JP5193983B2 - エポチロンbの製造、単離および精製方法並びにエポチロンbのx線結晶構造 - Google Patents
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Description
本発明はエポチロンBの製造、単離、および精製の改良された方法に関する。これらの方法は例えばエポチロンBの製造のための発酵方法、樹脂への吸着による単離、およびその後の精製を含む
エポチロンは粘液細菌(Sorangium cellulosum)の発酵により初めて得られた比較的新しい種類のマクロライド化合物である。これらの化合物は最初、それらの抗真菌性のため植物保護剤として研究された。エポチロンは次に動物細胞へのそれらの細胞毒性のため興味が引かれ、その後チューブリン重合剤としてキャラクタライズされた。エポチロンは、パクリタキセル(TAXOL(登録商標))に似た微小管安定化剤効果、および腫瘍細胞および他の過度に増殖性の細胞の病気等の休息に増殖する細胞にたいして細胞毒性活性を発揮することが今知られている。化学治療剤としてのエポチロンの使用はBollag,et al., Cancer Research 55,2325,1995に記載されている。
エポチロンAおよびB(それぞれepoAまたはepoB)は次の構造を有している。
本発明はエポチロンBの製造のための改良された発酵方法に関する。
本発明は更にエポチロンの製造のため突然変異誘発により得られたSorangium cellulosumの新規な株を含む。
本発明は更に発酵に添加物を供給することによりSorangium cellulosumの新規な株により製造されるエポチロンBのAに対する比を改良するをも含む。1つの好ましい態様では、添加物はプロピオン酸塩、適当なpH調節をしたプロピオン酸、または他のプロピオン酸前駆体である。
本発明は樹脂を用いる発酵培地からエポチロンBの単離のための改良された抽出方法をも含む。エポチロンにとんだ樹脂を洗浄して不純物レベルを下げ、下流の処理を改良する方法をも含む。
本発明はエポチロンBの精製のための改良された方法をも含む。1態様では、精製は結晶化を用いて行われる。他の態様では精製は順相クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー的方法により達成される。さらに他の態様では精製は結晶化並びに順相および逆相クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーによる試料の精製により達成される。更なる態様では樹脂抽出は結晶化のみにより処理される。
エポチロンB(「epoB])は誘導体1(「D1」)(米国特許第6262094号に記載され、本明細書の一部を構成する)の製造における中間体として有用である。その誘導体ではチアゾール環の2−メチルがアミンで置換されている。
前に記載した一般的な記述および次の詳細な記載は例示的であり、限定的でないことを理解すべきである。
本発明は、特別な方法およびSorangium cellulosumの新規な変異体株に関し、主に発酵の間に製造されるエポチロンAの割合を減少させることにより、それらは一緒にまたは別々に改良されたエポチロンBを有する発酵物を製造する。Sorangium cellulosumまたは他の適当な微生物の細胞は、例えば、1以上の最初の増殖段階培養により拡大し、エポチロン製造発酵のための接種物を提供するのに用いられる。例えば24−72時間の近辺の、発酵の最初の時間の間、細胞増殖は細胞が培地中の栄養を利用するので生ずる。その後、ビタミン、ミネラル、炭水化物、アミノ酸(またはアミノ酸前駆体のような他の炭素または窒素源)等の栄養をエポチロンの製造に資する量培地に加える。1態様において、ビタミン、ミネラル、炭水化物、アミノ酸等の栄養は発酵の間エポチロンAまたはエポチロンBの最大製造を維持する量加える。1態様において、エポチロンAまたはエポチロンBの最大製造速度は、添加物または栄養の添加がない場合と比べてより大量のエポチロンAまたはエポチロンBが製造される製造割合か、もし添加物または栄養が至適より少ない量加えたなら生じたであろうより大きい製造割合をもたらす。発酵の間、プロピオン酸、その前駆体、またはそれらの塩をエポチロンAに対するエポチロンBの割合(生産物比)を増加させるに有効な量加える。
抽出と最初の結晶化の間にエポチロンBは最初の抽出物中に存在下するたいていの不純物、特にエポチロンAから分離される。プライマリーグレードのエポチロンBは典型的には主な不純物としてエポチロンAを含む。発酵に由来する2つの他の構造的に類似した不純物、即ち次のオキサゾールアナログおよびエチルチアゾールアナログも典型的には存在する。
出願人は本明細書に記載の発明的方法および材料を用いて様々なエポチロンBの結晶形を作った。エポチロンB結晶は様々な溶媒および溶媒システムを用いて得られた。例えば出願人はトルエンを含有するエポチロンB溶媒和結晶形を発見した。これをepoB−Toβと名付け、単位格子データを表1に示す。エポチロンBのトルエンを含有する溶媒和結晶形をさらに図9−12および図15および16に説明する。出願人は更にアセトニトリル(即ち、epoB−ANβ)、酢酸エチル(即ち、epoB−EAβ)およびイソプロピルアルコール(即ち、epoB−IPβ)、そしてまた実施例に記載した溶媒システムも用いてエポチロンB結晶をも得た。これらの結晶学的に同型構造の形は結晶のb軸にそって延びる親油性溶媒チャネルを含む(1チャネル/単位格子)P21スペース群を有する単斜晶系の包接構造を有する。各チャネルは、トルエン、アセトニトリル、酢酸エチル、イソプロピルアルコール、またはMTBE(理想的にはエポチロンBの1:1溶媒和物を生ずる)等の2までの溶媒分子を含み得る。トルエン/酢酸エチル溶媒混合物、例えば1:1混合物)からの結晶化は包接チャネル中にトルエンの優先的な導入を生ずる(即ちepoB−EAβではなく、epoB−Toβを得る)。エポチロンBの両方の水素結合ドナー(ヒドロキシル)はエポチロン間水素結合に関与し、ゲスト溶媒に結合し束縛するのに利用されない。
以下の用語は本願の目的のために以下に説明するそれぞれの意味を有する。
凍結バイアルまたは維持フラスコからの1mLを約10mLの培地E(成分は以下に記載)を含む125mLのフルオロに移す。F1フラスコは3−4日、30℃および160rpmでインキュベートする。
F1フラスコ(約10mL)からの全内容を90mLの培地Eを含む250mLのフラスコに移す(10%)。このF2フラスコは同様に3−4日、30℃および160rpmでインキュベートする。
製造フラスコ(90mLの培地Eを含む250mLフラスコ)をF2段階からの10%レベル(10mL)でインキュベートする。或いは、「維持フラスコ」を用いてもよく、これらは5%−10%の範囲のレベルで3−4日毎に培養物のルーチンなフラスコ移転に由来する。その製造相は少なくとも15g/Lの樹脂を導入する。接種すると、製造フラスコ30℃および160rpmで14日間インキュベートする。供給をエポチロンBのAに対する比を改良するため導入する。供給添加は以下のように接種後72時間で開始する。
「トルエン含有」とは、当業者により用いられる分析技術により測定したトルエンのある量を主に含む溶媒和物をいい、トルエン含有溶媒和は1以上の他の溶媒を含んでもよく、含まなくてもよい。
以下の実施例は外に詳細に記載した場合を除き当業者によく知られ、ルーチンである標準的な技術により実施される。
細胞バンクの突然変異および選択および製造による株SC16408の製造
株SC16408は、株So ce90B2(SC16224)のニトロソグアジニン(NTG)処理、その後のランダム選択に由来した。従ってSC16224を10mM Tris−HCl緩衝液中に懸濁し、60分間pH8.2で1mg/mL NTGに付した。NTGでの処理後、コロニー細胞ラインをコロニー選択により得、エポチロンB生産性およびB/A比について試験した。単離したコロニーはフラスコに移し、8−14日培養し、その後増殖培地(培地E)に3−4日毎に移した。
振とうフラスコ発酵によるエポチロンBを製造するための培養
凍結バイアル(1.5mL)からの細胞を125mlフラスコ中の45mLの培地Eに接種し、30℃、160rpmで4−8日間増殖させた(F1段階)。次に、5mLのF1段階を、45mLの培地を含む新しい125mLフラスコに移し、3−4日間増殖させた(F2段階)。F2段階細胞を次にエポチロンB発酵のための接種として用いた。10%の接種(5.0mL)を45mLの製造培地を含む125mLフラスコに移した。次にフラスコを30℃で2週間シェーカー(160rpm)中でインキュベートした。製造培地は改変した培地Eであり、1.6%(0.8g)のXAD−16樹脂を含む。振とうフラスコのための製造培地の組成を示す。
エポチロンA:5.0−7.0mg/g樹脂
エポチロンB:8.0−12.0mg/g樹脂
B/A比 :1.1−2.0
以前の株に比べ、SC16408培養は振とうフラスコでより多いエポチロンBを生ずる。
14Lファーメンターにおけるエポチロンを製造する培養
F1段階:2つの凍結バイアルからの3.0mLのアリコートを250mLフラスコ中の90mLの培地Eに接種し、30℃、160rpmで4−8日間増殖させる。
F2段階:20mL(10%)のF1段階細胞を500mLのフラスコ中の180mLの培地Eに移し、30℃、160rpmで2−4日間増殖させる。
F3段階:接種量を増加させるためにF2段階を繰り返す。各180mLの培地Eを含む6−8x500mLフラスコにF2段階からの20mlの接種物を移し、30℃、160rpmで2−4日間増殖させる。
F4段階:4Lのアスピレーターボトル中に1080mLの培地EにF3段階からの120mL(10%)を移し、次に30℃、160rpmで2−4日間増殖させる。
エポチロンB力価(mg/mL樹脂) B/A比
5−12 1.0−3.0
エポチロンの製造プロセス
50Lのファーメンター接種段階
F1段階として、培地E(2L)を作り、90mLを17の別の250mLフラスコに分配する。次にフラスコを121℃で30分間オートクレーブすること、により滅菌する。一つの凍結したバイアルからの細胞を各フラスコに接種し、約30℃160rpmで4−8日間増殖させる。
培地E*は、
接種物を800Lアウテンレススチールファーメンターで、細胞の質量が次の接種段階(5000Lファーメンター)を接種するに十分となるまで増殖させた。バッチのための
5000Lステンレススチールファーメンターをこの段階で接種工程で用いる。接種物をファーメンターで、細胞の質量が40000L製造ファーメンターを接種するに十分となるまで増殖させた。
40000Lステンレススチールファーメンターをエポチロンの製造に用いる。ファーメンターを滅菌し、滅菌した培地を満たしたとき、5000Lファーメンターで製造した種を接種する。具体的な製造パラメーターが達成された時、製造ファーメンターの内容を収穫する。
MTBEによるXAD−16樹脂からのエポチロンBの抽出および固体エポチロンBを与える結晶化:逆相クロマトグラフィーによる精製;および高品質エポチロンBの最終単離
収穫し、水洗した、エポチロン(約5.03kgのエポチロンB)を含むXAD−16樹脂(約550kg)をメタノール水溶液と混合し、抽出カラムにスラリーとしてロードした。パックされた樹脂をメタノール水溶液(30%次に50%のメタノールの各1ベッド容積)で洗浄し高度に極性の不要の物質を除去した。エポチロンはMTBE洗浄(約4ベッド容積)により除去した。豊富な溶出液を集め、ポリッシュ濾過する。水相を除去するための重力沈降の後、豊富なMTBEを濃縮する。濃縮物を重力沈降し水層を除去し、更なるMTBE(2ベッド容積)をバッチに加える。そのバッチを約5−15gエポチロンB/Lの濃度まで再濃縮する。バッチを5−6時間かけて約0℃に徐々に冷却することにより結晶化させる。結晶性の固体を濾過し、洗浄し、乾燥する。生じた生成物ケーキは暖かい酢酸エチルに溶解し、ポリッシュ濾過する。豊富な濾液を20−45gエポチロンB/Lの濃度まで真空下に濃縮する。70℃まで加熱後、バッチを次に0℃までゆっくり冷却し、結晶性スラリーを得、それを濾過し、冷酢酸エチルで洗浄し、40℃以下で乾燥し、単離された再結晶されたエポチロンBを得る(樹脂から84%の収率で)。この洗浄を逆相クロマトグラフィーにより次に精製する。
酢酸エチルによるXAD−16樹脂からのエポチロンBの抽出および非溶媒としてトルエンを用いて結晶化して固体のエポチロンBを得ること;逆相クロマトグラフィーによる精製;高品質エポチロンBの最終単離
エポチロンBを含むXAD−16樹脂を振動するスクリーン(SWECO TM)上で水により洗浄し、樹脂をきれいにした。この一部分(15.6gのエポチロンBを含む約6.6L、1gの樹脂あたり2.36mgのエポチロンB)を、水で樹脂を濯ぐため約5Lの水を用いて20Lの容器に移す。酢酸エチル(投入樹脂の約2ベッド容積(BV))を次に容器に添加する。そのスラリーを約1時間攪拌し、600mLのスクリューキャップ遠心分離ジャーを用いて、3500rpmで5分間遠心分離し、相を分離する。最初の豊富な酢酸エチル上澄をデカントし、その容積を測定する。次に中身のない水性樹脂を含む底相を容器にプールし、酢酸エチル(2BV)を容器に加える。スラリーを約1時間攪拌し、次に遠心分離し相分離させる。第二の豊富な酢酸エチル上澄をデカントし、その体積を測定する。
酢酸エチルによるXAD−16からのエポチロンBの抽出および非溶媒としてのトルエンによる結晶化に続くプライマリーグレードエポチロンBを与える再結晶化;順相クロマトグラフィーによる精製;および高品質エポチロンBの最終単離
工程A.EtOAc抽出−トルエン結晶化を用いるプライマリーグレードエポチロンBの製造
水で洗ったエポチロンBの豊富な樹脂(1350g)をカラムに充填した。水(2700mL)を用いてカラムに充填し濯いだ。エポチロン活性は9450mL(7ベッド容積)の酢酸エチルを通すことのより溶出させた。酢酸エチル溶出液を少なくとも1時間沈降させた。暗褐色の水層およびエマルジョン層を除去した。豊富な酢酸エチル溶液を約20gのエポチロンB/Lの標的濃度まで真空下に濃縮する。濃縮物を2時間放置し、20℃まで冷却した。冷却した濃縮物はポリッシュ濾過し、フィルターを酢酸エチル(36mL)で洗浄した。一緒にした濾液および洗浄を約80gのエポチロンB/Lまで濃縮する。等容量のトルエンを攪拌しながら10−15分にわたって添加し、温度を60℃以上に保った。温度を65℃で30分間保ち、次に1.5時間にわたって40℃に下げ、次に2時間にわたって1℃に温度を下げた。生じた結晶性スラリーは少なくとも60分の間1℃で攪拌する。その固体を濾別し、トルエン(スラリー容量の20%)で洗浄する。(この方法の様々な繰り返しで、母液は2−6%の投入エポチロンB活性を典型的には含む)。その固体を真空下にオーブン中で40−45℃で少なくとも4時間乾燥する。或いは、その固体を約40℃と室温の間の温度で真空下にオーブン中で乾燥する。
評価した5つのロットについて
EtOAc(0.14L)を15gのプラマリーグレードエポチロンB(710μg/mg)に添加し、攪拌しながら65−68℃に加熱する。(エポチロンBの標的濃度は75−80g活性/Lである)。トルエン(0.14L)を20分かけて添加し、温度を60℃以上の温度に保持した。生じたスラリーを65℃で0.25−1時間保つ。次にバッチ3時間かけて40℃に冷却する。バッチの冷却を0−2℃まで2時間続ける。生じた結晶性スラリーを次に濾過し、ケーキをトルエン(2x0.028L)で洗浄する。典型的には、3%未満の投入エポチロンB活性が一緒にした母液および洗浄へと失われる。そのケーキは真空オーブン中で42℃および29in.Hgで2時間乾燥する。或いは、ケーキは真空オーブン中で40℃および室温の間の温度で、29in.Hgで2時間乾燥する。乾燥ケーキ重量は13.6gであり、力価は764μg/mgである。残存溶媒はEtOAc(0.9%)およびトルエン(13.2%)を含む。典型的には、EtOAcおよびトルエンは13−14重量%の合わせたレベルで存在する。再結晶化されたケーキについてエポチロンBに対するエポチロンAの面積5は平均6.9%まで落ちた。
次の移動層を調製する:
20%(v/v)酢酸エチル/n−ヘプタン溶液(約10L)
40%酢酸エチル/n−ヘプタン溶液(約10L)、および
100%酢酸エチル(約10L)。
次の装置を準備した:
Walters Delta Prep4000; 検出器:290nmにおけるUVセット;カラム:Phenomenex Luna,10 ミクロン、シリカ(2)、5.0x25cm(カラム容積約490mL)。
所望のハートカット画分をプールし、1.62−1.73Lのバッチ容積を得る。溶媒を真空下に40−45℃で除去する。標的蒸留容積は25−28mLである(エポチロンB濃度約200−210g/L)。濃縮物に暖かい(約40℃)ヘプタン(50mL)を加える。或いは、暖かい(約40℃)EtOAc(50mL)をこの段階で濃縮物に加えうる。生じたスラリーを約40℃で約2時間攪拌し、次に5時間かけて約0℃に冷却し、約0℃で最低5時間攪拌する。中間の早さの機械的攪拌を結晶化中用いる。結晶性のスラリーを濾過し、ケーキを冷1:1EtOAc/ヘプタン(25mL)で洗浄する。その固体を真空下に40−45℃で5−6時間乾燥させる。或いは、固体を真空オーブン中で40℃および室温の間の温度で5−6時間乾燥させる。単離されたエポチロンBの重量(5バッチについて)は結晶化(1回)エポチロンBから約4.2−5.0g(83.5−85.6%活性収率)であり、HPLC純度は99.78−99.93%面積パーセント(平均99.80%)である。母液中に失われたエポチロンBは、クロマトグラフィーへのエポチロンB活性投入に関して約4%である。ケーキ中の残存溶媒はEtOAc(5.8−6.0%w/wおよびヘプタン(0.6−0.7%w/w)である。最後のエポチロンBケーキの力価は91.5−92.7%w/wである。HPLC純度は99.7面積パーセント以上である。この工程で記載した方法に従って得られた結晶溶媒和物のPXRDパターンおよび熱分析を図13および14に示す。図14に見られるように、上の方法により製造し乾燥した酢酸エチル溶媒和物についての融点は約102℃である。図13のPXRDパターンは上の表8に記録されたデータによりさらに特徴付けられる。
樹脂からのエポチロンBの抽出とその後の繰り返し再結晶化
見積もられた4.10KgのエポチロンB活性(エポチロンBについての面積%=58.0%;エポチロンA=29.2%)を含む水洗したエポチロン豊富な樹脂(549.8kg)を水でスラリー化し、カラムに充填した。カラムをドレインし、窒素を吹き込んだ。酢酸エチル(2969Kg)を次に全体で約6ベッド容積に対して1時間あたり約1ベッド容積の速度でカラムを通して溶出させた。一緒にした豊富な酢酸エチル溶出物を1時間重力沈降させ、下の水層を除去した。その豊富な酢酸エチルを次に約574kgまで次に濃度した。濃縮した豊富な酢酸エチルを次に約20℃で2日間放置したのちポリッシュ濾過した。フィルターおよびラインを酢酸エチル(全体約115kg)で洗浄した。ポリッシュ濾液および洗浄を次に約64Lの容積まで濃縮し、次に約65℃まで暖めた。等しい容積の暖かいトルエンを次に攪拌しながら加え、その物質を約65℃に約30分保った。次にそのバッチを約4時間かけて約40℃にゆっくり冷却後、約2.5時間かけて0℃まで冷却した。その冷スラリーを約0℃に約1時間保った。生じた結晶性スラリーを次に濾過し、ケーキをトルエン(約64L)で洗浄した。その生じたケーキを真空下に短く乾燥し、次に温酢酸エチル(約200kg)を用いてフィルタードライアーから再溶解した
母液ストリームからのEpo Bの回収
MTBEまたはETOAc抽出からEpo Bの結晶化からの母液を一緒にし、溶液1リッター当たり2.2gのEpo Bおよび4.8gのEpo Aを含んでいた。この溶液10Lを真空下に<50℃で11−15gEpo B/Lまで濃縮した。1容量のトルエンを加え、固体が形成しはじめた。11−15gのEpo B/Lの濃度が再び達成されるまで蒸留を続けた。1容量のトルエンを再び加え、蒸留をもう1度繰り返し11−15gEpo B/Lに達した。そのスラリーを1時間かけて室温まで冷却し、次に90分撹拌した。その混合物を約50℃まで再加熱し、1時間攪拌し、1時間かけて室温まで冷却した。最低3時間攪拌後、その固体を濾過により集め、トルエンで洗浄し、次に真空下に約40℃で乾燥し、約92%のEpo B活性を回収した。その固体は16%w/wを有する42.9%w/wのEpo Bと分析された。母液は66%の投入エポチロンAおよび僅か5%の投入エポチロンBを含んでいた。
646mgのEpo Bを含む、を実施例7で説明した順相クロマトグラフィーからの、プールしたハートカット(200mL)を43mLのトルエンにゆっくり加え、ジャケット温度約65℃で約43mLまで真空下に濃縮した。トルエン(43mL)を真空下に加え、蒸留をジャケット温度約65℃で続けた。そのスラリー約43mlまで濃縮し、次に約3時間かけて約20℃まで冷却した。結晶を集め、2x5mLのトルエンで洗浄し、真空下に(29’’Hg)約40℃で30分間乾燥し、729mgの単離した結晶性ケーキを得た(85.3%w/w Epo B)。HPLC純度は99.77面積%であった(トルエン面積%を除く)。ケーキ中の残存溶媒は15.3%w/wトルエンおよび0.3%w/w EtOAcであった。母液および洗浄液は僅か5%のエポチロンB投入活性を含んでいた。
特殊な結晶形の製造
実施例8A:epoB−TOβの製造
エポチロンBトルエン溶媒和物の製造
epoBを約13mLの酢酸エチルに約40℃で溶解した。1容量のトルエンを加え、バス温度<40℃で9mLまで濃縮した。これを約55℃まで再加熱した後、もう1容量のトルエンを添加した。これを次に約10mLまで濃縮し、18℃まで冷却した。そのスラリーをx線構造決定に用いた
エポチロンBアセトニトリル溶媒和物の製造
アセトニトリル水溶液中の実質的に純粋なエポチロンBの溶液(実施例5の逆相クロマトグラフィーから生じたプールされたカラム画分からの)を室温でゆっくりと蒸発させ、アセトニトリル−水からの結晶スラリーを得た。その結晶スラリーはX線分散により直接的に調べた。
エポチロンB EtOAc溶媒和物の製造
1:1EtOAc/ヘプタン中のエポチロンBの溶液を約190−195g/Lの標的濃度まで濃縮した。エポチロンBのこの粘ちょうなスラリーに攪拌しながら10容量のEtOAcを約40℃で添加した。生じたスラリーを40℃で2時間攪拌し、5時間かけて0℃まで冷却し、最低5時間0℃で更に攪拌した。そのスラリーを濾過し、そのケーキを冷たい1:1EtOAc/ヘプタンで洗浄する。そのケーキを真空オーブン中で5−6時間乾燥し、約5−14%のEtOAcを有する最終エポチロンBを得た。
エポチロンB IPA溶媒和物の製造
エポチロンB(70mg)を4mLのIPAに、透明な溶液ができるまでその溶液を加熱することにより溶解した。この溶液を常温まで冷却した。直ちに生じた固体を濾過により除去した。透明な濾液を小さい試験管に入れ、数個のピンホールを有するアルミニウムホイルでカバーした。溶媒を、常温で非常にゆっくりと数日かけて、実質的な結晶成長が観察されるまで蒸発させた。結晶を湿潤スラリーとしてx線分析のため提供した。
エポチロンB(ラクトン)からの誘導体2(ラクタム)形成
テトラブチルアンモニウムアジド(TBAアジド)溶液を、THF/DMF中のテトラブチルアンモニウムクロライドおよびアジドナトリウムを混合することにより、製造した。生じたTBAアジド溶液を濾過によるNaCl結晶の除去により回収した。トリス(ジベンジレデンアセトン)−ジパラジウム等の触媒量の試薬またはアリルカチオンを安定化させるために選択されたこの触媒のクロロホルム付加物、塩化アンモニウム、エポチロンBおよびTBAアジドのTHF/DMF溶液を攪拌しながらフラスコに入れた。そのスラリーを約25分間0−5℃で窒素をバブリングすることにより脱酸素した。トリメチルフォスフィンを0−5℃で添加した。その反応混合物を32−38℃まで加熱し、攪拌を4−16時間続け、エステル官能性の破損から生じるアミノ酸中間体を製造した。反応混合物を18−24℃に冷却し、濾過し固体を除去した。その固体をTHFで洗浄し、濾液を豊富な濾液と一緒にした。この溶液を9−10時間かけて、1−供給ロキシベンゾトリアゾール水和物、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩および炭酸カリウムのTHF/DMFスラリーに30−37℃で滴加した。生じた混合物を0−12℃に冷却し、温度を<10℃に保ちながら水でクエンチした。その混合物を酢酸エチルで3−4回抽出し、一緒にした酢酸エチル層をシクロヘキサンで希釈し(3:1酢酸エチル−シクロヘキサン比)、水で逆抽出する。有機層を更なるシクロヘキサンにより2:1酢酸エチル−シクロヘキサン比まで希釈し、Zeta Pad R51SPまたはR53Sp等の活性炭浸せきカートリッジを通した。トリエチルアミン(1%)を有機の濾液に加え、その溶液を1%のトリエチルアミンを含む2:1酢酸エチル−シクロヘキサンを用いるショートシリカゲル濾過により精製した。豊富な溶出液を集め、<37℃で最終濃度11−14mL/gまで濃縮した。更なるシクロヘキサンを添加し、スラリーを67−78℃で45−60分加熱する。そのスラリーを約21℃までゆっくり冷却し、濾過し、結晶性固体を1:1酢酸エチル−シクロヘキサンで洗浄した。湿ったケーキを真空下に<45℃で乾燥し、約56M%収率でエポチロンBの結晶性ラクタムアナログを得た。
エポチロンBからのアミノ置換エポチロンB誘導体(誘導体1)の形成
エポチロンBを、エポチロンBのチアゾール環の2−メチル基の酵素的供給ロキシル化によりエポチロンFに変換した。その変換は、エポチロンBへのactinomycete株の作用により達成される。この工程で使用するためのactinomycete株は、2002年12月17日に出願された米国特許出願第10/321188号およびWO 00/39276号に開示されており、両者は本明細書の一部を構成する。
エポチロンBからエポチロンD(誘導体3)の製造
アルゴン下の−78℃の無水THF(5ml)にWCI6(198mg,0.5mmol)、次にnBuLi(ヘキサン中の1.6M溶液の0.625ml、1.0mmol)を添加した。反応は20分の期間にわたって室温まで暖めた。タングステン試薬のアリコート(0.50ml、0.05mmol)を除去し、アルゴン下にエポチロンB(9.0mg、0.018mmol)に添加し、反応混合物を15分攪拌し、次に飽和NaHCO3(1ml)の添加によりクエンチした。反応混合物をEtOAc(3x1ml)で抽出し、併せた抽出物を乾燥し(Na2SO4)、濾過し、蒸発物を真空下に除去した。残渣を35%EtOAc/ヘキサンでクロマトグラフィーし、標記化合物(7.0mg、0.014mmol)を得た。MS m/z:492.3(M++H)
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