vn)的粘附。预处理的细胞被允许在25℃下附着1小时；而且在洗掉非附着的细胞之后，用MTS细胞生存力试验(cell viability assay)估计每种条件下的附着细胞数目。Vicrostatin(VN)和天然CN显示出相似的抑制曲线。

【0043】图11显示对通过人工基底膜的MDA-MB-435乳腺癌细胞侵入的抑制效应。该细胞在各种浓度(10，100，1000nM)的天然CN或玻连蛋白的存在下、在25℃下被温育30min，并且然后让其在Boyden槽内迁移8小时。玻连蛋白(VN)和天然CN显示出相似的抑制曲线。

【0044】图12显示在给予含有天然CN和Vicrostatin(VN)的脂质体之后，分别为LCN和LVN，MDA-MB-435肿瘤在鼠异种移植模型中的生长。动物用LCN或LVN治疗(105μg，每周两次，静脉注射给药)。也包括PBS处理的对照动物。两者的T/C值为～0.27；对于每个治疗组，肿瘤生长至400mg(T-C)延缓到第31天。

【0045】图13A和13B显示CN和VN的抗血管形成作用，这通过来自MDA-MB-435肿瘤的组织切片的CD31免疫染色得到证实，该肿瘤是从用含有CN和VN的脂质体处理的异种移植老鼠体内得到的。图13A显示CD34(棕色)染色的每个治疗组的代表性切片。图13B显示对染色微脉管的测量估计，其中对于肿瘤诱导的血管生成，使用LCN显示90％的抑制以及使用LVN显示92％的抑制(两者均与PBS处理的对照动物相对比)。

【0046】图14A和14B分别显示天然CN和VN的MALDI-TOF质谱。对于VN，7143.41的Mr(分子量)单峰表明其是单体。

【0047】图15A和15B分别显示天然CN和VN的电喷雾电离(electron sprayionization(ESI))质谱。对于CN，在13C中的13507.0的大峰表明为二聚体；而对于VN，7146.0的单峰表明为单体。

【0048】图16是总结在大肠杆菌(E.coli)中使用的密码子的图表(来自Guerdoux-Jamet，Henaut et al.1977)。

【0049】图17显示在各种生物体内使用最少的八个密码子的图表(来自Guerdoux-Jamet，Henaut et al.1977)。

【0050】图18A显示含有细菌内极少使用的密码子的野生型CN基因，所述密码子以黑体显示。

【0051】图18B显示取代全部CGG和大部分ACA极少使用的密码子之后的突变的CN基因序列。剩余的未取代ACA密码子以黑体突出显示。

【0052】图19是pCDFDuet-1载体的图谱(来自Novagen)。

发明详述

【0053】提供了在微生物宿主中表达异源真核蛋白质的方法，所述蛋白质的生物学活性需要形成二硫键。该方法特别适合于表达需要形成多个二硫键(链内和链间)的生物学上具有活性的真核蛋白质，包括那些形成很少的二级结构至无二级结构的这种蛋白质。

【0054】在一个方法中，真核蛋白质融合到硫氧还蛋白而被以融合蛋白表达。如本文所使用，“硫氧还蛋白”是指含有二巯基/二硫键活性位点(CGPC)的小的(大约13kD)电子载体蛋白质家族，其是主要的细胞内蛋白质二硫键还原酶，它们充当酶的电子供体，如核苷酸还原酶、硫氧还蛋白过氧化物酶(过氧化物氧还蛋白)和甲硫氨酸亚砜还原酶。在细菌中，硫氧还蛋白的氧化还原电势由硫氧还蛋白还原酶(硫氧还蛋白B，TrxB)来维持。

【0055】如本文所使用，硫氧还蛋白是指小蛋白质种类(大约10-12kD)，其包括含有Cys-X1-X2-Cys序列(活性位点)的短序列基序，和含有这种基序的整体结构，其对应于被称为类硫氧还蛋白折叠(Martin1995)的结构。这种基序末端的半胱氨酸对(cysteine pair)可以氧化形成二硫键，其被NADPH依赖性酶——硫氧还蛋白还原酶还原。示例性硫氧还蛋白是来自大肠杆菌(E.coli)的硫氧还蛋白A(TrxA)，其在长度上大约含有109个氨基酸、而且是由trxA基因编码的。大肠杆菌野生型硫氧还蛋白A的氨基酸序列显示在下面，其中活性位点CXXC以黑体且带下划线标出。

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KGQLKEFLDANLA(SEQ ID NO：1)

【0056】硫氧还蛋白的活性位点突变体可以代替野生型硫氧还蛋白，使用在融合蛋白质中。因此，硫氧还蛋白活性位点基序CXXC，可以用来自另一氧化还原酶的活性位点基序进行代替。举例来说，野生型硫氧还蛋白A的活性位点突变体可以代替野生型硫氧还蛋白，而被使用在与真核蛋白质融合的融合构建物中。关于这一方面，硫氧还蛋白A的活性位点基序CGPC可以用获得自另一细菌的氧化还原酶——谷氧还蛋白A(也被称为谷氧还蛋白1)的活性位点基序CPYC来代替。这种突变体可被称为类谷氧还蛋白硫氧还蛋白(glutaredoxin-like thioredoxin)。另一个硫氧还蛋白活性位点突变体是类PDI硫氧还蛋白，是通过用取自真核蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isorherase，PDI)的活性位点基序CGHC代替活性位点野生型基序CGPC而产生的。

【0057】除了全长硫氧还蛋白A，更短的片段可以与真核蛋白质一起用作融合蛋白。

【0058】在融合蛋白质中使用的硫氧还蛋白，优选地，来自用于表达的同一类型的宿主。举例来说，融合蛋白质中的编码硫氧还蛋白部分，优选地来自特定细菌宿主，如果该特定细菌宿主被打算作为表达宿主。

【0059】可以由本文的方法表达的真核蛋白质，包括宽范围的含二硫键的蛋白质，所述蛋白质包括单体和多聚体的解联蛋白、蛇毒素(P I类、P II类或PIII类)、抗体片段(以scFv、Fab或F(ab′)2形式)、细胞因子、趋化因子、干扰素、肿瘤生长因子、蝎毒素、芋螺毒素、ADAM(A解联蛋白和A金属蛋白酶)蛋白质的各种结构域、疫苗、生长因子、纤溶酶原激活物、和属于不同类别且被表达为融合蛋白质(例如融合到解联蛋白里的趋化因子，等等)的前述蛋白质的组合，以及其它的生物活性的富含半胱氨酸的真核蛋白质(例如jararhagin-C——基因银行(GeneBank)登录代码AAB30855；解联蛋白schistatin——基因银行登录代码P83658；蛇金属蛋白酶纤溶酶——基因银行登录代码P83255；人类白细胞介素-2-前体——基因银行登录代码NP000577；人类干扰素-γ——基因银行登录代码NP000610；人类转化生长因子，β2——基因银行登录代码NP003229；人类肝脏表达趋化因子，CCL16——基因银行登录代码O15467；ω-芋螺毒素CVID前体——基因银行登录代码P58920；蝎氯毒素——基因银行登录代码P45639；人类ADAM9前体——基因银行登录代码Q13443；人类血管内皮因子A，VEGF-A——基因银行登录代码P15692；人类组织型纤溶酶原激活物前体，t-PA——基因银行登录代码P00750)，等等。

【0060】如本文所使用，“ADAM”(解联蛋白和金属蛋白酶)是一个跨膜真核蛋白质家族，其含有包括解联蛋白结构域和金属蛋白酶结构域在内的几种不同的结构域。

【0061】如本文所使用，“解联蛋白”是指一类富含半胱氨酸的蛋白质，其是整联蛋白的有效的可溶性配体，而且它们参与调节许多过程，例如细胞-细胞和细胞-细胞外基质的附着(粘附，adhesion)、运动(迁移，motility)和侵入，细胞周期进程，在许多多细胞生物体的发育过程中的分化和细胞类型特异化，以及细胞死亡和凋亡。三肽基序RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，(Arg-Gly-Asp))在大部分单体解联蛋白中是保守的，并且位于弹性环——整联蛋白-结合环的顶端，其被二硫键稳定且突出于肽链的主体之外。所有从蛇毒中提纯的解联蛋白结合到纤维蛋白原受体——整联蛋白αIIbβ3，其中该结合使得纤维蛋白原-依赖性的血小板聚集受到抑制。大部分解联蛋白也以RGD-依赖性的方式结合到整联蛋白素αvβ3(玻连蛋白受体)和α5β1(纤连蛋白受体)。

【0062】解联蛋白蛋白质的大部分解联蛋白结构域，在结构上是以使其与整联蛋白结合袋形成深且广泛的接触的方式设计的，所述整联蛋白结合袋产生在α-亚单元β-螺旋桨(推进器，propeller)与β-亚单元I样结构域之间，其显示出关键的MIDAS位点(金属离子-依赖性粘附位点(metalion-dependent adhesion site))，该位点与RGD三肽基序里的带负电Asp残基配位。除柔性整联蛋白-结合环之外，解联蛋白显示出其它的独特结构元件，它们已经显示出参与整联蛋白受体里与MIDAS相邻的结合袋。这些另外的结构元件增加解联蛋白与其受体之间的作用强度。一个这样的结构元件位于解联蛋白的C-末端的终端。

【0063】解联蛋白的C-端尾部稳定了解联蛋白的整联蛋白-结合环，使得其能与它的真核整联蛋白的结合袋相互作用。由于这个原因，解联蛋白成为比环状RGD肽更好的配体，而且作为治疗剂应当比后者更好。新的结构研究表明解联蛋白的整联蛋白-结合环与其C-端尾部形成紧密接触，一起折叠为功能单元，并且后者通过形成另外的接触部位协助结合袋里的整联蛋白-结合环(Fujii，Okuda et al.2003)。在将trimestatin停靠入整联蛋白ανβ3结合袋之后，推定的trimestatin-受体相互作用显示在图8中(来自Fujii，Okuda et al.2003)。一些解联蛋白的C-端尾部呈现一个或多个关键性的带负电残基，其用来与另外的结合袋配位，所述结合袋即在β-整联蛋白亚单位的表面上所发现的AMIDAS(另外的金属离子-依赖性粘附位点(additional metal ion-dependent adhesion site))。

【0064】如本文使用，“contortrostatin”(CN)是指从亚种南美铜头蝮(Agkistrodon contortrix contortrix(南铜头蝮))毒液中分离出来的解联蛋白(Trikha，Rote et al.1994)。CN，作为2027bp的多结构域前体，具有编码前体蛋白、金属蛋白酶和解联蛋白结构域的1449bp的开放阅读框，产生于蛇毒腺中。该前体经过蛋白水解加工，可能自身催化加工，产生成熟CN。该全长CN蛋白原是由全长mRNA(基因银行AF212305)的核苷酸序列85-1536编码的，然而CN的解联蛋白结构域指mRNA中的1339到1533。下面显示的是CN的解联蛋白结构域，其含有65个氨基酸，其中RGD序列用下划线标出。

DAPANPCCDAATCKLTTGSOCADGLCCDQCKFMKEGTVCRRARGDD

LDDYCNGISAGCPRNPFH(SEQ ID NO：2)

【0065】成熟CN包括由两个二硫键连接在一起的两个65aa的解联蛋白结构域。基于其它的同型二聚体解联蛋白的结构数据(Bilgrami，Tomar et al.2004)，据信：两个65aa亚单元对的第一个和第三个Cys残基以反向平行形式形成两个链间二硫键(亚单位对中的一个的第一个Cys残基与另一个亚单位的第三个Cys残基配对，反之亦然)。

【0066】CN在其整联蛋白-结合环内呈现典型的三肽RGD基序。与来自响尾蛇毒液的其它单体解联蛋白不同，CN是同型二聚体，如质谱所示，其完整分子具有的分子量(Mr)为13,505，以及对于还原链，为6,750(Trikha，Rote et al.1994)。

【0067】用编码硫氧还蛋白/真核蛋白质的表达载体所转化的宿主细胞，被培养生产融合蛋白，其含有生物活性形式的真核蛋白质。表达的蛋白质可以采用传统的细胞溶解的方法直接以可溶形式从细胞中得到，并且，从中，采用传统的提纯方法，可以分离得到基本上纯化形式的表达蛋白质。

【0068】如本文使用，涉及多肽(或蛋白质)的术语“提纯的(purified)”不需要是完全的纯化。相反，它代表的意思是目标多肽(或者多种多肽)处于这样的环境中，即：其中该蛋白质比最初生产该蛋白质的环境中的含量更丰富(以质量计)。提纯的多肽可以通过许多方法得到，举例来说包括层析法、制备型电泳法、离心法、沉淀法、亲和纯化等等。纯度优选地是至少10％。一个或多个“基本上纯化的(substantially purified)”多肽是环境中至少50％的蛋白质含量，更优选地环境中至少75％的蛋白质含量，和最优选地环境中至少95％的蛋白质含量。蛋白质含量可以采用Hartree(Hartree　1972)描述的、对Lowry等人的方法(Lowry，Rosebrough et al.1951)的改进来测定，使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。

【0069】按照本文的方法，切割位点可以设计在N-端硫氧还蛋白序列与C-端含有真核蛋白质序列之间，以便得到真核蛋白质，而不含有硫氧还蛋白。融合蛋白质可以在任何切割步骤之前被纯化。任何数目的已知切割位点可以用于此目的。合适的蛋白酶切割位点是TEV蛋白酶切割位点，其包括氨基酸序列ENLYFQG/S(三字母密码：Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser)。TEV位点可以仅在含有二硫键的真核蛋白质N-端的上游被基因工程化。化学切割位点也可以被用于此目的。举例来说，DP(Asp-Pro)二硫键序列，可以在融合蛋白质中、以与TEV位点相似的位置被基因工程化。因而，甲酸水解可被用来在DP位点切割蛋白质。

【0070】在一些实施方式中，构建物是由融合到真核蛋白质上的硫氧还蛋白和“标签”序列组成，所述“标签”序列有助于表达之后检测融合蛋白质或提纯融合蛋白质或提纯真核蛋白质。标签序列可以是His-tag(组氨酸标签)或poly His序列(多聚组氨酸序列)，或能络合金属离子的任何氨基酸序列。标签序列也可以是配体/受体结合关系中的任何部分(例如抗体和肽抗原)。标签序列可以被基因工程化到融合蛋白质中、位于N-端、C-端或两者之间的任何位置，正如受到表达体系和真核蛋白质的功能限制所确定。标签序列优选地位于融合蛋白质中的任何切割位点的上游。

【0071】根据本发明的方法，编码融合蛋白质的序列被包含在合适的表达载体里，处于合适的调节序列的控制下，例如启动子、任选的增强子、阻遏物和类似物。对于在微生物宿主内的外源蛋白质的表达，合适的表达载体在本领域是熟知的。在一个实施方式中，载体是pET32a。在另一个实施方式中，载体是pET32a/pCDFDuet-1联合体。

【0072】在另一个实施方式中，细菌宿主细胞可以被工程化，以便胞质表达通常靶向宿主周质空间的二硫键异构酶。在一个实施方式中，二硫键异构酶是DsbC。如本文所使用，“二硫键异构酶(disulfide isomerase)”是指原核蛋白质，其在氧化性蛋白质折叠期间，对不正确的二硫键进行重排。DsbC被跨膜电子转运蛋白DsbD的周质N-端结构域(DsbDα-结构域)特异性地活化。在细菌周质内，蛋白质二硫键的形成被DsbA和DsbC催化。DsbA是单体，其通过膜酶DsbB维持在完全氧化状态下；而DsbC是二聚体，其通过不同的膜蛋白，DsbD，维持在还原状态。尽管DsbA和DsbC的催化区域包括结构上同源的硫氧还蛋白基序结构域，DsbA在体内仅作为氧化酶发挥作用，然而DsbC催化二硫键的还原和异构化，并且DsbC也显示出显著的伴侣蛋白活性。

【0073】DsbC的胞质定位，可以通过表达不含信号序列的成熟蛋白质来实现。下面显示的是大肠杆菌DsbC的序列，其不含信号序列，含有的活性位点CGYC以带下划线的黑体表示。

DDAAIQQTLAKMGIICSSDIQPAPVAGMKTVLTNSGVLYITDDGKHIIQ

GPMYDVSGTAPVNVTNKMLLKQLNALEKEMIVYKAPQEKHVITVFTD

ITCGYCHKLHEOMADYNALGITVRYLAFPROGLDSDAEKEMKAIWC

AKDKNKAFDDVMAGKSVAPASCDVDIADHYALGVQLGVSGTPAVVL

SNGTLVPGYQPPKEMKEFXDEHQKMTSGK(SEQ ID NO：3)

【0074】在进一步的实施方式中，具有增强的异构酶活性的二硫键异构酶的活性位点突变体，可以被用来代替野生型序列。举例来说，DsbC活性位点CGYC，可以用CGFC或CTFC代替，以得到更大的异构酶活性。无信号序列的DsbC(或活性位点突变体)的表达，可以应用在trxB和/或gor缺陷型宿主细胞内。含有trxB和gor突变的双突变体菌株FA113和它的衍生物，可以应用于此目的。

【0075】在另一实施方式中，宿主细胞可以被基因工程，以胞质表达细菌巯基-二硫键交换蛋白质DsbD的α-结构域(DsbDα-结构域)。如本文所使用，“DsbD”是跨膜大肠杆菌酶，其通常靶向内部的周质膜，含有面向周质空间的α-结构域，在周质空间中，其充当二硫键交换催化剂(氧化还原催化剂)。DsbD的胞质定位，可以通过表达不含信号序列的结构域来实现。DsbDα-结构域的胞质表达可以与宿主细胞相结合，所述宿主细胞为trxB和/或gor缺陷型细胞、和可以表达DsbC的细胞(无信号序列的野生型酶或活性位点突变体)。DsbDα-结构域代表成熟DsbD的前132个氨基酸，然后19aa的可切割信号序列被去除。下面显示的是DsbDα-结构域的序列，其不含引导序列；且催化位点已经以下划线标出。

GLFDAPGRSQFVPADQAFAFDFQQNQHDLNLTWQIKDGYYLYRKQIR

ITPEHAKIADVQLPQGVWHEDEFYGKSEIYRDRLTLPVTINQASAGATL

TVTYOGCADAGFCYPPETKTVPLSEVVANNEASOPV(SEO ID NO：4)

【0076】不含其前导序列的DsbDα-结构域，被称为ΔssDsbDα-结构域。宿主细胞可以被修饰，以胞质表达DsbC以及DsbD的α-结构域。

【0077】在另一实施方式中，宿主细胞被修饰成硫氧还蛋白还原酶和/或谷胱甘肽还原酶活性的缺陷型。硫氧还蛋白还原酶(硫氧还蛋白B，TrxB)是关键的大肠杆菌酶，其控制细胞溶质内这两种主要的还原途径的第一途径。缺乏硫氧还蛋白还原酶，可以通过表达trxB基因的显性负性突变体产物来实现，所述基因来自宿主的胞质内的一个独立的质粒。谷胱甘肽还原酶(Gor)是另一种主要的酶，其控制细胞溶质内第二主要还原途径。缺乏谷胱甘肽还原酶，可以通过表达gor基因的显性负性突变体产物来实现，所述基因来自宿主胞质内的同一或独立的质粒。这些突变可以一起或单独被使用，以及可以与本文所述的任何其它的宿主细胞变异相结合。

【0078】在进一步的实施方式中，宿主细胞缺乏一种或多种蛋白酶。示例性的这些蛋白酶包括那些由ompT和lon基因编码的蛋白酶。举例来说，大肠杆菌宿主细胞AD494(DE3)pLysS缺乏trxB基因以及ompT和lon基因产物。大肠杆菌菌株Origami B(DE3)pLysS和Rosetta-gami B(DE3)pLysS缺乏trxB、gor、ompT和lon基因产物。这些突变可以与本文所述的任何其它的宿主细胞变异相结合使用。因此，ompT和lon突变可以与缺乏trxB和/或gor的宿主细胞相结合使用，以及与修饰用于胞质表达DsbC(野生型蛋白质或活性位点突变体)和/或DsbDα-结构域的宿主细胞相结合使用。

【0079】本发明的方法的其它说明如下。

【0080】A.细菌内氧化性蛋白质的折叠

【0081】在合成期间，新生的多肽链必须折叠形成独特的稳定的三维结构，以维持其生物学活性。在产生活性构象异构体的过程中，蛋白质受到分子伴侣的协助，所述分子伴侣保护蛋白质免于过早地缔合以及形成不溶性团聚体。此外，折叠催化剂(折叠酶)在折叠路径中起到加速限速步骤的作用。新生蛋白质中的半胱氨酸残基之间形成正确二硫键，是限速步骤。需要用来加速二硫键形成的最小酶器件，包括氧化酶和异构酶活性(Collet and Bardwell 2000)。在所有细胞体系(从原核生物到真核生物)中，最终命运是输出到细胞外空间的蛋白质，经常呈现具有复杂折叠形式的多个二硫键。含有多个二硫键稳定了这些分泌型蛋白质的二级和三级结构，使其在细胞内区室(compartment)之外的更严酷微环境下具有生存优势。

【0082】细胞已经发展成独特的酶器件，以确保多个二硫键蛋白质的适当折叠，因为不正确的二硫键的形成很可能产生无活性的、且不溶的产物(Walker andGilbert 1994)。在真核生物中，二硫键的形成和异构化被蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase(PDI))和相关蛋白质所催化，且在内质网中发生。十年多前，已经发现在原核周质空间内二硫键的形成也是催化过程(Bardwell，McGovern et al.1991)。正如在其它生物体例如细菌的情况下，富含半胱氨酸和其折叠依赖于正确的二硫键形成的那些蛋白质基本上注定是细胞外分泌的蛋白质。这些蛋白质通常对于细胞生存是重要的，而且涉及：运动器官的关键成分、呼吸链、或像外毒素或抗生素-抗性酶的毒力因子。为了正确折叠并且获得生物活性，这些蛋白质需要穿过周质空间，且在周质氧化还原酶的协助下进行其折叠。在周质空间里的氧化还原酶器件是由作为多功能单元发挥作用的两种途径组成：氧化途径和异构化途径。下面对这两种途径都作了简要描述。

【0083】

【0084】B.在大肠杆菌周质内的氧化途径

【0085】氧化途径是由DsbA——一种有效的氧化酶(已知的氧化性最强的酶)，和其调节剂DsbB组成，所述DsbB将DsbA与呼吸链(在有氧条件下)或与厌氧电子受体(在缺氧条件下)相偶联。DsbA是含有硫氧还蛋白折叠的小的周质蛋白质(21kDa)，在其活性位呈现CXXC基序(在DsbA中，为CPHC)，其与几个其它的氧化还原酶都共同含有这种基序，包括所有胞质硫氧还蛋白、DsbC、DsbD的γ-结构域，以及真核蛋白质二硫键异构酶(PDI)(Raina and Missiakas 1997)。DsbA的高氧化还原电势(-120mV)与该蛋白质的氧化剂作用相一致。氧化的DsbA是很不稳定的，会与进入周质空间的未折叠蛋白质进行迅速反应(Zapun，Bardwellet al.1993)。

【0086】DsbA在将其活性位点二硫键转移到真核蛋白质之后被还原。为了起到催化作用，DsbA需要重新装载。负责DsbA再氧化的蛋白质是一种嵌入内膜的蛋白质，称为DsbB，其被认为是不含有类硫氧还蛋白结构域的唯一一种Dsb蛋白质(Collet and Bardwell 2002)。DsbB是一种跨膜四次的21kDa内膜蛋白质。DsbB含有两对必要的半胱氨酸残基，其两个周质结构域之每一个中有一对。只有第一对具有CXXC基序，并且尽管三维的DsbB结构还没有被解析，但是DsbB不可能含有类硫氧还蛋白折叠的结构域。当DsbB首次被分离时，提出了一个假设：存在这种可能性，即分子氧和电子传递链可能参与到DsbB的再氧化中(Bardwell，Leeet al.1993)。累积的证据，和使用纯化组分的细菌二硫键催化体系的体外重组已经证实了电子传递与二硫键形成之间的联系(Bader，Muse et al.1999)。已经证实：DsbB是与内膜的醌系统相连接的，而且在有氧条件下，DsbB将其电子转移给氧化态的泛醌，泛醌然后将它们供给细胞色素氧化酶，细胞色素氧化酶还原氧。在缺氧条件下，DsbB将其电子传给甲基萘醌类，然后传给厌氧电子受体。从周质空间和DsbA到电子转移醌系统，存在还原等价物的连续流动，这通过嵌入膜的DsbB成为可能，嵌入膜的DsbB行使功能再生出DsbA。图2(来自Collet and Bardwell2002)阐述了大肠杆菌周质内的氧化途径。

【0087】C.大肠杆菌周质内的异构化途径

【0088】对于任何含有多于两个半胱氨酸残基的蛋白质，存在在重组表达期间形成错误的二硫键的可能性。这种陈述对于DsbA特别正确，DsbA倾向于在周质空间里极快地使半胱氨酸配对，而很少遵守(respect)它们的天然构象。DsbA在蛋白质内能形成非天然的二硫键，这在体外RNase A再折叠实验中得到证实。DsbA，在DsbB和醌的存在下，完全氧化RNase A，但是，氧化态RNase A，其含有四个二硫键，没有显示出活性，除非加入谷胱甘肽氧化还原缓冲溶液(Bader，Xieet al.2000)。

【0089】因为这个原因，在周质空间中，高效氧化器件是与有特效的异构酶体系相匹配的，所述异构酶体系是由两个以上的Dsb蛋白质组成的：DsbC和其调节剂，即DsbD。最初感觉DsbC通过充当氧化酶具有催化二硫键形成的能力(Missiakas，Georgopoulos et al.1994)，但是现在认为DsbC主要作为体内的二硫键异构酶和分子伴侣起作用。DsbC突变体，像DsbA和DsbB突变体一样，在二硫键的形成上是有缺陷的。DsbC突变特别地影响呈现多个二硫键的那些蛋白质的折叠：尿激酶(12个二硫键)是严重错折叠，然而碱性磷酸酶(两个二硫键)的产生只是轻微受到影响(Rietsch，Belin et al.1996)。既然可能的不正确二硫键的个数随着蛋白质中半胱氨酸残基的个数呈指数增长，所以有效异构酶的存在对于多个二硫键的蛋白质的正确折叠是关键的。

【0090】DsbC是两个相同的23kDa亚单位的V形同型二聚体。每个亚单位含有四个半胱氨酸残基。活性位点含有Cys-98-Cys-101对(在DsbC中，CXXC基序为CGYC)，其直接参与到DsbC的氧化还原行为中(Zapun，Missiakas et al.1995)。DsbC的结晶结构已经被解析(McCarthy，Haebel et al.2000)，并且已经表明：V形同型二聚体的每个臂是DsbC单体，DsbC单体是由铰合的三回转(three-turn)连接体α-螺旋连接起来的两个分离结构域组成的。每个单体的N-端结构域(残基1-61)参与形成位于V形同型二聚体的基部处的二聚体界面。C-端催化结构域(残基78-216)含有预期的类硫氧还蛋白。在V形同型二聚体内部，两个活性位点CXXC基序互相面对。此V形裂缝的表面主要含有疏水性和不带电的残基，这表明其可能参与到真核蛋白质的非共价键结合中，这使得DsbC具有分子伴侣活性。DsbC，对于氧化条件下所形成的埋藏的非天然二硫键的重排，是特别有效的(Maskos，Huber-Wunderlich et al.2003)。DsbC被认为依照下述发挥作用：Cys-98攻击底物蛋白质内的不正确二硫键，在DsbC与错折叠的蛋白质之间就形成了混交二硫键(mixed disulfide)。然后，该混交二硫键被再次分解，或者是通过该错折叠蛋白质的另一个半胱氨酸的攻击，使得在底物中形成了更稳定的二硫键和还原态的DsbC；或者，更经常地，通过DsbC的Cys-101的攻击。在这种情况下，DsbC变成氧化态，并且为了再次循环需要被还原(Collet and Bardwell 2002)。已经表明，为了起到异构酶的作用，DsbC需要在周质的非常具有氧化性的环境下保持还原状态。如果在它的催化循环结束时，DsbC没有被还原，则它倾向于发挥氧化酶的作用，从而失去了其异构酶活性。将DsbC保持在还原状态的酶，是一种嵌入内膜的蛋白质，其被称为DsbD。

【0091】巯基-二硫键互换蛋白质DsbD具有的分子量为59kDa，使其成为Dsb家族中最大的蛋白质。拓扑学研究已经揭示DsbD有三个截然不同的结构域：含有特殊的免疫球蛋白折叠的N-端周质结构域(α-结构域)(Haebel，Goldstone et al.2002)，然后是带有八个跨膜片段的疏水性核(β-结构域)，和第二个周质结构域(γ-结构域)，其预期含有类硫氧还蛋白折叠(Katzen and Beckwith 2000)。DsbD的每个结构域有两个保守性的半胱氨酸残基。定点诱变实验表明：与DsbD无效突变体相类似，单个半胱氨酸对丙氨酸活性位点突变体导致氧化态DsbC的聚积，且不能产生活性的尿激酶(Gordon，Page et al.2000)。最近已经提出了DsbD作用机理的一个模型，该模型涉及电子的连续转移，电子从胞质硫氧还蛋白到DsbD的β-结构域，然后穿过膜，连续到达γ-和α-结构域，最后到达DsbC。图2阐述了该作用机理。该模型，是基于观察到的DsbC与DsbD的α-结构域之间的二硫键交联(Katzenand Beckwith 2000；Katzen and Beckwith 2003)。此外，最近，提纯的α-结构域显示出能与体外的DsbC相互作用，并且还原DsbC(Goldstone，Haebel et al.2001)。图3显示的是：DsbC的结晶结构，以及将DsbDα停靠入DsbC裂缝内之后所揭示的DsbC-DsbDα相互作用(来自Haebel，Goldstone et al.2002)。

【0092】D.细菌周质空间—考虑的事项

【0093】基于上述描述，周质空间中的氧化/异构化酶器件具有两个主要的特征。第一，它的设计类似一个电路，其含有两个臂，而且为了闭合该路径，两个臂必须与折叠的富含半胱氨酸的蛋白质形成接触，所述折叠的富含半胱氨酸的蛋白质受到那些折叠酶的协助。通过闭合该路径，折叠蛋白质将确保：还原等价物，沿一个方向，从细胞质(NADPH)穿过两个酶臂到达膜中的电子转移链(在有氧条件下，为呼吸链；和，在不存在氧时，为厌氧电子受体)的连续流动，以及沿相反方向的二硫键恒定转移。这就解释了每个途径中的主要酶、DsbA氧化酶和DsbC异构酶，是如何以不受打扰的方式持续再生以及协助蛋白质折叠。第二，尽管两条途径共存于同一个氧化区室内，但是它们保持动力学上是分开的。DsbA需要保持在氧化状态、以起到二硫键供体的作用，而DsbC需要保持在还原状态、以起到异构酶的作用。这意味着：具有相反目标的两种系统，可以共存于同一周质空间内。已经显示：与DsbB再氧化DsbA相比，DsbB再氧化DsbC的速度至少慢500倍，这表明DsbB能区分这两种蛋白质(Bader，Xie et al.2000)。这种行为的原因在于DsbC的二聚化界面，其保护该二聚体避免与DsbB相互作用，而且保持其活性位点避免被DsbB氧化。已经证实，DsbC的经过突变的单体变异体与DsbB相互作用，这能够拯救(rescue)dsbA^-表型，并且替代DsbA氧化酶。在图4中，显示的是：上面描述的，在大肠杆菌周质内的二硫键形成的模型(来自Raina andMissiakas 1997)。

【0094】大肠杆菌具有完整的酶器件，为真核生物的内质网的痕迹，其用于催化周质空间里的多种富含半胱氨酸的蛋白质的正确折叠。已经证实，复杂的多二硫键真核蛋白质，可以通过周质空间，表达为生物活性的天然构象异构体。另外，如果DsbA和/或DsbC也被共同过表达，则会明显提高产量(Becker and Hsiung1986；Kurokawa，Yanagi et al.2000；Kurokawa，Yanagi et al.2001)。

【0095】在周质空间生产重组蛋白质存在两个主要问题。主要问题在于周质空间并没有被设计成为物质生产点。遵循这条路径的细菌多二硫键蛋白质是分泌型蛋白质，像外毒素或β-内酰胺酶，它们在小数量时是有活性的；或者是运动器官的关键成分，它们在细胞外空间进行组装。第二个问题源自于这个事实：即，向细菌周质传输蛋白质是一个特别复杂的、且没有被完全理解的过程，而且信号肽的存在不总是确保通过内膜的有效蛋白质转运(Makrides 1996)。例如，Hsiung等(Becker and Hsiung 1986)，在他们的研究中，观察到：在异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导之后，在细胞外累积了更大数量的包括信号序列在内的人类生长激素前体，但是在转运的人类生长激素的数量上没有增加。

【0096】E.在大肠杆菌胞质和硫氧还原蛋白内的二硫键形成

【0097】细菌胞质蛋白质一般不含有结构二硫键，尽管某些胞质酶形成这种键作为它们催化循环的一部分。这些后来的酶中的二硫键，在大肠杆菌胞质内被两个系统还原：硫氧还蛋白途径和谷胱甘肽/谷氧还蛋白途径(Stewart，Aslund et al.1998)。在生理条件下，这两种还原途径维持胞质在还原状态，这强烈不利于蛋白内的稳定二硫键的形成。图5阐明大肠杆菌内的主要还原途径，其借助作为关键酶的硫氧还蛋白还原酶(由trxB基因编码)和谷胱甘肽还原酶(由gor基因编码)。然而，突变体(trxB或trxB/gor突变体)，其中硫氧还蛋白和谷胱甘肽中的一个或两个的还原作用被消弱，累积了氧化态的二硫键蛋白质，像胞质内的酶促活性的人碱性磷酸酶(Stewart，Aslund et al.1998；Bessette，Aslund et al.1999)。在这些突变体中，二硫键的形成依赖于胞质硫氧还蛋白的存在，所述胞质硫氧还蛋白起反向作用、且有效地协助二硫键的形成，因此在这种情况下起到氧化酶的作用。双突变体在不存在外源还原剂(例如DTT)时生长很差，而且以高频率累积了抑制基因：快速生长的菌落是不依赖于DTT的。此抑制基因突变，被定位在ahpC基因中，其编码野生型形式的过氧化物氧还蛋白。FA113(快速生长抑制子的一种)所承载的突变，使这种酶充当二硫键还原酶的作用(Jurado，Ritz et al.2002)。在丰富培养基或者规定培养基中，大肠杆菌FA113的生长几乎和大肠杆菌DHB4差不多，其中倍增时间为大约35分钟。已经报道：当使用一些抗生素进行选择时，例如氯霉素、卡那霉素、或四环素，延缓了FA113的生长速度(倍增时间为大约60分钟)(Jurado，Ritz et al.2002)。

【0098】F.用于支持胞质内异源蛋白质的二硫键形成的原核体系

【0099】为了寻求进一步设计FA113双突变体，以使其具有更有效地协助胞质内富含二硫键蛋白质的正确折叠的能力，将周质酶器件的活性引入胞质，以便帮助异源重组蛋白质在此区室内进行折叠。对本方法以前的描述，已经集中在异源蛋白质上，例如，抗体片段(以scFv或Fab形式)或一些其它的真核富含半胱氨酸的蛋白质(Levy，Weiss et al.2001；Jurado，Ritz et al.2002；Venturi，Seifert et al.2002；Maskos，Huber-Wunderlich et al.2003)。

【0100】以前报道的经过修饰的表达宿主，或者含有无信号序列的氧化酶(ΔssDsbA或活性位点突变变异体)或者含有无信号序列的异构酶(通常为ΔssDsbC)，其从周质空间输入；并且，在双突变体trxB^-/gor^-菌株的胞质内，与富含半胱氨酸重组蛋白质一起，被同时共同过表达(Levy，Weiss et al.2001；Jurado，Ritz et al.2002)。这种类型的体系，已经被应用在大肠杆菌内，用来产生Fab抗体片段；而且，与野生型菌株相比，已经显示出提高了正确折叠抗体的产量(重组蛋白质从数纳克提高到接近1mg/L)。然而，尽管被认为是一个进步，但是这种体系无法产生期望的产量。此方法的一个问题在于：同时共同过表达的氧化酶/异构酶组合并没有有效地催化重组蛋白质内二硫键的形成，因为这种体系缺乏周质空间再生其折叠酶的非凡能力。基于周质空间的原理，从周质空间输入的氧化酶和异构酶需要持续被充电以使其发挥作用。因为这个原因，需要第三组分，以便在输入到胞质里的氧化酶/异构酶的酶器件间建桥。该组分(或者多个组分)通过持续地给它们充电、保持还原等价物沿一个方向流动而二硫键沿相反方向转移，应当将氧化酶与在FA113中共同过量表达的异构酶连接起来。

【0101】根据本发明的方法，重组体系使用来自两区室(周质和胞质)的彼此天然相互作用的关键酶，而不是人工迫使其相互作用以重组体系的分子。天然组合包括DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，但是将它们全部输入胞质是困难的。DsbA、DsbB、DsbC和DsbD在胞质内的同时共同过量表达已经有所报道。然而，这种表达的净增益并不引人注目(DsbA/DsbB/DsbC/DsbD表达质粒—CA2281035)。这可以由下面的事实解释：当在细菌胞质内表达为可溶性蛋白质时，生理上起嵌入膜分子作用的DsbB和DsbD可能不能正确地起作用。第二，如上所述DsbB与电子转移链相耦合。通过在胞质内表达DsbB，此蛋白质可能不能使DsbA再充电，这就损害表达体系。另一方面，假定可溶形式的DsbD在胞质中仍起作用而且与其上游伴侣硫氧还蛋白以及与其下游伴侣DsbC发生反应，DsbC-DsbD伴侣关系可能受影响。对于在胞质内对DsbC-DsbD伴侣关系设计以进一步变为自动再生(auto-regenerating)的体系来说，也将需要第三组分——氧化酶伴侣。使用胞质硫氧还蛋白A(硫氧还蛋白1)作为DsbC-DsbD氧化酶伴侣的观点是吸引人的，因为DsbD天然地与硫氧还蛋白A和DsbC两者都发生相互作用。

【0102】DsbD分子是具有疏水性结构域的大的跨膜蛋白质。由于其大小和跨膜的疏水性β-结构域，在胞质内DsbDα-结构域的表达优于全长DsbD分子的表达。全长DsbD蛋白质太大而不能与其它三种蛋白质在同一体系中有效地共同过表达。去掉19aa的可切割信号序列之后，DsbDα-结构域代表DsbD的氨基酸1-131。DsbDα-结构域本身在体外能有效地与DsbC发生作用，而且能使其保持在还原状态且随后对其异构酶伴侣再充电(Goldstone，Haebel et al.2001；Goulding，Sawaya et al.2002)。当将还原的DsbDα-结构域和氧化的DsbC以化学计量的量混合时，将发生快速反应而且DsbC被极快速地还原。DsbDα-结构域是否与硫氧还蛋白A——DsbD的天然伴侣发生作用，已被Collet等人提出(Collet，Riemer et al.2002)，他们描述了体外重建的周质细菌二硫键异构化体系。第一，在催化量的DsbDα-结构域单独存在的情况下，DsbC的还原以与在所有三种结构域一起存在下所测得的速度可比较的速度进行。这表明在所有三种结构域一起存在下所观察到的活性只能解释为是单独的α-结构域的贡献。第二，通过将化学计量数量的硫氧还蛋白与DsbDα-结构域混合，惊奇地发现硫氧还蛋白体外有效地直接还原α-结构域。当硫氧还蛋白与氧化的DsbDγ-结构域或氧化的DsbC温育时，观察到极低的活性。最后这一观察是重要的，因为知道了DsbC在动力学上与氧化体系(周质DsbA)分开，而且DsbC也不与胞质硫氧还蛋白发生相互作用。

【0103】如本文所公开，新的强大的氧化还原体系可以在大肠杆菌trxB^-/gor^-双突变体菌株(FA113)中再产生，这是通过将氧化酶(硫氧还蛋白A)与异构酶(ΔssDsbC；减去信号序列的成熟DsbC)相结合，和通过利用DsbDα-结构域(ssDsbDα)——丢失的具有再生折叠酶的酶器件的能力的分子成分，进一步将它们在同一区室内连接在一起。在这个新的体内体系中，含有重组二硫键的真核蛋白闭合该路径，DsbDα-结构域是填充氧化与还原路径之间空隙的关键分子，这确保还原等价物从硫氧还蛋白至DsbC是沿一个方向流动的，而二硫键的持续转移沿相反方向进行的。

【0104】将硫氧还蛋白和DsbC的活性位点突变以增加这些酶活性的尝试已被报道(Mossner，Huber-Wunderlich et al.1998；Bessette，Aslund et al.1999；Bessette，Qiu et al.2001)。野生型硫氧还蛋白含有具有很低氧化还原电势(-270mV)的活性位点，此数值与其作为细菌中的还原酶的基本功能非常一致。报道提出，通过用细菌谷氧还蛋白A的活性位点基序CPYC替代野生型硫氧还蛋白活性位点基序CGPC，提高的硫氧还蛋白A的氧化酶活性可以实现。这个变化使硫氧还蛋白的活性位点氧化还原电势从—270mV(野生型)变到—195mV(谷氧还蛋白型)，且突变的谷氧还蛋白型硫氧还蛋白变成更好的氧化酶。当该硫氧还蛋白突变体和富含二硫键的蛋白质在同一体系中被共同过表达时，谷氧还蛋白型突变体能得到富含二硫键蛋白质的更好产量(Bessette，Aslund et al.1999)。

【0105】另一目标硫氧还蛋白突变体是类PDI硫氧还蛋白，这是含有真核蛋白二硫键异构酶活性位点基序的硫氧还蛋白。以前已经表明，用真核蛋白二硫键异构酶序列CGHC替代野生型硫氧还蛋白活性位点基序，将活性位点氧化还原电势从—270mV增加到大约—229mV。氧化还原电势的变化使得PDI型硫氧还蛋白成为FA113体系中更有效的酶，不但是比野生型硫氧还蛋白更好的氧化酶，而且是比谷氧还蛋白型氧还蛋白突变体好的还原酶。

【0106】DsbC活性位点突变体也已经被描述。DsbC活性位点CGYC用CGFC或CTFC替代，发现其能增加异构酶活性。当这些活性位点DsbC突变体被共同过表达时，已经显示出在FA113菌株内产生的多二硫键蛋白质产量增加(Bessette，Qiuet al.2001)。

【0107】Origami和Rosetta-gami菌株是trxB和gor基因产物的双突变体，其使得大肠杆菌胞质中的两个主要还原酶途径不起作用。这使得胞质微环境具有更强的氧化性，这将最终使得该区室成为二硫键形成的更适合的地方。

【0108】Origami和Rosetta-gami菌株具有与大肠杆菌野生型菌株中得到的那些生长速度和生物质产量相近的生长速度和生物质产量，这使其对于重组CN的大规模生产和纯化具有吸引力。

【0109】对于CN在大肠杆菌中的重组生产，已经使用这样的体系，由OrigamiB(DE3)pLysS表达宿主结合含有强的T7lac启动子的pET32a载体(Novagen)所组成。Origami B宿主菌株携带与原始Origami菌株(FA113)相同的trxB/gor突变，除了它们衍生自BL21的lacZY突变体。因此，Origami B菌株将BL21(ompT和lon蛋白酶缺陷)、Tuner和Origami宿主期望的特征组合到单一菌株体内。

【0110】已经发现，硫氧还蛋白还原酶(trxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)两种基因的突变极大地促进了胞质中二硫键的形成。即使整体的表达水平是相似的，在Origami(DE3)中的表达产生比在另一宿主内活性高10倍的蛋白质(Prinz，Aslundet al.1997)。

【0111】不存在IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside))诱导剂时，在DE3溶原体内具有lacUV5启动子促成的T7RNA聚合酶的可检测表达水平，从而导致重组蛋白质的基本表达。大肠杆菌中如此低水平的重组蛋白质表达可以干扰细胞的正常生长过程，而且因此可能对细菌具有“毒性”。控制基本表达的一个方法是使用含有T7lac启动子的载体(Studier，Rosenberg et al.1990；Dubendorff and Studier 1991)。这些质粒含有T7启动子正下游的lac操纵子序列而且携带lac抑制基因(lacl)的天然启动子和编码序列，其被定向使得T7lac和lacl启动子分开。载体中的lac抑制基因在两个方面起作用：在宿主染色体中，在lacUV5启动子水平抑制宿主聚合酶引起的T7RNA聚合酶基因转录；在载体中，在T7lac启动子水平阻滞产生的任何T7RNA聚合酶引起的真核基因的转录。

【0112】通过在含有相容性的抗氯毒素质粒的宿主菌株中表达，还原性的基本真核蛋白表达可以被完成，而少量的T7溶菌酶——T7RNA聚合酶的天然抑制剂从所述宿主质粒表达(Studier 1991)。pLysS宿主对生长速度几乎没有影响，而且全部的pLysS增加了λDE3溶原体对含有毒性插入物的质粒的耐受性：不稳定的质粒变得稳定，否则将不会被建立的质粒可以被维持并表达。pLysS的存在具有帮助细胞提取物制备的进一步的优势，因为细胞对冷冻和解冻循环的抗性更小而且容易裂解。

【0113】Tuner菌株和衍生物(Origami B和Rosetta-gami B)是BL21的lacY1缺失突变体，其使得蛋白质的表达水平可调整。lac通透酶(lacY1)突变允许IPTG(乳糖衍生物)均一地进入细胞，这就引起浓度依赖性的均质水平的诱导。通过调整IPTG的浓度，表达可以在极低水平至极高水平范围内进行调节；然而，真核蛋白表达的最佳水平可以在比通常使用的水平明显低的IPTG水平下取得。该方法提供了与IPTG相关的成本节省。

【0114】Origami和Rosetta-gami菌株的重要特征是能够提供足够的氧化能力，以催化异源重组蛋白质的二硫键形成。然而，这样的体系缺乏异构化能力。与野生型大肠杆菌相比，在Origami/Rosetta-gami胞质内重组蛋白质的二硫键形成以增加的速度进行，但是没有酶器件(enzymatic equipment)来确保正确的匹配和产生含有与天然构象异构体(conformer)中相同的二硫键形式的产物。

【0115】二硫键异构化而非二硫键的形成，限制了在大肠杆菌野生型细胞的周质内多二硫键蛋白质的折叠。Origami细胞在胞质内没有酶器件来确保二硫键的正确配对或将不正确形成的二硫键改组到正确的位置。因此，可能需要进一步改造宿主蛋白质以增加胞质内异构化活性水平。

【0116】Origami大肠杆菌(FA113)可以被修饰以在胞质内过表达DsbC异构酶(不含其信号序列的DsbC；“ΔssDsbC”)和DsbDα-结构域(不含信号序列的DsbD；“ΔssDsbDα”)，其中后者起到还原DsbC异构酶活性位点的半胱氨酸的作用。尽管不希望被任何理论束缚，但是据认为DsbDα-结构域是填充胞质中新的氧化(TrxA)与异构化(DsbC)途径之间空隙的关键分子，这确保还原等价物从硫氧还蛋白至DsbC是沿一个方向流动的，而二硫键的持续转移沿相反方向进行的。这两种特点的组合就建立了具有自动再生能力的体系。

【0117】通过使用突变体trxA和dsbC基因产物，可以实现增加的含二硫键蛋白质表达。具有增加的氧化酶和异构酶活性的活性位点突变体已经有所报道(Mossner，Huber-Wunderlich et al.1998；Bessette，Aslund et al.1999；Bessette，Qiu etal.2001)。含有谷氧还蛋白活性位点基序CPYC和真核PDI活性位点基序CGHC的活性位点突变体硫氧还蛋白是优选的。含有CGFC和CTFC活性位点基序的活性位点突变体DsbC异构酶是优选的。

【0118】使用方法

【0119】按照本文所述生产的真核蛋白可被用于治疗各种疾病和症状，这些疾病和症状可用天然蛋白质治疗。这样的蛋白质可以作为用药学上可接受的载体制成的医药或药物进行给药。因此，真核蛋白可以应用在药物和医药组合物的制备中。

【0120】本文所描述的同型二聚体和单体解联蛋白(例如VN)可被用于如此任何目的，天然同型二聚体解联蛋白可以用于所述任何目的。这种应用在2003年10月2日公布的美国专利公开第NO.2003/0186884号中有所描述。

【0121】此外，同型二聚体和单体解联蛋白可以被用来调节表达整联蛋白的肿瘤细胞的粘附、运动(迁移，motility)和侵入。当按照医药上可接受的组合物配制时，通过抑制或干扰与配体结合ανβ3或ανβ5整联蛋白相关的疾病过程，这样的蛋白质可被用于治疗病人。

【0122】本文所描述的同型二聚体和单体解联蛋白(例如VN)可在降低ανβ3整联蛋白表达细胞的流动的方法中使用，所述方法包括在整联蛋白表达细胞上交联至少两个αvβ3整联蛋白，从而抑制所述细胞的运动。这种交联被认为破坏FAK信号传递且活化FAK和CAS的酪氨酸磷酸化。此外，该交联被认为引起了细胞形态的改变，包括细胞骨架或病灶粘附结构的变化。在优选的实施方式中，αvβ3整联蛋白表达细胞是肿瘤细胞。

【0123】本文所描述的同型二聚体和单体解联蛋白(例如VN)可被用于抑制整联蛋白表达细胞与玻连蛋白的粘附，这通过将该细胞暴露于同型二聚体和单体解联蛋白而进行。该同型二聚体和单体解联蛋白被认为通过结合到整联蛋白，特别是ανβ3或ανβ5整联蛋白来抑制粘附。

【0124】本文所描述的同型二聚体和单体解联蛋白(例如VN)可以配制成用于治疗哺乳动物的血栓形成疾病的组合物，其单独配制或与一种或多种血栓溶解剂组合配制。特别地，这样的组合物具有治疗或预防动脉、静脉和微脉管血栓症和血栓栓塞的效用。这样的组合物也具有治疗中风、瞬时局部缺血发作、动脉硬化、粥样硬化、肺血栓、动脉瘤和咽痛的效用。特别地，这样的组合物具有防止或治疗心肌梗塞的效用。

【0125】本文所描述的同型二聚体和单体解联蛋白(例如VN)可用于抑制黑素瘤、癌和肉瘤患者的癌转移。在具体的实施方式中，同型二聚体和单体解联蛋白可用于预防乳腺癌患者的癌转移。

【0126】本文所描述的同型二聚体和单体解联蛋白(例如VN)可用于治疗骨质疏松症。可以使用治疗骨质疏松症的组合物和方法，其使用抑制破骨细胞的骨质再吸收的有效数量的同型二聚体和单体解联蛋白。

【0127】本文所描述的同型二聚体和单体解联蛋白(例如VN)可用于促进伤口愈合。同型二聚体和单体解联蛋白可防止细胞-细胞和细胞-细胞外基质间的相互作用(包括与纤连蛋白的相互作用)，因此促进伤口修复，包括瘢痕瘤形成。当向需要这样治疗的患者给药时，含有同型二聚体和单体解联蛋白的组合物可用于防治粘附形成。

【0128】含有同型二聚体和单体解联蛋白的医药组合物应当包括有效地取得期望效果(例如，防止血栓形成，防止癌症患者的癌转移，防止粘附形成，等等)的最小数量的蛋白质和合适的载体或赋形剂。一般地，在这些组合物中，应当含有足够数量的同型二聚体和单体解联蛋白，以便每天能提供大约0.01mg/kg至大约50mg/kg，优选地每天大约0.1mg/kg至大约5.0mg/kg，和最优选地每天大约0.1mg/kg至大约0.5mg/kg。这样的组合物具有防治血栓形成的具体效用。

【0129】同型二聚体和单体解联蛋白可与至少一种血栓溶解剂一起给药，所述至少一种血栓溶解剂存在的量是可有效地取得血栓溶解的量。合适的血栓溶解剂包括但不限于如下试剂：茴香酰化血浆酶原溶栓酶激活复合体(anisoylatedplasminogen streptokinase activator complex，APSAC)；组织型血浆酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，tPA)；尿激酶型血浆酶原激活物(urokinase-typeplasminogen activator，uPA)；和fibrolase，蛇毒纤维溶解剂，如在授予Markland，Jr等的美国专利第4,610,879号中所描述的。

【0130】同型二聚体和单体解联蛋白可以采用各种迄今已知的适合其以基本数量释放到血液中的手段进行给药。合适的液体载体或赋形剂内的同型二聚体和单体解联蛋白的静脉内给药目前被认为是优选的给药途径。同型二聚体和单体解联蛋白是水溶性的，并且因此可以以合适的水溶液形式(例如磷酸盐缓冲盐水)有效给药。可选地，同型二聚体和单体解联蛋白可以口服给药(用合适的粘合剂或赋形剂材料制成的片剂或胶囊的形式，或水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂的形式)或作为肠胃外悬浮液给药。本领域众所周知的，佐剂，例如局部麻醉剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂、润湿剂、着色剂、填充剂和稀释剂，可以适当地被包括在这些剂型的任何一种中。

【0131】本发明的多功能性由下面的实施例阐明，其阐明了本发明优选的实施方式且不以任何方式限制权利要求书和说明书。

实施例

【0132】实施例1.contortrostatin在大肠杆菌的Origami B菌株中的表达

【0133】基于FA113双突变体的细菌Origami菌株(Novagen)被应用在细菌内重组CN产生。

【0134】图6中显示的pET32a载体图谱(Novagen Inc.)已经被用于表达融合于109个氨基酸的硫氧还蛋白野生型序列下游的肽序列(LaVallie，DiBlasio et al.1993)。克隆位点可用于产生融合蛋白，所述融合蛋白还含有用于检测和纯化的可切割的His-tag序列和S-tag序列。如本文所公开的，包括重组CN序列的解联蛋白可以作为与硫氧还蛋白的融合蛋白而被表达，以得到加速的二硫键形成和增强的真核蛋白的溶解度。

【0135】HKGPAT序列，其代表单体解联蛋白echistatin的C-端氨基酸序列，被包括在CN解联蛋白结构域序列的C-末端。该构建物是嵌合物，通过基因工程手段结合了不同来源的两种蛇毒解联蛋白的序列：echistatin(毒蛇解联蛋白)和contortrostatin(响尾蛇解联蛋白)。因为这个原因，携带C-端移植物的这种解联蛋白构建物被称为“Vicrostatin”或“VN”。不含HKGPAT序列的CN解联蛋白结构域被称为“rCN”或“rCN构建物”。下面显示的是Vicrostatin的氨基酸序列，被称为SEQ ID NO：5。

DAPANPCCDAATCKLTTGSQCADGLCCDQCKFMKEGTVCRRARGDD

LDDYCNGISAGCPRNPFHHKGPAT(SEQ ID NO：5)

【0136】contortrostatin野生型解联蛋白结合域或含有echistatin C-端移植物的解联蛋白结构域通过PCR定向克隆到pET32a载体中硫氧还蛋白序列的下游。用于克隆的一组限制性内切酶是BglII/Nco I。克隆用的寡核苷酸引物如下：

CNfor1—用于引入BglII限制性位点的rCN(解联蛋白结构域)的正向引物

5’GTTCCAGATCTCGAGAATCTTTACTTCCAAGGAGACGCTCCTGCAAAT

CCGTGCTGCGATGCTGCA3’(SEQ ID NO：6)

CNback1—用于引入Nco I限制性位点的rCN(解联蛋白结构域)的反向引物

5’GTTATTCGCCATGGCTTAGGCATGGAAGGGATTTCTGGGACAGCCAGCA

GA3’(SEQ ID NO：7)

CNback2—用于引入Nco I限制性位点的VN(解联蛋白结构域)的反向引物

5’GTTATTCGCCATGGCTTAAGTAGCTGGACCCTTGTGGGGATTTCTGGGAC

AGCC AGC AGATATGCC3’(SEQ ID NO：8)。

【0137】正向引物引入独特的TEV蛋白酶切割位点，其使得在通过Ni-柱层析纯化融合蛋白之后能够去除硫氧还蛋白融合伴侣。TEV蛋白酶高特异性地识别规范ENLYFQG氨基酸序列，该ENLYFQG氨基酸序列被基因工程化在这种构建物的重组CN与硫氧还蛋白融合伴侣之间。反向引物将HKGPAT片段嫁接到融合蛋白质的C-端。因此，两种重组融合蛋白质，命名为Trx-rCN和Trx-VN，是采用上述的克隆策略产生的。

【0138】最初的克隆是在DH5α菌株里进行的，DH5α菌株是recA^-endA^-而且具有高的转化效率和良好的质粒产量。通过对从DH5α转化体得到的构建物进行测序确认该克隆之后，该载体被用于转化表达宿主Origami B(DE3)pLysS，以使表达最优化。

【0139】没有优化的情况下，Origami B/pET32a体系产生了高达20mg/L的重组CN(Trx-rCN和Trx-VN两种构建物)。转化的Origami B细胞的单克隆被用于接种含有10ml LB培养基(肉汤，broth)的基本培养物，所述LB肉汤含有羧苄青霉素(100μg/mL)、四环素(12.5μg/mL)、卡纳霉素(15μg/mL)和氯毒素(34μg/mL)。将该培养物生长过夜直到高度混浊，并且被用于接种1L含有所有四种抗生素的新鲜LB培养基。第一培养物被用于接种更大体积的带有抗生素的LB培养基，其在37℃以250rpm摇动下生长直到OD₆₀₀为1-2。此时，加入1mMIPTG，并且将该细胞在37℃以250rpm摇动下进一步生长另外的3-5小时。

【0140】收集细胞，重新悬浮于5ml冷的20mM的Tri-HCl，pH7.5，并通过超声处理进行裂解。不溶性的细胞碎片通过4000×g离心去除，且收集总的可溶性蛋白质部分。从细胞裂解物得到并通过SDS-PAGE分析(图8)的全部可溶性蛋白质部分表明融合蛋白质(Trx-rCN和Trx-VN)是广泛存在于该细胞部分中的物质。依照制造商的方案(Invitrogen)，全部可溶性蛋白质部分中的融合蛋白质用重组TEV蛋白酶进行蛋白质水解，以便将rCN或VN与其融合蛋白伴侣——硫氧还蛋白切割开来。TEV蛋白酶处理(用SDS-PAGE监控)之后，蛋白质裂解物通过0.22μm过滤器进行除菌，并进一步通过30kDa分子截留过滤器(Millipore，MA)。滤出液中含有的重组解联蛋白物质(rCN和VN)进一步通过反相HPLC纯化进行回收。另外，含有His-tag序列的融合蛋白最初使用商业可得的His·Band树脂试剂盒(kit，Novagen)通过Ni-螯合亲和层析法进行纯化。更换缓冲液(去除过量的咪唑)之后，在很小量的DTT或GSH/GSSG存在下，融合蛋白用TEV蛋白酶在室温下进行蛋白质水解过夜，其中很小量的DTT或GSH/GSSG为了保持TEV蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)处于还原(活性)状态)。当蛋白质水解完全(用SDS-PAGE估测)时，重组CN种类(rCN或VN)通过反相HPLC纯化进行回收。

【0141】在融合蛋白质TEV切割之后，C18-反相HPLC被用于纯化重组CN构建物。用于rCN和VN的HPLC柱条件与用于天然CN的一样。HPLC使用VydacC18柱(218TP54，Temecula CA)在0.1％的TFA水溶液中进行。柱用装载液冲洗(1ml/ml)十分钟，接着用流动相进行线性梯度(0-100％)洗脱50分钟，该流动相含有0.1％TFA中的80％乙腈。在这些条件下，天然CN和两种形式的重组CN在41％乙腈下洗脱。洗脱的物质用还原性SDS-PAGE进行分析，其表明单条带的分子量～8kDa的VN，比天然CN稍大，这与含有五个额外氨基酸的一级结构相一致。回收的rCN在大小上与天然CN几乎相同。

【0142】在ELISA和Western印迹试验中，HPLC纯化的rCN和VN被针对天然CN产生的多克隆抗血清识别(没有显示数据)。

【0143】实施例2.重组contortrostatin构建物的生物活性

【0144】A.体外功能性试验

【0145】通过血小板聚集抑制试验评价重组CN产物的生物活性。根据此试验，以RGD依赖性的方式结合到GPIIb/IIIa(整联蛋白αIIbβ3)的CN抑制ADP诱导的血小板聚集(Trikha，Rote et al.1994)。在该试验中，潜在的抑制物被加入到新鲜的富含血小板的血浆中，数分钟后，加入ADP至最终浓度为1μM，以诱导聚集。如果存在抑制物，功能性的聚集将不会发生。IC₅₀被定义为50％的活性被抑制时的浓度，其被用作抑制物效力的度量。

【0146】经显示，在血小板抑制试验中，VN的IC₅₀为59nM，这与天然CN所观察到的结果几乎相同。然而，rCN构建物并不抑制血小板聚集，甚至在低μM浓度下，其对于小的合成RGD肽是有效的。ADP诱导的血小板聚集功能试验中rCN、VN和天然CN的作用显示在图9中。

【0147】此外，嵌合重组解联蛋白VN在几种其它的体外基于整联蛋白的功能试验中显示出相似的结果：MDA-MB-435癌细胞与固定化的纤连蛋白(Fn)和玻连蛋白(Vn)粘附的抑制试验，或MDA-MB-435癌细胞通过人工基膜(Matrigel)侵入改变的Boyden室的抑制试验。对于细胞粘附试验，用各种浓度的(0-1000nM)天然CN或VN预处理MDA-MB-435乳腺癌细胞30min，抑制MDA-MB-435细胞(100μl的细胞，105个细胞/ml)粘附到固定化的纤连蛋白(Fn)或玻连蛋白(Vn)。预处理的细胞被允许在25℃粘附1小时，在非粘附细胞被洗掉之后，每种条件下粘附细胞数目用MTS细胞生存力试验进行估测。在细胞侵入试验中，使用含有细胞培养插入物的侵入室，所述细胞培养插入物装入24孔组织培养板。该插入物含有8μm-孔大小的聚碳酸酯膜，其上覆盖一层薄的ECMatrixTM。ECMatrixTM充当体外重组基膜，其是从Engelbreth Holm-Swarm(EHS)小鼠肿瘤制备的ECM蛋白质的固体胶。ECM层使膜孔闭合，阻止非侵入性细胞通过膜孔的迁移。将该细胞25℃时在各种浓度的(10、100、1000nM)天然CN或Vicrostatin的存在下温育30min，然后允许其在Boyden室中迁移8小时。在8hr时，测量通过孔侵入到较低室中的细胞。通过使用荧光板读数器，对回收的标记DNA定量，近似计算每一条件下侵入的细胞的数量。结果以％侵入来计算，其中未处理的对照被认为是100％侵入。在所有这些体外功能性试验中，只有Vicrostatin(VN)显示出与天然CN相同的效力，和呈现出与天然CN几乎相同的IC₅₀(图10和11)。在测试的所有体外功能性试验中，rCN在纳摩尔范围内不具有活性(数据未显示)。

【0149】B.含有重组解联蛋白的脂质体的制备

【0150】采用前述的探针超声处理(Fujii，Chang et al.1997)，制备含有无内毒素的VN的脂质体(指定为LVN)和含有无内毒素的天然CN的脂质体(指定为LCN)。简单地说，将脂类(二类固醇卵磷脂(disteroylphosphatidylcholine)、胆固醇和聚乙二醇衍生的脂质)溶解在氯仿/甲醇溶液中。将等份的脂类溶液吸入圆底玻璃管中，然后在氮气蒸汽下于65℃蒸发溶剂，制备脂质薄膜。该膜在真空中放置至少24小时，以去除残留的有机溶剂。用溶解在10mM磷酸钠9％蔗糖，pH7.2中的天然CN或VN将脂质薄膜水合之后，脂质体形成。混合物在65℃温育5-10分钟。水合之后进行探针超声处理，直到悬浮液半透明。得到的悬浮液含有捕获CN/VN的脂质体和未包囊的CN/VN。未包囊的部分通过超滤去除。清洗之后，悬浮液通过0.22μm的过滤器进行除菌。

【0151】通过用氯仿/甲醇/水(10:40:50)破裂脂质体，然后在14,000×g离心过滤，测定脂质体捕获的CN/VN的浓度。利用BCA蛋白质试验分析上清液的CN/VN的浓度(Smith，Rrohn et al.1985)。用水：甲醇：氯仿溶液破裂LrCN之后，通过BCA蛋白质测定来估测包囊效率。

【0152】观察到，与天然(蛋白质)CN的80％相比，包囊溶液中72％的重组蛋白质VN被捕获在脂质体中。LVN显示出与包囊的天然CN相同的稳定性和大小分布(平均颗粒大小140nm)。

【0153】C.利用含重组解联蛋白的脂质体的肿瘤治疗

【0154】脂质体包囊的CN的生物学活性依照前述进行评估(Swenson，Costaet al.2004)。简单地说，三组五只裸鼠含有植入到乳房脂肪垫内的MDA-MB-435人乳腺癌细胞。植入之后两周，小的肿瘤是可触知的并开始进行治疗。动物用LCN或LVN治疗(105μg，每周两次，静脉给药)；包括PBS治疗的对照。观察到LVN对肿瘤生长具有显著的抑制作用(图12)。VN的体内肿瘤治疗效果表明VN的功能活性，发现这与天然CN相似。

【0155】D.含有重组解联蛋白的脂质体的抗血管形成活性

【0156】以前用天然CN和包囊的天然CN(LVN)进行的体内研究证实了对生长中的肿瘤血管形成的显著抑制效果(Zhou，Nakada et al.1999；Zhou，Sherwin etal.2000；Markland，Shieh et al.2001；Golubkov，Hawes et al.2003；Swenson，Costa etal.2004)。因此，LVN对MDA-MB-435乳腺癌模型中的肿瘤血管形成的影响，通过用抗CD31(抗-PECAM-1)单克隆抗体对血管进行组织化学鉴定来检测。已经报道，CD31在血管形成脉管系统中被高度表达，在内皮细胞表面上被报告有大约一百万个拷贝(Newman 1994)。也已被报道，在血管形成期间，CD31参与内皮细胞侧面连接处细胞-细胞接触的初始形成和稳定、血管渗透性屏障的维护、细胞迁移的调节、以及新血管的形成(Newman，Berndt et al.1990；Ferrero，Ferrero et al.1995；DeLisser，Christofidou-Solomidou et al.1997)。CD31的这些组合特性使其成为测定血管生长的最佳报告分子。

【0157】简单地说，在用MDA-MB-435动物肿瘤模型进行的LCN/LVN功效研究中来自治疗和未治疗老鼠的肿瘤被固定在4％的福尔马林标准缓冲溶液中并包埋在石蜡块中，如前所述(Shi，Key et al.1991)。石蜡块被切成5μm的切片并放在玻璃载玻片上。如前所述，组织切片经过脱石蜡、再水合和抗原提取(Pileri，Roncador et al.1997)。通过将该切片暴露于3％ H₂O₂中，内源性过氧化物酶的活性被阻断。样品用正常的山羊血清(1:20)阻断30min，接着用第一抗体温育1小时。CD31的兔子单克隆抗体(Sigma)被用作第一抗体来检测小的血管。然后与过氧化物酶(Zymed)偶联的第二(检测)山羊抗-兔子抗体被施用到样品上，并在室温下温育10分钟，接着通过多次用PBS清洗去除未结合的抗体。依照制造商(Zymed HistoMouse Max)的说明书，使用3，3′-二氨基联苯(3，3′-diaminobenzidine，DAB)作为色原检测第二抗体。载玻片用苏木精进行复染。采用“热点(hot spot)”分析进行染色血管的定量分析(Gasparini，Weidner et al.1993)，其中“热点”被定义为高密度血管区(Weidner，Folkman et al.1992；Swenson，Costa et al.2004)。使用SimplePCI高级成像软件(C-Imaging Systems，Cranberry Township，PA)，在给定的热点内，根据像素对显示正染色的面积(放大100×)进行定量分析。

【0158】在MDA-MB-435肿瘤切片中用CD31进行的血管检测结果显示在图13A和13B中。图14B中条形图的概括表明每个治疗组中的正染色差异：PBS，静脉内脂质体包囊的天然CN(LCN)和静脉内脂质体包囊的天然VN(称为LCN)。在LCN和LVN处理的肿瘤中，微血管密度具有统计学上显著的降低(p<0.0005)，其对应于LCN组中血管形成降低90％以及LVN组中血管形成降低92％。在MDA-MB-435乳腺癌异种移植物模型中，在所有的治疗组中，通过CD31免疫染色所观察到的血管形成的降低，表明LVN是血管形成的有效抑制物。

【0159】E.重组解联蛋白的结构分析

【0160】天然CN和VN的结构用质谱进行分析。MALDI-TOF质谱使用α-氰-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnarnic acid)基质施行。使用MALDI-TOF的天然CN显示在图14A而使用MALDI-TOF的VN显示在图14B(可看到分子量7143.41的单体峰)。这些结果表明VN是单体而不是如天然CN所观察到的二聚体。

【0161】电喷雾离子化质谱也被用于评价天然CN和VN。图15A显示的13507.0的大峰，表明CN为二聚体，以及两个较小的峰，可能是切割掉单个氨基酸的CN。图15B显示出VN的7146.0单峰，确定其为单体。

【0162】质谱数据表明VN是单体结构，不像二聚体形式的天然CN。因为如上所述测得的CN的生物活性存在于分子的C-端部分，这表明VN至少在分子的C-端部分正确折叠，这使得产生正确的二硫键组合且保留了在天然构建物中存在的整联蛋白结合环。然而，不能得到天然的二聚体构像表明VN的N-端部分以与天然CN不同的方式折叠，这就损害了VN的N-端半胱氨酸参与分子间二硫键形成的能力。这一点通过在VN中检验到至少一个自由的巯基所证实。在天然状态中，CN的第一个半胱氨酸残基(Cys-7)与第七个半胱氨酸残基(Cys-30)进行配对，是在CN中桥接的最远部分的半胱氨酸。CN中C7和C30半胱氨酸桥接的固有困难是VN不能形成二聚体的可能的解释。

【0163】实施例3.优化密码子使用(密码子选择)

【0164】Origami大肠杆菌菌株(FA113)的潜在问题是其缺乏密码子使用的优化。在许多生物体中，不是所有61种tRNA都被等同使用。所称的主要密码子是在高度表达的基因中出现的那些密码子，相反次要或稀有密码子倾向于在以较低水平表达的基因中。61种密码子中哪些是稀有密码子强烈取决于生物体。

【0165】真核蛋白在大肠杆菌中倾向低效地翻译，这是由于错配的密码子使用阻碍了异源表达体系中蛋白质的产生(Makrides 1996)。每个生物体的密码子使用可以在本领域熟知的密码子使用数据库找到而且可以在线得到。大肠杆菌中的密码子使用显示在图16中。该图中的基因被分为三种类型。类型I的基因参与大部分代谢过程。类型II的基因对应于指数生长期间高度和连续表达的基因。类型III的基因在DNA水平转移中被复制。类型III的基因中密码子的分布或多或少比较均匀，相反种类II的基因中密码子的分布具有极大的偏好性——特别地，以A终止的密码子被选择(Guerdoux-Jamet，Henaut et al.1997)。通常，密码子使用的频率反映其同源tRNA的丰度。因此，当要表达的蛋白质的密码子使用与表达宿主的平均密码子使用显著不同时，这就可能在表达期间产生问题。

下面的密码子使用问题可能被碰到：

·翻译中断——这产生各种截短的蛋白质产物

·移码——这导致蛋白质产物的错译

·氨基酸错参——例如，由于AGA密码子使赖氨酸错参为精氨酸，这可以通过质谱检测到，因为这引起了蛋白质的分子量降低28Da。

·蛋白质合成和细胞生长的抑制——显著影响表达产量

【0166】结果，观察到的表达水平经常是低的或者甚至检测不到。尤其是在稀有密码子存在于mRNA的5’-端或发现连续稀有密码子的情况下，表达水平低并产生截短的蛋白质。图17比较了各种生物体中8种最少使用的密码子。

【0167】对于CN基因，具有在大肠杆菌中很少使用的39种密码子，在图18A中以黑体显示，这使得CN天然基因密码子使用对于这种表达体系而言是困难。来自Novagen的另一大肠杆菌表达宿主，Rosetta-gami B，通过为AGA、AGG、GGA、ATA、CTA和CCC密码子提供tRNA补充但没有为CGG或ACA提供tRNA补充，使密码子使用最优化。因此，即使使用增强的细菌宿主Rosetta-gami B，CN基因仍有两个密码子，这种高度工程化(改造)的大肠杆菌没有为这两个密码子提供充分的支持。CGG是典型的稀有密码子，因此在DNA序列中被优选地替代。ACA密码子编码苏氨酸，尽管不像稀有类型的密码子那样很少使用，但是其是重要的，因为其在天然CN基因中被充分表示(represent)(在编码序列中有11个ACA密码子)。因此，ACA密码子应当在编码序列中可能的地方被替代。

【0168】在一些实施方式中，CN基因整联蛋白结构域中11个ACA密码子中的8个用与宿主更相容的同源密码子替代。通过使用一组重叠的寡聚核苷酸引物，采用PCR(定点诱变)将这两组密码子替代成更常使用的同源密码子(分别为CGT和ACC/ACT)。由PCR建立的突变CN基因序列显示在图18B。在该图中，以黑体显示的密码子是唯一未被取代的ACA密码子。

【0169】产生下面重叠的寡核苷酸引物，而且如上所述被用于替换野生型CN基因中的CGG和ACA密码子：

CNCGG正向—CN解联蛋白结构域正向引物，其替代CGG和第十一个ACA密码子：

5’ACCGTATGCCGTAGAGCAAGGGGTGATGACCTGGATGATTAC3’(SEQ ID NO：9)

CNCGG反向—CN解联蛋白结构域反向引物，其替代CGG和第十一个ACA密码子：

5’TGCTCTACGGCATACGGTTCCTTCTTTCATAAATTTGCACTG3’(SEQ ID NO：10)

CNACA正向—CN解联蛋白结构域正向引物，其替代第八个、第九个和第十个ACA密码子：

5’TGCGATGCTGCAACCTGTAAACTGACCACCGGGTCACAGTGTGCAGAT3’(SEQ ID NOr 11)

CNACA反向—CN解联蛋白结构域反向引物，其替代第八个、第九个和第十个ACA密码子：

5’CAGTTTACAGGTTGCAGCATCGCAGCACGGATTTGC3’(SEQ ID NO：12)

CNMACA12正向—CN金属蛋白酶结构域正向引物，其替代前两个ACA密码子：

5’TCTGATGGCAGAAAAATTACCACCAACCCTCCGGTTGAG3’(SEQ ID NO：13)

CNMACA 12反向—CN金属蛋白酶结构域反向引物，其替代前两个ACA密码子：

5’AATTTTTCTGCCATCAGAGGAATAATG3’(SEQ ID NO：14)

CNMACA45正向—CN金属蛋白酶结构域正向引物，其替代第四个和第五个ACA密码子：

5’CATAGTGCAATAAATCTTTGGGTTGCAGTTACTATGGCCCATGAG3’(SEQ ID NO：15)

CNMACA45反向—CN金属蛋白酶结构域反向引物，其替代第四个和第五个ACA密码子：

5’ATTTATTGCACTATGATCCTGAACAATTCCGGTAGAAAGCTTCGG3’(SEQ IDNO：16)

【0170】实施例4 工程化宿主系统

【0171】工程化的Rosetta-gami B宿主，其在胞质中具有二硫键异构酶活性并且在同一区室内包括氧化-还原酶器件的自动再生能力，可以被用于细菌中重组CN的产生。该宿主可以被工程化，以在胞质内与ΔssDsbC和ΔssDsbDα一起伴随着过表达融合到硫氧还蛋白的含有二硫键的真核蛋白。此目标可以用共存于同一体系的一对载体来实现。该载体组的最低特征是：存在强启动子如T7lac，其可同时被用于所有3种蛋白质，以及在不同的MCSs(多克隆位点)上存在的便利的多个限制性位点，这些限制性位点整合入载体中。两种Novagen载体(pET32a和pCDFDuet-1)，其通过具有不同的复制子而彼此相容，而且也与Rosetta-gami表达宿主相容，具有前面提到的特征并且可被用在本文所述体系中。通过使用这两种载体，使用整合体系的方案可以实现，在所述体系中所有的3种蛋白质的表达将被单一的强启动子T7lac同时控制。由Novagen提供的pCDFDuet-1载体的图谱显示在图19中。

【0172】几种野生型和活性位点突变的硫氧还蛋白-CN遗传构建物被制备，其表达融合蛋白质，所述融合蛋白质含有位于N-端的硫氧还蛋白和解联蛋白结构域(CN)，或者与包括echistatin C-端移植物的解联蛋白结构域(VN)，或者与由前体蛋白、金属蛋白酶和含有或不含echistatin C-端移植物的CN解联蛋白结构域组成的更大的真核蛋白(被命名为rCN PMD和VN PMD)。下面使用的宽泛的术语“TrxA-解联蛋白构建物”指依照本文所述制备的如下构建物：TrxA-rCN(融合到CN解联蛋白结构域的硫氧还蛋白A)、TrxA-VN(融合到包括echistatin C-端移植物的CN解联蛋白结构域的硫氧还蛋白A)、TrxA-rCN PMD(融合到大蛋白质的硫氧还蛋白A，所述大蛋白质由CN前体蛋白、金属蛋白酶和解联蛋白结构域组成)、TrxA-VN PMD(融合到大蛋白质的硫氧还蛋白A，所述大蛋白质由CN前体蛋白、金属蛋白酶和含有echistatin C-端移植物的解联蛋白结构域组成)、TrxA(CPYC)-rCN(融合到CN解联蛋白结构域的带有CPYC基序的活性位点突变的硫氧还蛋白A)、TrxA(CPYC)-VN(融合到具有echistatin C-端移植物的CN解联蛋白结构域的包括CPYC基序的活性位点突变硫氧还蛋白A)、TrxA(CPYC)-rCNPMD(融合到大蛋白质的包括CPYC基序的活性位点硫氧还蛋白A，所述大蛋白质由CN前体蛋白、金属蛋白酶和解联蛋白结构域组成)、TrxA(CPYC)-VN PMD(融合到大蛋白质的包括CPYC基序的活性位点硫氧还蛋白A，所述大蛋白质由CN前体蛋白、金属蛋白酶和具有echistatin C-端移植物的解联蛋白结构域组成)、TrxA(CGHC)-rCN(融合到CN解联蛋白结构域的带有CGHC基序的活性位点突变的硫氧还蛋白A)、TrxA(CGHC)-VN(融合到具有echistatin C-端移植物的CN解联蛋白结构域的具有CGHC基序的活性位点突变的硫氧还蛋白A)、TrxA(CGHC)-rCN PMD(融合到大蛋白质的包括CGHC基序的活性位点突变的硫氧还蛋白A，所述大蛋白质由CN前体蛋白、金属蛋白酶和解联蛋白结构域组成)、和TrxA(CGHC)-VN PMD(融合到大蛋白质的包括CGHC基序的活性位点突变的硫氧还蛋白A，所述大蛋白质由CN前体蛋白、金属蛋白酶和具有echistatin C-端移植物的解联蛋白结构域组成)。

【0173】为了增加一些重组真核蛋白转录物在表达宿主胞质内的稳定性——特别是那些含有蛋白质原、金属蛋白酶和解联蛋白结构域(含有或不含echistatin C-端移植物)的大的转录物，一些重组构建物被设计成包括各种长度的核苷酸序列，这些核苷酸序列通常能在CN天然mRNA的3’非可译区域被发现，即位于CN天然转录物中发现的发送翻译终止信号的终止密码子的下游。通过使用CN cDNA作为模板，几种解联蛋白构建物与从CN天然mRNA中模拟的额外的非编码核苷酸区域一起被克隆(Zhou，Hu et al.2000)。天然CN cDNA可在USC的Francis S.Markland实验室得到。

【0174】使用如此引物通过PCR将下述序列克隆到pET32a载体：TrxA核苷酸序列的下游；含有或不含echistatin C-端移植物的CN解联蛋白结构域序列；或者由前体蛋白、金属蛋白酶和含有或不含echistatin C-端移植物的解联蛋白结构域组成的更大的CN序列，所述引物描述如下：

CNfor2(CN正向2)—引入Nco I限制性位点和TEV蛋白酶切割位点的CN解联蛋白结构域的正向引物：

5’GTTCCCCATGGATGAGAATCTTTACTTCCAAGGAGACGCTCCTGCAAATCCGTGCTGCGATGCTGCA3’(SEQ ID NO：17)

CNfor3(CN正向3)—引入Nco I限制性位点和TEV蛋白酶切割位点的全长CN的正向引物：

5’GTTCCCCATGGATGAGAATCTTTACTTCCAAGGAATGATCCAGGTTCTCTTGGTGACTCTATGCTTA3’(SEQ ID NO：18)

CNback3(CN反向3)—引入EcoRI限制性位点的、不含echistatin C-端移植物的CN构建物的反向引物：

5’GTTATTCGGAATTCTTAGGCATGGAAGGGATTTCTGGGACAGCCAGCAGA3’(SEQ ID NO：19)

CNback4(CN反向4)—引入EcoRI限制性位点的、具有echistatin C-端移植物的CN构建物的反向引物：

5’GTTATTCGGAATTCTTAAGTAGCTGGACCCTTGTGGGGATTTCTGGGACAGCCAGCAGATATGCC3’(SEQ IDNO：20)

【0175】用于将括有CN天然mRNA的非可译核苷酸序列的各种解联蛋白构建物克隆到pET32a载体的反向引物如下：

CNback5(CN反向5)—用于产生引入EcoRI限制性位点的CN天然转录物的反向引物：

5’GTTATTCGGAATTCATATTACAGAATTTGGATACCATCTGGAAGCTA3’(SEQID NO：21)

CNback6(CN反向6)—用于产生引入EcoRI限制性位点的CN天然转录物的反向引物：

5’GTTATTCGGAATTCGAATGAGAATAGTTTGTTTATTGACGGAAGCAG3’(SEQID NO：22)

【0176】用于扩增活性位点硫氧还蛋白突变体并将它们克隆到pET32a载体以替换野生型TrxA核苷酸序列的寡核苷酸引物如下：

Trxfor(Trx正向)—引入Xba I限制性位点并且设计用于将活性位点突变体的5’端插入pET32a载体的Trx正向外部引物：

5’CCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACT3’(SEQ ID NO：23)

Trxback(Trx反向)—引入BglII限制性位点并且设计用于将活性位点突变体的3’端插入pET32a载体的Trx反向外部引物：

5’TACCCAGATCTGGGCTGTCCATGTGCT3’(SEQ ID NO：24)

TrxGrxfor(TrxGrx正向)—使TrxA活性位点突变为谷氧还蛋白样活性位点的Trx正向引物：

5’TTCTGGGCAGAGTGGTGCCCGTATTGCAAAATGATCGCCCCG3’(SEQ ID NO：25

TrxGrxback(TrxGrx反向)—使TrxA活性位点突变为谷氧还蛋白样活性位点的Trx反向引物：

5’GCACCACTCTGCCCAGAAATC3’(SEQ ID NO：26)

TrxPDIfor(TrxPDI正向)—使TrxA活性位点突变为PDI样活性位点的Trx正向引物：

5’TTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCATTGCAAAATGATCGCCCCG3’(SEQ ID NO：27)

TrxPDIback(TrxPDI反向)—使TrxA活性位点突变为PDI样活性位点的Trx反向引物：

5’GCACCACTCTGCCCAGAAATC3’(SEQ ID NO：28)

【0177】对于DsbD克隆，使用的限制性位点是Nco I/EcoR I。该限制性酶对被使用，因为它从pCDFDuet-1载体第一个多克隆位点去除His标签序列，因此ΔssDsbDα-结构域将表达为非标记分子。对于DsbC克隆，Nde I/Xho I限制性酶对被使用，以便ΔssDsbC蛋白将被表达为非标记的。

【0178】野生型DsbC基因携带EcoR I限制性位点。由于这个原因，折叠酶序列采用PCR以分步的方式被克隆，步骤如下：在第一步克隆中，ΔssDsbDα-结构域核苷酸序列被插入到pCDFDuet-1载体的一个多克隆位点，接着是ΔssDsbC核苷酸序列，其在第二步克隆中被插入到载体的其它多克隆位点。在本文所述的体系中表达的唯一His-标记蛋白质是TrxA-解联蛋白融合构建物，所以通过采用Ni-柱层析纯化技术它们可以容易地与其它两种共同过表达蛋白质分离开。所有TrxA-解联蛋白构建物包括TEV蛋白酶切割位点，该切割位点恰好基因工程化(设计)在含二硫键的重组蛋白(真核蛋白)核苷酸序列的上游。TrxA-解联蛋白构建物的所有纯化步骤以与那些在讨论Origami体系部分所述相同的方式进行。然而，一些TrxA-解联蛋白构建物也携带蚁酸切割位点(Asp-Pro)代替TEV蛋白酶切割位点，其也是恰好设计在含二硫键的重组真核蛋白核苷酸序列的N-端的上游。与其它蛋白酶切割体系例如TEV蛋白质水解体系相比，蚁酸在水解中的应用降低了成本。

【0179】用于将各种解联蛋白构建物克隆到pET32a载体的寡核苷酸引物如下，所述解联蛋白构建物被工程化为携带Asp-Pro蚁酸切割位点，该切割位点恰好位于各种CN构建物(含有或不含多个结构域或echistatin C-端移植物)的N-端上游：

CNfor4(CN正向4)—引入Nco I限制性位点和Asp-Pro切割位点的CN解联蛋白结构域的正向引物：

5’GTTCCCCATGGATGACCCTGCAAATCCGTGCTGCGATGCTGCAACA3’(SEQ ID NO：29)

CNfor5(CN正向5)—引入Nco I限制性位点和Asp-Pro切割位点的全长CN的正向引物：

5’GTTCCCCATGGATGACCCTATGATCCAGGTTCTCTTGGTGACTCTATGCTTA3’(SEQ ID NO：30)

【0180】用于将ΔssDsbC、ΔssDsbDα-结构域核苷酸序列以及它们的活性位点突变体序列通过PCR克隆入pCDFDuet-1载体的寡核苷酸引物如下：

DsbCUP——引入NdeI限制性位点的DsbC正向引物：

5’GTATTCATATGGATGACGCGGCAATTCAACAAACGTTA3’(SEQ ID NO：31)

DsbCDN——引入XhoI限制性位点的DsbC反向引物：

5’GTTCCCTCGAGTTATTTACCGCTGGTCATTTTTTGGTG3’(SEQ ID NO：32)

DsbDUP——引入NcoI限制性位点的DsbD正向引物：

5’GTTATTCGCCATGGGATTATTCGACGCGCCGGGACGTTCA3’(SEQ ID NO：33)

DsbDDN——引入EcoRI限制性位点的DsbD反向引物：

5’GTCTACGAATTCGCTTAAGGCTGTGGCGCTGCGTTGTTGGC3’(SEQ ID NO：34)

【0181】用于产生DsbC活性位点突变体的重叠延伸寡核苷酸引物如下：

DsbCTFfor(DsbCTF正向)——活性位点突变的DsbC(CTFC)重叠延伸正向引物：

5’TTTACTGATATTACCTGTACCTTCTGCCACAAACTGCATGAG3’(SEQ ID NO：35)

DsbCGFfor(DsbCGF正向)——活性位点突变的DsbC(CGFC)重叠延伸正向引物：

5’TTTACTGATATTACCTGTGGTTTCTGCCACAAACTGCATGAG3’(SEQ ID NO：36)

DsbCOEback(DsbCOE反向)——活性位点突变的DsbC重叠延伸反向引物：

5’ACAGGTAATATCAGTAAACAC3’(SEQ ID NO：37)

【0182】用于测序的pET32a和pCDFDuet-1外部和内部寡核苷酸引物如下：

DuetCDFUP1：

5’GGATCTCGACGCTCTCCCTTA3’(SEQ ID NO：38)

DuetCDFUP2：

5’TTGTACACGGCCGCATAATCG3’(SEQ ID NO：39)

DuetCDFDN1：

5’CGATTATGCGGCCGTGTACAA3’(SEQ ID NO：40)

PETUP1：

5’GGAATTGTGAGCGGATAACAATTC3’(SEQ ID NO：41)

PETUP2：

5’CGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACC3’(SEQ ID NO：42)

PETDN1：

5’GTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGG3’(SEQ ID NO：43)

【0183】使用前述的寡核苷酸引物，通过PCR，从在南加州大学(Universityof Southern California)Francis S.Markland实验室中制备和纯化的大肠杆菌K-12MG1655菌株基因组DNA，直接扩增细菌的巯基-二硫键互换蛋白DsbDα-结构域和二硫键异构酶DsbC核苷酸序列。CN序列通过PCR从质粒扩增，和/或首先突变，以替换在细菌中很少使用的所有天然密码子或Rosetta-gami B对其不提供支持的那些密码子。在几个PCR步骤中，通过利用位点定向诱变变技术，使用重叠延伸寡核苷酸引物，对包括蛋白质原、金属蛋白酶和解联蛋白结构域的CN核苷酸序列进行突变。

【0184】在野生型全长CN核苷酸序列的PCR扩增和优化密码子的替换完成，以及所有折叠酶序列扩增(具有或不具有活性位点突变)之后，这些序列以分步的方式被克隆入pET32a和pCDFDuet-1载体。具有替换的密码子的全长CN核苷酸序列进一步作为模板，以建立包括echistatin C端移植物的解联蛋白构建物。利用BglII/NcoI限制性位点，野生型TrxA、具有或不具有echistatin C端移植物的解联蛋白核苷酸序列被直接插入pET32a载体。为建立具有TrxA活性位点突变的TrxA-解联蛋白构建物，首先使用重叠延伸引物单独扩增TrxA突变体，然后使用XbaI/BglII限制性酶组将其插入pET32a载体，以替换野生型TrxA序列。包括野生型TrxA核苷酸序列的pET32a载体被用作所有PCR扩增步骤的模板，所述PCR扩增步骤对于产生TrxA活性位点突变体是必需的。在进一步的步骤中，在活性位点TrxA突变体被插入所述载体之后，解联蛋白核苷酸序列通过使用NcoI/EcoRI限制性酶组也被插入pET32a中。

【0185】下面的活性位点Trx A突变体被用于本文描述的表达载体中：谷氧还蛋白样(类谷氧还蛋白)Trx A(具有细菌谷氧还蛋白A活性位点的硫氧还蛋白A)和PDI样TrxA(具有真核蛋白二硫键异构酶活性位点的硫氧还蛋白A)。

【0186】使用重叠延伸引物，通过PCR从E.coli K-12 MG1655菌株基因组DNA直接扩增ΔssDsbC活性位点突变的序列。下面的活性位点突变体被用于本文描述的表达载体中：ΔssDsbC(CGFC)和ΔssDsbC(CTFC)。分别使用两组限制性酶：NcoI/EcoRI和NdeI/XhoI，ΔssDsbDα-结构域和ΔssDsbC的野生型核苷酸序列或者ΔssDsbC的活性位点突变序列被克隆入pCDFDuet-1载体分离的多克隆位点中。pETDuet-1和pCDFDuet-1载体构建物被用于共转化电穿孔感受态DH5α细胞，其进一步在培养基中扩增。然后，所有的构建物通过测序加以验证，而且重组质粒被进一步用于共转化Rosetta-gami B表达宿主。

【0187】所有的生长步骤与先前对于Origami系统所描述的步骤相同，除了抗体的使用。Rosetta-gami B共转化体在五种抗生素中生长：羧苄青霉素(100μg/mL)、壮观霉素(50μg/mL)、四环素(12.5μg/mL)、卡那霉素(15μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)。各种重组蛋白的所有处理和纯化步骤与先前对于Origami系统所描述的那些处理和纯化步骤相同。

【0188】在使用下面的表达组合之后，具有不同的共同过表达折叠酶的重组解联蛋白变体的产生水平和生物活性被初步确定：

1.TrxA-解联蛋白+ΔssDsbC+ΔssDsbDα

2.TrxA(CPYC)-解联蛋白+ΔssDsbC+ΔssDsbDα

3.TrxA(CGHC)-解联蛋白+ΔssDsbC+ΔssDsbDα

【0189】通过比较不同Trx-A解联蛋白融合蛋白的结构和产量，选择以最佳表达水平正确折叠的二聚体的类型(version)。为进一步提高正确折叠蛋白质的表达水平，最佳氧化酶类型，也称为“最佳氧化酶-解联蛋白(Best oxidase-disintegrin)”，结合DsbC的两种突变体被进一步加以测试。

4.最佳氧化酶-解联蛋白+ΔssDsbC(CGFC)+ΔssDsbDα

5.最佳氧化酶-解联蛋白+ΔssDsbC(CTFC)+ΔssDsbDα

【0190】为了产生重组解联蛋白，使用实施例1中描述的相同步骤。然而，包括蛋白质原、金属蛋白酶和解联蛋白结构域的表达的重组变体可以经受翻译后自催化蛋白水解，从而释放含有或不含echistatin C端移植物的C端重组解联蛋白结构域，解联蛋白结构域可以通过反相HPLC，可以在从细菌回收的全部可溶性蛋白部分直接纯化。该期望的事件将不需要Ni柱亲和层析纯化以及TEV蛋白酶蛋白水解或蚁酸水解中间步骤，这些步骤被用于重组解联蛋白产生。

【0191】实施例5.优化表达

【0192】通过改变若干个参数，系统可被优化，以取得更好的产量，所述参数改变例如使用：增加的羧苄青霉素(青霉素的更稳定的形式)浓度，羧苄青霉素在所有的生长步骤中对于β-内酰胺酶降解具有更大抗性；最优的IPTG浓度(在Tuner衍生宿主中可容易实现的特征)；以及，最后，用于得到最佳产量的最优诱导温度。获得更均质的培养物并防止质粒损失的最简易的途径是使用更稳定的抗生素羧苄青霉素而不是青霉素。对于更紧密地调控基础表达——也导致质粒不稳定的一种现象，培养基可以补充1％的葡萄糖，以抑制乳糖对lac启动子的诱导，乳糖存在于大多数富有营养成分的培养基(例如，LB)中。而且，添加少量乙醇、多元醇和蔗糖、或低分子量硫醇可用于在E.coli中显著促进可溶性蛋白的表达(例如从几克重组蛋白到几十克甚至几百克)。同样，可使用密码子优化，如已经讨论的。在优化密码子使用的努力中，Rosetta-gami B(DE3)pLysS表达宿主——补充有稀有tRNAs的菌株——可被优选使用，以代替Origami B(DE3)pLysS。

【0193】实施例6.表达系统组合

【0194】下面的元件可用在本发明的方法中。“TP”是指真核蛋白。

1.TrxA-TP或TrxA(CPYC)-TP或TrxA(CGHC)-TP

2.TP的整联蛋白结合(例如HKGPAT)C端序列

3.第1项的“Tag”序列

4.第1项的切割位点序列

5.ΔssDsbC

6.ΔssDsbDα

7.trxB突变体

8.gor突变体

9.ompT突变体

10.lon突变体

【0195】所述方法可以包括上面1-10的任何组合，用于表达TP。在另一种方法中，下列元件的任何一个可以被组合，用于表达未融合到硫氧还蛋白上的真核蛋白。

1.未融合到硫氧还蛋白上的真核蛋白

2.TP的整联蛋白结合(例如HKGPAT)C端序列

3.第1项的“Tag”序列

4.第1项的切割位点序列

5.ΔssDsbC

6.ΔssDsbDα

7.trxB突变体

8.gor突变体

9.ompT突变体

10.lon突变体

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【0196】尽管本发明已经被详细描述和示例性说明到对于本领域技术人员足以制造和使用的程度，但是在不背离本发明的精神和范围的情况下，各种替代、变化和改进应该是明显的。

【0197】本领域的技术人员很容易认识到，本发明完全适合于实施各种目标并获得所提到的目的和益处，以及其中固有的那些目的和益处。本文所提供的实施例代表优选的实施方式，是示例性的，而无意限定本发明的范围。本领域技术人员将想到其中的变化和其它应用。这些变化被包括在本发明的精神内并由权利要求书的范围限定。

【0198】对于本领域技术人员很明显的是，可以对本文公开的发明进行不同的替代和改变，而不背离本发明的范围和精神。

【0199】在说明书中提及的所有专利和出版物提示了本发明所属技术领域的普通技术人员的水平。所有的专利和出版物均以相同的程度并入本文作为参考，如同被特定地和单独地指出并入本文作为参考的每一单独的出版物。

【0200】本文中描述的发明，可以在缺乏任一因素或多个因素、限定或多个限定的情况下被恰当地实践，这在本文没有具体公开。因此，例如，在本文的每一种情况中，术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”的任何一个术语可被其它两个中的任一个替换。所使用的术语和表达只是用作描述性术语，并非限制性术语，并且当使用这些术语和表达时，无意排除任何所示出和描述的特征或其部分的等价物，但是，也认识到，在所要求保护的发明范围内进行不同的变化是可能的。因此，应当理解，虽然本发明已经通过优选的实施方式和任选的特征被具体地公开，但是本领域的技术人员可以想到对本文公开的概念进行修改和变化，而这些修改和变化被认为是在本发明的范围内，如本文所附权利要求书限定。

【0201】其它实施方式在权利要求书中被提出。

Claims (67)

1.一种在原核宿主细胞内表达真核蛋白的方法，所述真核蛋白要求形成多个链间或链内二硫键以获得其生物学活性，所述的方法包括：

a)用编码融合蛋白的表达载体转化原核宿主细胞，所述融合蛋白包括编码硫氧还蛋白的N端片段和编码真核蛋白的C端片段，所述真核蛋白要求形成至少两个链内或链间二硫键以获得生物学活性；和

b)以生物学活性形式表达融合到所述的硫氧还蛋白的所述的真核蛋白。

2.权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞已被修饰，以在所述细胞的细胞质中表达二硫键异够酶(DsbC)。

3.权利要求2所述的方法，其中所述DsbC具有SEQ ID NO：3所示的序列。

4.权利要求2所述的方法，其中所述DsbC被修饰，以便其活性位点序列CGYC已被变为CGFC或CTFC。

5.权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞已被修饰，以在所述细胞质中表达巯基-二硫键互换蛋白(DsbD)α-结构域片段。

6.权利要求5所述的方法，其中所述DsbDα-结构域具有SEQ ID NO：4所示的序列。

7.权利要求2所述的方法，其中所述宿主细胞已被修饰，以在所述细胞质中表达巯基-二硫键互换蛋白(DsbD)α-结构域片段。

8.权利要求7所述的方法，其中所述DsbDα-结构域具有SEQ ID NO：4所示的序列。

9.权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白的硫氧还蛋白部分来自与所述原核宿主相同类型的生物体。

10.权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白的硫氧还蛋白部分具有SEQID NO：1所示的序列。

11.权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白的硫氧还蛋白部分含有作为活性位点序列的CPYC。

12.权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白的硫氧还蛋白部分含有作为活性位点序列的CGPC。

13.权利要求1所述的方法，其中所述宿主缺乏硫氧还蛋白还原酶(trxB)、谷胱甘肽还原酶(gor)、ompT或lon基因产物中的任何一种或多种。

14.权利要求1所述的方法，其中编码切割位点的序列位于所述编码硫氧还蛋白的序列和所述编码真核蛋白的序列之间。

15.权利要求14所述的方法，其中所述切割位点容易遭受蛋白质水解。

16.权利要求15所述的方法，其中所述切割位点是TEV切割位点，其具有选自ENLYFQG或ENLYFQS的序列。

17.权利要求14所述的方法，其中所述切割位点容易遭受化学切割。

18.权利要求17所述的方法，其中所述切割位点序列具有氨基酸序列DP。

19.权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白包括肽序列，所述肽序列是受体的配体。

20.权利要求19所述的方法，其中所述肽序列包括聚组氨酸序列。

21.权利要求1所述的方法，其中所述宿主是细菌。

22.权利要求21所述的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(E.coli)。

23.权利要求22所述的方法，其中所述大肠杆菌是Origami菌株。

24.权利要求1所述的方法，其中所述真核蛋白是解联蛋白。

25.权利要求24所述的方法，其中所述解联蛋白是选自PI、PII或PIII类的蛇毒素。

26.权利要求24所述的方法，其中所述解联蛋白是contortrostatin。

27.权利要求24所述的方法，其中所述解联蛋白在其C端包括编码整联蛋白结合结构域的序列。

28.权利要求27所述的方法，其中所述的整联蛋白选自整联蛋白αIIbβ3、αvβ3、αvβ5和α5β1。

29.权利要求27所述的方法，其中所述的序列是HKGPAT。

30.权利要求1所述的方法，其中所述真核蛋白包括解联蛋白结构域。

31.权利要求1所述的方法，其中所述真核蛋白选自细胞因子、趋化因子、干扰素、生长因子、免疫球蛋白、毒素和纤溶酶原激活物。

32.权利要求1所述的方法，其中所述真核蛋白选自jararhagin、解联蛋白schistatin、蛇金属蛋白酶纤维溶酶、人白细胞介素-2-前体、人干扰素-γ、人转化生长因子β2、人肝表达趋化因子、CCL16、ω-芋螺毒素CVID前体、蝎氯毒素、人ADAM9前体、人血管内皮因子A(VEGF-A)和人组织型纤溶酶原激活物前体(t-PA)。

33.权利要求1所述的方法，其中所述真核蛋白是多聚体。

34.权利要求1所述的方法，其中所述真核蛋白是单体。

35.一种在原核宿主细胞内表达解联蛋白的方法，所述的方法包括：

a)用编码融合蛋白的表达载体转化原核宿主细胞，所述融合蛋白包括编码硫氧还蛋白的N端片段和编码解联蛋白的C端片段；和

b)表达融合到所述的解联蛋白的所述的真核蛋白。

36.权利要求35所述的方法，其中所述宿主细胞已被修饰，以在所述细胞的细胞质中表达二硫键异够酶(DsbC)。

37.权利要求36所述的方法，其中所述DsbC具有SEQ ID NO：3所示的序列。

38.权利要求36所述的方法，其中所述DsbC被修饰，以便其活性位点序列CGYC已被改变为CGFC或CTFC。

39.权利要求35所述的方法，其中所述宿主细胞已被修饰，以在所述细胞质中表达巯基-二硫键互换蛋白(DsbD)α-结构域片段。

40.权利要求39所述的方法，其中所述DsbDα-结构域片段具有SEQ ID NO：4所示的序列。

41.权利要求35所述的方法，其中所述宿主细胞已被修饰，以在所述细胞质中表达巯基-二硫键互换蛋白(DsbD)α-结构域片段。

42.权利要求41所述的方法，其中所述DsbDα-结构域具有SEQ ID NO：4所示的序列。

43.权利要求35所述的方法，其中所述融合蛋白的硫氧还蛋白部分具有SEQID NO：1所示的序列。

44.权利要求35所述的方法，其中所述宿主缺乏硫氧还蛋白还原酶(trxB)、谷胱甘肽还原酶(gor)、ompT或lon基因产物中的任何一种或多种。

45.权利要求35所述的方法，其中编码切割位点的序列位于所述编码硫氧还蛋白的序列和所述编码真核蛋白的序列之间。

46.权利要求35所述的方法，其中所述融合蛋白进一步包括肽序列，所述肽序列是受体的配体。

47.权利要求35所述的方法，其中所述解联蛋白是选自PI、PII或PIII类的蛇毒素。

48.权利要求35所述的方法，其中所述解联蛋白是contortrostatin。

49.权利要求48所述的方法，其中所述解联蛋白在其C端包括编码整联蛋白结合结构域的序列。

50.权利要求49所述的方法，其中所述序列是HKGPAT。

51.权利要求35所述的方法，其中所述真核蛋白包括解联蛋白结构域。

52.权利要求35所述的方法，其中所述真核蛋白作为单体被表达。

53.权利要求35所述的方法，其中所述融合蛋白以至少1-3mg/L的水平表达。

54.权利要求35所述的方法，其中所述融合蛋白以至少7-9mg/L的水平表达。

55.单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域，其包括对于所述解联蛋白或解联蛋白结构域非天然的C端序列，所述的C端序列编码功能性整联蛋白结合环。

56.权利要求55所述的单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域，其中所述整联蛋白是αIIbβ3。

57.权利要求55所述的单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域，其中所述整联蛋白结合环C端序列包括HKGPAT。

58.权利要求55所述的单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域，其中所述整联蛋白结合环通过至少一个分子间二硫键加以稳定。

59.权利要求55所述的单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域，其中所述单体解联蛋白或解联蛋白结构域来自contortrostatin。

60.权利要求59所述的单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域，其中所述单体解联蛋白或解联蛋白结构域包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

61.权利要求55所述的单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域，其是vicrostatin(SEQ ID NO：5)。

62.权利要求55所述的单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域，其是基本上纯的。

63.一种抑制表达整联蛋白受体的细胞和一种或多种选自αIIbβ3、αvβ3、αvβ5或α5β1的整联蛋白之间的结合的方法，所述整联蛋白受体对选自αIIbβ3、αvβ3、αvβ5或α5β1的一种或多种整联蛋白具有特异性，所述的方法包括使所述细胞和权利要求55的单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域接触。

64.权利要求63所述的方法，其中所述的整联蛋白受体是玻连蛋白受体。

65.一种体内抑制血小板聚集、细胞生长、细胞粘附、转移或新血管形成的方法，所述的方法包括向需要此类治疗的个体施用有效量的权利要求55的单体解联蛋白或单体解联蛋白结构域。

66.转化的原核宿主，其通过权利要求1所述的方法获得。

67.融合蛋白，其通过权利要求24所述的转化细胞获得。

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