KR101372563B1 - 에포틸론 함유물질로부터 에포틸론 ａ와 ｂ의 추출 및 정제 방법 - Google Patents

에포틸론 함유물질로부터 에포틸론 ａ와 ｂ의 추출 및 정제 방법 Download PDF

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Abstract

에포틸론 함유물질로부터 에포틸론을 추출 및 정제하는 방법 및 상기 에포틸론 추출 및 정제 방법을 통해서 고순도의 에포틸론 A와 B를 분리하는 방법이 제공된다.

Description

에포틸론 함유물질로부터 에포틸론 Ａ와 Ｂ의 추출 및 정제 방법{Method of isolating and purifying epothilone A and B from epothilone containing material}
본 발명은 에포틸론 함유물질로부터 에포틸론을 추출 및 정제하는 방법 및 상기 에포틸론 추출 및 정제 방법을 통해서 고순도의 에포틸론 A와 B를 분리하는 방법에 관한 것이다.
믹소박테리아에 속하는 점액 세균인 소란지움 셀룰로좀은 '에포틸론'이라고 하는 생리활성 물질을 생산하는데, 이 물질의 항진균 활성이 Gerhard Hofle와 그의 동료들에 의해 최초로 확인되었다 [1]. 그 후 에포틸론은 튜불린 중합 에세이에서 항종양 활성을 가지는 것으로 알려졌고, 이후로 암치료를 위한 잠재 항-종양제로서 광범위하게 연구되어 왔다. 현재 에포틸론은 암 치료에 가장 많이 쓰이고 있는 탁솔(Taxol: 성분명 파클리탁셀)이나 탁소텔 등의 항암제처럼 미세소관(microtubule)을 안정화시키고 세포 분열을 억제함으로써 암세포의 증식을 막는 것으로 알려져 있다 [2].
소란지움 셀룰로좀 So ce 90 균주에 의해 생산된 에포틸론의 화학 구조는 Hofle et al. 1996, Epothilone A and B-novel 16-membered macrolides with cytotoxic activity: isolation, crystal structure, and conformation in solution, Angew, Chem, Int, Ed. Engl. 35(13/14): 1567-1569에 개시되어 있다. 에포틸론 A(R=H), B(R=CH3)는 하기의 구조를 가지며, 진핵 세포에 대해 광범위한 세포독성 활성과 유방 종양 및 결장 종양 세포주에 대해 두드러진 억제 활성 및 선택성을 갖는 것으로 나타났다 [3]. 에포틸론 구조를 아래의 화학식 1에 나타내었다 (에포틸론 A: R=H, 에포틸론 B: R=CH3).
Figure 112011103565635-pat00001
믹소박테리아에 의한 천연물의 추출은 세포 균주 소랄지움 셀룰로좀의 배양에 의하여 에포틸론을 만족할만한 수준으로 얻기 위해서, 폴리스티렌에 기초한 합성 수지를 항상 배양 배지에 가하여, 예를 들면 Amberlite XAD-16(Rohm & Hass, Germany)와 같은 고분자 흡착제에 흡착되도록 하였다. 흡착된 물질을 메틸-t부틸 에테르(MTBE)와 같이 극성이 약하거나 무극성인 용매로 추출 하여 결정화를 통해서 정제를 실시 하였다[4][5][6]. 그러나, 이러한 방법들은 대량 생산시 고가 용매를 사용해야 하고 수율이 떨어지는 문제점이 있다.
이러한 문제를 해결하기 위하여, 메탄올과 같은 알코올을 용매로 하여 추출하면 비용이 적게 들고 수율은 높지만, 순도가 떨어지는 문제점이 있다. 또한, 추출액을 바로 고속 액체 크로마토그래피에 사용하면 컬럼 수명이 빨리 줄어들고 비용 소모가 많아져서 경제성이 낮아지는 문제가 있다[5].
따라서, 이들 추출액으로부터 산업적으로 이용할 수 있는 저렴한 용매를 가지고 고순도 제품을 만들기 위한 방법이 필요하고, 저가의 유기용매 추출물에서 합성 흡착제를 처리하여 불순물을 제거하고 탈색을 통해서 깨끗한 처리를 하기 위하여, 고속 액체 크로마토그래피에 사용되는 고가의 충진제 대신 저렴한 충진제를 사용하여 고속 액체 크로마토그래피를 오래 사용 할 수 있도록 하는 추출 및 정제 방법의 개발이 필요한 실정이다.
참고문헌
1. Gerth, K. and Bedorf, N. et al., 1996. Epothilones A and B: antifungal and cytotoxic compounds from sporangium cellulosum(myxobacteria) production, phsico-chemical and biological properties. The journal of antibiotics. 49:560~563.
2. Bollag, D. and Mcquency, P.et al., 1995.Epothilones, a New class of microtubule-stabilizating agents with a taxol-like mechanism of action.Cancer Research., 55:2325~2333.
3. Kowalski R.J., Giannakakou P. and Hamel E. 1997. Activities of the microtubule-stabilizing agents epothilones A and B with purified tubulin and in cells resistant to Paclitaxel. The Journal of Biological Chemistry 272(4):2534-2541.
4. WO 93/10121
5. WO 2002/46196
6. WO 2004/026254
이에 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 에포틸론 함유물질로부터 효율적으로 에포틸론을 정제하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 일례는,
(a) 에포틸론 함유물질에 제1 유기용매를 가하여 추출하여 추출물을 얻는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 추출물에 물과 혼합되지 않는 제2 유기용매를 가하여 비극성 유기용매 층을 분리하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)에서 얻어진 비극성 유기용매 층을 흡착제로 처리하고 여과하여 얻어진 여과물을 C5 내지 C10의 알칸에 첨가하여 침전물을 얻는 단계;
(d) 상기 단계 (c)에서 얻어진 침전물을 제3 유기용매에 녹이고 순상 크로마토그래피를 수행하여 용출물을 분리하는 단계; 및
(e) 상기 단계 (d)에서 얻어진 용출물을 고속액체 크로마토그래피로 정제하는 단계
를 포함하는 에포틸론 분리 방법을 제공한다.
또 다른 예는,
(a-1) 에포틸론 함유물질에 제1 유기용매를 가하여 추출하여 추출물을 얻는 단계;
(b-1) 상기 단계 (a-1)에서 얻어진 추출물에 물과 혼합되지 않는 제2 유기용매를 가하여 비극성 유기용매 층을 분리하는 단계;
(c-1) 상기 단계 (b-1)에서 얻어진 비극성 유기용매 층을 흡착제로 처리하고 여과하여 얻은 여과물을 C5 내지 C10의 알칸에 첨가하여 침전물을 형성하는 단계;
(d-1) 상기 단계 (c-1)에서 얻어진 침전물을 제1 유기용매에 녹이고 역상 크로마토그래피를 실시하여 용출물을 분리하는 단계; 및
(e-1) 상기 단계 (d-1)에서 얻어진 용출물을 결정화하는 단계
를 포함하는 에포틸론 분리 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 사용된 바로서, '에포틸론 함유물질'은 믹소박테리아 (myxobacteria) 미생물, 상기 미생물에서 유래된 세포, 상기 세포를 배양한 조직, 상기 세포 및/또는 배지를 포함하는 세포 배양물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미한다. 상기 믹소박테리아는 Cystobacterineae 아목 및 Sorangineae 아목에 속하는 균으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 Cystobacterineae 아목은 Myxococcaceae의 myxococcus, corallococcus, 또는 angiococcus 속일 수 있으며, Cystobacteraceae 의 archangium, cystobacter, melittangium, 또는 stigmetella 속일 수 있다. 또한, 상기 Sorangineae 아목은 Polyangiceae의 polyangium, haploangium, chondromyces, 또는 속일 수 있고, Nanocystaceae 의 Nannocystis 속 일수 있다. 상기 미생물은 바람직하게는 myxococcus, 또는 sporangium 속, 더욱 바람직하게는 소랜지움 셀룰로좀일 수 있다.
상기 배양물은 스티렌/디비닐벤젠 중합체 수지 (예컨대, XAD 수지, HP 수지)와 같은 수지와 함께 배양된 것일 수 있다. 상기 수지는 바람직하게는 합성 수지, 예를 들면 매트릭스로서의 폴리스티렌 기재의 수지, 예를 들면 앰버라이트 XAD-16 (롬 앤드 하스사, 독일) 및 디아이온 HP-20 (미쯔비시 케미칼사) 중 1종 이상을 사용할 수 있다. 에포틸론 물질이 세포 안에서 배양액 밖으로 분비되기 때문에 배양액 내의 수지는 이것을 흡착하여 에포틸론 과생산을 더욱 유도하고, 에포틸론의 용이한 회수를 가능하게 해 주므로 배양 시 첨가하여 사용할 수 있다.
상기 단계 (a) 또는 (a-1)에서 에포틸론 함유물질에 첨가하는 제1 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올 (예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올), 디클로로메탄, 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide; DMSO) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 바람직하기로는 상기 유기용매는 메탄올일 수 있다. 상기 제1 유기용매는 에포틸론 함유 물질(수지를 포함하는 경우, 수지의 무게 포함 기준)을 기준으로 5 내지 50%(w/v)로, 바람직하게는 10 내지 30%(w/v)의 양으로 가할 수 있으며, 0 내지 40℃, 구체적으로 10 내지 35℃, 예컨대, 상온에서 1 내지 60분, 구체적으로 20 내지 40분, 예컨대, 약 30분간 교반하여 여과하는 과정을 3회 이상, 예컨대 3 내지 10회 반복하여 에포틸론과 에포틸론 유도체를 추출할 수 있다.
이와 같이 얻어진 추출액은 감압농축 등의 통상적인 방법으로 농축할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 '추출물'은 특별한 언급이 없는 한 통상적인 방법으로 농축된 농축물을 포함하는 개념이다.
상기 단계 (b) 또는 (b-1)에서는 상기 단계 (a) 또는 (a-1)에서 얻은 추출물(또는 이의 농축물)에 비극성인 제2 유기용매를 10% 내지 100%(v/v), 바람직하게는 25% 내지 50%(v/v)의 양으로 가하여 교반하고 분배시킨 후 비극성 유기용매층을 분리한다. 비극성 유기용매층 분리는 1회 이상, 예컨대, 2회 내지 10회 반복실시 할 수 있다. 이와 같이 분리된 유기용매 층은 통상적 방법으로 농축 (예컨대, 감압농축) 및/또는 건조시킬 수 있다. 따라서, 단계 (b)에서 얻어지는 유기용매층은 그대로 사용되거나 농축물 또는 건조물 형태로 사용될 수 있다.
상기 단계 (b)에서 사용되는 제2 유기용매는 물과 섞기지 않은 용매이며, 예컨대 비극성 유기용매일 수 있다. 예컨대, 상기 제2 유기용매는 디클로로메탄, 카본 테트라클로라이드, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄 등의 탄소수 1 내지 4의 알킬할라이드; 디-에틸 에테르(di-ethyl ether), 메틸-t-부틸 에테르(methyl-t-butyl ether), 디-이소-프로필 에테르(di-iso-propyl ether) 등의 탄소수 2 내지 6의 에테르; 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 등의 탄소수 2 내지 6의 카르복시산 에스테르; 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone) 등의 탄소수 3 내지 6의 케톤 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
단계 (b) 또는 (b-1)를 통하여 극성 물질을 제거한다.
상기 단계 (c) 또는 (c-1)에서는 타르 등의 불순물을 제거하기 위하여, 흡착제, 바람직하게는 합성 흡착제를 처리하는 것을 특징으로한다.
우선, 상기 단계 (b) 또는 (b-1)에서 얻어진 산물은 그대로 사용하거나, 유기용매를 산물 중량 기준으로 100 내지 1000 %(v/w), 바람직하게는 300 내지 600%(v/w)의 양으로 가하여 용해시킨 후 사용할 수 있다. 상기 단계 (b) 또는 (b-1)에서 얻어진 산물 또는 이의 유기용매 용해물에 합성 흡착제를 상기 용해물 중량 기준으로 20 내지 100%(w/w), 구체적으로 30% 내지 50%(w/w)의 양으로 첨가하여 10 내지 60분간, 구체적으로 20 내지 40분, 예컨대 약 30분 정도 동안 0 내지 40 ℃, 구체적으로 15 내지 35℃, 예컨대 상온에서 교반한다.
단계 (c) 또는 (c-1)에서 (b) 또는 (b-1)에서 얻어진 비극성 유기용매 층을 용해시키기 위하여 사용될 수 있는 유기용매는 단계 (b) 또는 (b-1)단계에서 정의한 제2 유기용매 종류에서 선택된 것으로, (b) 또는 (b-1)단계에서 사용된 제2 유기용매와 동일하거나 상이한 물질일 수 있다. 예컨대, 본 단계에서 사용되는 유기용매는 디클로로메탄, 카본 테트라클로라이드, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄 등의 탄소수 1 내지 4의 알킬할라이드; 디-에틸 에테르(di-ethyl ether), 메틸-t-부틸 에테르(methyl-t-butyl ether), 디-이소-프로필 에테르(di-iso-propyl ether) 등의 탄소수 2 내지 6의 에테르; 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 등의 탄소수 2 내지 6의 에스테르; 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone) 등의 탄소수 3 내지 6의 케톤 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 단계 (b) 또는 (b-1)단계에서 사용한 제2 유기용매와 상이하거나 동일한 물질일 수 있다.
이 단계에서 사용 가능한 흡착제는 백토, 활성탄, 실리카겔, 알루미늄 옥사이드, 다공성 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 실리카 계열의 실리카겔(예컨대, sylopute)를 사용할 수 있다. 상기 흡착제의 처리량은 상기 얻어진 유기용매층(건고물) 중량 기준으로 20 내지 100 중량%, 구체적으로 30 내지 50 중량%의 양으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같이 흡착제 처리 후, 얻어진 산물을 감압 여과 등의 통상적 방법으로 여과하여 얻어진 여과물을 수집하여 다음 단계에 사용한다. 상기 여과물은 필터를 통과한 여액 (즉, 흡착물 이외에 필터를 통과한 여액, 이하 '통과여액'), 필터 상에 남은 여과 케이크 (즉, 여과 이후에 필터를 통과하지 못하고 필터 상에 잔류하는 흡착물 부분), 및 상기 여과 케이크에 유기용매를 흘려 보내어 얻어진 여액 (즉, 여과 케이크의 유기용매 추출액, 이하 '추출여액')으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 통과여액과 추출여액의 혼합물일 수 있다. 예컨대, 상기 여과물은 필터를 통과한 통과여액을 수집하고, 이를 필터 상에 잔류하는 여과 케이크를 유기용매로 추출하여 얻어진 추출여액과 합하여 준비된 것일 수 있다. 상기 통과여액 및 추출여액에는 흡착제에 흡착되어 있던 에포틸론이 유기용매에 의하여 녹아 나와서 포함되어 있다.
이 때 여과 케이크 추출에 사용되는 유기용매는 디클로로메탄 등과 같이 앞서 설명한 단계 (b)에서 얻어진 비극성 유기용매 층을 용해시키기 위하여 사용 가능한 유기용매 중에서 선택된 것, 즉 디클로로메탄, 카본 테트라클로라이드, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄 등의 탄소수 1 내지 4의 알킬할라이드; 디-에틸 에테르(di-ethyl ether), 메틸-t-부틸 에테르(methyl-t-butyl ether), 디-이소-프로필 에테르(di-iso-propyl ether) 등의 탄소수 2 내지 6의 에테르; 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 등의 탄소수 2 내지 6의 에스테르; 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone) 등의 탄소수 3 내지 6의 케톤 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 비극성 유기용매 층을 용해시키기 위하여 사용된 유기용매와 동일한 것일 수 있다. 여과 케이크의 추출(세척)에 사용되는 유기용매의 사용량은 여과 케이크 기준으로 400%(v/v) 이상, 구체적으로 400%(v/v) 내지 1000%(v/v)일 수 있다.
상기 얻어진 통과여액 및/또는 추출여액을 통상의 방법으로 감압 농축하는 단계를 임의로 수행할 수 있다.
단계 (c) 또는 (c-1)에 있어서, 상기 얻어진 여과물 (통과여액 및/또는 여과 케이크 및/또는 상기 여과 케이크의 추출여액) 또는 이의 감압농축물에 탄소수 5 내지 10의 알칸, 예컨대 헥산 및/또는 펜탄을 가하여 침전물을 얻는다.
이 때, 추출 여액 또는 이의 감압 농축물의 고형분 함량이 많은 경우, 침전물 생성을 용이하게 하기 위하여, 이들 여과물 또는 감압 농축물을 유기용매에 용해시켜 유기용매 용해물 상태로 사용할 수 있다. 이 때 사용 가능한 유기 용매는 앞서 설명한 비극성 유기용매 층의 용해 또는 여과 케이크의 추출에 사용 가능한 유기용매 중에서 선택된 것일 수 있으며, 상기 비극성 유기용매 층의 용해에 사용된 유기용매 및/또는 여과 케이크의 추출에 사용된 유기용매와 동일하거나 상이한 것일 수 있으며, 예컨대, 디클로로메탄 또는 아세톤일 수 있다. 또한, 이 때 사용되는 유기용매의 사용량은 여과물 또는 그의 감압농축물의 중량을 기준으로 5 내지 40%(w/v), 바람직하게는 10 내지 30%(w/v) 일수 있다.
탄소수 5 내지 10의 알칸의 사용량은 여과물 (통과여액 및/또는 여과 케이크 및/또는 상기 여과 케이크의 추출여액) 또는 이의 농축물, 또는 상기 여과물 또는 이의 감압 농축물의 유기용매 용해물 부피를 기준으로 500 내지 1500%(v/v), 바람직하게는 600 내지 800%(v/v)의 양으로 할 수 있다.
상기 침전물을 얻는 단계는 상기 알칸을 가한 후 0 내지 10℃, 예컨대 약 4℃에서 12 내지 36 시간, 구체적으로 18 내지 30시간, 예컨대 24시간 정도 방치하여 수행할 수 있다. 상기 얻어진 침전물은 통상적인 건조단계를 통하여 건조될 수 있다.
단계 (d)는 상기 단계 (c)에서 얻어진 침전물을 제3 유기용매에 현탁한 후 이를 순상 컬럼 크로마토그래피를 실시하는 단계이다.
상기 침전물을 현탁시키는 제3 유기용매는 디클로로메탄, 아세톤, 헥산, 및 에틸아세테이트로 이루이전 군으로부터 선택된 1종 이상의 유기용매일 수 있으며, 상기 침전물 건조 중량 대비 5 내지 20 부피배, 바람직하게는 약 10 부피배의 양으로 사용할 수 있다. 예컨대, 제3 유기용매는 침전물 건조 중량 1g에 대하여 5 내지 20 ml, 바람직하게는 약 10 ml의 양으로 사용될 수 있다. 상기 '침전물의 건조 중량'은 침전물에서 용매를 제거한 건조물의 중량을 의미한다.
순상 컬럼크로마토그래피의 컬럼 충진제는 통상적인 실리카켈, 예컨대, 실리카켈 40(63 내지 200um), 실리카켈 60(63 내지 200um), 실리카켈60F254(200 내지 500um) 등을 사용할 수 있다.
순상 컬럼 크로마토그래피는 아이소크래틱(isocratic) 용출 또는 단계적 농도구배(step gradient)용출을 통하여 분획을 용출시킬 수 있다. 상기 아이소크래틱 방법은 동일 조성의 용매를 이용하여 용출시키는 방법이고, 단계적 농도구배 방법은 용매의 조성(농도)를 단계적으로 변환시키면서 용출하는 방법을 의미한다.
아이소크래틱 용출은 전개용매로 메탄올:디클로로메탄이 1 내지 10 : 99 내지 90 부피비로 혼합된 용매를 사용할 수 있다. 단계적 농도구배 용출은 전개용매로는 디클로로메탄, 또는 메탄올:디클로로메탄이 0.1 내지 5 : 99.9 내지 95 부피비로 혼합된 용매를 사용할 수 있으며, 용출용매로는 0.5 내지 100%(v/v)의 메탄올 및 잔량의 디클로로메탄올을 포함하는 용매를 사용할 수 있다.
단계 (d-1)은 단계 (c-1)에서 얻은 침전물을 유기용매에 녹이고 역상 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 단계이다.
본 단계에서 침전물을 용해시키기 위하여 사용되는 유기용매는 상기 제1 유기용매로 사용 가능한 용매 중에서 1종 이상 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올 및/또는 디메틸설폭사이드를 사용할 수 있다. 상기 유기용매의 사용량은 (c-1)에서 얻은 침전물의 건조 중량 기준으로 10내지 20 부피배(w/v), 바람직하게는 13 내지 15 부피배의 양으로 사용할 수 있다.
단계 (d-1)의 역상 컬럼 크로마토그래피 사용되는 컬럼 충진제로서 통상적인 ODS(Octadecylsilylated, C18), 예컨대, ODS50(5um), ODS(60um), ODS(100um) 등을 사용할 수 있다. 전개용매로는 메탄올과 정제수를 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 50%(v/v) 내지 80%(v/v) 메탄올/물을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 이소크래틱(isocratic) 용출 방법의 경우는 55% 내지 65%(v/v) 메탄올/물을 사용하며, 농도 구배 용출 방법의 경우에는 30%(v/v) 내지 90% 메탄올/물을 사용할 수 있다.
단계 (e)는 단계 (d)에서 얻은 활성 분획(용출물)을 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계이다.
상기 활성 분획(용출물)은 그대로 사용하거나, 활성 분획 또는 이의 농축물을 유기용매에 용해시킨 유기용매 용해물 형태로 하여 고속액체 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 본 단계에서 사용되는 유기용매는 상기 제1 유기용매로 사용 가능한 용매 중에서 1종 이상 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 디클로로메탄 및/또는 메탄올을 사용할 수 있다. 상기 유기용매의 사용량은 단계 (d)에서 얻은 활성분획 또는 그 농축물의 건조 중량 기준으로 5 내지 20 부피배(v/w), 바람직하게는 10 내지 15 부피배(v/w)일 수 있다.
본 단계에서 수행되는 고속액체 크로마토그래피는, 이에 한정되지 않지만, 바람직하게는 압력이 1500psi 내지 4000psi인 크로마토그래피이며, 상기 고속액체 크로마토그래피보다 상대적으로 저압인 일반적인 액체 크로마토그래피는, 이에 한정되지 않지만, 바람직하게는 150psi 내지 1000psi인 압력에서 수행되는 크로마토그래피일 수 있다. 컬럼 충진제는 소수성 수지, 예를 들면 ODS(Octadecsylsilylated, 20um; C18, C8, 또는 C4 등), 실리카(20um) 등으로 이루어진 군에서 선택하여 사용할 수 있다. 컬럼 충진제로서 소수성 수지, 예를 들면 ODS(Octadecsylsilylated, 20um; C18, C8, 또는 C4 등) 등을 사용하는 경우, 상기 역상 고속 액체 크로마토그래피는 전개용매로 55% 내지 80%(v/v), 바람직하게는 60% 내지 65% 메탄올/정제수를 사용할 수 있다. 또한, 컬럼 충진제로서 실리카(20um)를 사용하는 경우, 전개용매로 95%내 99%(v/v), 바람직하게는 98%내 98.5%(v/v) 디클로로메탄/메탄올 혼합용액을 사용할 수 있다. 상기와 같은 고속 액체 크로마토그래피를 거치면, 99% 이상의 고순도 에포틸론 A와 B를 재현성 있게 얻을 수 있다.
상기 단계 (d), (d-1), 및 (e)에 기재된 혼합용매 기재에 있어서, 기재된 농도는 혼합용매 중의 앞에 기재된 용매의 농도를 의미하는 것이다. 예컨대, 50%(v/v) 내지 80%(v/v) 메탄올/물은 메탄올과 물의 함량이 부피기준으로 50:50 내지 80:20 (메탄올 부피:물 부피)인 혼합 용매를 의미한다.
단계 (e-1)은 단계 (d-1)에서 얻은 활성 분획(용출물) 또는 이의 농축물을 유기용매에 용해시킨 후 비극성 용매를 첨가하여 상기 유기용매로부터 결정화하는 단계이다. 본 단계에서 사용가능한 유기용매는 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 등의 탄소수 2 내지 6의 에스테르, 및 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone) 등의 탄소수 3 내지 6의 케톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 바람직하게는 에틸아세테이트 및/또는 아세톤일 수 있고, 상기 비극성 용매는, 예컨대, 헵탄(n-헵탄), 헥산(n-헥산)과 같은 탄소수 5 내지 10의 알칸(alkane)일 수 있다. 상기 유기용매의 사용량은 용액의 농도가 0.025 내지 0.2 mg/mL, 구체적으로 0.05 내지 0.15 mg/mL가 되도록 할 수 있다.
결정화 단계는 에틸아세테이트 및/또는 아세톤 등의 유기용매를 사용하는 용해 과정과 알칸 첨가 과정을 고온에서 수행하여 충분히 녹인 후, 서서히 냉각하면서 수행할 수 있다. 예컨대, 에틸아세테이트 및/또는 아세톤 등의 유기용매를 넣고 45℃ 내지 60℃에서 교반속도 100 내지 200rpm로 교반하여 건고물이 녹아 있는지 확인하면서 충분히 녹이고, 헵탄 및/또는 헥산 등의 탄소수 5 내지 10의 알칸을 상기 사용된 유기 용매 종류에 따라 유기 용매 사용량에 대하여 0.5배 내지 6배 부피비로 첨가하여 교반을 실시할 수 있다.
예컨대, 유기 용매로 에틸 아세테이트를 사용하는 경우, 건고물은 55℃ 내지 60℃에서 완전히 녹으므로, 에틸 아세테이트를 넣고 상기 온도 범위에서 용해 반응을 진행한다. 그 후, 반응온도를 약 40℃로 떨어뜨리고, 30분에서 1시간 정도 반응시킨다. 그 후, 탄소수 5 내지 10의 알칸을 상기 에틸 아세테이트의 투입량의 1/2 내지 1부피배의 양으로 투입하고, 약 40℃에서 약 30분간 반응시킨다. 이후 반응온도를 20℃까지 약 2시간에 걸쳐 떨어뜨린다. 즉, 반응온도가 떨어지는 시간이 2시간 정도 걸리도록 한다. 그리고 난 후, 앞서 첨가된 알칸과 동일하거나 상이한 종류의 탄소수 5 내지 10의 알칸을 상기 유기용매 투입량의 절반(1/2) 내지 1 부피배 정도를 재차 투입한다. 그 후 반응온도를 약 10℃ 정도까지 약 1시간 정도에 걸쳐서 떨어뜨린 후, 6시간 이상 유지할 수 있다.
또 다른 예로서, 유기용매로서 아세톤을 사용하는 경우, 아세톤을 첨가하여 40℃ 내지 45℃에서 건고물을 완전히 녹인다. 그 후 반응온도 약 30℃로 떨어뜨려서, 30분에서 1시간 정도 반응시킨다. 그리고 난 후, 탄소수 5 내지 10의 알칸을 상기 아세톤 투입량의 2부피배 내지 3부피배의 양으로 투입한다. 그 후, 약 30℃에서 약 30분간 반응시킨다. 이후 반응온도를 약 20℃까지 약 2시간 정도에 걸쳐서 떨어뜨린다. 그 후, 앞서 첨가된 알칸과 동일하거나 상이한 종류의 탄소수 5 내지 10의 알칸을 아세톤 투입량의 2 부피배 내지 3 부피배 정도를 재차 투입한다. 그 후, 반응온도를 약 10℃ 정도까지 약 1시간 정도에 걸쳐서 떨어뜨리고 6시간 이상 유지한다.
이와 같은 과정에서 얻어진 슬러리는 여과하고, C5 내지 C10의 알칸에서 선택된 1종 이상의 유기 용매로 세척하여 고품질의 에포틸론을 생산할 수 있다.
본 발명의 에포틸론 제조 방법에 의하면, 장시간의 침전 과정 없이 순도 99%이상의 에포틸론 A와 B을 각각 50% 이상, 또는 60% 이상, 구체적으로 65% 이상 또는 75%이상, 예컨대 90 내지 95%의 수율로 얻을 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 단계별로 수득할 수 있는 시료내 에포틸론의 순도 및 회수율 범위를 표 1 및 표 2에 나타내었다.
순상 크로마토 그래피를 수행하는 경우 (단위 %)
공정 A기준 순도 A기준 수율 B기준 순도 B기준 수율
추출 3~5 100 3~5 100
액-액추출 8~13 95~99 8~13 95~99
흡착 및 침전 20.5~23 85~90 23.5~26 90~95
크로마토그래피 85~90 90~95 90~95 93~95
고속액체크로마토그래피 99~99.5 93~95 99.5~99.9 93~95
최종물질 99~99.5 67.6~80.4 99.5~99.9 73.9~84.9
역상 크로마토 그래피를 수행하는 경우 (단위 %)
공정 A기준 순도 A기준 수율 B기준 순도 B기준 수율
추출 3~5 100 3~5 100
액-액추출 8~13 95~99 8~13 95~99
흡착 및 침전 20.5~23 85~90 23.5~26 90~95
크로마토그래피 85~90 90~95 90~95 93~95
결정화 99~99.5 80~85 99.5~99.9 90~94
최종물질 99~99.5 58.1~71.9 99.5~99.9 71.6~84.0
하기하는 실시예에서의 에포틸론 A와 B의 순도 및 회수율은 표 3의 조건에서 HPLC을 사용하여 정량 분석하여 계산 하였다.
기기 Waters
컬럼 4.6 x 250mm
컬럼 온도 35 ℃
이동상 아세토나이트릴 : 물(30%~90% 농도구배)
유속 1mL/분
주입량 10ul
검출기 UV(249nm)
샘플용액 메탄올, 아세토나이트릴
본 발명은 저렴한 용매와 충진제를 사용함으로써, 보다 경제적으로 고순도 및 고수율의 에포틸론 A와 B를 제조할 수 있다.
도 1은 실시예 1의 추출물의 HPLC 결과를 나타낸 것으로, RT가 22.058 인 것(앞쪽 피크)이 에포틸론 A 이며, RT(뒤쪽 피크)가 23.900 인 것이 에포틸론 B이다.
도 2는 실시예 1의 액-액 추출물(디클로로메탄 층)의 HPLC 결과를 나타낸 것이다 (앞쪽 피크: 에포틸론 A. 뒤쪽 피크: 에포틸론 B).
도 3은 실시예 3의 침전물의 HPLC 결과를 나타낸 것이다 (앞쪽 피크: 에포틸론 A. 뒤쪽 피크: 에포틸론 B).
도 4a 및 4b는 실시예 6의 용출분획의 HPLC 결과를 나타낸 것으로, 4a는 에포틸론 A, 4b는 에포틸론 B를 나타낸다.
도 5a 및 5b는 실시예 7의 용출분획의 HPLC 결과를 나타낸 것으로, 5a는 에포틸론 A, 5b는 에포틸론 B를 나타낸다.
도 6a 및 6b는 실시예 8의 결정화 물질의 HPLC 결과를 나타낸 것으로, 6a는 에포틸론 A, 6b는 에포틸론 B를 나타낸다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다.
실시예 1: 세포배양액의 유기용매 추출 및 액-액 추출
소랜지움 셀룰로좀에서 유래된 믹소박테리아 균주인 한국 미생물 보존 센터(KCCM)에 기탁 번호 KCCM11007P으로 기탁된 소란지움 셀룰로좀 SYC248균주를 한국특허공개 제2011-0049304호의 실시예 4에 기재된 배양조건으로 배양하여 얻은 세포와 XAD-16 레진의 혼합물 10kg에 메탄올 25L를 가하고 상온에서 30분간 대략 50~100rpm 정도로 교반하여 여과하는 과정을 4회 반복하여 메탄올 추출액을 얻었다. 그 후, 얻어진 추출액을 감압농축하여 약 1.4kg 농축물을 얻었다.
상기 추출물에 대한 HPLC 분석 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 추출물은 에포틸론 A 61.4g과 에포틸론 B 63.6g을 포함하고 있다.
상기 얻어진 농축물에 메탄올를 첨가하여 밀도가 0.90에서 0.98 정도가 되게 하고, 디클로로메탄 250 mL을 가하고 상온(25 ℃)에서 교반기로 대략 100 내지 200rpm의 속도로 30분 동안 교반하고 분배시켜서 디클로로메탄층을 분리하였다. 디클로로메탄 층 분리를 4회 실시하여 액-액 분리 방법을 통해서 추출물을 확보 한 후, 감압농축 및 건조하여 순도 8.14%인 에포틸론 A 59.42g과 순도 8.62%인 에포틸론B 62.93g이 되는 건고물 730g을 얻었다. 상기 액-액 추출액에 대한 HPLC 분석 결과를 도 2에 나타내었다.
실시예 2: 추출물에 대한 흡착 공정
실시예 1에서 얻어진 건고물 150g을 디클로로메탄 750mL에 녹인 후 흡착제인 sylopute 30TM(Fuji Silysia Chemical Ltd 제조) 52.5g을 가하고 25 ℃에서 1시간 정도 교반한 후, 감압여과하였다. 얻어진 여과 케이크를 디클로로메탄 750mL으로 3회 이상 세척하여 여액을 얻고, 여액을 농축하여 여액 농축물 120g을 얻었다. 이 농축물에 순도 10.1%인 에포틸론 A 12.12g과 순도 10.7% 에포틸론 12.84g을 얻었다.
실시예 3: 디클로로메탄과 헥산 침전
실시예 2에서 얻어진 농축물 10g에 디클로로메탄 50mL를 가하여 용해시킨 후, 헥산을 100, 200, 300, 400 및 500mL의 양으로 각각 가한 후 4℃에서 24 시간 방치하였다. 이후 여과하여 침전물을 회수 하였으며, 침전물내 에포틸론의 순도 및 회수율을 표 2의 조건으로 확인하여 하기 표 4에 나타내었다. 상기 침전물에 대한 HPLC 분석 결과를 도3에 나타내었다.
침전공정 실험조건
출발물질 순도 실험 조건 침전물 순도 침전물 회수율
에포틸론
A(%)		 에포틸론
B(%)		 디클로로
메탄(mL)		 헥산(mL) 에포틸론
A(%)		 에포틸론
B(%)		 에포틸론
A(%)		 에포틸론
B(%)
10.1 10.7 50 100 25.3 27.5 65 80.2
10.1 10.7 50 200 24.1 27.2 73 85.5
10.1 10.7 50 300 23.5 26.9 80 96.8
10.1 10.7 50 400 18.5 19.2 85 98.1
10.1 10.7 50 500 18.7 19.5 90 98.5
실시예 4: 아세톤과 펜탄 침전
실시예 2의 농축물(건조상태) 10g에 100mL 아세톤을 가하여 용해시킨 후, 펜탄을 100, 200, 400, 600, 800 및 1000mL의 양으로 각각 가한 후 4℃에서 24 시간 방치하였다. 이후 여과하여 침전물을 회수 하였으며, 침전물내 에포틸론의 순도 및 회수율을 표 2의 조건으로 확인하여 하기 표 5에 나타내었다.
침전공정 실험조건
출발물질 순도 실험 조건 침전물 순도 침전물 회수율
에포틸론
A(%)		 에포틸론
B(%)		 아세톤
(mL)		 펜탄
(mL)		 에포틸론
A(%)		 에포틸론
B(%)		 에포틸론
A(%)		 에포틸론
B(%)
10.1 10.7 100 200 25.3 27.5 55 75
10.1 10.7 100 400 24.1 27.2 60 80.5
10.1 10.7 100 600 23.5 26.9 80 96.8
10.1 10.7 100 800 18.5 19.2 85 98.1
10.1 10.7 100 1000 18.7 19.5 90 98.5
실시예 5: 순상 컬럼 크로마토그래피
실시예 3에서 최적 조건으로 나타난 디클로메탄 50mL과 헥산 300mL, 즉 디클로로메탄:헥산=1:6 인 조건으로 제조한 건조물 15g을 디클로로메탄 150mL으로 녹이고, 실리카겔(60~100um, particle size)이 충진된 10mm x 50mm 스테인레스 스틸로 만든 컬럼에 상기 용해물을 주입하였다. 전개용매로 99%, 98.5%, 98%, 97%, 95%(v/v)의 디클로로메탄/메탄올을 각각 사용하였으며, 용출분획을 회수 하였다. 회수한 용출 분획 내 에포틸론 A와 B의 순도 및 회수율은 표 2의 조건으로 확인하여 하기 표 6과 같다.
실험조건
%(v/v), 메탄올/디클로로메탄		 순도 회수율
에포틸론
A(%)		 에포틸론
B(%)		 에포틸론
A(%)		 에포틸론
B(%)
1.0/99.0 (99%(v/v)) 77.5 73.2 89.2 88.4
1.0/98.5 (98.5%(v/v)) 75.3 74.5 85.7 89.5
1.0/98.0 (98%(v/v)) 60.3 65.4 90.5 92.3
1.0/97.0 (97%(v/v)) 40.5 41.3 91.3 94.2
1.0/95.0 (95%(v/v)) 45.2 43.2 93.3 94.1
실시예 6: 역상 컬럼 크로마토그래피
실시예 3에서 최적 조건으로 나타난 디클로메탄 50mL과 헥산 300mL, 즉 디클로로메탄:헥산=1:6 인 조건으로 제조된 건조물 15g을 메탄올 150mL으로 녹이고, ODS-C18(50um, particle size)이 충진된 10mm x 50mm 스테인레스 스틸로 만든 컬럼에 상기 용해물을 주입하였다. 전개용매로 70%, 65%, 60%, 55%(v/v)의 메탄올/물을 각각 사용하였으며, 용출분획을 회수 하였다. 회수한 용출 분획 내 에포틸론 A와 B의 순도 및 회수율을 표 2의 조건으로 확인하여 하기 표 7과 같다. 상기 용출분획 건조물에 대한 HPLC 분석 결과를 도 4에 나타내었다.
실험조건
%(v/v), 메탄올/물		 순도 회수율
에포틸론
A(%)		 에포틸론
B(%)		 에포틸론
A(%)		 에포틸론
B(%)
70/30 (70%(v/v)) 75.1 70.2 85.2 89.5
65/35 (65%(v/v)) 81.1 83.2 85.7 90.0
60/40 (60%(v/v)) 90.1 94.4 94.5 95.5
55/45 (55%(v/v)) 91.3 94.2 95.2 95.1
실시예 7: 고속 액체 크로마토그래피
실시예 5에서 얻어진 에포틸론 A와 B를 각각 2g씩 75%(v/v)에서 메탄올에 용해시키고, ODS(C18)를 충진한 역상 고속 액체크로마토그래피에 주입하였다. 전개용매로 60%(v/v)의 메탄올 및 40%(v/v)의 정제수를 포함하는 용매를 사용하였고, 이소크래틱 용출로 분획물을 수득하였다. 분획물은 순도 99%이상의 에포틸론 A와 B를 각각 얻었고, 수율은 93~95% 정도이다.
실시예 5에서 얻어진 에포틸론 A와 B 를 각각 2g씩 100% 디클로로메탄에 용해시키고 실리카(20um)가 충진된 고속 액체 크로마토그래피에 주입하고, 98.5%(v/v)의 디클로로메탄 및 1.5%(v/v)의 메탄올을 포함하는 전개용매를 흘려주어, 용출되는 분획을 수득하였다. 상기 분획은 99%이상 고순도의 에포틸론 A와 B를 각각 수율 93~95%이상 얻었다. 구체적으로, 에포틸론 A는 순도가 99.5%이고 회수율 95% 얻었고, 에포틸론 B가는 순도 99.7%이고 회수율 93%을 얻었다.
상기 용출분획에 대한 대표적인 에포틸론 A에 HPLC 분석 결과를 도 5에 나타내었다.
실시예 8: 결정화 실험
실시예 6에서 얻어진 용출물을 각각 1.9g씩 에틸아세트용액 19mL를 넣어서 농도 0.1mg/mL 로 해서 60 ℃ 정도에 1시간 동안 녹였다. 이때, 헵탄 용액을 에틸아세트용액과 동일한 양만큼 추가 해서 온도를 40℃로 떨어뜨렸다. 그 후, 2시간에 걸쳐서 반응온도를 20℃까지 떨어뜨렸다. 그 후, 1시간에 걸쳐서 10℃까지 추가로 감온하고, 마지막으로 10℃에서 6시간 이상 유지하면서 최종적인 결정을 얻었다. 순도는 99.8% 이상이었고 수율은 대략 93~97%사이로 얻을 수 있었다.
또 다른 방법으로, 실시예 6에서 얻어진 건고물 1.9g을 아세톤 38mL를 넣어서 농도 0.05mg/mL로 해서 45℃ 정도에서 1시간 녹였다. 이때, 헥산 용액을 아세톤 부피의 5배 부피배로 첨가하고 온도를 20℃로 떨어뜨렸다. 그 후, 1시간에 걸쳐서 반응온도를 10℃까지 더욱 떨어뜨렸다. 마지막으로 10℃에서 6시간 이상 유지하면서 최종적인 결정을 얻었다. 순도는 99.5%이상이었고 수율은 대략 90~95%사이로 얻을 수 있었다. 구체적으로, 에포틸론 A는 순도가 99.5%이고 회수율 90% 얻었고, 에포틸론 B가는 순도 99.8%이고 회수율 93%을 얻었다.
결정화 물질에 대한 대표적인 에포틸론 B에 HPLC 분석 결과를 도 6에 나타내었다.

Claims (11)

  1. (a) 믹소박테리아 미생물, 상기 미생물에서 유래된 세포, 상기 세포를 배양한 조직, 및 상기 세포 또는 배지를 포함하는 세포배양물로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 에포틸론 함유물질에 제1 유기용매를 가하여 추출하여 추출물을 얻는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 추출물에 물과 혼합되지 않는 제2 유기용매를 가하여 비극성 유기용매 층을 분리하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)에서 얻어진 비극성 유기용매 층을 흡착제로 처리하고 여과하여 얻은 여과물을 C5 내지 C10의 알칸에 첨가하여 침전물을 얻는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)에서 얻어진 침전물을 제3 유기용매에 녹이고 순상 크로마토그래피를 수행하여 용출물을 분리하는 단계; 및
    (e) 상기 단계 (d)에서 얻어진 용출물을 고속액체 크로마토그래피로 정제하는 단계
    를 포함하며,
    상기 제1 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올, 디클로로메탄, 및 디메틸설폭사이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 제2 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알킬할라이드, 탄소수 2 내지 6의 에테르, 탄소수 2 내지 6의 카르복시산 에스테르, 및 탄소수 3 내지 6의 케톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이며,
    상기 제3 유기용매는 디클로로메탄, 메탄올, 벤젠, 아세톤, 펜탄, 헥산, 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인,
    에포틸론 분리 방법.
  2. (a-1) 믹소박테리아 미생물, 상기 미생물에서 유래된 세포, 상기 세포를 배양한 조직, 및 상기 세포 또는 배지를 포함하는 세포배양물로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 에포틸론 함유물질에 제1 유기용매를 가하여 추출하여 추출물을 얻는 단계;
    (b-1) 상기 단계 (a-1)에서 얻어진 추출물에 물과 혼합되지 않는 제2 유기용매를 가하여 비극성 유기용매 층을 분리하는 단계;
    (c-1) 상기 단계 (b-1)에서 얻어진 비극성 유기용매 층을 흡착제로 처리하고 여과하여 얻은 여과물을 C5 내지 C10의 알칸에 첨가하여 침전물을 형성하는 단계;
    (d-1) 상기 단계 (c-1)에서 얻어진 침전물을 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올, 디클로로메탄, 및 디메틸설폭사이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매에 녹이고 역상 크로마토그래피를 실시하여 용출물을 분리하는 단계; 및
    (e-1) 상기 단계 (d-1)에서 얻어진 용출물을 결정화하는 단계
    를 포함하며,
    상기 제1 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올, 디클로로메탄, 및 디메틸설폭사이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 제2 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알킬할라이드, 탄소수 2 내지 6의 에테르, 탄소수 2 내지 6의 카르복시산 에스테르, 및 탄소수 3 내지 6의 케톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인,
    에포틸론 분리 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 (b) 또는 (b-1)의 제2 유기용매는 디클로로메탄, 카본 테트라클로라이드, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 디-에틸 에테르(di-ethyl ether), 메틸-t-부틸 에테르(methyl-t-butyl ether), 디-이소-프로필 에테르(di-iso-propyl ether), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 및 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 에포틸론 분리 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,　상기 단계 (c) 또는 (c-1)의 흡착제는 백토, 활성탄, 실리카겔, 알루미늄 옥사이드, 및 다공성 스티렌-디비닐벤젠 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 에포틸론 분리 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,　상기 단계 (c) 또는 (c-1)의 알칸은 헥산 및 펩탄으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 에포틸론 분리 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제2항에 있어서, 상기 단계 (e-1)는
    단계 (d-1)에서 얻어진 용출물을 탄소수 2 내지 6의 카르복시산, 및 탄소수 3 내지 6의 케톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매에 용해시키는 단계; 및
    상기 얻어진 용액에 탄소수 5 내지 10의 알칸을 첨가하는 단계
    를 포함하는 것인, 에포틸론 분리 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 유기 용매는 에틸아세테이트 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 상기 알칸은 헵탄 및 헥산으로 이루이진 군에서 선택된 1종 이상인, 에포틸론 분리 방법.
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