MXPA05003006A - Metodos para la preparacion, aislamiento y purificacion de epotilona b y estructuras cristalinas de rayos x y de epotilona b. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos mejorados para la produccion, aislamiento y purificacion de la epolitona B. Estos metodos incluyen, por ejemplo, un procedimiento de fermentacion para la produccion de la epolitona B, el aislamiento via de la absorcion en una resina y la purificacion subsecuente.

Description

METODOS PARA LA PREPARACION, AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE EPOTILONA B Y ESTRUCTURAS CRISTALINAS DE RAYOS X DE EPOTILONA B Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos mejorados para la producción, aislamiento y purificación de epotilona B. Estos métodos incluyen, por ejemplo, un procedimiento de fermentación para la producción de. epotilona B, el aislamiento por medio de la adsorción en una resina y la purificación subsecuente. Antecedentes de la Invención Las epotilonas son una clase relativamente nueva de compuestos de macrólidos que se obtuvieron originalmente mediante la fermentación de mixobacterias {Sorangium cellulosum) . Estos compuestos se investigaron inicialmente como agentes protectores de plantas debido a sus propiedades antifungales . Las epotilonas entonces se volvieron de interés debido a su actividad citotóxica sobre células de animales y se caracterizaron subsecuentemente como agentes de polimerización de tubulina. Ahora se sabe que las epotilonas ejercen efectos de estabilización de microtúbulos similares al paclitaxel (TAX0LMR) y actividad citotóxica contra células que proliferan rápidamente, tales como células tumorales u otra enfermedad celular, hiperproliferativa . El uso de REF : 162185 epotilonas como agentes quimioterapéuticos se describe en Bollag y colaboradores, Cáncer Research 55, 2325, 1995. Las epotilonas A y B (epo A o epo B, respectivamente) tienen las estructuras, Epotilona A R=H Epotilona B R=Me Un esquema de reacción para obtener las epotilonas fue revelado por Hófle y colaboradores, en la patente O 93/10121. Hófle cultivó una cepa de Sorangium cellulosum en un medio que contenia fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y sales minerales. Se utilizó una resina adsorbedora durante el cultivo de la cepa. Las epotilonas se eluyeron con un solvente de la resina absorbente. Las diversas epotilonas se separaron mediante la cromatografía de fase inversa y se cristalizaron. Sin embargo, Hófle y colaboradores reconocieron que este método solo produjo una baja cantidad de la epotilona B, y también que la relación de la epotilona B con la epotilona A en la fermentación fue baja. Esta baja relación de la epotilona B con referencia a la epotilona A hace difícil la recuperación de la epotilona B pura. De esta manera, existe la necesidad en el campo por métodos mejorados de fermentación para producir la epotilona B preferiblemente que la epotilona A y por métodos mejorados de aislamiento y purificación de la epotilona B. Breve Descripción de la Invención La presente invención se dirige a un procedimiento de fermentación mejorado para la producción de la epotilona B. Además, en la presente invención se incluyen nuevas cepas de Sorangíum cellulosum obtenidas mediante la mutagénesis para la producción de epotilonas . También se incluyen en la presente invención métodos para mejorar la relación de la epotilona B con referencia a la epotilona A producida mediante la nueva cepa de Sorangium cellulosum al proporcionar un aditivo a la fermentación. En una modalidad preferida, el aditivo es propionato, ácido propiónico con ajuste apropiado de pH u otro precursor de propionato. También se incluye en la presente invención un procedimiento de extracción mejorado para el aislamiento de la epotilona B del medio de fermentación utilizando una resina. Además, están incluidos métodos para lavar la resina con alto contenido de epotilona para reducir los niveles de impurezas y para mejorar el procesamiento corriente abajo. También se incluye en la presente invención un procedimiento mejorado para la purificación de la epotilona B. En una modalidad, la purificación se logra utilizando la cristalización. En otra modalidad, la purificación se logra por métodos cromatograficos que incluyen la cromatografía de fase normal o la cromatografía de fase inversa. En todavía otra modalidad, la purificación se logra por medio de una combinación de la cristalización y la purificación de las muestras mediante la cromatografía, que incluye la cromatografía de fase normal e inversa. En una modalidad adicional, el extracto de la resina se procesa mediante la cristalización únic mente. La epotilona B ("epo B") es útil como un producto intermediario en la preparación del derivado 1 ("DI"), (como se describe en la patente norteamericana No. 6,262,094, incorporada en este texto a manera de referencia) , donde el grupo 2 -metilo en el anillo de tiazol es sustituido por una amina : Derivado 1 La epotilona B también es útil en la preparación del derivado 2 ("D2") (esta conversión de la lactona de la epotilona B a la lactama del derivado 2 es descrita por Borzilleri y colaboradores, J. Amer. Chem. Soc. 122, 8890, 2000, y en la patente WO 99/02514, incorporadas en este texto a manera de referencia) : Derivado 2 Además, la epotilona B ("epo B") es útil para la preparación del derivado 3 (epotilona D, "D3") (como se describe en la patente norteamericana No. 6,320,045, incorporada en este texto a manera de referencia) : Derivado 3 Además, en la invención se incluyen formas cristalinas de la epotilona B producida utilizando los métodos y materiales descritos en este texto. Se debe entender que tanto la descripción general, anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplares, pero no restrictivas, de la invención.

Breve Descripción de las Figuras Las ventajas, la naturaleza y las diversas características de la invención pueden manifestarse más completamente con la consideración de las figuras anexas. En las figuras: La figura 1 muestra la estructura molecular en la célula unidad, monoclínica de la forma epoB-??ß, con dos moléculas de epotilona B y dos moléculas de acetato de etilo en el canal imitado de la célula unidad, monoclinica. La figura 2 muestra la estructura molecular en la célula unidad, monoclínica de la forma epoB-? ß, con dos moléculas de epotilona B y dos moléculas de acetonitrilo en el canal huésped de la célula unidad, monoclínica. La figura 3 muestra la estructura molecular en la célula unidad, monoclínica de la forma epoB-??ß, con dos moléculas de epotilona B y dos moléculas de isopropanol en el canal huésped de "la -célula unidad, monoclínica. La figura 4 muestra la estructura molecular en la célula unidad, monoclínica de la forma epoB-??ß, con dos moléculas de epotilona B y dos moléculas de tolueno en el canal huésped de la célula unidad, monoclínica. La figura 5 muestra los patrones PXRD observados (parte superior y simulados (parte inferior) para el solvato de acetato de etilo (forma cristalina de epoB-??ß) de la epotilona B. En la figura 5, el patrón simulado se calculó a partir de parámetros atómicos, refinados en la estructura cristalina, monoclínica a -33 °C y el patrón observado se midió a +23 °C. La figura 6 muestra los patrones PXRD observados (parte superior) y simulados (parte inferior) para el solvato de tolueno (forma cristalina de epoB-??ß) de la epotilona B. En la figura 6, el patrón simulado se calculó a partir de parámetros atómicos, refinados en la estructura cristalina, monoclínica a -33°C y el patrón observado se midió a +23°C. La figura 7 muestra los patrones PXRD observados (parte superior) y simulados (parte inferior) para el solvato de acetonitrilo (forma cristalina de epoB-??ß) de la epotilona B. En la figura 7, el patrón simulado se calculó a partir de parámetros atómicos, refinados en la estructura cristalina, monoclínica a -40°C y el patrón observado se midió a +23 °C. La figura 8 muestra los patrones PXRD observados (parte superior) y simulados (parte inferior) para el solvato de alcohol isopropílico (forma cristalina de epoB-??ß) de la epotilona B. En la figura 8, el patrón simulado se calculó a partir de parámetros atómicos, refinados en la estructura cristalina, monoclínica a -3°C y el patrón observado se midió a +23°C. La figura 9 muestra un patrón PXRD observado para un solvato de grado primario que contiene tolueno de la epotilona B producido siguiendo el método descrito en el e emplo 7, paso A. La figura 10 muestra el análisis térmico (DSC y TGA) para el solvato de grado primario que contiene tolueno de la figura . La figura 11 muestra un patrón PXRD observado para el solvato recristalizado que contiene tolueno de la epotilona B, producido siguiendo el método descrito en el ejemplo 7, para B. La figura 12 muestra el análisis térmico (DSC y TGA) para el solvato recristalizado que contienen tolueno de la figura 11. La figura 13 muestra el patrón PXRD observado para el solvato que contiene acetato de etilo de la epotilona B, producido siguiendo el método descrito en el ejenplo 7, paso C. La figura 14 muestra el análisis térmico (DSC y TGA) para el solvato que contiene acetato de etilo de la figura 13. La figura 15 muestra un patrón PXRD observado (parte superior) para el solvato que contiene tolueno preparado siguiendo el método descrito en el e emplo 7C, junto con un patrón PXRD simulado (parte inferior) para el solvato de tolueno de la epotilona B a temperatura ambiente. La figura 16 muestra el análisis térmico (DSC y TGA) para el solvato que contiene tolueno de la figura 15.

Se debe entender que estos dibujos tienen el propósito de ilustrar los conceptos de la invención y no son de naturaleza limitante. En cada una de las figuras 1 hasta 4, todos los átomos de hidrógeno de metilo y metileno de la epotilona han sido omitidos por claridad. En las figuras 1-4, los enlaces intermoleculares de hidrógeno se muestran en las porciones derecha inferior e izquierda superior de los diagramas como varillas de trazos y las distancias de enlaces de H (Angstroms) designan las distancias intermoleculares de oxígeno-oxígeno. Descripción Detallada de la Invención La presente invención describe métodos de procedimientos específicos y cepas mutantes, novedosas de Sorangium cellulosum, los cuales, juntos o por separado, producen fermentaciones con concentraciones mejoradas de la epotilona B, principalmente mediante la reducción de la cantidad relativa de la epotilona A producida durante la fermentación. Las células de Sorangium cellulosum u otros microorganismos apropiados son, por ejemplo, expandidas a través de uno o más cultivos en etapas de desarrollo iniciales y se utilizan para proporcionar un inoculo para las fermentaciones productoras de epotilona. Durante las primeras horas de fermentación, por ejemplo alrededor de 24-72 horas, ocurre el desarrollo celular ya que las células utilizan nutrientes en el medio. Después, los nutrientes, tales como vitaminas, minerales, carbohidratos y aminoácidos (u otras fuentes de carbono o nitrógeno, tales como precursores de aminoácidos) , se adicionan al medio en una cantidad favorable para la producción de epotilonas . En una modalidad, los nutrientes, tales como vitaminas, minerales, carbohidratos y aminoácidos, se adicionan en una cantidad que mantiene la velocidad de producción máxima de la epotilona A o la epotilona B durante la fermentación. En una modalidad, la velocidad de producción máxima de la epotilona A o la epotilona B es una velocidad de producción en la cual se produce una mayor cantidad de la epotilona A o la epotilona B en comparación con aquella producida sin la adición de aditivos o nutrientes o también da por resultado una mayor velocidad de producción que la que ocurriría si los aditivos o nutrientes se adicionaran en una cantidad que es menor a aquella óptima. Durante la fermentación, se adiciona ácido propiónico, un precursor del mismo o una sal del mismo, en una cantidad efectiva para incrementar la relación de la epotilona B con referencia a la epotilona A (la "relación de producto") . La presente invención también se dirige a nuevas cepas de Sorangium cellulosum, las cuales son útiles en la preparación de las epotilonas. Estas nuevas cepas, particularmente la cepa SC16408, se han obtenido mediante la mutagénesis seguida por la selección aleatoria.

La cepa Sorangium cellulosum fue aislada primero de una muestra de tierra colectada de los bancos del río Zambesi en Africa del sur en 1985. El organismo fue descrito primero para la producción de las epotilonas por Hófle y colaboradores (citado anteriormente) . La cepa utilizada por Hófle y colaboradores fue designada So ce90, y está depositada en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Germán Collection of Microorganisms , DS ) bajo el número de depósito 6773. La cepa So ce90 se sujetó a la mutagenesis de radiación UV seguida por la selección aleatoria para generar la cepa So ce90B2. La cepa So ce90B2 (también designada SC16224) produjo títulos de epotilona B en matraces de agitación (que contenían por ejemplo 1.8% p/v de resina por matraz) de aproximadamente 50 mg/L o 2.8 mg/g de resina (lo cual puede variar, por ejemplo, de 3.5 o 4.5 mg/g) y una relación de epotilona B/A de aproximadamente 0.6. En la presente invención, la cepa So ce90B2 o un derivado de la misma se sujetó a la mutagenesis con nitrosoguanidina (NTG) , seguida por la selección aleatoria para producir las cepas SC16408 (la cual está depositada como ATCC No. PTA-3880) y SC16449 (la cual está depositada como ATCC No. PTA-3881) . Estas últimas dos cepas han sido depositadas en the American Type Culture Collection como depósitos de patente conforme al tratado de Budapest. Los detalles del procedimiento de selección se exponen en los ej emplos . La presente invención proporciona, en una modalidad, cepas de Sorangium cellulosum que producen (por ejemplo, bajo condiciones de producción definidas posteriormente) al menos aproximadamente 100 mg de la epotilona B por litro de volumen de caldo. En otra modalidad, la invención proporciona cepas que producen, bajo condiciones de producción comparativas de epotilona B, al menos 80 mg de la epotilona B por litro de volumen de caldo y una relación de epotilona B con relación a la epotilona A de al menos 1. La presente invención proporciona, en una modalidad, cepas que producen 5 mg de epotilona B/g de resina de epotilona B o 5 mg/g de resina en una relación de epotilona B/A de al menos 1.0. En otra modalidad, la relación de epotilona B/A es al menos 1.5.. En todavía otra modalidad, la relación de epotilona B/A es 1.5 a 4.0. La presente invención también se dirige a métodos para mejorar la relación de la epotilona B con A producida por Sorangium cellulosum mediante la alimentación de un aditivo en la fermentación. En las modalidades preferidas, el aditivo comprende propionato, adicionado después de que las células se han desarrollado durante hasta 96 horas, pero preferiblemente a aproximadamente 24-48 horas. En algunas modalidades preferidas, las células se desarrollaron durante aproximadamente 34 horas antes de que se adicionara el propionato. Los primeros estudios por GBF investigaron, entre otros factores que influyen en la fermentación, el efecto de una adición en una ocasión de propionato al medio a un nivel de 0.1% para un mejoramiento creciente en la relación de epotilona B/epotilona A (B/A) . Los inventores han descubierto en la presente, sorprendentemente, y es una de las características de la presente invención, que los títulos de las epotilonas, en particular la epotilona B, y la relación de B/A producida en los matraces de agitación, fermentadores de 14 litros y fermentadores de producción, se mejoraron marcadamente por la alimentación de propionato o propionato sódico. La alimentación de propionato o propionato sódico produce un mejoramiento significante de los títulos de la epotilona B. Por ejemplo, la producción en matraz de la epotilona B se mejoró mediante el complemento con propionato sódico dentro de un rango preferido, monitoreado en el cultivo, de 0.05 a 0.80 mg/mL (0.005-0.08%) periódicamente (por ejemplo, al día) una vez que se inició la alimentación, más preferiblemente dentro de un rango de 0.005-0.04%. En una modalidad, la cantidad de propionato en el cultivo se fija como objetivo a 0.02% o menos. Además, también se descubrió que otros compuestos relacionados con el propionato que incluyen, pero no están limitados a, éster metílico de ácido propiónico y éster etílico de ácido propiónico, mejoran la producción de la epotilona B y, subsecuentemente, la relación de B/A. En una modalidad, particularmente útil para las fermentaciones en un matraz, se agrega una alimentación adicional que contiene una mezcla de fosfato monobásico y dibásico, con la relación seleccionada para soportar un pH apropiado. Esta alimentación se puede incorporar en una alimentación de propionato o se puede adicionar por separado. En la presente invención, se describe un método de purificación de epotilona a gran escala, el cual utiliza exitosamente la adición de resina. Se descubrió que la inclusión de resina es útil en el aislamiento y purificación de las epotilonas, y también que mejora dramáticamente los títulos de epotilona. En una modalidad preferida de la presente invención, la resina es una resina polimérica de estireno/divinilbenceno , tal como una resina XAD, preferiblemente XAD-16 o el equivalente (disponible como AmberliteMR XAD-16 de Sigma-Aldrich, St . Louis, MO o Rohm and Haas Co., Filadelfia, PA) . Otras resinas AmberliteMR con superficies hidrófobas, tales como XAD-4, XAD-1180 o XAD-1600 a base de agua (Rohm y Haas Co.) también puede ser útiles en la invención, asi como también resinas, tales como XD-207, HP20, HP21, SP825, SP850, SP700 o SP207 a base de estireno (la cual es más hidrófoba debido a grupos bromuro adicionados) (estas resinas son de Mitsubishi, Tókyo, Japón o Mitsubishi Chemical America, Inc., White Plains, ??) . La resina se puede incorporar en el medio dentro de un amplio rango, tal como 0.2% p/v a 5.0% p/v y preferiblemente 1.5% p/v a .0% p/v. La resina que contiene epotilonas de la fermentación se lava opcionalmente con agua y ya sea 20-30% de acetonitrilo acuoso o metanol acuoso para remover las impurezas polares o con una solución que contiene detergente, preferiblemente un detergente iónico, tal como un detergente a base de sulfato de alquilo y una cantidad de una amina (adicionada a la solución en una forma básica) . Las cantidades se seleccionan para- mejorar la calidad del extracto de epotilona obtenido después de la resina. Un lavado acuoso, preferido utiliza 0.5% p/v de dodecil-sulfato de sodio y 0.5% p/v de amoníaco. En esta última modalidad, antes de la extracción del solvente, la resina se lava preferiblemente una o más veces con agua. La resina que contiene epotilonas de la fermentación se extrae preferiblemente con un solvente que es inmiscible con (separa las fases de) una fase acuosa, tal como acetato de etilo o éter metil - t-butílico (MTBE) , para remover la epotilonas adsorbidas en la resina. Los solventes adicionales que pueden ser útiles para extraer la epotilona B incluyen n-butanol, acetato de isopropilo, acetato de n-propilo, acetato de n-butilo y acetato de t-butilo. El extracto de solvente abundante es concentrado preferiblemente y la epotilona B es cristalizada del producto concentrado. En una modalidad, el solvente abundante se lava con agua y el solvente abundante lavado con agua se concentra y se pasa por un filtro abrillantador opcionalraente . Cuando el solvente es adecuado, como lo es el acetato de etilo, la epotilona B es cristalizada al realizar un intercambio de solventes destilatorios en un anti-solvente . En otras palabras, un segundo solvente con un punto de ebullición relativamente alto en el cual es esencialmente insoluble, la epotilona B se adiciona al solvente abundante y el solvente abundante se destila a un grado suficiente para permitir la cristalización. Se puede utilizar el vacio para impulsar o facilitar la destilación. En una modalidad, el solvente se concentra y se utiliza una cantidad adecuada de anti-solvente. Los anti-solventes útiles incluyen tolueno, hexanos y heptanos. La suspensión espesa, resultante se puede calentar y enfriar a una temperatura establecida que se selecciona para mejorar la calidad de los cristales resultantes . Las oscilaciones de temperatura se pueden utilizar para mejorar la pureza del cristal, para minimizar los finos y para producir una suspensión espesa que se filtra más rápido. Para algunos otros solventes, tales como MTBE, la concentración destilatoria del solvente abundante produce un ambiente de cristalización efectivo con el enfriamiento (sin el uso de un anti-solvente) . Los cristales resultantes se filtran preferiblemente para producir una epotilona B de grado primario . Durante la extracción y la cristalización inicial, la epotilona B se separa de la mayoría de impurezas presentes en el extracto inicial, especialmente la epotilona A. La epotilona B de grado primario contiene típicamente la epotilona A como una impureza mayor. También están presentes típicamente dos impurezas estructuralmente similares derivadas de la fermentación, específicamente el siguiente análogo de oxazol y al análogo de etil-tiazol: Oxazol Etil-tiazol Subsecuentemente, los métodos de purificación aplicados (que incluyen los pasos de recristalización y cromatografía) descritos en este texto para la epotilona B involucran, entre otras cosas, la remoción de estos dos compuestos a un nivel donde ya no se consideran significantes . La epotilona B de grado primario (es decir, la forma cristalina que contiene tolueno epo B, grado primario) , obtenida preferiblemente como se describiera anteriormente, entonces se puede recristalizar mediante el calentamiento en acetato de etilo seguido por la adición de tolueno con calentamiento continuo. La mezcla entonces se enfría, la suspensión espesa, cristalina, resultante se filtra y la torta se lava con tolueno para proporcionar la epotilona B una vez recristalizada (es decir, la forma cristalina que contiene tolueno de epo B, recristalizada) Alternativamente, la epotilona B de grado primario se puede procesar a través de un paso de cromatografía de fase inversa de alta resolución, preparativa (por ejemplo, en RP/C-18 en la forma de una columna) como se expone en los ejemplos. Opcionalmente, antes de cargar la muestra de epotilona en la columna, se adiciona un volumen anterior de un solvente orgánico, adecuado, o una mezcla se solventes orgánicos, para reducir la precipitación de la epotilona. En una modalidad, el solvente orgánico es uno tal como sulfóxido de dimetilo (DMSO) . Opcionalmente, se adiciona un volumen posterior de un solvente orgánico, adecuado o una mezcla de solventes orgánicos para reducir la precipitación de la epotilona. Las epotilonas entonces son eluidas con un solvente orgánico, adecuado, o una mezcla de solventes orgánicos o una solución acuosa de un solvente orgánico. En una modalidad, las epotilonas son eluidas con una mezcla de acetonitrilo y agua. El perfil de elusión ue utiliza estos solventes puede ser, por ejemplo, lineal o gradiente, y se selecciona para obtener bajos niveles de impurezas. Las fracciones que contienen la epotilona B de pureza deseada se reúnen, se concentran y se extraen con un solvente que incluye, pero no está limitado a, acetato de etilo. Los extractos de solvente abundante entonces se concentran y se cristalizan, por ejemplo, mediante la adición de un solvente de baja polaridad, tal como n-heptano o heptanos, y se enfría opcionalmente . La suspensión espesa se filtra, se lava con solvente/anti - solvente (en una relación y cantidad seleccionadas para no disolver cantidades significantes de la epotilona B) , tal como acetato de etilo/n-heptano en una relación de 2:1. Los cristales lavados se secan para producir la epotilona B de alta calidad . Se pueden utilizar otros métodos de purificación, tales como la cromatografía en fases normales, tales como sílice, o fases normales a base de sílice y similares. Por ejemplo, se puede utilizar la cromatografía de fase normal de alta resolución. Se pueden cargar muestras en la columna en un solvente de polaridad relativamente baja, tal como cloruro de metileno y las epotilonas eluidas con solvente de polaridad superior, tal como una mezcla de acetato de etilo y heptano. El perfil de elusión utilizando estos solventes puede ser, por ejemplo, lineal o gradiente y se selecciona para obtener bajos niveles de impurezas. Las fracciones deseadas se reúnen, se concentran y se cristalizan, por ejemplo, de acetato de etilo mediante la adición de solventes de baja polaridad, tales como n-heptano, heptanos o tolueno. La suspensión espesa se filtra, se lava con solvente/ ant i - solvente (en una relación y cantidad seleccionadas para no disolver cantidades significantes de la epotilona B) , tales como acetato de etilo/n-heptano en una relación 2:1 o acetato de etilo/ tolueno . Los cristales lavados se secan para producir la epotilona B de alta calidad. En ciertos casos, donde no se requiere la remoción extensiva de los análogos de etil-tiazol u oxazol, tal como en la síntesis de DI, la epotilona B se puede purificar mediante la cristalización sola. El material sólido de epotilona B se disuelve, por ejemplo, en acetato de etilo caliente y se cristaliza (o recristaliza) mediante el enfriamiento a temperatura ambiente o una temperatura inferior, seguido por la filtración y el secado (por ejemplo, in vacuo) . Las cristalizaciones se pueden repetir para obtener la pureza deseada, tal como 2 a 3 veces. El medio de desarrollo para cultivar el microorganismo productor de epotilona se puede formular, por ejemplo, como sigue: Ingrediente Preferido Más Todavía Más (g/L) Preferido Preferido (g/L) (g/L) Leche Descremada 0.5-12 1-8 2-6 en Polvo Harina de 0.5-12 1-8 2-6 Nitrosoya Tostada1 Tastona - 1541 0.5-12 1-6 1-4 Maltrin-M0401 4-18 6-14 8-12 CaCl2-2H20 0.2-2.4 0.4-1.6 0.8-1.2 MgS04'7H20 0.2-2.4 0.4-1.6 0.8-1.2 Sal de EDTA, FelII, Na 0.002-0.02 0.004-0.016 0.006-0.014 HEPES 6-20 8-16 10-14 Glicerol 0.5-12 1-8 2-6 También se han utilizado intercambiablemente otras leches descremadas, harinas de soya, extractos de levadura y almidones MaltrinMR con resultados comparables . El medio de producción para el desarrollo del microorganismo productor de epotilona y para la producción de epotilonas, especialmente en matraces de agitación, se puede formular, por ejemplo, como antes con la siguiente diferencia con respecto al glicerol y la siguiente adición de resina: Una solución de alimentación de nutrientes útil, especialmente para el uso en matraces de agitación, comprende : Esta alimentación de nutrientes puede contener además una mezcla de fosfato sódico dibásico y fosfato monosódico, como sigue: La relación de fosfato disódico con referencia a fosfato monosódico se selecciona para minimizar la desviación del pH del cultivo lejos del pH deseado con la adición de la alimentació .

Para el uso en los fermentadores, los componentes de nutrientes descritos anteriormente, con la excepción de HEPES, el cual es suprimido preferiblemente, se pueden utilizar preferiblemente con un agente antiespumante, (por ejemplo, de Dow Corning, AF Emulsión, Food Grade) adicionado como sigue: Se puede adicionar sosa cáustica (solución de hidróxido de sodio o potasio) al medio de fermentación como sea necesario para mantener un rango de pH útil. La resina se puede adicionar como sigue: En la fermentación de producción, el propionato y los nutrientes se adicionan preferiblemente por separado, como sea necesario. La alimentación de propionato puede comprender, por ejemplo, de 80 a 150 g/L de propionato sódico, con la cantidad adicionada más preferiblemente para mantener (por ejemplo, determinada mediante la CLAR) los niveles de propionato de 0.05 a 0.20 mg/mL. La adición de propionato se puede iniciar 20-40 horas después de la adición del cultivo de semilla en el fermentador . Los nutrientes son complementados, por ejemplo, con una solución madre, alimentadora, estéril como sigue: Para las fermentaciones a largo plazo, los nutrientes adicionales se agregan preferiblemente, por ejemplo, de la siguiente solución madre, alimentadora, estéril, la cual se agrega en un volumen superior en comparación con la solución madre, alimentadora, anterior: Estos nutrientes de las dos alimentaciones anteriores se pueden seleccionar para evitar el inicio de una fase de desarrollo.

La presente invención incluye procedimientos para la producción de la epotilona B, en donde la epotilona B ("epo B" ) se convierte al derivado 1 ("DI") como se describe en la patente norteamericana No. 6,262,094, incorporada en este texto a manera de referencia) , que tiene la siguiente fórmula: Derivado 1 La presente invención también incluye procedimientos para la producción de la epotilona B, en donde la epotilona B se convierte al derivado 2 ("D2") (descrito por Borzilleri y colaboradores, J. Amer. Chem. Soc. 122, 8890, 2000 y en la patente O 99/02514, incorporadas en este texto a manera de referencia), que tiene la fórmula: Derivado 2 La presente invención además incluye procedimientos para la producción de la epotilona B, en donde la epotilona B ("epo B") se convierte al derivado 3 (epotilona D, WD3") (como se describe en la in patente norteamericana No. 6,320,045, incorporada en este texto a manera de referencia), que tiene la siguiente fórmula: Derivado 3 Formas cristalinas de la epotilona B Los solicitantes también han hecho varias formas cristalinas de la epotilona B utilizando los métodos inventivos y materiales descritos en este texto. Los cristales de epotilona B se han obtenido utilizando diferentes solventes y sistemas de solventes. Por ejemplo, los solicitantes han descubierto una forma cristalina, solvatada de la epotilona B que contiene tolueno, designada en este texto como epoB-??ß, que tiene los datos de células unidad reportados posteriormente en la tabla 1. La forma cristalina, solvatada que contiene tolueno de la epotilona B se ilustra adicionalmente con las figuras 9 hasta 12 y las figuras 15 y 16, en este texto. Los solicitantes también han obtenido cristales de epotilona B utilizando acetonitrilo (es decir, epoB-??ß) , acetato de etilo (es decir, epoB-Ea ) y alcohol isopropílico (es decir, epoB-??ß) , así como también los sistemas de solventes descritos posteriormente en los ejemplos. Estas formas isoestructurales cristalográficamente tienen una estructura clatrada, monoclínica con un grupo separador P2X que contiene canales de solvente lipofílicos que se extienden a lo largo del eje b por todos los cristales (1 canal/célula unidad) . Cada canal puede contener hasta dos moléculas de solvente, tal como tolueno, acetonitrilo , acetato de etilo, alcohol isopropílico o MTBE (lo que da por resultado idealmente solvatos de epotilona B 1:1) . La cristalización de mezclas de solventes de tolueno/acetato de etilo (por ejemplo, una mezcla 1:1) da por resultado la incorporación preferencial de tolueno en canales clatrados (es decir, la obtención de la forma epoB-??ß, no epoB-??ß) . Ambos donadores de enlaces de hidrógeno de la epotilona (hidroxilos) están involucrados en los enlaces de hidrógeno interepotilona y no son disponibles para unirse, restringir, a los solventes hospederos. Las formas epoB-??ß, epoB-??ß, epoB-??ß y epoB-??ß exhiben los datos de células unidad presentados en la tabla I. Las condiciones de cristalización para obtener estas formas de cristales que contienen tolueno, acetonitrilo, acetato de etilo e isopropanol se presentan posteriormente en los ejemplos. Los patrones PXRD para los cristales preparados utilizando los métodos descritos en el ejemplo 7 se exponen en las figuras 9, 11 y 13, también descritas adicionalmente más adelante. Los parámetros ejemplares, específicos, tabulados para estas formas cristalinas son como sigue y se muestran en la tabla 1: Los coordinados atómicos, fracciónales para epoB-??ß, epoB-??ß, epoB-??ß y epoB-??ß se muestran en las tablas 2 , 3, 4 y 5, respectivamente. Los patrones PXRD expuestos en las figuras 9, 11 y 13 son caracterizados por los datos listados en las tablas 6, 7 y 8, posteriormente.

TABLA 1 Datos de células unidades Densidades ideales calculadas, asumiendo una ocupación de solvente 1:1.

TABLA 2 Coordinados Atómicos, Fracciónales para el Solvato de Acetonitrilo de la Epotilona B, Forma epoB-??ß (la mayoría de átomos de hidrogeno han sido omitidos) Atomo X Y Z Cl 0.4422 0.2380 0.3076 C2 0.5619 0.2882 0.3165 C3 0.6422 0.1833 0.3013 C4 0.7565 0.2263 0.2807 C5 0.8531 0.2847 0.3800 C6 0.8409 0.4180 0.4193 C7 0.8968 0.4218 0.5419 C8 0.8360 0.3345 0.5975 C9 0.7205 0.3935 0.6018 CIO 0.6345 0.2947 0.6184 Cll 0.5287 0.3609 0.6355 C12 0.4328 0.2722 0.6397 C13 0.3118 0.2674 0.5573 C14 0.2626 0.3435 0.4562 C15 0.2748 0.2789 0.3613 016 0.3977 0.3084 0.3684 C16 0.7197 0.3194 0.1878 C17 0.8080 0.1051 0.2508 C18 0.9083 0.5112 0.3717 C19 0.9258 0.3048 0.7095 C20 0.4763 0.1572 0.7109 C21 0.1833 0.3270 0.2580 C22 0.1927 0.4656 0.2359 C23 0.1008 0.2458 0.1993 C24 -0.0043 0.2676 0.1034 C25 -0.0708 0.1728 0.0409 C26 -0.1519 0.3799 -0.0163 C27 -0.2252 0.4942 -0.0664 S -0.1936 0.2297 -0.0595 10 N -0.0507 0.3873 0.0719 01 0.3897 0.1501 0.2552 02 0.6748 0.1045 0.3926 05 0.9464 0.2278 0.4266 07 0.8893 0.5485 0.5778 15 012 0.3313 0.3359 0.6550 H3 0.5936 0.1283 0.2313 H6 0.7466 0.4426 0.3937 H7 0.9913 0.3942 0.5683 H8 0.8117 0.2471 0.5514 20 H13 0.2618 0.1794 0.5410 H15 0.2633 0.1778 0.3662 H30 0.6691 0.0154 0.3705 H70 0.9636 0.5994 0.5825 N27 0.4609 0.5049 0.0188 (acetonitrilo) 25 C28 0.3963 0.4080 0.0038 (acetonitrilo) C29 0.3379 0.2975 -0.0775 (acetonitrilo) TABLA 3 Coordinados Atómicos, Fracciónales para el Solvato de Acetato de Etilo de la Epot lona B, Forma epoB-??ß (la mayoría de átomos de hidrógeno han sido omitidos) Atomo X Y Z Cl 0.4400 0.2438 0.3107 C2 0.5605 0.2943 0.3190 C3 0.6416 0.1904 0.3056 C4 0.7559 0.2327 0.2857 C5 0.8532 0.2913 0.3822 C6 0.8410 0.4228 0.4212 C7 0.8957 0.4275 0.5404 C8 0.8319 0.3405 0.5928 C9 0.7164 0.4000 0.5966 CIO 0.6298 0.3042 0.6134 Cll 0.5231 0.3717' 0.6266 C12 0.4266 0.2844 0.6321 C13 0.3066 0.2780 0.5503 C14 0.2581 0.3526 0.4526 C15 0.2706 0.2867 0.3589 016 0.3940 0.3148 0.3668 C16 0.7203 0.3272 0.1940 C17 0.8079 0.1121 0.2559 C18 0.9092 0.5160 0.3757 C19 0.9227 0.3099 0.7056 C20 0.4667 0.1703 0.7040 C21 0.1800 0.3335 0.2576 C22 0.1887 0.4688 0.2331 C23 0.0962 0.2506 0.2011 C24 -0.0076 0.2687 0.1042 C25 -0.0762 0.1706 0.0472 C26 -0.1515 0.3743' -0.0242 C27 -0.2158 0.4821 -0.0821 5 -0.1923 0.2232 -0.0566 N -0.0487 0.3847 0.0652 01 0.3878 0.1559 0.2575 03 0.6749 0.1137 0.3972 06 0.9464 0.2337 0.4280 07 0.8889 0.5526 0.5755 012 0.3257 0.3484 0.6457 H3 0.5927 0.1346 0.2372 H6 0.7463 0.4478 0.3947 H7 0.9884 0.3992 0.5620 H8 0.8080 0.2533 0.5499 H13 0.2573 0.1911 0.5357 H15 0.2575 0.1863 0.3624 H30 0.6713 0.0150 0.3759 H70 0.9745 0.5994 0.5930 028 0.5242 0.5794 0.0077 (acetato de etilo) 031 0.4179 0.4326 0.0063 (acetato de etilo) C28 0.4731 0.5098 0.0256 (acetato de etilo) C29 0.4265 0.4705 0.0892 (acetato de etilo) C31 0.3610 0.3621 -0.0408 (acetato de etilo) C30 0.2548 0.3272 -0.0460 (acetato de etilo) TABLA 4 Coordinados Atómicos, Fracciónales para el Solvato de Alcohol Isopropílico de la Epotilona B, Forma epoB-??ß (la mayoría de átomos de hidrógeno han sido omitidos) Atomo X ? Z Cl 0.4418 0.2548 0.3104 C2 0.5609 0.3055 0.3186 C3 0.6429 0.2009 0.3049 C4 0.7565 0.2462 0.2851 C5 .0.8541 0.3018 0.3837 C6 0.8410 0.4357 0.4229 C7 0.8977 0.4390 0.5415 C8 0.8345 0.3493 0.5940 C9 0.7184 0.4107 0.5972 CIO 0.6325 0.3111 0.6156 Cll 0.5261 0.3793 0.6303 C12 0.4292 0.2892 0.6329 C13 0.3087 0.2842 0.5528 C14 0.2607 0.3630 0.4551 C15 0.2736 0.2932 0.3613 016 0.3950 0.3241 0.3669 C16 0.7179 0.3380 0.1935 C17 0.8084 0.1250 0.2541 C18 0.9098 0.5290 0.3774 C19 0.9269 0.3222 0.7069 C20 0.4742 0.1736 0.7031 C21 0.1807 0.3387 0.2590 C22 0.1879 0.4780 0.2352 C23 0.1028 0.2530 0.2009 C24 -0.0041 0.2724 0.1029 C25 -0.0678 0.1712 0.0456 C26 -0.1517 0.3781 -0.0198 C27 -0.2289 0.4888 -0.0775 S -0.1896 0.2262 -0.0575 N -0.0526 0.3893 0.0653 01 0.3903 0.1657 0.2594 03 0.6763 0.1239 0.3954 05 0.9485 0.2459 0.4293 07 0.8898 0.5642 0.5781 012 0.3283 0.3539 0.6476 H3 0.5946 0.1457 0.2365 H6 0.7464 0.4597 0.3977 H7 0.9915 0.4115 0.5668 H8 0.8111 0.2625 0.5504 H13 0.2582 0.1971 0.5380 H15 0.2640 0.1927 0.3679 H30 0.6731 0.0260 0.3733 H70 0.9599 0.6223 0.5696 028 0.4344 0.2122 0.0495 (alcohol isopropílico) C28 0.3601 0.2863 -0.0462 (alcohol isopropílico) C30 0.4351 0.3798 -0.0762 (alcohol isopropílico) C29 0.2460 0.3279 -0.0487 (alcohol isopropílico) TABLA 5 Coordinados Atómicos, Fracciónales para el Solvato de Tolueno de la Epotilona B, Forma epoB-??ß (la mayoría de átomos de hidrógeno han sido omitidos) Atomo X Y Z Cl 0.4314 0.2211 0.3158 C2 0.5581 0.2739 0.3228 C3 0.6395 0.1704 0.3110 C4 0.7506 0.2081 0.2888 C5 0.8509 0.2746 0.3880 C6 0.8414 0.4043 0.4212 C7 0.8976 0.4053 0.5382 C8 0.8372 0.3234 0.5911 C9 0.7204 0.3812 0.5930 CIO 0.6312 0.2790 0.6075 Cll 0.5255 0.3494 0.6227 C12 0.4302 0.2588 0.6250 C13 0.3014 0.2537 0.5473 C14 0.2538 0.3361 0.4501 C15 0.2643 0.2640 0.3626 016 0.3877 0.2964 0.3648 C16 0.7158 0.3123 0.2026 C17 0.8082 0.0907 0.2610 C18 0.9061 0.4961 0.3806 C19 0.9323 0.2951 0.6989 C20 0.4703 0.1447 0.6945 C21 0.1702 0.3170 0.2598 C22 0.1709 0.4486 0.2391 C23 0.0898 0.2230 0.2030 C24 -0.0145 0.2462 0.1060 C25 -0.0811 0.1430 0.0546 C26 -0.1432 0.3561 -0.0251 C27 -0.2089 0.4563 -0.0926 S -0.1987 0.1985 -0.0555 N -0.0507 0.3632 0.0580 01 0.3838 0.1303 0.2676 03 0.6742 0.0956 0.3983 05 0.9468 0.2169 0.4313 07 0.8912 0.5329 0.5727 012 0.3254 0.3255 0.6408 H3 0.5816 0.1062 0.2496 H6 0.7457 0.4264 0.3944 H7 0.9919 0.3719 0.5628 H8 0.8141 0.2297 0.5521 H13 0. 2871 ' 0 .1529 0. 5221 H15 0. 2567 0 .1589 0. 3722 H30 0. 6633 -0.0002 0. 3785 H70 0. 9663 0 .5756 0. 5776 C28 0. 4258 0 .4317 0. 0030 (tolueno) C29 0. 3526 0 .3996 0. 0429 (tolueno) C30 0. 2586 0 .3239 0. 0126 (tolueno) C31 0. 2245 0 .2386 -0 .0713 (tolueno) C32 0. 2984 0 .2800 -0 .1182 (tolueno) C33 0. 3923 0 .3496 -0 .1016 (tolueno) C34 0. 5043 0 .4979 -0 .0119 (tolueno) TABLA 6 Datos de PX D para el Solvato que Contiene Tolueno de la Epotilona B, Producido Utilizando el Método del Ejemplo 7, Paso A y Mostrado en la Figura 9 Angulo de Intensidad Angulo de Intensidad difusión Separación-d Relativa difusión Separación-d Relativa (grado-2-theta) (A) (%) (grado-2-theta) (A) (%) 6.680 13.2212 48.5 20.720 4.2833 4.2 8.210 10.7604 2.1 21.320 4.1641 1.4 10.610 8.3312 2.2 21.890 4.0570 6.3 12.590 7.0251 4.3 24.200 3.6747 3.2 13.370 6.6169 25.8 24.500 3.6304 4.7 14.840 5.9646 1.9 24.800 3.5871 14.4 15.680 5.6469 0.9 26.150 3.4049 4.4 16.160 5.4802 2.3 26.870 3.3153 4.5 16.550 5.3520 2.9 28.370 3.1433 4.3 18.170 4.8783 5.0 29.930 2.9829 2.2 18.410 4.8152 10.6 30.890 2.8924 2.0 20.090 4.4162 100.0 31.400 2.8466 2.2 TABLA 7 Datos de PXRD para el Solvato que Contiene Tolueno de Epotilona B, Producido Utilizando el Método del EjempL Paso B y Mostrado en la Figura 11 Angulo de Intensidad Angulo de Intensidad difusión Separación-d Relativa difusión Separación-d Relativa (grado-2-theta) (A) (%) (grado-2-theta) (A) (%) 6.680 13.2212 62.1 20.720 4.2833 9.0 8.210 10.7604 3.4 21.320 4.1641 4.4 10.610 8.3312 6.9 21.890 4.0570 21.8 12.590 7.0251 8.1 24.200 3.6747 10.8 13.370 6.6169 26.9 24.500 3.6304 9.7 14.870 5.9526 5.9 24.800 3.5871 18.9 15.680 5.6469 3.7 26.150 3.4049 12.8 16.160 5.4802 4^5 26.900 3.3117 4.9 16.550 5.3424 9.1 28.340 3.1466 7.6 18.170 4.8783 20.3 29.960 2.9800 5.9 18.440 4.8075 28.2 30.950 2.8869 5.3 20.090 4.4162 100.0 31.400 2.8466 4.1 TABLA 8 Datos de PXRD para el Solvato que Contiene Acetato de Etilo de la Epotilona B, Producida Utilizando el Método del Ejemplo 7, Paso C y Mostrado en la Figura 13 Angulo de Separación-d Intensidad Angulo de Separación-d Intensidad difusión (A) Relativa difusión (A) Relativa (grado-2-theta) (%) (grado-2-theta) (%) 6.800 12.9881 26.2 20.720 4.2833 100.0 6.950 12.7082 32.5 22.610 3.9294 25.5 8.450 10.4553 4.0 24.470 3.6347 8.9 10.850 8.1474 9.4 24.860 3.5786 13.5 11.690 7.5638 2.8 25.190 3.5325 7.8 13.070 6.7681 11.6 26.120 3.4088 5.7 13.850 6.3887 10.2 26.600 3.3483 5.9 14.990 5.9053 4.7 27.050 3.2936 3.5 16.040 5.5210 5.4 27.530 3.2373 5.2 16.850 5.2574 11.0 28.850 3.0921 6.7 18.200 4.8703 13.5 29.090 3.0671 6.7 18.770 4.7237 16.9 30.020 2.9742 4.0 19.130 4.6356 14.3 30.320 2.9454 4.6 20.480 4.3330 72.2 30.740 2.9062 5.6 20.600 4.3080 71.6 31.220 2.8626 6.5 Definiciones Los siguientes términos tendrán, para los propósitos de esta solicitud, los significados respectivos expuestos a continuación: "Condiciones de producción comparativas de la epotilona B". Para medir la producción relativa de la epotilona B con relación a la epotilona A, o la producción neta de epotilona B entre las cepas, son necesarias condiciones estándar. Las "condiciones de producción comparativas de la epotilona B" se exponen a continuación. Se debe observar que las condiciones estándar se pueden aumentar a escala apropiadamente (por ejemplo, a matraces de producción de 125 mL de acuerdo con el ejemplo 2) como se describe en los ejemplos: 1) Etapa Fl : Un mL de un frasquito congelado o matraz de mantenimiento se transfiere a un matraz de 125 mL que contiene aproximadamente 10 mL del medio E (composición descrita posteriormente) . El matraz Fl se incuba durante 3-4 días a 30°C y 160 rpm. 2) Epata F2 : El contenido completo del matraz Fl (aproximadamente 10 mL) se transfiere (10%) a un matraz de 250 mL que contiene 90 mL del medio E. Este matraz F2 es incubado de manera similar durante 3-4 días a 30°C y 160 rpm. 3) Etapa de Producción: Los matraces de producción (matraces de 250 mL que contienen 90 mL del medio E, véase las formulaciones posteriores de los medios) se inoculan a un nivel de 10% (10 mL) de la etapa F2. Alternativamente, se pueden utilizar "matraces de mantenimiento", y estos se derivan de la transferencia rutinaria desde los matraces del cultivo cada 3-4 días a niveles que varían de 5% a 10%. La fase de producción incorpora al menos 15 g/L de resina. Una vez inoculados, los matraces de producción son incubados a 30°C y 160 rpm durante 14 días. Una alimentación es incorporada para mejorar la relación de epotilona B con A. Las adiciones de alimentación comienzan a 72 horas posteriores a la inoculación como sigue: Se adiciona un mL de alimentación por matraz de producción (volumen de cultivo de 100 mL) por día desde los días 3-11 con adiciones que continúan también hasta el día 14 donde se indica. La alimentación que contiene propionato contiene 10% de Maltrin-M040MR, 4% de propionato sódico y 3% de Tastone-154MR, de tal manera que cuando se adiciona como se describe en una dilución de 100 veces, la concentración final en el caldo de cultivo, al día, se vuelve 0.1% de Maltrin-M040MR, 0.04% de propionato sódico y 0.03% de Tastone-154MR (excluyendo los niveles residuales de las adiciones anteriores) . Los matraces se recolectaron generalmente para el ensayo 14 días después de la inoculación. El "precursor de ácido propiónico" se refiere a cualquier compuesto que se pueda adicionar a un cultivo apropiado en una cantidad efectiva para generar una cantidad de ácido propiónico que es efectiva para incrementar la relación de epotilona B con relación a epotilona A. El ácido propiónico se puede generar espontáneamente, por ejemplo, con ésteres lábiles a través de la acción de enzimas celulares. Aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo reconocerán los compuestos candidatos que se pueden someter a prueba fácilmente para generar ácido propiónico o para incrementar la relación de epotilona B con epotilona A. Los ejemplos incluyen ésteres metílicos y etílicos de ácido propiónico. Por "alimentación" se da a entender que al menos uno o más nutrientes o aditivos, tales como propionato, propionato sódico, una mezcla o solución que contiene propionato sódico, una vitamina, un mineral, una fuente de carbohidratos o una fuente de aminoácidos, se adiciona e más de una ocasión durante el curso de la fermentación, tal como, por ejemplo, periódicamente, por medio de una alimentación pulsátil, por vía de una alimentación sustancialmente continua y similares . Se debe entender que una alimentación continua a través de la fermentación es incluida dentro . del significado del término "adicionado en más de una ocasión" . "Que contiene tolueno" significa un solvato que contiene predominantemente una cantidad de tolueno medida por medio de técnicas analíticas utilizadas por aquellas personas expertas en el campo, en donde el solvato que contiene tolueno puede o no contener también uno o más solventes adicionales.

"Que contiene acetato de etilo" significa un solvato que contiene predominantemente una cantidad de acetato de etilo medida por medio de técnicas analíticas utilizadas por aquellas personas expertas en el campo, en donde el solvato que contiene acetato de etilo puede o no contener también uno o más solventes adicionales . EJEMPLOS Los ejemplos posteriores se llevan a cabo utilizando técnicas estándar que son bien conocidas y rutinarias para aquellas personas expertas en el campo, excepto donde se describa de otra manera en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la presente invención. Ejemplo 1 Preparación de la cepa SC16408 por medio de la mutación y selección, y preparación de bancos de células La cepa SCI6408 se derivó del tratamiento con nitrosoguanidina (NTG) de la cepa So ce90B2 (SC16224) , seguido por la selección aleatoria. De esta manera, la cepa SC16224 se suspendió en amortiguador Tris-HCl 10 mM y se sujetó a 1 mg/ml de NTG durante 60 minutos a pH 8.2. Después del tratamiento con NTG, las líneas de células de colonias se obtuvieron mediante la selección de colonias y se sometieron a prueba por la productividad de epotilona B y la relación de B/A. Las colonias aisladas se transfirieron a matraces y se cultivaron durante 8-14 días, seguido por transferencias cada 3-4 días en el medio de cultivo (medio E) : Medios de Desarrollo E para matraces de agitación: Los ingredientes anteriores se adicionan a agua destilada y el pH se ajusta a pH 7.2 con 10% de NaOH (o OH) antes de la esterilización durante 30 minutos a 121°C. Preparación del banco de células de investigación: un volumen de 10 mL de un cultivo de 3 días de edad de la cepa SC16408 se transfirió en un matraz de 250 mL que contenia 90 mL del medio E. El matraz entonces se incubó a 30 °C, 160 rpm durante 2 días. Al final de los 2 días, se retiraron alícuotas de 1.8 mL del matraz y se transfirieron en frasquitos criogénicos, los cuales se congelaron entonces a -70°C.

Preparación del banco de células maestro: 2 frasquitos del banco de células de investigación se descongelaron y se transfirieron en 2 x matraces de 125 mL que contenían 10 mL del medio E, y entonces se incubaron a 30°C, 160 rpm durante 4-5 días. Después, se transfirieron 2 x 10 mL en 2 x matraces de 250 mL que contenían 90 mL del medio E y se incubaron a 30°C, 160 rpm durante 2-4 días. Finalmente, estos 2 matraces se reunieron y se transfirieron alícuotas de 1.8 mL en frasquitos criogénicos y se almacenaron en un congelador a -70°C. Preparación del banco de células de trabajo: 5 frasquitos del banco de células maestro se descongelaron y se transfirieron a 5 x matraces de 125 mL que contenían 10 mL del medio E, entonces se incubaron a 30°C, 160 rpm durante 3-6 días. Después, se transfirieron 5 x 10 mL en 5 x matraces de 250 mL que contenían 90 mL del medio E y se incubaron a 30°C, 160 rpm durante 2-4 días. Las células en estos 5 matraces se utilizaron para inocular 12 x matraces de 250 mL que contenían 90 mL del medio E, los cuales se incubaron nuevamente a 30°C, 60 rpm durante 2-4 días. Finalmente, estos matraces se reunieron conjuntamente y se transfirieron alícuotas de 1.8 mL en frasquitos criogénicos y se almacenaron en un congelador a -70°C. Se generaron aproximadamente 500-600 frasquitos para este banco de células de trabajo. Ejemplo 2 Cultivo para producir las epotilonas mediante la fermentación en matraces de agitación Las células de un frasquito congelado (1.5 mli) se inoculan en 45 mL del medio E en un matraz de 125 mL y se desarrollaron durante 4-8 días a 30°C y 160 rpm (etapa Fl) . Entonces, se transfieren 5 mL de la etapa Fl a un nuevo matraz de 125 mL que contiene 45 mL del medio E y se desarrollan durante 3-4 días (etapa F2) . Las células de la etapa F2 entonces se utilizan como inoculo para las fermentaciones de la epotilona B. Diez por ciento del inoculo (5.0 mL) se transfiere en un matraz de 125 mL que contiene 45 mL de medio de producción. Los matraces entonces se incuban en un agitador (160 rpm) a 30°C durante 2 semanas. El medio de producción es el medio E modificado, que contiene 1.6% (0.8 g) de resina XAD-16. La composición del medio de producción para los matraces de agitación es como sigue : Medio de producción de epotilona B para matraces de agitación: Los ingredientes anteriores se disuelven en agua destilada y el pH se ajusta a 7.2 con 10% de NaOH (o KOH) antes de la esterilización durante 30 minutos a 121 °C. La composición de la solución de alimentación para la fermentación de epotilona B en matraces de agitación es: 4% de propionato sódico, 10% de Maltrin-M040MR y 3% de Tastone-154MR. La alimentación (100 mL en un matraz de 250 mL) se ajusta a pH 6.8-7.0 con NaOH y se esteriliza durante 30 minutos a 121 °C. Desde el día 3 hasta el día 14 posteriores a inoculación, se adicionan diariamente 0.5 mL de solución de alimentación a cada matraz de fermentación. Alternativamente, se ha descubierto que se pueden obtener resultados comparables al doblar los niveles de alimentación y realizar las adiciones en los días 3, 5, 7 y 10. También se pueden obtener resultados mejorados mediante la complementación adicional de la solución de alimentación anterior con fosfato, en la forma de 1.5% de fosfato sódico, dibásico y 0.5% de fosfato sódico, monobásico, de tal manera que cuando se diluya 100 veces en el medio de cultivo, los niveles finales son 0.015% y 0.005%, respectivamente, excluyendo los niveles residuales de las adiciones anteriores. Una ventaja agregada de la adición de fosfato es que no es necesario realizar un ajuste de pH. Los mejoramientos adicionales en el rendimiento (en la epotilona B) tan altos como 10-20% se pueden lograr a través de la complementación de fosfato. Para el ensayo de epotilonas, las muestras de resina (0.8 g) se recolectan y se someten a ensayo mediante la CLA . La producción de epotilona en matraces de agitación debe dar por resultado los siguientes títulos en 14 días: Epotilona A: 5.0-7.0 mg/g de resina Epotilona B: 8.0-12.0 mg/g de resina Relación de B/A: 1.1-2.0 Comparado con cepas previas, el cultivo de SC16408 parece producir más epotilona B en los matraces de agitación.

Ejemplo 3 Cultivo para producir las epotilonas en ermentadores de 14 L Etapa Fl una alícuota de 3.0 mL de dos frasquitos congelados se inocula en 90 mL del medio E en un matraz de 250 mL y se desarrolla durante 4-8 días a 30 °C y 160 rpm. Etapa F2: 20 mL (10%) de las células de la etapa Fl se transfieren a 180 mL del medio E en un matraz de 500 mL y se incuba durante 2-4 días a 30°C y 160 rpm. Etapa F3 Se repite la etapa F2 para incrementar la cantidad de inoculo. Se transfieren 20 mL del inoculo de la etapa F2 en 6-8 x matraces de 500 mL cada uno que contiene 180 mL del medio E y se incuban los matraces durante 2-4 días a 30 °C y 160 rpm. Etapa F4 Se transfieren 120 mL (10%) de la etapa F3 a 1080 mL del medio E en una botella aspiradora de 4 L, entonces se incuba durante 2-4 días a 30°C y 160 rpm.

El medio E se utiliza para construir el inoculo para un fermentador de 14 L. Los tiempos en autoclave para las etapas en el matraz de agitación y la botella aspiradora son 30 y 60 minutos, respectivamente. Para el fermentador, el medio de producción se esteriliza durante 60 minutos a 121 °C. El medio de producción del fermentador de 14 L es un medio de producción en matraz de agitación modificado (como se describiera anteriormente) donde HEPES ha sido suprimido y se han adicionado 2.5 g/L de un agente ant iespumant e (Antifoam AF, de Dow Corning) . Seis litros del medio de producción (pH ajustado a 7.2-7.4) se suministran en un fermentador de 14 L y se esterilizan. La tabla posterior resume los parámetros de procedimiento a la escala del fermentador de 14 L: Parámetros del procedimiento en el fermentador a nivel superior: Composición de la Una solución compuesta alimentación de nutrientes: de 4.1% de Maltrin-M040MR y 1.3% de Tastone-154MR se prepara en una botella de 5 L. La alimentación se esteriliza durante 60 minutos a 121°C. Velocidad de alimentación La velocidad de de nutrientes: alimentación es 6 mL/hora Alimentación de propionato El 5.0% de propionato sódico : sódico (1.5 L en una botella de 2 L) se esteriliza durante 60 minutos a 121°C Velocidad de alimentación De 24-48 horas a la de propionato sódico: terminación, 2 mL/hora. La velocidad de alimentación se ajusta para mantener la concentración de propionato sódico entre 0.05-0.2 mg/ml en base al ensayo de CLAR.

El rango de titulo de epotilona B en los termentadores de 14 L se resume a continuación: Titulo de epotilona B, mg/g de resina Relación de B/A 5-12 1.0-3.0 Ejemplo 4 Proceso de preparación para las epotilonas Etapa de semilla del fermentador de 50 L Para la etapa Fl, se hace el medio E (2 L) y se suministra, 90 mL cada uno en 17 matraces separados de 250 mL. Los matraces entonces se esterilizan por medio de una autoclave a 121°C durante 30 minutos. Las células de un frasquito congelado se inoculan en cada matraz y se desarrollan durante 4-8 días a aproximadamente 30°C y 1G0 rpm. Para la etapa F2, se hacen 27 L del medio E y se suministran, 1.5 L cada uno en 17 matraces separados de 4 L, entonces se esterilizan como antes. Cada matraz de 4 L se inocula con los contenidos completos de un matraz de la etapa Fl, entonces se desarrollan durante 2-4 días a aproximadamente 30°C y 160 rpm. Para la etapa F3 , se hacen 80 L del medio E* y se divide en dos termentadores de semilla de acero inoxidable de 50 L y cada fermentador de 50 L se inocula con los contenidos de los tres matraces de 4 L de la etapa F2. Los termentadores de 50 L se desarrollan durante 2-4 días a 30-33°C, entonces se combinan y se utilizan para inocular un fermentador de 800 L.

El medio . E* es El inoculo se desarrolla en un fermentador de acero inoxidable de 800 L hasta que la masa de células es suficiente para inocular la siguiente etapa de semilla (un fermentador de 5,000 L) . El medio E* para el lote se hace en agua desionizada (400 L) y la mezcla, pH 8.7-8.9, se esteriliza a 1.194 kg/cm2 (17 psig) , 124°C durante 6 minutos. El medio se transfiere del esterilizador al fermentador de 800 L y el pH se ajusta a pH 7.1-7.3. El fermentador entonces se inocula con 80 L de la etapa F3. El lote se conduce con los siguientes puntos de referencia de control: Presión: 0.562-0.843 kg/cm¿ Flujo del aire: 0.5-0.7 vvm (8-12 psig) Temperatura : 30-33°C pH: 7.1-7.3 Velocidad del eje del agitador: 50-60 rpm Como sea necesario, se adiciona sosa cáustica (solución de hidróxido de sodio o potasio) de un suministro estéril para mantener el pH en el rango de 7.1-7.3. Se toman muestras del lote en intervalos y se analiza por la esterilidad, pH, sedimento y concentración de glucosa. El gas residual de salida C02 y 02 también se monitorea. Aproximadamente a 48-60 horas, cuando la concentración de glucosa está comenzando a caer, los contenidos .del fermentador de 800 L (aproximadamente 440-480 L) se transfieren a un fermentador de 5,000 L. Etapa de semilla del fermentador de 5,000 L Un fermentador -de acero inoxidable de 5,000 L se utiliza en proceso de inoculo en esta etapa. El inoculo se desarrolla en el fermentador hasta que la masa de células es suficiente para inocular el fermentador de producción de 40, 000 L. El medio E*, preparado como antes (en agua desionizada, 2,600 L) , se transfiere al fermentador de 5,000 L y entonces se inocula con aproximadamente 440-480 L del inoculo del fermentador de 800 L. El lote se conduce con los puntos de referencia de control y se monitorea como se describiera anteriormente. Nuevamente, el pH se mantiene en el rango de 7.1-7.3. Aproximadamente a 48-72 horas, cuando la concentración de glucosa comienza a caer, el contenido del fermentador de 5,000 L se transfiere al fermentador de 40,000 L. Etapa de producción del fermentador de 40,000 L Un fermentador de acero inoxidable de 40,000 L se utiliza en la producción de las epotilonas. Una vez que el fermentador se ha esterilizado y llenado con el medio estéril, se inocula con la semilla preparada en el termentador de 5,000 L. Una vez que se alcanzan los parámetros de producción específicos, los contenidos del fermentador de producción se recolectan. El medio para el fermentador de producción se esteriliza en dos partes. La resina se adiciona en 2,800 L de agua y la mezcla se esteriliza a 1.194 kg/cm2 (17 psig) , 124 °C durante 75 minutos: Para hacer 18, 000 L del medio, se adicionan los siguientes ingredientes en agua desionizada (15,000 L) y el pH se ajusta 7.1-7.3. El medio se esteriliza a 150°C en un esterilizador continuo (tiempo de retención 100 segundos, temperatura de salida 60°C): Ingrediente Peso (kg) Leche Descremada en Polvo 130 Harina de Nitrosoya Tostada 130 Tastona - 154 65 Maltrin-M040 238 CaCl2-2H20 21.6 MgS( 7¾0 21.6 Sal de EDTA, FelII, Na 0.22 Glicerol 216 Agente antiespumante 54 El medio y la resina se transfieren al fermentador de producción, el cual entonces es inoculado con aproximadamente 3,100 L de inoculo del fermentador de 5,000 L. El lote se conduce con los puntos de referencia de control descritos anteriormente, excepto que el flujo de aire es 0.2-0.4 vvm. Como sea necesario, el pH (entre 0 y 80 horas) se eleva con sosa caótica. Después de 80 horas, el pH se disminuye con ácido sulfúrico. Como sea necesario, la espumación se controla con un agente antiespumante. Se toman muestras del fermentador al menos una vez al dia para la esterilidad, pH, sedimento, glucosa, propionato y concentración de epotilona B. El C02 en el gas residual se monitorea y se registra. Las alimentaciones se inician a aproximadamente 30-60 horas, ya que el C02 es al menos 0.3%. El fermentador es alimentado con propionato sódico (102 g/L) con tamaño de dosis de 1.9 L/dosis (rango 1.5-3.0). El intervalo entre las dosis comienza a 60 minutos y disminuye cada 12 horas a un mínimo de 12 minutos. El propionato se adiciona en 2, 800 L de agua desionizada y la solución se esteriliza a 1.194 kg/cm2 (17 psig) , 124°C durante 75 minutos. En una modalidad preferida, la semilla de propionato sódico se separa de la alimentación que contiene otros componentes de los medios. El fermentador se alimenta con Maltrin-M040MR y Tastone-154MR con un tamaño de dosis de 14.5 L. El intervalo entre dosis comienza en 60 minutos y cambia en 104 horas a 40 minutos. Los ingredientes se adicionan a agua desionizada (3, 000 L) y se esterilizan a 1.194 kg/cm2 (17 psig), 124°C durante 75 minutos. La alimentación comprende: Durante la corrida, algunos de los componentes de los medios, tales como leche descremada en polvo, Maltrin-M040MR y glicerol son agotados. Comenzando en aproximadamente 115 horas, la alimentación previa es interrumpida y la siguiente mezcla con un tamaño de dosis de 14.5 L se adiciona al fermentador de producción en intervalos de 40 minutos. Los ingredientes se adicionan en agua desionizada (3,000 L) y la mezcla, pH 8.7-8.9, se esteriliza a 1.194 kg/cm2 (17 psig), 124 °C durante 75 minutos: Ingrediente g/L Leche Descremada en Polvo 49 Maltrin-M040 154 Tastona - 154 20 Glicerol 73 Agente Antiespumante 1.6 Cuando se logra una concentración deseada de epotilona B (normalmente después de 9-21 días) , los contenidos del recipiente se recolectan. Los títulos de epotilona B varían de aproximadamente 5-24 mg/g de resina, con relaciones de B/A de aproximadamente 1.5-4. Ejemplo 5 Extracción de epotilona B de la resina XAD-16 con MTBE y cristalización para proporcionar la epotilona B sólida; purificación mediante la cromatografía de fase inversa y aislamiento final de epotilona B de alta calidad La resina XAD-16 recolectada y lavada con agua (aproximadamente 550 kg) que contiene las epotilonas (aproximadamente 5.03 kg de epotilona B) se mezcla con metanol acuoso y se carga en una columna de extracción como una suspensión espesa. La resina empacada se lava con metanol acuoso (1 volumen de lecho cada 30% luego 50% de MeOH) para remover los materiales indeseados, altamente polares . Las epotilonas son removidas con lavados de MTBE (aproximadamente 4 volúmenes de lecho) . El eluato abundante se colecta y se pasa por un filtro abrillantador. Después del asentamiento por gravedad para remover cualquier fase acuosa, se concentra el TBE abundante. El producto concentrado se asienta por gravedad, la fase acuosa se remueve y el MTBE adicional (2 volúmenes de lecho) se adiciona al lote. El lote es concentrado nuevamente a una concentración de aproximadamente 5 a 15 g de epotilona B por L. El lote es cristalizado mediante el enfriamiento gradual durante 5-6 horas a aproximadamente 0°C. El sólido cristalino se filtra, se lava y se seca. La torta del producto resultante se disuelve en acetato de etilo caliente y se pasa por un filtro abrillantador. El producto filtrado, abundante se concentra bajo vacío a una concentración de aproximadamente 20 a 45 g de epotilona B por L. Después del calentamiento a 70 °C, el lote entonces se enfría lentamente a aproximadamente 0°C para proporcionar una suspensión espesa, cristalina, la cual se filtra, se lava con EtOAc frío y se seca a menos de 40 °C para -proporcionar la epotilona B recristalizada, aislada (en un rendimiento de 84% de la resina) . Este producto entonces se purifica mediante la cromatografía de fase inversa. Una columna cromatográfica (11 cm de diámetro x 40 cm de longitud del lecho) empacada con un soporte estacionario de fase inversa RP C-18 es equilibrada con acetonitrilo acuoso (30-50% v/v) . El producto recristalizado se disuelve en sulfóxido de dimetilo (DMSO, 1-1.5 L por kg) , la mezcla se filtra para remover los materiales insolubles, entonces se carga en la columna precedida por una alícuota de 100% de DMSO y es perseguida por un volumen igual de DMSO para reducir la precipitación de la muestra con la introducción de la fase móvil, acuosa. La muestra es eluida de la columna utilizando acetonitrilo acuoso (30-50% v/v) , y el efluente se monitorea a 290 nm mediante un detector de radiación UV. El pico del producto de epotilona B se colecta en una variedad de fracciones. Las fracciones se someten a ensayo mediante la CLAR para la epotilona tanto A como B y otras impurezas relacionadas. Las fracciones de columna reunidas, deseadas se cargan en un paquete de destilación y el lote se concentra al vacío para remover el acetonitrilo a una temperatura inferior a 40°C. La fase acuosa, resultante se extrae hasta tres veces con acetato de etilo y la solución orgánica se concentra bajo vacío a una temperatura inferior a 40 °C para proporcionar una concentración de 0.1 a 0.2 g/mL de epotilona B. Se adiciona n-heptano (o heptanos) al lote a 40°C, entonces el lote de enfría lentamente de 2 a -10°C y se mantiene durante al menos 2 horas. La suspensión espesa, cristalina se filtra y se lava con una solución de acetato de etilo/n-heptano, entonces la torta final de epotilona B se seca bajo vacío a 35-40°C para producir 3.367 kg con una potencia de 91.7% que es equivalente a 3.09 kg de actividad de epotilona B. El rendimiento de la resina fue 61.4%. La CLA indicó 99.6% de área de epotilona B, 0.4% de área de epotilona A, son otras impurezas presentes a >0.1% de área. Ejemplo 6 Extracción de epotilona B de la resina XAD-16 con acetato de etilo y cristalización con tolueno como anti-solvente para proporcionar la epotilona B; purificación mediante la cromatografía de fase inversa; aislamiento final de la epotilona B de alta calidad La resina XAD-16 que contiene la epotilona B se lava con agua en un tamiz vibratorio (SWECO T ) para limpiar la resina. Una porción de esto (aproximadamente 6.6 L, que contiene 15.6 g de epotilona B, 2.36 mg de ensayo de la epotilona B por gramo de resina) se transfiere a un recipiente de 20 L utilizando aproximadamente 5 L de agua para enjuagar la resina con agua. Entonces se adiciona acetato de etilo (aproximadamente 2 volúmenes de lecho (BV) de la resina de entrada) al recipiente. La suspensión espesa se agita durante aproximadamente una hora y se centrifuga a 3,500 rpm durante 5 minutos utilizando jarras de centrífuga con tapón roscado de 600 mL para separar las capas. Los primeros sobrenadantes de acetato de etilo abundante son decantados y sus volúmenes se miden. Después, las capas de fondo que contienen resina, acuosas de préstamo se reúnen en el recipiente y se adiciona acetato de etilo (2 BV) al recipiente. La suspensión espesa se agita durante aproximadamente 1 hora y entonces se centrífuga para separar las capas . Los segundos sobrenadantes de acetato de etilo abundante son decantados y sus volúmenes se miden. Entonces se adiciona agua (-0.3 BV de resina de entrada) a las primeras y segundas corrientes de acetato de etilo abundantes, combinadas y se agitan durante aproximadamente 5 minutos. Se permite que las capas se asienten durante aproximadamente 30 minutos. Después, la capa acuosa, inferior se separa de la capa de acetato de etilo abundante, superior. La capa de acetato de etilo lavada, abundante se concentra a una temperatura menor que 45°C, a una concentración de aproximadamente 10 g de actividad de epotilona B por litro. La solución de acetato de etilo abundante, concentrada entonces se pasa por un filtro abrillantador y se concentra a 20-25 g/L de epotilona B. Después de la concentración, se adiciona tolueno y el lote se concentra nuevamente utilizando vacío a menos de 50°C, al volumen del lote antes de la adición de tolueno. El lote se deja enfriar a aproximadamente 18°C durante aproximadamente 1 hora, entonces se agita durante aproximadamente 16 horas a esta temperatura para dar por resultado cristales del producto. Después, el lote de cristalización se filtra y se lava con tolueno (-0.2 de BV) y los sólidos se secan para producir aproximadamente 30.4 g de un sólido que contiene 13.5 g de actividad de epotilona B. El rendimiento de actividad de la resina de inicio es 87%. La purificación mediante la cromatografía de fase inversa se realiza en la epotilona B sólida extraída de la resina utilizando el procedimiento anterior. La columna (Phenomenex Luna, 15, C18(2), 5.0 cm x 25 cm, columna BV de 400 mL) es equilibrada previamente con 3 BV de 40% de acetonitrilo - agua (v/v) . Aproximadamente 4-6 g de la epotilona B sólida se disuelven en aproximadamente 6 mL de DMSO a aproximadamente 40°C, entonces la mezcla se filtra a través de papel filtro para remover los materiales particulados. Se inyecta aproximadamente 1.5 mL de DMSO en el ciclo de la muestra para prevenir la precipitación de las epotilonas en la tubería. El producto filtrado abundante en epotilona entonces se inyecta en el ciclo de la muestra. Después de la inyección, el recipiente del producto filtrado de epotilona se lava con alrededor de 0.5 mL de DMSO y se inyecta junto con aproximadamente 1 mL de DMSO en el ciclo de la muestra. La inyección de DMSO después de la inyección de la muestra de epotilona impide la precipitación en la tubería. Los contenidos del ciclo de la muestra son cargados en la columna a una velocidad de flujo de aproximadamente 5 mL/minuto. Después de cargar la epotilona en la columna, la solución de 40% de acetonitrilo - agua entonces se bombea a través de la columna. Después de 3-4 minutos, la velocidad de flujo se incrementa a aproximadamente 60 mL/minuto. Los picos de epotilona A y B son colectados en las fracciones. Las fracciones que contienen epotilona B abundante se obtienen típicamente en los cortes entre un volumen eluido de aproximadamente 2.5 L y 3.25 L (el pico de epotilona B se eluye típicamente entre aproximadamente 6 y 8 volúmenes de lecho) . El volumen de las fracciones reunidas es aproximadamente 0.75 L. Después de que el pico para la epotilona B casi ha alcanzado la línea de base (< 10% de la altura pico) , se bombea acetonitrilo al 100% a través de la columna. Cuando el cromatograma indica que la absorbancia a 290 nm ha regresado esencialmente a la línea de base, el reequilibrio de la columna se inicia para la siguiente corrida mediante el bombeo de la solución de 40% de acetonitrilo - agua en la columna. Típicamente, se utilizan 2 BV de 100% de acetonitrilo- y 3 BV de 40% de acetonitrilo para lavar y re-equilibrar la columna. Las fracciones son sometidas a ensayo para determinar la pureza utilizando el análisis de CLAR y las fracciones deseadas se reúnen. Los rendimientos típicos son 90-98%. Las fracciones reunidas de epotilona B se concentran bajo vacío a menos de 40 °C, a aproximadamente 50% del volumen inicial. Las fracciones concentradas se extraen con acetato de etilo. Los extractos reunidos de acetato de etilo se concentran a aproximadamente 0.1 g/mL de epotilona B a una temperatura del baño de aproximadamente 40°C. Mientras se agita, se adiciona n-heptano (o heptanos) (utilizando un volumen de 50% de la solución de acetato de etilo) durante un periodo de aproximadamente 15 minutos . Los extractos se reúnen a 5°C y se mantienen a esa temperatura durante al menos 2 horas. Los cristales del producto se filtran y se lavan con una solución de n-heptano : acetato de etilo 1:2 (v:v) . Finalmente, los cristales se secan bajo vacío a aproximadamente 40°C durante aproximadamente 12 horas. La CLAR indicó, para varios lotes, 99.5-99.7% de área de epotilona B y 0.3-0.5% de área de epotilona A. Ejemplo 7 Extracción de epotilona B de la resina XAD-16 con acetato de etilo y cristalización con tolueno como anti-solvente, seguida por la recristalización para proporcionar la epotilona B de grado primario; purificación mediante la cromatografía de fase normal; y aislamiento final de la epotilona B de alta calidad Paso A, Preparación de la epotilona B de grado primario utilizando la extracción de EtOAc - cristalización de tolueno : La resina abundante de epotilona B lavada con agua (1350 g) se carga en una columna. Se utiliza agua (2700 mL) para cargar y enjuagar la columna. La actividad de epotilona se eluye al pasar 9450 mL (7 volúmenes de lecho) del acetato de etilo a través de la columna. El eluato de acetato de etilo se deja asentar durante al menos una hora. Una capa acuosa de color café oscuro y una capa de emulsión se remueven. La solución de acetato de etilo abundante se concentra bajo vacio a una concentración objetivo de aproximadamente 20 g de epotilona B por L. El producto concentrado se deja reposar 2 horas y se enfria a 20°C. El producto concentrado, frío se pasa por un filtro abrillantador y el filtro se lava con acetato de etilo (36 mL) . El producto filtrado, combinado y el lavado se concentran a aproximadamente 80 g de epotilona B por L y se calientan a 65°C. Se adiciona un volumen igual de tolueno con agitación durante 10-15 minutos mientras que se mantiene la temperatura sobre 60°C. La temperatura se mantiene a 65°C durante 30 minutos seguido por la disminución de la temperatura a 40°C durante 1.5 horas y luego la disminución de la temperatura a 1°C durante 2 horas. La suspensión espesa, cristalina, resultante se agita a 1°C durante al menos 60 minutos. Los sólidos se filtran y se lavan con tolueno (20% del volumen de la suspensión espesa) . (En varias repeticiones de este método, el licor madre contiene típicamente 2-6% de la actividad de epotilona B de entrada) . Los sólidos se secan al vacío en un horno a 40-45°C durante al menos 4 horas. Alternativamente, los sólidos se secan al vacío en un horno a una temperatura entre aproximadamente 40 °C y la temperatura ambiente durante al menos 4 horas . El peso de la torta seca de epotilona B primaria varió de 8.4 a 20 g, la potencia de la epotilona B varia de 650 a 713 µg/mg. La torta también contuvo 12% a 26% de epotilona ? (porcentaje de área) . Los niveles residuales de solvente fueron 0.7% (p/p) de EtOAc y 13% (p/p) de tolueno. Para cinco lotes que se evaluaron: Las pérdidas totales para el procedimiento de aislamiento promediaron 9.4%. El porcentaje pico de epotilona A con relación al pico de epotilona B de la resina con la torta primaria cayó de un promedio de 49% a 19%. El patrón PXRD y el análisis térmico para el solvato cristalino obtenido siguiendo el método descrito en este paso se exponen en las figuras 9 y 10, respectivamente. El patrón PXRD de la figura 9 es caracterizado adicionalmente por los datos reportados en la tabla 6, anterior. Paso B, Recristalización de la epotilona B: Se adiciona EtOAc (0.14 L) a 15 g de epotilona B de grado primario (710 µg/mg) y se calienta a 65-68°C con agitación. (La concentración objetivo de la epotilona B fue 75- 80 g de actividad por litro) . Se adiciona tolueno (0.14 L) durante 20 minutos mientras que se mantiene una temperatura superior a S0°C. La suspensión espesa, resultante se mantiene a 65°C durante 0.25 horas a 1 hora. El lote entonces se enfría a 40°C durante 3 horas. El enfriamiento de lotes continúa a 0-2 °C durante 2 horas. El lote entonces se mantiene a 0-2 °C durante 12 horas. La suspensión espesa, cristalina, resultante entonces se filtra y la torta se lava con tolueno (2 x 0.028 L) . Típicamente, menos de 3% de la actividad de epotilona B de entrada se pierde para el licor madre, combinado y el lavado. La torta se seca en un horno al vacío a 42 °C y 736.6 mmHg (29 pg. Hg) durante 2 horas. Alternativamente, la torta se seca en un horno al vacío a una temperatura entre aproximadamente 40°C y la temperatura ambiente y 736.6 mmHg (29 pg. Hg) durante 2 horas. El peso de la torta seca es 13.6 g con una potencia de 764 µg/mg. Los solventes residuales incluyen EtOAc (0.9% en peso) y tolueno (13.2%). Típicamente, el EtOAc y el tolueno están presentes en niveles combinados de 13-14% en peso. El porcentaje del área del pico de epotilona A con relación al pico de epotilona B para la torta recristalizada cayó a un promedio de 6.9%. El patrón PXRD y el análisis térmico para el solvato cristalino obtenido siguiendo el método descrito en este paso se exponen en las figuras 11 y 12, respectivamente. El patrón PXRD de la figura 11 es caracterizado adicionalmente por los datos reportados en la tabla 7, anteriormente . Cromatografía de fase normal : Se preparan las siguientes fases móviles : solución de 20% de acetato de etilo/n-heptano (v/v) (-10 L) , 40% de acetato de etilo/n-heptano (~10 L) , y 100% de acetato de etilo (-10 L) . Se instala el siguiente equipo: Waters Delta Prep 4000; Detector: radiación UV establecido a 290 nm; Columna: Phenomenex Luna, 10 mieras, sílice (2), 5.0 cm X 25 cm (volumen de columna ~ 490 mL) . La columna es equilibrada con 3 volúmenes de lecho de solución de 20% de acetato de etilo/n-heptano (v/v) antes de la inyección de la solución de epotilona. La torta de epotilona B (5.5 g) se disuelve en 55 mL de cloruro de metileno. El lote se filtra a través de un filtro de PTFE de 1 miera para remover cualquier partícula que puede estar presente. Se utiliza cloruro de metileno (2-5 mL) para enjuagar el filtro. El producto filtrado de cloruro de metileno abundante se inyecta en la columna a una velocidad del flujo inicial de 5 mL/minuto durante los primeros 30 segundos, seguido por el incremento de flujo a 20 mL/minuto hasta que la muestra es cargada completamente. El recipiente que contiene el producto filtrado de epotilona se enjuaga con cloruro de metileno (2-5 mL) y el enjuague también se carga en la columna. La elusión comienza con 20% de EtOTAc/heptano mientras que incrementa la velocidad de flujo a 118 mL/minuto. Después de que la velocidad de flujo alcanza 118 mL/minuto, el controlador del programa de la bomba se utiliza para conducir el programa deseado de la bomba. Se utiliza el siguiente programa de la bomba: Las fracciones se colectan y se someten a ensayo por la pureza utilizando la CLAR. En cinco lotes, el porcentaje de área de epotilona B en las fracciones colectadas fue 99.59-99.93%, con un rendimiento que promediaba 91%. Opcionalmente, la cromatografía se realiza de manera similar utilizando un paso de elusión isocrática de 40% de acetato de etilo/n-heptano, con el paso de lavado similar de la columna de 100% de acetato de etilo seguido por el re-equilibrio con 40% de acetato de etilo. Se utiliza el mismo equipo de la cromatografía con una columna de diámetro más pequeño, 1.0 cm x 25 cm. El rendimiento de la cromatografía para la epotilona B (1S4 mg) en las fracciones medias fue 86% y el porcentaje de área de la epotilona B en las fracciones colectadas fue 99.4%. El procedimiento isocrático anterior también se realizó sobre una columna comprimida, axial de 11 cm con 31-35 gm de epo B eluida en la fracción media con rendimientos cromatográficos de 90-94%. El porcentaje de área de la epotilona B en las fracciones medias, colectadas fue 99.6-99.9%. La columna puede ser reutilizada múltiples veces. Paso C, Cristalización final.:. Las fracciones medias, deseadas se reúnen para proporcionar un volumen de lote de 1.62-1.73 L. El solvente se remueve bajo vacío a 40-45°C. El volumen de destilación objetivo es 25-28 mL (concentración de epotilona B de aproximadamente 200-210 g/L) . Al producto concentrado se adiciona heptano caliente (aproximadamente 40°C) heptano (50 mL) . Alternativamente, se podría adicionar EtOAc (50 mL) caliente (aproximadamente 40°C) al producto concentrado en este paso. La suspensión espesa, resultante se agita a aproximadamente 40°C durante aproximadamente 2 horas, entonces se enfría a aproximadamente 0°C durante aproximadamente 5 horas y se agita adicionalmente a aproximadamente 0°C durante un mínimo de 5 horas. La agitación mecánica a velocidad moderada se utiliza por toda la cristalización. La suspensión espesa, cristalina se filtra y la torta se lava con EtOAc/heptano frío 1:1 (25 mL) . Los sólidos se secan en un horno al vacío a 40-45°C durante 5-6 horas. Alternativamente, los sólidos se secan en un horno al vacío a una temperatura entre aproximadamente 40°C y la temperatura ambiente durante 5-6 horas. El peso de la epotilona B aislada (para cinco lotes) es aproximadamente 4.2-5.0 g (rendimiento de actividad de 83.5-85.6%) de la epotilona B recristalizada (una vez) y la pureza de la CLAR es 99.78 a 99.93% de área (99.80% promedio) . La pérdida de epotilona B en el licor madre es de aproximadamente 4% con respecto a la entrada de actividad de la -epotilona B a la cromatografía. Los solventes residuales en la torta son EtOAc (5.8-6.0% p/p) y heptano (0.6-0.7% p/p). La potencia de la torta de epotilona B final varía de 91.5 a 92.7% p/p. La pureza de CLAR es sobre 99.7 por ciento de área. El patrón PXRD y el análisis térmico para un solvato cristalino obtenido siguiendo el método descrito en este paso se exponen en las figuras 13 y 14, respectivamente. Como se puede observar en la figura 14, el punto de fusión para el solvato de acetato de etilo preparado y secado de acuerdo con el procedimiento anterior es aproximadamente 102 °C. El patrón PXRD de la figura 13 es caracterizado adicionalmente por los datos reportados en la tabla 8, anteriormente. Alternativamente, las fracciones medias, reunidas que contenían 4.83 Kg de Epo B (1790 L) se concentraron bajo vacío a <30°C a una concentración objetivo de 200-210 g/L y entonces se adicionó n-heptano (60 Kg) . Esta concentración se repitió y entonces se agregaron 60 Kg adicionales de heptano . La suspensión espesa se enfrió a 20°C durante tres horas, entonces se colectó y se lavó con 30 Kg de heptano. Los sólidos se secaron a 20-36°C durante 16 horas bajo vacío. Se obtuvo un total de 5.141 Kg del sólido con una pureza en la CLAR de >99.6% de área. Los solventes residuales en la torta fueron 10.6% de acetato de etilo y 1.4% de heptano. Ejemplo 7A Extracción de epotilona B de la resina, seguida por la recristalización repetida La resina abundante de epotilona lavada con agua (549.8 kg) que contenía 4.10 Kg estimados de actividad de epotilona B (% de área para la epotilona B = 58.0%; epotilona A = 29.2%) se mezcló espesamente con agua y se cargó a una columna (700 L) . La columna se drenó y se sopló con nitrógeno. El acetato de etilo (2969 Kg) entonces se eluyó a través de la columna a una velocidad de -1 volumen de lecho por hora durante un total de ~6 volúmenes de lecho. El eluato de acetato de etilo abundante, combinado se dejó asentar por gravedad durante -1 hora antes de remover la fase acuosa, inferior. El acetato de etilo abundante entonces se concentró a -574 kg. El acetato de etilo abundante, concentrado entonces se dejó reposar a -20 °C durante -2 días antes del paso por un filtro abrillantador. El filtro y las líneas se lavaron con acetato de etilo (-115 kg totales) . El producto pasado por el filtro abrillantador y el lavado entonces se concentraron a un volumen de -64 L, entonces se calentó a -65 °C. Entonces se adicionó un volumen igual de tolueno caliente con agitación y el material se mantuvo a -65 °C durante -30 minutos. El lote entonces se enfrió lentamente a ~40°C durante -4 horas, seguido por el enfriamiento a 0°C durante -2.5 horas. La suspensión espesa, fría entonces se mantuvo -0°C durante -1 hora. La suspensión espesa, cristalina, resultante entonces se filtró y la torta se lavó con tolueno (-64 L) . La torta resultante se secó brevemente bajo vacío, entonces se disolvió nuevamente del secador de filtro utilizando acetato de etilo caliente (-200 kg) . La primera recristalización se realizó de manera similar al concentrar el acetato de etilo abundante a -65 L. Después de calentar a 65°C, se agregó un volumen igual de tolueno con agitación y el material se mantuvo a -65°C durante -30 minutos. El lote se enfrió de manera similar como antes y la suspensión espesa, cristalina, resultante se filtró y se lavó utilizando el mismo procedimiento y equipo como antes. Dos recristalizaciones similares, adicionales como las descritas anteriormente se realizaron para producir una torta cristalina de epotilona B con (4.384 Kg) (81.5% p/p) (3.573 kg de epotilona B) (%'s de área de CLAR para: epotilona B = 97.18; epotilona A = 1.40; epotilona F = 0.30; análogo de oxazol = 0.30 y análogo de etil-tiazol = 0.56) . No fueron detectables otras impurezas mediante la CLAR sobre 0.1 de área. El producto contuvo 13.8% p/p de tolueno y 0.8% p/p de acetato de etilo. El rendimiento de actividad total de la resina para la epotilona B purificada, asilada fue 87%. Ejemplo 7B Recuperación de epo B de las Corrientes de Licor Madre Los licores madre de la cristalización de Epo B a partir de extracto de MTBE o EtOAc se combinaron y contuvieron 2.2 g de Epo B y 4.8 g de Epo A por litro de solución. Se concentraron diez litros de esta solución bajo vacío a <50 °C a una concentración de 11-15 g de Epo B por litro. Se adicionó un volumen de tolueno y se comenzaron a formar sólidos; la destilación continuó hasta que se logró nuevamente una concentración de 11-15 g de Epo B/L. Un volumen de tolueno se adicionó nuevamente y la destilación se repitió una vez más para alcanzar 11-15 g de Epo B/L. La suspensión espesa se enfrió a temperatura ambiente durante 1 hora, entonces se agitó durante 90 minutos. La mezcla entonces se calentó nuevamente a -50 °C, se agitó durante 1 hora y se enfrió a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la agitación durante un mínimo de 3 horas, los sólidos se colectaron mediante la filtración, se lavaron con tolueno y entonces se secaron bajo vacío a -40 °C para proporcionar una recuperación de -92% de la actividad de Epo B. Los sólidos sometieron a ensayo 42.9% p/p de Epo B con 16% p/p de tolueno. EL licor madre contuvo 66% de la epotilona A de entrada y solo 5% de la epotilona B de entrada. Ejemplo 7C Las fracciones medias, reunidas (200 mL) , del procedimiento de cromatografía de fase normal expuesto en el ejemplo 7, que contenían 64-6 mg de Epo B se adicionaron lentamente a 43 mL de tolueno mientras que se concentraban bajo vacío con una temperatura de camisa de -65°C a -43 mL. Se adicionó tolueno (43 mL) bajo vacío mientras que la destilación continuaba con una temperatura de camisa de -65 °C. La suspensión espesa se concentró a -43 mL y entonces se dejó enfriar a ~20°C durante -3 horas. Los cristales se colectaron se lavaron con 2x5 mL de tolueno y se secaron bajo vacío (736.6 mmHg (29" Hg) ) a -40°C durante 30 minutos para proporcionar 729 mg de la torta cristalina, aislada (85.3% p/p de Epo B) . La pureza mediante la CLAR fue 99.77% de área (excluyendo el % de área de tolueno) . Los solventes residuales en la torta fueron 15.3% p/p de tolueno y 0.3% p/p de EtOAc. El licor madre y el lavado contuvieron solo 0.5% de la actividad de entrada de la epotilona B. Un patrón PXRD observado para el solvato cristalino obtenido siguiendo los métodos descritos en este paso se expone en la figura 15 (patrón superior) , junto con un patrón PXRD simulado para un solvato de tolueno a temperatura ambiente (patrón inferior) . El análisis térmico para este solvato cristalino se expone en la figura 16. Ej emplo 8 Preparación de Formas Cristalinas, Específicas Ejemplo 8A: Preparación de epoB-??ß Preparación de solvato de tolueno de la epotilona B La Epo B se disolvió en -13 mL de acetato de etilo a ~40°C. Se adicionó un volumen de tolueno seguido por la concentración a una temperatura de baño de <40°C a 9 mL. Esto se calentó nuevamente a -55 °C, seguido por la adición de otro volumen de tolueno. Esto entonces se concentró a -10 mL y se dejó enfriar a 18°C. La suspensión espesa se utilizó para la determinación de la estructura de rayos x. La estructura molecular de la forma monoclínica de célula unidad de epoB-??ß y los patrones PXRD de epoB-??ß, obtenidos siguiendo el método descrito anteriormente, se muestran en las figuras 4 y 6, respec ivamente. Ejemplo 8B: Preparación de epoB-??ß Preparación de solvato de acetonitrilo de la epotilona B Una solución de la epotilona B esencialmente pura en acetonitrilo acuoso (de fracciones de columna reunidas que resultan de la cromatografía de fase inversa en el ejemplo 5) se dejó evaporar lentamente a temperatura ambiente para producir una suspensión espesa, cristalina de acetonitrilo-agua. La suspensión espesa, cristalina se examinó directamente mediante la difracción de rayos x. La estructura molecular de la forma monoclínica de célula unidad de epoB-??ß y los patrones PXRD de epoB-??ß, obtenidos siguiendo el método descrito anteriormente, se muestran en las figuras 2 y 7, respectivamente. E emplo 8Ct Preparación de epoB-??ß Preparación de solvato de EtOAc de la epotilona B A una -solución de epotilona B en EtOAc/heptano 1:1 se concentra a una concentración objetivo de -190-195 g/L. A esta suspensión muy espesa de la epotilona B se adicionan con agitación 10 volúmenes de EtOAc a -40 °C. La suspensión espesa, resultante se agita a 40°C durante 2 horas, se enfría a 0°C durante 5 horas y se agita adicionalmente a 0°C durante un mínimo de 5 horas. La suspensión espesa entonces se filtra y la torta se lava con EtOAc/heptano frío 1:1. La torta se seca en un horno al vacio durante 5-6 horas para proporcionar la torta final de epotilona B con ~ 5-14% de EtOAc. La estructura molecular de la forma monoclínica de célula unidad de epoB-??ß y los patrones PXRD de epoB-??ß, obtenidos siguiendo el método descrito anteriormente, se muestran en las figuras 1 y 5, respectivamente. Ejemplo 8D: Preparación de epoB-??ß Preparación de solvato de IPA de la epotilona B La epotilona B (70 mg) se disolvió en 4 mL de IPA mediante el calentamiento de la solución hasta que se formó una solución clara. Esta solución se enfrió a temperatura ambiente. Cualquier sólido formado se removió inmediatamente mediante la filtración. El producto filtrado, claro se colocó en un frasquito pequeño y se cubrió con una hoja delgada de aluminio con varios agujeros minúsculos. El solvente se dejó evaporar a temperatura ambiente muy lentamente durante un periodo de varios días hasta que se observó un desarrollo sustancial del cristal. Los cristales se sometieron al análisis de rayos X como una suspensión espesa, húmeda. La estructura molecular de la forma monoclínica de célula unidad de epoB-??ß y los patrones PXRD de epoB-??ß, obtenidos siguiendo el método descrito anteriormente, se muestran en las figuras 3 y 8, respectivamente.

Ejemplo 9 Formación del Derivado 2 (una lactama) a partir de la Epotilona B (una lactona) Una solución de azida de tetrabutilamonio (azida de TBA) , se prepara al mezclar cloruro de tetrabutilamonio y azida de sodio en THF/DMF. La solución de azida de TBA resultante se recupera mediante la remoción de cristales de NaCl mediante la filtración. Una cantidad catalítica de un agente, tal como tris (dibenciledenacetona) -dipaladio o el aducto de cloroformo de este catalizador seleccionado para estabilizar un catión alílico, cloruro de amonio, epotilona B y la solución de THF/DMF de azida de TBA se cargan en un matraz con agitación. La suspensión espesa es desoxigenada al burbujear nitrógeno durante aproximadamente 25 minutos a 0-5°C. Se adiciona trimetilfosf ina a 0-5°C. La mezcla de reacción se calienta a 32-38°C y la agitación continua durante 4-16 horas para dar por resultado un producto intermedio de aminoácido resultante de la ruptura de la funcionalidad de éster. La mezcla de reacción se enfría a 18-24°C y se filtra para remover los sólidos. Los sólidos se lavan con THF y el producto filtrado se combina con el producto filtrado, abundante. Esta solución se adiciona gota a gota durante 9-10 horas a la suspensión espesa en THF-DMF del hidrato de 1-hidroxibenzotriazol, cloruro de 1- (3 -dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida y carbonato de potasio a 30-37°C. La mezcla resultante se enfría a 0-12°C, se enfria rápidamente con agua mientras que se mantiene la temperatura <10°C. La mezcla se extrae con acetato de etilo de tres a cuatro veces y las capas combinadas de acetato de etilo se diluyen con ciclohexano (relación de acetato de etilo-ciclohexano de 3:1) y se extraen nuevamente con agua . La capa orgánica se diluye adicionalmente a una relación de acetato de etilo-ciclohexano de 2:1 con ciclohexano adicional y se pasa a través de un cartucho impregnado con carbón vegetal activado, tal como Zeta Pad R51SP o R53SP para reducir la cantidad de Pd residual. Se adiciona trietilamina (1%) . al producto filtrado, orgánico y la solución se purifica mediante la filtración en una columna de gel de sílice con acetato de etilo-ciclohexano 2:1 que contiene 1% de trietilamina. El eluyente abundante se colecta y se concentra a <37°C a una concentración final de 11-14 mL/g. Se agrega ciclohexano adicional y la suspensión espesa se calienta a 67-78°C durante 45-60 minutos. La suspensión espesa se enfría lentamente a aproximadamente 21°C, se filtra y el sólido cristalino se lava con acetato de etilo-ciclohexano 1:1. La torta húmeda se seca al vacío a <45°C para producir un análogo de lactama cristalina de la epotilona B en un rendimiento de aproximadamente 56 M% .

Ejemplo 10 Formación de un Derivado de Epotilona Amino-Sustituido (Derivado 1} de Epotilona B La epotilona B se convierte a la epotilona F mediante la hidroxilacion enzimática del grupo 2-metilo en el anillo de tiazol de la epotilona B. La conversión se logra mediante la acción de una cepa de actinomicetos en epotilona B. Las cepas de actinomicetes para el uso en este paso se describen en la solicitud de patente norteamericana número de serie 10/321,188, presentada el 17 de Diciembre de 2002 y la patente WO 00/39276, ambas son incorporadas en este texto a manera de referencia. Se adiciona epotilona B en etanol (5% v/p) a los microbios, se desarrollan en un medio adecuado a 16-18°C y el pH se mantiene entre 6.9 y 7.1 ya sea con 50% de hidróxido de sodio p/v o 30% de ácido sulfúrico p/v. La bioconversión continúa hasta que la concentración de la epotilona B se reduce a 3-5% de su valor inicial. Una resina, tal como XAD-16 o SP207, que es capaz de adsorber la epotilona F se adiciona al tanque de fermentación (5% v/p) y se agita durante 16-72 horas a 10-18°C. El caldo de fermentación se decanta y la resina se lava con agua (relación de agua-resina 2:1) . El lavado se repite dos veces más. La mayor parte del agua residual se remueve mediante la filtración en un embudo Buchner .

La resina XAD-16, con la epotilona F previamente adsorbida, se mezcla espesamente con agua y se carga en una columna. Las columnas de resina se extraen con acetato de etilo y se colecta el eluato abundante. La capa acuosa se extrae y la fracción de acetato de etilo abundante entonces se lava con una solución de 5% de bicarbonato de sodio y agua para eliminar el color. La fracción orgánica, abundante se concentra bajo presión reducida, entonces se pasa a través de un filtro pre-revestido con sílice, seguido por el paso por un filtro abrillantador 10 µ?. El producto entonces se destila bao vacío y la epotilona F primaria se cristaliza mediante la adición de tolueno con agitación como un anti-solvente . La mezcla de tolueno abundante se concentra adicionalmente para reducir el contenido de acetato de etilo y se adiciona más tolueno. La suspensión espesa, cristalina se filtra y se lava con tolueno. La epotilona F se disuelve en cloruro de metileno o una mezcla de cloruro de metileno/acetato de etilo, entonces se carga en una columna cromatográfica empacada con sílice de grado de CLAR que ha sido equilibrada con una mezcla de acetato de etilo :n-heptano 60-80:40-20 (v/v) . El producto es eluido de la columna ya sea con un gradiente isocrático o gradual de una mezcla de acetato de etilo :n-heptano 60-80:40-20 (v/v), seguido por una mezcla de acetato de etilo :n-heptano 60-80:40-20 (v/v). La muestra y el procedimiento se supervisan por medio de la detección de radiación UV a 290 nm. El pico del producto de epotilona F es fraccionado para minimizar estrechamente la elusión de impurezas. Las fracciones reunidas, abundantes se destilan bajo vacío a una concentración objetivo de aproximadamente 100 g/L. A la suspensión espesa de la epotilona F, se adiciona un volumen igual de n-heptano con agitación. El lote se destila nuevamente bajo vacío a una concentración objetivo de aproximadamente 100 g/L, se adiciona acetato de etilo y la suspensión espesa se mantiene a 40°C. El lote se enfría de 2 a -10°C y se mantiene durante al menos 5 horas a esa temperatura para cristalizar el producto de la solución. La suspensión espesa, resultante se filtra y se lava con una solución fría de acetato de etilo/n-heptano 1:1. La torta final de epotilona F se seca bajo vacío a 35-40°C. Se adiciona lentamente 1 , 8-diazabiciclo [5.4.0] -undec-7-ano (DBU, 1.8 eq) a una suspensión de la epotilona F y azida de difenilfosforilo (1.5 eq) en tetrahidrofurano (secado previamente sobre 3? MS) y la reacción se agita a 15-25°C durante 12-24 horas. Se adiciona lentamente una solución de trimetilfosfina/tetrahidrofurano (1.0 M, 1.1 eq.) a la mezcla de reacción. Se adiciona agua e hidróxido de amonio y la mezcla se agita durante 30 minutos adicionales. La mezcla de reacción se diluye con agua y la fase acuosa se extrae con tres porciones de diclorometano . La fase orgánica entonces se lava con soluciones de hidróxido de amonio diluido y cloruro de sodio medio saturado y se evapora a sequedad proporcionar el derivado de amino crudo (Derivado funcionalizado en el grupo tiazol-metilo . producto crudo purifica mediante cromatografía en columna utilizando gel de sílice tratado previamente con 2.5% de metanol-0.2% de trietilamina-diclorometano . Las fracciones de calidad adecuada se combinan, se microfiltran y se evaporan a sequedad para proporcionar el derivado 1 cromatografiado. Este material se adiciona a acetato de etilo y la suspensión resultante se calienta a 72-75°C para obtener una solución. Se adiciona lentamente el anti-solvente n-heptano y la mezcla se deja enfriar lentamente en presencia de semillas con agitación a 15-25°C. Después del enfriamiento y el mantenimiento a ~ 5°C, el sólido resultante se aisla mediante la filtración seguida por el secado al vacío para proporcionar el derivado purificado de amino cristalino (Derivado 1) en un rendimiento promedio de aproximadamente 70 M% de la epotilona F. Ejemplo 11 Preparación de Epotilona D (Derivado 3) a partir de la Epotilona B [4S- [4R*, 7S*, 8R*, 9R* , 15R* (E) ] ] -4 , 8-Dihidroxi-5 , 5 , 7 , 9, 13-pentametil-16- [l-metil-2- (2-metil-4-tiazolil) etenil] -1-oxa-13 (Z) -ciclohexadecen-2 , 6-diona [epotilona D, Derivado 3]. Al THF anhidro (5 mi) a -78 °C bajo argón se adicionó C1S (198 mg, 0.5 mmol) seguido por nBuLi (0.625 mi de una solución 1.5 M en hexanos, 1.0 mmol). La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante un periodo de 20 minutos. Se removió una alícuota (0.50 mi, 0.05 mmol) del reactivo de tungsteno y se adicionó a la epotilona B (9.0 mg, 0.018 mmol) bajo argón y la mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos -y entonces se enfrió rápidamente por la adición de NaHC03 saturado (1 mi) . La mezcla de reacción se extrajo con EtOAc (3 1 mi), los extractos combinados se. _ secaron (Na2S0) , se filtraron y los productos volátiles se removieron bajo vacío. El residuo se sometió a la cromatografía con 35% de EtOAc/hexano para proporcionar el compuesto del título (7.0 mg, 0.014 mmol). EM m/z: 492.3 (M++H) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. 88 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un procedimiento para el aislamiento de la epotilona B a partir de un microorganismo productor de epotilona, caracterizado porque comprende los pasos que consisten en: (a) fermentar una cepa del microorganismo productor de epotilona en presencia de una resina que adsorbe la epotilona B mediante una interacción hidrófoba; (b) colectar la resina en un medio a base de agua; (c) extraer la resina con un solvente seleccionado para extraer la epotilona B y separarla del medio a base de agua; y (d) cristalizar la epotilona B de la fase de extracción antes de un paso de cromatografía. 2. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la epotilona B cristalizada del paso (d) es sustancialmente pura. 3. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la resina se extrae con un solvente polar. . El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de 89 fermentación además comprende alimentar un aditivo capaz de mejorar la cantidad de epotilona B producida en comparación con la cantidad de epotilona A producida. 5. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el aditivo es TASTONE™, MaltrinMR o glicerol . 6. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de fermentación comprende alimentar continuamente un aditivo capaz de mejorar la relación de epotilona B con epotilona A. 7. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el aditivo es una sal o éster de ácido propiónico. 8. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el aditivo es propionato sódico, éster metílico de ácido propiónico o éster etílico de ácido propiónico. 9. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cristalización se conduce para reducir la cantidad de epotilona A a aproximadamente 55% o menos de la cantidad de epotilona A presente después del paso de extracción (c) . 10. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además comprende (e) al menos un segundo paso de cristalización 90 efectivo para reducir la cantidad de epotilona A a aproximadamente 55% o menos de la cantidad de epotilona A presente después del paso de cristalización (d) . 11. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue el microorganismo productor de epotilona es Sorangium cellulosum. 12. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el microorganismo es la cepa de Sorangium cellulosum No. de ATCC PTA 3880. 13. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el microorganismo es la cepa de Sorangium cellulosum No. de ATCC PTA 3881. 14. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la resina es un polímero a base de estireno/divinilbenceno . 15. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la resina es XAD-16. 16. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso (d) comprende: (i) la adición de un segundo solvente en el cual la epotilona B es ya sea no soluble o escasamente soluble; (ii) la remoción de al menos una porción del solvente de extracción; y (iii) el cambio del solvente resultante o mezcla de solvente a una temperatura en la cual se cristaliza la 91 epotilona B. 17. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el solvente de extracción es acetato de etilo o MTBE y el segundo solvente es tolueno. 18. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende: (f) antes del paso (c) , el lavado de la resina con acetonitrilo acuoso, o metanol acuoso, o un medio acuoso que contiene un detergente y un reactivo de amina adicionado en forma básica, el medio acuoso se selecciona para no eluir la epotilona B. 19. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso (c) comprende además el paso por un filtro abrillantador del solvente que contiene la epotilona B. 20. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende convertir la epotilona B, o un solvato de la misma, al derivado 2 , o un solvato del mismo, que tiene la fórmula: derivado 2 92 21. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende convertir la epotilona B, o un solvato de la misma, al derivado 1, o una sal o solvato del mismo, que tiene la fórmul : derivado 1 22. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende convertir la epotilona B, o un solvato de la misma, al derivado 3, o un solvato del mismo, que tiene la fórmula: derivado 3 23. Un método para el cultivo de un microorganismo que produce la epotilona A o epotilona B, caracterizado porque comprende los pasos que consisten en: alimentar un cultivo del microorganismo que es cultivado bajo condiciones seleccionadas para promover la 93 producción de epotilonas con ácido propiónico, un precursor del mismo o una sal de uno de los anteriores, en donde la sincronización de la alimentación y la cantidad de ácido propiónico, un precursor del mismo, o una sal de uno de los anteriores, se seleccionan para proporcionar al menos un incremento de dos veces en una relación de epotilona B con epotilona A relativa a la relación de la epotilona B con la epotilona A producida por un cultivo del microorganismo cultivado en ausencia de la alimentación de ácido propiónico, un precursor del mismo, o una sal de uno de los anteriores; y aislar la epotilona B del cultivo. 2 . El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la sincronización del contacto y la cantidad de ácido propiónico, un precursor del mismo, o una sal de uno de los anteriores, se seleccionan para proporcionar al menos un incremento de tres veces en una relación de epotilona B con epotilona A. 25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la sincronización del contacto y la cantidad de ácido propiónico, un precursor del mismo, o una sal de uno de los anteriores, se seleccionan para proporcionar un incremento de la relación de epotilona B con epotilona A de al menos 1.5. 26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el microorganismo es una cepa de 94 Sorangium cellulosum. 27. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el ácido propiónico, un precursor del mismo, o una sal de uno de los anteriores, se selecciona durante o después de la fase de desarrollo del cultivo. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porgue además comprende alimentar el cultivo con una vitamina, un mineral, una fuente de carbohidratos o una fuente de aminoácidos en una cantidad que incremente la cantidad de epotilona B producida con relación a la cantidad de epotilona B producida en ausencia de la alimentación. 29. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque además comprende alimentar el cultivo con una mezcla de fosfato monobásico y dibásico. 30. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque además comprende convertir la epotilona B, o un solvato de la misma, al derivado 1, o una sal o un solvato del mismo, que tiene la fórmula: 95 31. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque además comprende convertir la epotilona B, o un solvato de la misma, al derivado 2, o un solvato del mismo, que tiene la fórmula: derivado 2 32. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque además comprende convertir la epotilona B, o un solvato de la misma, al derivado 3, o un solvato del mismo, que tiene la fórmula: derivado 3 33. Una cepa de Sorangium cellulosum, caracterizada porque produce, bajo condiciones comparativas de producción de epotilona B, al menos 5 mg de epotilona B/g de resina. 34. Una cepa de conformidad con la reivindicación 96 33, caracterizada porque produce epotilonas con una relación de epotilona B/A de al menos 1.0. 35. Una cepa de Sorangium cellulosum, caracterizada porque es depositada como el No. de ATCC ???-3880. 36. Una cepa de Sorangiv cellulosum, caracterizada porque es depositada como el No. de ATCC PTA-3881. 37. Un método para purificar una epotilona aislada del método de conformidad con la reivindicación 1 mediante la cromatografía líquida de alta resolución, de fase inversa (CIAR) , caracterizado porque comprende los pasos que consisten en: (a) equilibrar una columna de CLAR de fase inversa que comprende una resina de separación con un solvente orgánico, acuoso o una mezcla acuosa de solventes orgánicos; (b) proporcionar una muestra de carga disuelta en un solvente orgánico, adecuado o una mezcla de solventes orgánicos ,- (c) inyectar la columna con una muestra de carga y un volumen posterior de un solvente orgánico, adecuado o una mezcla de solventes orgánicos efectivos para reducir la precipitación de epotilona en el volumen de carga; y (d) eluir la columna con un solvente orgánico, acuoso o una mezcla acuosa de solventes orgánicos, que inicia con un contenido orgánico, inferior e incrementa después a más de aquel de la mezcla utilizada en el paso de equilibrio, para obtener la epotilona. 97 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la cromatografía líquida de alta resolución (CLA ) se realiza utilizando un aparato que comprende un volumen de carga interpuesto entre un orificio de inyección y una columna de separación. 39. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el solvente orgánico del paso (b) es sulfóxido de dimetilo. 40. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el solvente orgánico del paso (c) es sulfóxido de dimetilo. 41. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el solvente orgánico del paso (d) es acetonitrilo acuoso o metanol acuoso. 42. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el paso de inyección comprende utilizar un volumen inmediatamente precedente de sulfóxido de dimetilo que es efectivo para reducir la precipitación de epotilona en el volumen de carga. 43. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque además comprende: (e) cristalizar la epotilona para obtener la epotilona B purificada. 44. Un método para purificar una epotilona aislada del método de conformidad con la reivindicación 1 mediante la 98 cromatografía liquida de alta resolución de fase normal (CLA ) , caracterizado porque comprende: (a) equilibrar una columna de CLAR de fase normal que comprende un gel de separación o una resina con un solvente orgánico o una mezcla de solventes orgánicos; (b) proporcionar una muestra de carga disuelta en un solvente orgánico, o una mezcla de solventes orgánicos; (c) inyectar la columna con la muestra de carga; y (d) eluir la columna con un solvente orgánico, o una mezcla de solventes orgánicos, que inicia con un contenido de solvente menos polar e incrementa después a una mezcla de solventes más polar que aquella utilizada en el paso de equilibrio, para obtener la epotilona. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el solvente orgánico del paso (b) es dielorómetaño . 46. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el solvente orgánico del paso (d) es acetato de etilo o n-heptano. 47. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque además comprende el paso que consiste en: (a) cristalizar la epotilona para obtener la epotilona B purificada.