KR101406635B1 - 에포틸론 ｂ의 제조, 분리 및 정제 방법, 및 에포틸론 ｂ의 ｘ-선 결정 구조 - Google Patents

에포틸론 ｂ의 제조, 분리 및 정제 방법, 및 에포틸론 ｂ의 ｘ-선 결정 구조 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에포틸론 B의 개선된 제조, 분리 및 정제 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 예를 들면, 에포틸론 B의 생산을 위한 발효 방법, 수지 상으로의 흡착을 통한 분리, 및 이후의 정제를 포함한다.

Description

에포틸론 Ｂ의 제조, 분리 및 정제 방법, 및 에포틸론 Ｂ의 Ｘ-선 결정 구조{METHODS FOR THE PREPARATION, ISOLATION AND PURIFICATION OF EPOTHILONE B, AND X-RAY CRYSTAL STRUCTURES OF EPOTHILONE B}
관련 출원
본 출원은 2002년 9월 23일자로 출원된 미국 가출원 제60/412,994호의 우선권을 청구한다.
본 발명은 에포틸론 B의 개선된 제조, 분리 및 정제 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 예를 들면, 에포틸론 B의 생산을 위한 발효 방법, 수지 상으로의 흡착을 통한 분리, 및 이후의 정제를 포함한다.
에포틸론은 점액세균 (소란쥼 셀룰로숨 (Sorangium cellulosum))의 발효에 의해 원래 얻어지는 비교적 새로운 부류의 마크로라이드 화합물이다. 이들 화합물은 초기에는 그의 항진균 특성으로 인해 식물 보호제로서 연구되었다. 그후에, 에포틸론은 동물 세포에 대한 그의 세포독성 활성으로 인해 중요시되었고, 계속하여 튜불린 중합제로서 특징화되었다. 현재는 에포틸론이 파클리탁셀 (TAXOL (등록상표))과 유사한 미세소관-안정화 효과 및 종양 세포 또는 다른 과증식성 세포 질환과 같은 신속 증식 세포에 대한 세포독성 활성을 발휘하는 것으로 알려져 있다. 화학요법제로서의 에포틸론의 사용은 문헌 [Bollag et al., Cancer Research 55, 2325, 1995]에 기재되어 있다.
에포틸론 A 및 B (각각, epo A 또는 epo B)는 하기 화학식을 갖는다.
Figure 112012044011939-pat00001
에포틸론을 얻기 위한 한가지 방식은 WO 93/10121호에서 회플레 (Hoefle) 등에 의해 밝혀졌다. 회플레는 탄소원, 질소원 및 미네랄 염을 함유하는 배지에서 소란쥼 셀룰로숨의 균주를 배양하였다. 흡착 수지가 균주의 배양 중에 첨가되었다. 에포틸론은 흡착 수지로부터 용매로 용출되었다. 각종 에포틸론이 역상 크로마토그래피에 의해 분리되어 결정화되었다. 그러나, 회플레 등은 이 방법이 단지 소량의 에포틸론 B를 생산하였으며, 또한 발효시에 에포틸론 B 대 에포틸론 A의 비가 작음을 인정하였다. 이렇게 에포틸론 A에 대한 에포틸론 B의 비가 작은 것은 순수한 에포틸론 B의 회수를 어렵게 만든다. 따라서, 당업계에서는 에포틸론 A에 우선하여 에포틸론 B를 생산하기 위한 개선된 발효 방법, 및 에포틸론 B의 개선된 분리 및 정제 방법을 필요로 하고 있다.
발명의 요약
본 발명은 에포틸론 B의 생산을 위한 개선된 발효 방법에 관한 것이다.
또한, 에포틸론의 생산을 위한 돌연변이에 의해 얻어지는 소란쥼 셀룰로숨의 새로운 균주가 본 발명에 포함된다.
또한, 발효 첨가제를 제공함으로써 소란쥼 셀룰로숨의 새로운 균주에 의해 생산되는 에포틸론 B 대 A의 비를 개선시키는 방법이 본 발명에 포함된다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 첨가제는 프로피온산염, 적당하게 pH 조정된 프로피온산, 또는 다른 프로피온산염 전구체이다.
수지를 사용하여 발효 배지로부터 에포틸론 B를 분리하는 개선된 추출 방법이 본 발명에 포함된다. 불순물 농도를 감소시키고 분리 정제 (downstream processing)를 개선시키기 위해 에포틸론-풍부 수지를 세척하는 방법이 본 발명에 포함된다.
에포틸론 B의 개선된 정제 방법이 본 발명에 포함된다. 한 실시태양에서, 정제는 결정화를 이용하여 이루어진다. 다른 실시태양에서, 정제는 정상 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피 방법에 의해 이루어진다. 또다른 실시태양에서, 정제는 시료의 결정화 및 정상 및 역상 크로마토그래피를 포함한 크로마토그래피에 의한 정제의 조합에 의해 이루어진다. 또다른 실시태양에서, 수지 추출물은 결정화만으로 처리된다.
에포틸론 B ("epo B")는 티아졸 고리 상의 2-메틸이 아민으로 치환된 유도체 1 ("D1")의 제조에서 중간체로서 유용하다 (본원에 참고로 포함된 미국 특허 제6,262,094호에 기재된 바와 같음).
Figure 112012044011939-pat00002
에포틸론 B는 또한 유도체 2 ("D2")의 제조에 유용하다 (에포틸론 B의 락톤의 유도체 2의 락탐으로의 그러한 전환은 본원에 참고로 포함된 문헌 [Borzilleri et al., J. Amer. Chem. Soc. 122, 8890, 2000] 및 WO 99/02514호에 기재되어 있음).
Figure 112012044011939-pat00003
또한, 에포틸론 B ("epo B")는 유도체 3 (에포틸론 D, "D3")의 제조에 유용하다 (본원에 참고로 포함된 미국 특허 제6,320,045호에 기재된 바와 같음).
Figure 112012044011939-pat00004
또한, 본원에 기재된 방법 및 재료를 사용하여 생산된 에포틸론 B의 결정 형태가 본 발명에 포함된다.
상기 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 본 발명의 제한적인 것이 아니라 예시임을 이해하여야 한다.
본 발명은 주로 발효 중에 생산되는 에포틸론 A의 상대량을 감소시켜, 발효 산물과 개선된 농도의 에포틸론 B를 함께 또는 별도로 생산하는, 특정 처리 방법 및 소란쥼 셀룰로숨의 신규 돌연변이 균주를 설명한다. 소란쥼 셀룰로숨 또는 기타 적절한 미생물의 세포는, 예를 들면 하나 이상의 초기 성장 단계 배양을 통해 성장되며 에포틸론 생성 발효를 위한 접종원을 제공하는데 사용된다. 발효 초기에, 예를 들면 대략 24 내지 72 시간에, 세포가 배지 내의 영양소를 이용할 때 세포 성장이 일어난다. 그후에, 영양소, 예를 들면 비타민, 미네랄, 탄수화물 및 아미노산 (또는 기타 탄소 또는 질소원, 예를 들면 아미노산 전구체)이 에포틸론의 생산을 유도하는 양으로 배지에 첨가된다. 한 실시태양에서, 영양소, 예를 들면 비타민, 미네랄, 탄수화물 및 아미노산이 발효 중에 에포틸론 A 또는 에포틸론 B의 최대 생산 속도를 유지하는 양으로 첨가된다. 한 실시태양에서, 에포틸론 A 또는 에포틸론 B의 최대 생산 속도는 첨가제 또는 영양소의 첨가없이 생산되는 것에 비해 더 많은 양의 에포틸론 A 또는 에포틸론 B를 생산하는 생산 속도이거나 또는 첨가제 또는 영양소가 최적 미만의 양으로 첨가되는 경우 발생되는 더 빠른 생산 속도가 된다. 발효 중에, 프로피온산, 그의 전구체, 또는 이들의 염이 에포틸론 B 대 에포틸론 A 비 ("생성물 비")를 증가시키는데 효과적인 양으로 첨가된다.
본 발명은 또한 에포틸론의 제조에 유용한 소란쥼 셀룰로숨의 새로운 균주에 관한 것이다. 이들 새로운 균주, 특히 균주 SC16408은 돌연변이에 이은 무작위 선택에 의해 얻어졌다.
소란쥼 셀룰로숨은 처음에 1985년 남아프리카 잠베시 (Zambesi) 강가로부터 수집한 토양 시료로부터 분리되었다. 이 생물은 처음에 회플레 등 (상기 인용됨)에 의해 에포틸론의 생산에 대해 설명되었다. 회플레 등에 의해 사용된 균주는 So ce90으로 지정되었으며, 독일 미생물 보존 은행 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (German Collection of Microorganisms, DSM)에 기탁 번호 6773으로 기탁되었다. 균주 So ce90은 UV 돌연변이에 이어 무작위 선택되어 균주 So ce90B2를 발생시켰다. 균주 So ce90B2 (또한 SC16224로 지정됨)는 진탕 플라스크 (예를 들면, 플라스크 당 1.8 w/v％ 수지 함유)에서 약 50 ㎎/L 또는 2.8 ㎎/g 수지 (예를 들면, 3.5 또는 4.5 ㎎/g까지의 범위일 수 있음)의 에포틸론 B 역가, 및 약 0.6의 에포틸론 B/A의 비를 나타내었다.
본 발명에서, 균주 So ce90B2 또는 그의 유도체는 니트로소구아니딘 (NTG)에 의한 돌연변이에 이어서 무작위 선택되어 균주 SC16408 (ATCC PTA-3880호로 기탁됨) 및 SC16449 (ATCC PTA-3881호로 기탁됨)를 생산하였다. 이들 후자의 두 균주는 부다페스트 조약에 의거하여 특허 기탁물로서 미국 ATCC (American Type Culture Collection)에 기탁되었다. 선택 방법의 상세한 것은 실시예에 기재되어 있다.
한 실시태양에서, 본 발명은 브로스 부피 리터 당 약 100 ㎎ 이상의 에포틸론 B를 (예를 들면, 아래에 정의된 생산 조건 하에서) 생산하는 소란쥼 셀룰로숨 균주를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 에포틸론 B 비교 생산 조건 하에서 브로스 부피 리터 당 약 80 ㎎ 이상의 에포틸론 B를 생산하고 1 이상의 에포틸론 B 대 에포틸론 A 비를 나타내는 균주를 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 1.0 이상의 에포틸론 B/A 비로 에포틸론 B 5 ㎎/g 에포틸론 B 수지, 또는 5 ㎎/g 수지를 생산하는 균주를 제공한다. 다른 실시태양에서, 에포틸론 B/A 비는 1.5 이상이다. 또다른 실시태양에서, 에포틸론 B/A 비는 1.5 내지 4.0이다.
본 발명은 또한 발효 첨가제를 공급하여 소란쥼 셀룰로숨에 의해 생산되는 에포틸론 B 대 A의 비를 개선시키는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 첨가제는 96시간 이하, 바람직하게는 약 24 내지 48시간 동안 세포를 성장시킨 후에 첨가된 프로피온산염을 포함한다. 일부의 바람직한 실시태양에서는, 프로피온산염을 첨가하기 전에 약 34시간 동안 세포가 성장되었다. GBF에 의한 초기 연구는 발효에 영향을 미치는 다른 인자 중에서 특히 에포틸론 B/에포틸론 A (B/A) 비의 점진적인 개선을 위해 프로피온산염을 배지에 0.1％ 농도로 1회 첨가한 효과를 연구하였다. 본원의 발명자들은 놀랍게도 진탕 플라스크, 14 L 발효조 및 생산 발효조에서 생산된 에포틸론, 특히 에포틸론 B의 역가, 및 B/A 비가 프로피온산염 또는 프로피온산 나트륨을 공급함으로써 현저하게 개선되었음을 발견하였으며, 그것이 본 발명의 특징 중의 하나이다. 프로피온산염 또는 프로피온산 나트륨을 공급함으로써 에포틸론 B 역가가 상당히 개선된다. 예를 들면, 에포틸론 B의 플라스크 생산은 일단 공급이 시작된 후 주기적으로 (예를 들면, 매일) 배양물에서 탐지된 바와 같이 0.05 내지 0.80 ㎎/mL (0.005 내지 0.08％)의 바람직한 범위 내로, 더욱 바람직하게는 0.005 내지 0.04％의 범위 내로 프로피온산 나트륨으로 보충함으로써 개선되었다. 한 실시태양에서, 배양물 중의 프로피온산염의 양은 0.02％ 이하가 목표이다. 또한, 프로피온산 메틸 에스테르 및 프로피온산 에틸 에스테르를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다른 프로피온산염 관련 화합물은 또한 에포틸론 B 생산 및 이후에 B/A 비를 개선시키는 것으로 밝혀졌다.
한 실시태양에서, 플라스크에서의 발효에 특히 유용한, 일염기성 및 이염기성 인산염의 혼합물을 함유하는 추가의 공급액이 적절한 pH를 유지하도록 선택된 비로 첨가된다. 이 공급액은 프로피온산염 공급액에 포함되거나 또는 별도로 첨가될 수 있다.
본 발명에서는, 수지 첨가를 성공적으로 이용하는 대규모 에포틸론 정제 방법이 설명된다. 수지의 혼입은 에포틸론의 분리 및 정제에 유용하고 또한 에포틸론 역가를 현저하게 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 수지는 스티렌/디비닐벤젠 중합체 수지, 예를 들면 XAD 수지, 바람직하게는 XAD-16 또는 등가물 (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO 소재) 또는 Rohm and Haas Co. (Philadelphia, PA 소재)로부터 Amberlite XAD-16으로서 시판됨)이다. 소수성 표면을 가진 다른 앰벌라이트 (Amberlite) 수지, 예를 들면 스티렌계 XAD-4, XAD-1180 또는 XAD-1600 (Rohm and Haas Co.), 및 스티렌계 XD-207, HP20, HP21, SP825, SP850, SP700 또는 SP207과 같은 수지 (첨가된 브롬기로 인해 더욱 소수성임) (이들 수지는 Mitsubishi (Tokyo, Japan 소재) 또는 Mitsubishi Chemical America, Inc. (White Plains, NY 소재)로부터 구입함)가 또한 본 발명에 유용할 수 있다. 수지는 넓은 범위로, 예를 들면 0.2 w/v％ 내지 5.0 w/v％, 바람직하게는 1.5 w/v％ 내지 4.0 w/v％로 배지에 포함될 수 있다.
발효로부터의 에포틸론 함유 수지는 극성 불순물을 제거하기 위해 임의로, 물 및 20 내지 30％ 수성 아세토니트릴 또는 수성 메탄올로, 또는 세제, 바람직하게는 이온성 세제, 예를 들면 알킬 설페이트계 세제, 및 일정량의 아민 (염기 형태로 용액에 첨가됨)을 함유하는 용액으로 세척된다. 그 양은 나중에 수지로부터 수득되는 에포틸론 추출물의 질을 개선시키도록 선택된다. 하나의 바람직한 수성 세척액은 0.5 w/v％ 소듐 도데실 설페이트 및 0.5 w/v％ 암모니아를 사용한다. 이러한 마지막 실시태양에서, 용매 추출 전에 수지는 바람직하게는 물로 1회 이상 세척된다.
발효로부터의 에포틸론 함유 수지는 바람직하게는 수지 상에 흡착된 에포틸론을 제거하기 위해 수성상과 불혼화성인 (상 분리되는) 용매, 예를 들면 에틸 아세테이트 또는 메틸-t-부틸 에테르 (MTBE)로 추출된다. 에포틸론 B를 추출하는데 유용할 수 있는 추가의 용매는 n-부탄올, 이소프로필 아세테이트, n-프로필 아세테이트, n-부틸 아세테이트 및 t-부틸 아세테이트를 포함한다. 풍부 용매 추출물은 바람직하게는 농축되며, 에포틸론 B는 농축물로부터 결정화된다. 한 실시태양에서, 풍부 용매는 물로 세척되며, 물-세척된 풍부 용매는 농축되고 임의로 연마 여과된다. 에틸 아세테이트와 같이, 용매가 적당하다면 에포틸론 B는 증류 용매를 역용매로 교체함으로써 결정화된다. 즉, 에포틸론 B가 본질적으로 불용성인 비교적 고비점의 제2 용매가 풍부 용매에 첨가되며, 풍부 용매는 증류 제거되어 충분한 수준의 결정화가 일어나게 된다. 진공을 이용하여 증류를 유도하거나 촉진시킬 수 있다. 한 실시태양에서, 용매는 농축되고 적당량의 역용매가 첨가된다. 유용한 역용매는 톨루엔, 헥산 및 헵탄을 포함한다. 결과 슬러리는 형성된 결정의 품질을 향상시키기 위해 선택된 설정 온도로 가열되고 냉각될 수 있다. 온도 변동을 이용하여 결정 순도를 개선시키고, 미세물질을 최소화하고 더 빠른 여과 슬러리를 생산할 수 있다. MTBE와 같은 일부 다른 용매의 경우, 풍부 용매의 증류 농축은 (역용매를 사용하지 않고) 냉각 시에 효과적인 결정화 환경을 형성한다. 형성된 결정은 바람직하게는 여과되어 일차 등급 에포틸론 B를 생산한다.
추출 및 초기 결정화 중에, 에포틸론 B는 초기 추출물에 존재하는 대부분의 불순물, 특히 에포틸론 A로부터 분리된다. 일차 등급 에포틸론 B는 전형적으로 주요 불순물로서 에포틸론 A를 함유한다. 또한, 발효로부터 유래된 구조적으로 유사한 2가지의 다른 불순물, 즉 다음의 옥사졸 유사체 및 에틸 티아졸 유사체가 전형적으로 존재한다.
Figure 112012044011939-pat00005
에포틸론 B에 대해 본원에 설명된, 이후에 적용되는 정제 방법 (재결정화 및 크로마토그래피 단계 포함)은 특히 상기 두 화합물을 의미없는 정도로 제거하는 것을 포함한다.
바람직하게는 상기한 바와 같이 얻어지는 일차 등급 에포틸론 B (즉, 톨루엔 함유 결정 형태 epo B, 일차 등급)는 그후에 에틸 아세테이트에서 가열하고, 이어서 계속 가열하며 톨루엔을 첨가함으로써 재결정화될 수 있다. 그후에, 혼합물은 냉각되고, 결과의 결정성 슬러리는 여과되고 케이크는 톨루엔으로 세척되어 일단 재결정화된 에포틸론 B (즉, 톨루엔 함유 결정 형태 epo B, 재결정화됨)를 제공한다. 다르게는, 일차 등급 에포틸론 B는 실시예에 기재된 바와 같이 분취 고속 역상 크로마토그래피 단계 (예를 들면, 컬럼 형태의 RP/C-18 상에서)를 통해 처리될 수 있다. 임의로, 에포틸론 시료를 컬럼 상에 로딩하기 전에, 이전 부피의 적당한 유기 용매 또는 유기 용매의 혼합물을 첨가하여 에포틸론의 침전을 감소시킨다. 한 실시태양에서, 유기 용매는, 예를 들면 디메틸술폭시드 (DMSO)이다. 임의로, 말기 부피의 적당한 유기 용매 또는 유기 용매의 혼합물을 첨가하여 에포틸론의 침전을 감소시킨다. 그후에, 에포틸론은 적당한 유기 용매, 유기 용매의 혼합물 또는 유기 용매의 수용액으로 용출된다. 한 실시태양에서, 에포틸론은 아세토니트릴과 물의 혼합물로 용출된다. 이들 용매를 사용하는 용출 프로파일은, 예를 들면 직선 또는 경사일 수 있으며, 낮은 불순물 농도를 얻도록 선택된다. 목적하는 순도의 에포틸론 B를 함유하는 분획은 푸울되고, 농축되고, 에틸 아세테이트를 포함하나, 이에 제한되지 않는 용매로 추출된다. 그후에, 풍부 용매 추출물은 농축되고, 예를 들어 n-헵탄 (또는 헵탄)과 같은 저극성 용매를 첨가하여 결정화되고, 임의로 냉각된다. 슬러리는 여과되고, 2:1 비의 에틸 아세테이트/n-헵탄과 같은, (상당량의 에포틸론 B를 용해시키지 않도록 선택된 비 및 양의) 용매/역용매로 세척된다. 세척된 결정은 건조되어 고품질의 에포틸론 B를 생산한다.
다른 정제 방법, 예를 들면 실리카와 같은 정상, 또는 실리카계 정상 크로마토그래피 등이 이용될 수 있다. 예를 들면, 고속 정상 크로마토그래피가 이용될 수 있다. 시료는 염화 메틸렌과 같은 비교적 저극성 용매 중의 컬럼 상에 로딩되고, 에포틸론은 에틸 아세테이트와 헵탄의 혼합물과 같은 더 높은 극성의 용매로 용출된다. 이들 용매를 사용하는 용출 프로파일은, 예를 들면 직선 또는 경사일 수 있으며, 낮은 불순물 농도를 얻도록 선택된다. 목적하는 분획은 푸울되고, 농축되고, 예를 들어 n-헵탄, 헵탄들 또는 톨루엔과 같은 저극성 용매를 첨가하여 에틸 아세테이트로부터 결정화된다. 슬러리는 여과되고, 에틸 아세테이트/n-헵탄 (2:1 비) 또는 에틸 아세테이트/톨루엔과 같은, (상당량의 에포틸론 B를 용해시키지 않도록 선택된 비 및 양의) 용매/역용매로 세척된다. 세척된 결정은 건조되어 고품질의 에포틸론 B를 생산한다.
D1의 합성에서와 같이, 에틸 티아졸 또는 옥사졸 유사체의 광범위한 제거가 필요하지 않는 특정 경우에는, 에포틸론 B가 결정화 만으로 정제될 수 있다. 고체 에포틸론 B 재료는 예를 들면, 가온된 에틸 아세테이트에 용해되고, 주위 온도 또는 더 낮은 온도로의 냉각에 이은 여과 및 건조 (예를 들면, 진공 건조)에 의해 결정화 (또는 재결정화)된다. 결정화를 예를 들어 2 내지 3회 반복하여 목적하는 순도를 얻을 수 있다.
에포틸론 생성 미생물의 성장을 위한 증식 배지는, 예를 들면 다음과 같이 제조될 수 있다.
Figure 112012044011939-pat00006
에포틸론 생성 미생물의 성장을 위한 또한 특히, 진탕 플라스크에서의 에포틸론의 생산을 위한 생산 배지는, 예를 들면 글리세롤에 대해 다음과 같이 상이하고 수지를 첨가하여 상기한 바와 같이 제조할 수 있다.
Figure 112012044011939-pat00007
특히 진탕 플라스크에 사용하기 위한 유용한 영양 공급 용액은 다음을 포함한다.
Figure 112012044011939-pat00008
그러한 영양 공급액은 다음과 같이, 제2 인산 나트륨 및 제1 인산 나트륨의 혼합물을 더 함유할 수 있다.
Figure 112012044011939-pat00009
제2 인산 나트륨 대 제1 인산 나트륨의 비는 공급액 첨가시에 배양물의 목적하는 pH에서의 pH 편차가 최소화되도록 선택된다.
발효조에 사용하기 위해, 바람직하게는 생략되는 HEPES를 제외하고는 상기한 영양 성분이 다음과 같이 첨가되는 소포제 (Dow Corning 제품, AF 에멀젼, 식품 등급)와 함께 바람직하게 사용될 수 있다.
Figure 112012044011939-pat00010
가성 물질 (수산화 나트륨 또는 칼륨 용액)은 유용한 pH 범위를 유지하기 위해 필요에 따라 발효 배지에 첨가될 수 있다. 수지는 다음과 같이 첨가될 수 있다.
Figure 112012044011939-pat00011
생산 배지에서, 프로피온산염 및 영양소는 바람직하게는 필요에 따라 별도로 첨가된다. 프로피온산염 공급액은, 예를 들면 프로피온산염 나트륨 L 당 80 내지 150 g을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.05 내지 0.20 ㎎/mL의 프로피온산염 농도를 유지하기 위해 첨가되는 양이다 (예를 들면, HPLC에 의해 결정됨). 프로피온산염 첨가는 종자 배양물을 발효조에 첨가한 후에 20 내지 40 시간에 개시될 수 있다. 영양소는 예를 들면, 다음과 같이 멸균 공급장치 원료로 보충된다.
Figure 112012044011939-pat00012
더 장기간의 발효를 위해, 추가의 영양소는 바람직하게는, 이전 공급장치 원료에 비해 더 많은 부피로 첨가되는 다음 멸균 공급장치 원료로부터 첨가된다.
Figure 112012044011939-pat00013
상기 두 공급액의 이러한 영양소는 증식기의 개시를 피하도록 선택될 수 있다.
본 발명은 에포틸론 B ("epo B")를 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제6,262,094호에 기재된 바와 같이 하기 화학식의 유도체 1 ("D1")로 전환시키는 에포틸론 B의 제조 방법을 포함한다.
Figure 112012044011939-pat00014
본 발명은 또한 에포틸론 B를 문헌 [Borzilleri et al., J. Amer. Chem. Soc. 122, 8890, 2000 및 WO 99/02514호]에 기재된 바와 같이 하기 화학식의 유도체 2 ("D2")로 전환시키는 에포틸론 B의 제조 방법을 포함한다.
Figure 112012044011939-pat00015
본 발명은 또한 에포틸론 B ("epo B")를 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제6,320,045호에 기재된 바와 같이 하기 화학식의 유도체 3 (에포틸론 D, "D3")으로 전환시키는 에포틸론 B의 제조 방법을 포함한다.
Figure 112012044011939-pat00016
에포틸론 B의 결정 형태
출원인은 또한 본원에 기재된 본 발명의 방법 및 재료를 이용하여 에포틸론 B의 각종 결정 형태를 만들었다. 에포틸론 B 결정들은 상이한 용매 및 용매계를 사용하여 얻어졌다. 예를 들면, 출원인은 하기 표 1에 보고된 단위 셀 데이타를 가진, 본원에서 epo B-Toβ로서 지칭되는, 톨루엔 함유 에포틸론 B 용매화 결정 형태를 발견하였다. 에포틸론 B의 톨루엔 함유 용매화 결정 형태는 본원의 도 9 내지 12 및 도 15 및 16에 더 예시되어 있다. 출원인은 또한 아세토니트릴 (즉, epo B-Anβ), 에틸 아세테이트 (즉, epo B-Eaβ) 및 이소프로필 알코올 (즉, epo B-Ipβ), 및 하기 실시예에 기재된 용매계를 사용하여 에포틸론 B 결정을 얻었다. 이러한 결정학적 동일구조 형태는 결정 전체에서 b-축을 따라 연장되는 친지성 용매 채널을 함유하는 P21 공간군을 가진 단사결정 포접화합물 구조를 갖는다 (1 채널/단위 셀). 각 채널은 톨루엔, 아세토니트릴, 에틸 아세테이트, 이소프로필 알코올 또는 MTBE와 같은 2개 이하의 용매 분자를 함유할 수 있다 (이상적으로 에포틸론 B의 1:1 용매화물이 형성됨). 톨루엔/에틸 아세테이트 용매 혼합물 (예를 들면, 1:1 혼합물)로부터의 결정화로 인해 포접화합물 채널 중에 톨루엔의 우선적인 혼입이 일어나게 된다 (즉, epo B-EAβ가 아니라 형태 epo B-TOβ를 얻음). 에포틸론의 수소-결합 도너 모두 (히드록실)는 인터에포틸론 수소 결합에 관련이 있으며 게스트 용매에 결합하여 구속하는데 이용될 수 없다.
형태 epo B-TOβ, epo B-ANβ, epo B-EAβ 및 epo B-IPβ는 표 1에 제시된 단위 셀 데이타를 나타낸다. 톨루엔, 아세토니트릴, 에틸 아세테이트 및 이소프로판올을 함유하는 이들 결정 형태를 얻기 위한 결정화 조건은 하기 실시예에 제시되어 있다. 실시예 7에 기재된 방법을 이용하여 제조된 결정에 대한 PXRD 패턴은 역시 아래에 더 설명되는 바와 같이 도 9 , 11 및 13에 도시되어 있다.
이들 결정 형태에 대한 표 작성된 특정의 예시적인 파라메터는 다음과 같으며, 표 1에 나타내어져 있다.
Figure 112012044011939-pat00017
epo B-ANβ, epo B-EAβ epo B-IPβ및 epo B-TOβ에 대한 부분 원자 좌표는 각각 표 2, 3, 4 및 5에 나타내어져 있다. 도 9, 11 및 13에 나타낸 PXRD 패턴은 하기 표 6, 7 및 8에 기록된 데이타에 의해 특징화된다.
단위 셀 데이타
형태 T
(℃)		 a
(Å)		 b
(Å)		 c
(Å)		 B V Z V/Z sg d(calc)1 R 이상 용매 위치
Epo B-
TOβ		 -33 11.853(1) 10.613(2) 14.328(2) 113.04(1) 1659(1) 2 829 P21 1.201 0.09 Epo B 당 1 톨루엔
Epo B-
ANβ		 -40 11.961(1) 10.543(1) 13.601(2) 111.89(1) 1592(1) 2 796 P21 1.145 0.07 Epo B 당 1 아세토니트릴
Epo B-
EAβ		 -33 11.939(1) 10.587(1) 13.882(1) 111.87(1) 1628(1) 2 814 P21 1.215 0.07 Epo B 당 1 EtOAc
Epo B-
IPβ		 -3 11.928(2) 10.610(1) 13.870(2) 111.92(1) 1628(1) 2 814 P21 1.158 0.09 Epo B 당 1 IPA
1 계산된 이상 밀도. 1:1 용매 사용 추정.
Figure 112012044011939-pat00018
Figure 112012044011939-pat00019
Figure 112012044011939-pat00020
Figure 112012044011939-pat00021
실시예 7. 단계 A의 방법을 이용하여 생산되고 도 9에 나타낸, 에포틸론 B, 톨루엔 함유 용매화물에 대한 PXRD 데이타
산란각
(° 2-쎄타)		 d-간격
(A)		 상대 세기
(％)		 산란각
(° 2-쎄타)		 d-간격
(A)		 상대 세기
(％)
6.680 13.2212 48.5 20.720 4.2833 4.2
8.210 10.7604 2.1 21.320 4.1641 1.4
10.610 8.3312 2.2 21.890 4.0570 6.3
12.590 7.0251 4.3 24.200 3.6747 3.2
13.370 6.6169 25.8 24.500 3.6304 4.7
14.840 5.9646 1.9 24.800 3.5871 14.4
15.680 5.6469 0.9 26.150 3.4049 4.4
16.160 5.4802 2.3 26.870 3.3153 4.5
16.550 5.3520 2.9 28.370 3.1433 4.3
18.170 4.8783 5.0 29.930 2.9829 2.2
18.410 4.8152 10.6 30.890 2.8924 2.0
20.090 4.4162 100.0 31.400 2.8466 2.2
실시예 7. 단계 B의 방법을 이용하여 생산되고 도 11에 나타낸, 에포틸론 B, 톨루엔 함유 용매화물에 대한 PXRD 데이타
산란각
(° 2-쎄타)		 d-간격
(A)		 상대 세기
(％)		 산란각
(° 2-쎄타)		 d-간격
(A)		 상대 세기
(％)
6.680 13.2212 62.1 20.720 4.2833 9.0
8.210 10.7604 3.4 21.320 4.1641 4.4
10.610 8.3312 6.9 21.890 4.0570 21.8
12.590 7.0251 8.1 24.200 3.6747 10.8
13.370 6.6169 26.9 24.500 3.6304 9.7
14.870 5.9526 5.9 24.800 3.5871 18.9
15.680 5.6469 3.7 26.150 3.4049 12.8
16.160 5.4802 4.5 26.900 3.3117 4.9
16.580 5.3424 9.1 28.340 3.1466 7.6
18.170 4.8783 20.3 29.960 2.9800 5.9
18.440 4.8075 28.2 30.950 2.8869 5.3
20.090 4.4162 100.0 31.400 2.8466 4.1
실시예 7. 단계 C의 방법을 이용하여 생산되고 도 13에 나타낸, 에포틸론 B, 에틸 아세테이트 함유 용매화물에 대한 PXRD 데이타
산란각
(° 2-쎄타)		 d-간격
(A)		 상대 세기
(％)		 산란각
(° 2-쎄타)		 d-간격
(A)		 상대 세기
(％)
6.800 12.9881 26.2 20.720 4.2833 100.0
6.950 12.7082 32.5 22.610 3.9294 25.5
8.450 10.4553 4.0 24.470 3.6347 8.9
10.850 8.1474 9.4 24.860 3.5786 13.5
11.690 7.5638 2.8 25.190 3.5325 7.8
13.070 6.7681 11.6 26.120 3.4088 5.7
13.850 6.3887 10.2 26.600 3.3483 5.9
14.990 5.9053 4.7 27.050 3.2936 3.5
16.040 5.5210 5.4 27.530 3.2373 5.2
16.850 5.2574 11.0 28.850 3.0921 6.7
18.200 4.8703 13.5 29.090 3.0671 6.7
18.770 4.7237 16.9 30.020 2.9742 4.0
19.130 4.6356 14.3 30.320 2.9454 4.6
20.480 4.3330 72.2 30.740 2.9062 5.6
20.600 4.3080 71.6 31.220 2.8626 6.5
정의
다음 용어들은 본 출원에 대해 아래에 기재된 각각의 의미를 가질 것이다.
"에포틸론 B 비교 생산 조건". 에포틸론 A에 대한 에포틸론 B의 상대적 생산, 또는 균주 사이의 순 에포틸론 B 생산을 측정하기 위해, 표준 조건이 필요하다. "에포틸론 B 비교 생산 조건"은 아래에 기재되어 있다. 표준 조건은 실시예에 기재된 바와 같이 적절하게 비례될 수 있다 (예를 들면, 실시예 2에 따라서 125 mL 생성 플라스크로)
1) F1 단계:
동결 바이알 또는 보존 플라스크로부터의 1 mL를 약 10 mL의 배지 E (하기하는 조성물)를 함유하는 125 mL 플라스크로 옮긴다. F1 플라스크를 30 ℃ 및 160 rpm에서 3 내지 4일 동안 인큐베이션한다.
2) F2 단계:
F1 플라스크로부터의 전체 내용물 (약 10 mL)을 배지 E 90 mL를 함유하는 250 mL 플라스크로 옮긴다 (10％). 이 F2 플라스크를 마찬가지로 30 ℃ 및 160 rpm에서 3 내지 4일 동안 인큐베이션한다.
3) 생산 단계:
생산 플라스크 (배지 E 90 mL (하기 배지 제조 참조)를 함유하는 250 mL 플라스크)를 F2 단계로부터 10％ (10 mL) 수준으로 접종시킨다. 다르게는, "보존 플라스크"를 사용할 수 있으며, 이들은 5％ 내지 10％ 수준으로 3 내지 4일 마다 배양물의 통상적인 플라스크 옮김으로부터 유래된다. 생산기는 15 g/L 이상의 수지를 포함한다. 접종되면, 생산 플라스크를 30 ℃ 및 160 rpm에서 14일 동안 인큐베이션한다. 공급액은 에포틸론 B 대 A 비를 개선시키도록 포함된다. 공급액 첨가는 다음과 같이 접종 72시간 후에 시작한다.
공급액 1 mL를 3 내지 11일에서부터 매일 생산 플라스크 (100 mL 배양물 부피) 마다 첨가하고 또한 나타낸 경우 14일 동안 첨가를 계속한다.
프로피온산염 함유 공급액은 100배 희석으로 설명된 바와 같이 첨가될 때, 매일 배양 브로스 중의 최종 농도가 0.1％ 말트린-M040, 0.04％ 프로피온산 나트륨 및 0.03％ 태스톤-154가 되도록 (이전 첨가로부터의 잔류 농도는 제외함), 10％ 말트린-M040, 4％ 프로피온산 나트륨 및 3％ 태스톤-154를 함유한다. 플라스크는 일반적으로 접종 14일 후에 수확되어 분석된다.
"프로피온산 전구체"는 에포틸론 B 대 A 비를 증가시키는데 효과적인 양의 프로피온산을 발생시키는데 효과적인 양으로 적절한 배양물에 첨가될 수 있는 임의의 화합물을 의미한다. 프로피온산은 예를 들면, 세포 효소의 작용을 통해 불안정한 에스테르에 의해 자발적으로 발생될 수 있다. 당업계의 숙련자는 프로피온산을 발생시키기 위해 또는 에포틸론 B 대 A 비를 증가시키기 위해 쉽게 시험될 수 있는 추천 화합물을 인지할 것이다. 그 예로는 프로피온산의 메틸 및 에틸 에스테르가 있다.
"공급"은 1종 이상의 영양소 및 첨가제, 예를 들면 프로피온산염, 프로피온산 나트륨, 프로피온산 나트륨 함유 혼합물 또는 용액, 비타민, 미네랄, 탄수화물원 또는 아미노산원이 발효 중에 한번보다 많이, 예를 들면 주기적으로, 펄스 공급을 통해, 실질적으로 연속적인 공급 등을 통해 첨가되는 것을 의미한다. 발효 동안의 연속적인 공급은 "한번보다 많이 첨가"라는 용어의 의미내에 포함되는 것으로 이해하여야 한다.
"톨루엔 함유"는 당업계의 숙련자에 의해 이용되는 분석 기술에 의해 측정되는 양의 톨루엔을 주로 함유하는 용매화물을 의미하며, 여기서 톨루엔 함유 용매화물은 1종 이상의 추가의 용매를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다.
"에틸 아세테이트 함유"는 당업계의 숙련자에 의해 이용되는 분석 기술에 의해 측정되는 양의 에틸 아세테이트를 주로 함유하는 용매화물을 의미하며, 여기서 에틸 아세테이트 함유 용매화물은 1종 이상의 추가의 용매를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다.
본 발명의 이점, 성질 및 각종 특징은 첨부 도면을 고려하여 더욱 충분하게 나타날 수 있다.
도 1은 단사결정 단위 셀의 게스트 채널 내에 2 분자의 에포틸론 B 및 2 분자의 에틸 아세테이트를 가진, 형태 epo B-EAβ의 단사결정 단위 셀 내의 분자 구조를 나타낸다.
도 2는 단사결정 단위 셀의 게스트 채널 내에 2 분자의 에포틸론 B 및 2 분자의 아세토니트릴을 가진, 형태 epo B-ANβ의 단사결정 단위 셀 내의 분자 구조를 나타낸다.
도 3은 단사결정 단위 셀의 게스트 채널 내에 2 분자의 에포틸론 B 및 2 분자의 이소프로판올을 가진, 형태 epo B-Ipβ의 단사결정 단위 셀 내의 분자 구조를 나타낸다.
도 4는 단사결정 단위 셀의 게스트 채널 내에 2 분자의 에포틸론 B 및 2 분자의 톨루엔을 가진, 형태 epo B-Toβ의 단사결정 단위 셀 내의 분자 구조를 나타낸다.
도 5는 에포틸론 B의 에틸 아세테이트 용매화물 (결정 형태 epo B-EAβ)에 대한 관찰 (상부) 및 모의 (하부) PXRD 패턴을 나타낸다. 도 5에서, 모의 패턴은 -33 ℃에서 단사결정 구조의 수정된 원자 파라메터로부터 계산되었으며, 관찰 패턴은 +23 ℃에서 측정되었다.
도 6은 에포틸론 B의 톨루엔 용매화물 (결정 형태 epo B-TOβ)에 대한 관찰 (상부) 및 모의 (하부) PXRD 패턴을 나타낸다. 도 6에서, 모의 패턴은 -33 ℃에서 단사결정 구조의 수정된 원자 파라메터로부터 계산되었으며, 관찰 패턴은 +23 ℃에서 측정되었다.
도 7은 에포틸론 B의 아세토니트릴 용매화물 (결정 형태 epo B-ANβ)에 대한 관찰 (상부) 및 모의 (하부) PXRD 패턴을 나타낸다. 도 7에서, 모의 패턴은 -40 ℃에서 단사결정 구조의 수정된 원자 파라메터로부터 계산되었으며, 관찰 패턴은 +23 ℃에서 측정되었다.
도 8은 에포틸론 B의 이소프로필 알코올 용매화물 (결정 형태 epo B-IPβ)에 대한 관찰 (상부) 및 모의 (하부) PXRD 패턴을 나타낸다. 도 8에서, 모의 패턴은 -3 ℃에서 단사결정 구조의 수정된 원자 파라메터로부터 계산되었으며, 관찰 패턴은 +23 ℃에서 측정되었다.
도 9는 실시예 7, 단계 A에 기재된 방법에 따라서 생산된, 에포틸론 B의 톨루엔 함유 일차 등급 용매화물에 대한 관찰된 PXRD 패턴을 나타낸다.
도 10은 도 9의 톨루엔 함유 일차 등급 용매화물에 대한 열 분석 (DSC 및 TGA)을 나타낸다.
도 11은 실시예 7, 단계 B에 기재된 방법에 따라서 생산된, 에포틸론 B의 톨루엔 함유 재결정화 용매화물에 대한 관찰된 PXRD 패턴을 나타낸다.
도 12는 도 11의 톨루엔 함유 재결정화 용매화물에 대한 열 분석 (DSC 및 TGA)을 나타낸다.
도 13은 실시예 7, 단계 C에 기재된 방법에 따라서 생산된, 에포틸론 B의 에틸 아세테이트 함유 용매화물에 대한 관찰된 PXRD 패턴을 나타낸다.
도 14는 도 13의 에틸 아세테이트 함유 용매화물에 대한 열 분석 (DSC 및 TGA)을 나타낸다.
도 15는 실시예 7C에 기재된 방법에 따라서 제조된 톨루엔 함유 용매화물에 대한 관찰된 (상부) PXRD 패턴과, 실온에서 에포틸론 B의 톨루엔 용매화물에 대한 모의 (하부) PXRD 패턴을 나타낸다.
도 16은 도 15의 톨루엔 함유 용매화물에 대한 열 분석 (DSC 및 TGA)을 나타낸다.
이들 도면이 본 발명의 개념을 예시하기 위한 것이며 본질적으로 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 도 1 내지 4 각각에서, 에포틸론의 모든 메틸 및 메틸렌 수소 원자가 명확함을 위해 생략되었다. 도 1 내지 4에서, 분자간 수소 결합은 대시 막대로서 도면의 하부 우측 및 상부 좌측 부분에 나타내어져 있으며, H-결합 거리 (Å)는 분자간 산소-산소 간격을 지칭한다.
하기 실시예는 달리 상세하게 설명된 것을 제외하고는, 당업계의 숙련자에게 공지되고 통상적인 표준 기술을 이용하여 수행된다. 실시예는 예시적인 것으로서 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
돌연변이 및 선택에 의한 균주 SC16408 의 제조, 및 세포 은행의 제조
균주 SC 16408은 균주 SC ce90B2 (SC16224)의 니트로소구아니딘 (NTG) 처리에 이은 무작위적 선택으로부터 유래되었다. 따라서, SC16224를 10 mM Tris-HCl 완충액에 현탁시키고 pH 8.2에서 60분 동안 1 ㎎/mL NTG 처리하였다. NTG로 처리한 후에, 집락 선택에 의해 집락 세포주를 얻고 에포틸론 B 생산성 및 에포틸론 B/A 비에 대해 시험하였다. 분리된 집락을 플라스크로 옮기고 8 내지 14일 동안 배양하고, 이어서 증식 배지 (배지 E)에 3 내지 4일마다 옮겼다.
진탕 플라스크에 대한 증식 배지 E
Figure 112012044011939-pat00022
상기 성분들을 증류수에 첨가하고 pH를 10％ NaOH (또는 KOH)로 pH 7.2로 조정한 후에 121 ℃에서 30분 동안 멸균하였다.
연구 세포 은행의 제조: 균주 SC16408의 3일된 배양물로부터의 10 mL를 배지 E 90 mL를 함유하는 250 mL 플라스크로 옮겼다. 그후에, 플라스크를 30 ℃, 160 rpm에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 2일 말기에, 1.8 mL 분취량을 플라스크로부터 회수하고 극저온 바이알에 옮기고 나서 -70 ℃에서 냉동시켰다.
마스터 세포 은행의 제조: 연구 세포 은행으로부터의 2 바이알을 해동시키고 배지 E 10 mL를 함유하는 2 x 125 mL 플라스크로 옮기고, 그후에 30 ℃, 160 rpm에서 4 내지 5일 동안 인큐베이션하였다. 다음에, 2 x 10 mL를 배지 E 90 mL를 함유하는 2 x 250 mL 플라스크로 옮기고, 30 ℃, 160 rpm에서 2 내지 4일 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 이들 2 플라스크를 푸울하고 1.8 mL 분취량을 극저온 바이알에 옮기고 냉동기에서 -70 ℃로 저장하였다.
제조용 세포 은행의 제조: 마스터 세포 은행으로부터의 5 바이알을 해동시키고 배지 E 10 mL를 함유하는 5 x 125 mL 플라스크로 옮기고, 그후에 30 ℃, 160 rpm에서 3 내지 6일 동안 인큐베이션하였다. 다음에, 5 x 10 mL를 배지 E 90 mL를 함유하는 5 x 250 mL 플라스크로 옮기고, 30 ℃, 160 rpm에서 2 내지 4일 동안 인큐베이션하였다. 이들 5 플라스크 내의 세포를 이용하여 배지 E 90 mL를 함유하는 12 x 250 mL 플라스크를 접종하고, 다시 30 ℃, 160 rpm에서 2 내지 4일 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 이들 플라스크를 함께 푸울하고 1.8 mL 분취량을 극저온 바이알에 옮기고 냉동기에서 -70 ℃로 저장하였다. 이러한 제조용 세포 은행을 위해 약 500 내지 600 바이알을 형성하였다.
실시예 2
진탕 플라스크 발효에 의해 에포틸론을 생산하기 위한 배양
동결 바이알로부터의 세포 (1.5 mL)를 125 mL 플라스크에서 배지 E 45 mL에 접종하고 30 ℃ 및 160 rpm에서 4 내지 8일 동안 성장시켰다 (F1 단계). 그후에, F1 단계의 5 mL를 배지 E 45 mL를 함유하는 새로운 125 mL 플라스크로 옮기고 3 내지 4일 동안 성장시켰다 (F2 단계). 그후에, F2 단계 세포를 에포틸론 B 발효를 위한 접종원으로서 사용하였다. 접종원의 10％ (5.0 mL)를 생산 배지 45 mL를 함유하는 125 mL 플라스크로 옮겼다. 그후에, 플라스크를 진탕기 (160 rpm)에서 30 ℃에서 2주 동안 인큐베이션하였다. 생산 배지는 1.6％ (0.8 g) XAD-16 수지를 함유하는 변형된 배지 E이다. 진탕 플라스크에 대한 생산 배지의 조성은 아래에 나타내었다.
진탕 플라스크에 대한 에포틸론 B 생산 배지:
Figure 112012044011939-pat00023
상기 성분들을 증류수에 용해시키고 pH를 10％ NaOH (또는 KOH)로 pH 7.2로 조정한 후에 121 ℃에서 30분 동안 멸균하였다.
진탕 플라스크 에포틸론 B 발효를 위한 공급액의 조성은 4％ 프로피온산 나트륨, 10％ 말트린-M040 및 3％ 태스톤-154이다. 공급액 (250 mL 플라스크 내의 100 mL)를 NaOH로 pH 6.8 내지 7.0으로 조정하고 121 ℃에서 30분 동안 멸균하였다. 접종후 3 내지 14일부터, 공급액 0.5 mL를 각 발효 배지에 매일 첨가하였다. 다르게는, 공급 농도를 두배로 하고 3, 5, 7 및 10일에 첨가를 수행하여 비교가능한 결과를 얻을 수 있음을 발견하였다. 배지에 100배로 희석되었을 때, 이전 첨가로부터의 잔류 농도를 제외한 최종 농도가 각각 0.015％ 및 0.005％가 되도록, 상기 공급액을 1.5％ 제2 인산 나트륨 및 0.5％ 제1 인산 나트륨 형태의 인산염으로 더 보충하여 개선된 결과를 또한 얻을 수 있다. 인산염 첨가의 추가된 이점은 pH 조정이 필요없다는 것이다. 10 내지 20％의 추가의 수율 개선 (에포틸론 B)은 인산염 보충을 통해 이루어질 수 있다.
에포틸론의 분석을 위하여, 수지 시료 (0.8 g)을 수확하고 HPLC로 분석하였다. 진탕 플라스크에서의 에포틸론 생산은 14일째에 다음 역가를 나타내야 한다.
에포틸론 A : 5.0-7.0 ㎎/g 수지
에포틸론 B : 8.0-12.0 ㎎/g 수지
B/A : 1.1-2.0
이전 균주에 비해, SC16408 배양물은 진탕 플라스크에서 더 많은 에포틸론 B를 생산하는 것으로 보인다.
실시예 3
14 L 발효조에서 에포틸론을 생산하기 위한 배양
Figure 112012044011939-pat00024
배지 E를 사용하여 14 L 발효조에 대한 접종원을 형성하였다. 진탕 플라스크 및 아스피레이터 바틀 단계에 대한 오토클레이브 시간은 각각 30분 및 60분이었다. 발효조의 경우, 생산 배지는 121 ℃에서 60분 동안 멸균되었다. 14 L 발효조 생산 배지는 HEPES가 제거되고 소포제 (Antifoam AF, Dow Corning 제품) 2.5 g/L가 첨가된 변형된 진탕 플라스크 생산 배지 (상기함)이다. 6 리터의 생산 배지 (7.2 내지 7.4로 조정된 pH)를 14 L 발효조에 분배하고 멸균하였다. 하기 표는 14 L 발효조 규모의 공정 파라메터를 요약한다.
탁상용 발효조 공정 파라메터:
Figure 112012044011939-pat00025
Figure 112012044011939-pat00026
14L 발효조에서의 에포틸론 B 역가 범위는 아래에 요약되었다.
에포틸론 B 역가, ㎎/g 수지 B/A 비
5-12 1.0-3.0
실시예 4
에포틸론의 제조 방법
50 L 발효조 종자 단계:
F1 단계의 경우, 배지 E (2 L)를 제조하고 17개의 분리된 250 mL 플라스크에 각각 90 mL를 분배하였다. 그후에, 플라스크를 121 ℃에서 30분 동안 오토클레이빙하여 멸균하였다. 하나의 동결 바이알로부터의 세포를 각 플라스크에 접종하고 약 30 ℃ 및 160 rpm에서 4 내지 8일 동안 성장시켰다.
F2 단계의 경우, 배지 E 27 L를 제조하고 17개의 분리된 4 L 플라스크에 각각 1.5 L를 분배하고, 그후에 상기한 바와 같이 멸균하였다. 각 4 L 플라스크를 F1 단계로부터의 플라스크의 전체 내용물로 접종하고, 약 30 ℃ 및 160 rpm에서 2 내지 4일 동안 성장시켰다.
F3 단계의 경우, 배지 E* 80 L를 제조하고 2개의 50 L 스테인레스 스틸 종자 발효조로 나누고 각 50 L 발효조를 F2 단계로부터의 3개의 4L 플라스크의 내용물로 접종하였다. 50 L 발효조를 30 내지 33 ℃에서 2 내지 4일 동안 성장시켜 800 L 발효조를 접종하는데 사용하였다.
배지 E*는 다음과 같다.
Figure 112012044011939-pat00027
800 L 발효조 종자 단계:
세포괴가 다음 종자 단계 (5,000 L 발효조)를 접종시키는데 충분할 때까지 접종원을 800 L 스테인레스 스틸 발효조에서 성장시켰다.
배치를 위한 배지 E*를 탈이온수 (400 L)에 제조하고 혼합물 (pH 8.7 내지 8.9)을 17 psig, 124 ℃에서 60분 동안 멸균하였다. 배지를 멸균기로부터 800 L 발효조로 옮기고 pH를 7.1 내지 7.3으로 조정하였다. 그후에, 발효조를 F3 단계로부터의 80 L로 접종하였다. 배치를 다음 대조군 설정점으로 진행하였다.
Figure 112012044011939-pat00028
필요에 따라, 가성 물질 (수산화 나트륨 또는 칼륨 용액)은 7.1 내지 7.3 범위의 pH를 유지하기 위해 멸균 공급물로부터 첨가된다. 배치를 일정 간격으로 시료 채취하고 무균성, pH, 침전 및 글루코스 농도에 대해 분석하였다. 또한, 배출 폐가스 CO2 및 O2를 탐지하였다. 약 48 내지 60 시간에, 글루코스 농도가 저하되기 시작할 때, 800 L 발효조의 내용물 (약 440 내지 480 L)을 5,000 L 발효조로 옮겼다.
5,000 L 발효조 종자 단계:
5,000 L 스테인레스 스틸 발효조를 이 단계에서의 접종 과정에 사용하였다. 세포괴가 40,000 L 생산 발효조를 접종시키는데 충분할 때까지 접종원을 발효조에서 성장시켰다.
상기한 바와 같이 (탈이온수 2,600 L에) 제조된 배지 E*를 5,000 L 발효조로 옮기고 그후에 800 L 발효조로부터의 접종원 약 440 내지 480 L로 접종하였다. 배치를 대조군 설정점으로 진행하고 상기한 바와 같이 탐지하였다. 다시, pH를 7.1 내지 7.3 범위로 유지하였다. 약 48 내지 72 시간에, 글루코스 농도가 저하되기 시작할 때, 5,000 L 발효조의 내용물을 40,000 L 발효조로 옮겼다.
40,000 L 발효조 생산 단계:
40,000 L 스테인레스 스틸 발효조를 에포틸론의 생산에 사용하였다. 발효조를 멸균하고 멸균 배지로 채운 후에, 그것을 5,000 L 발효조에서 제조된 종자로 접종하였다. 특정 생산 파라메터가 얻어진 후에, 생산 발효조의 내용물을 수확하였다.
생산 발효조에 대한 배지를 두 부분으로 멸균하였다. 수지를 2800 L의 물에 첨가하고 혼합물을 17 psig, 124 ℃에서 75분 동안 멸균하였다.
Figure 112012044011939-pat00029
18,000 L의 배지를 제조하기 위해, 다음 성분을 탈이온수 (15,000 L)에 첨가하고 pH를 7.1 내지 7.3으로 조정하였다. 배지를 연속 멸균기에서 150 ℃에서 멸균하였다 (체류 시간 100 초, 배출 온도 60 ℃).
Figure 112012044011939-pat00030
배지 및 수지를 생산 발효조에 옮기고 그후에 5,000 L 발효조로부터의 접종원 약 3,100 L로 접종하였다. 배치를 풍량이 0.2 내지 0.4 vvm인 것을 제외하고는 상기한 대조군 설정점으로 진행하였다. 필요에 따라, pH (0 내지 80 시간)를 가성 물질로 상승시켰다. 80시간 후에, pH를 황산으로 저하시켰다. 필요에 따라, 소포제로 발포를 조절하였다. 발효조를 무균성, pH, 침전, 글루코스, 프로피온산염 및 에포틸론 B 농도에 대해 분석하기 위해 하루에 1회 이상 시료 채취하였다. 폐가스 중의 CO2를 탐지하고 기록하였다. CO2가 0.3％ 이상이기만 하면, 약 30 내지 60시간에 공급을 시작하였다.
발효조에 1.9 L/샷 (1.5 내지 3.0 범위)의 샷 크기로 프로피온산 나트륨 (102 g/L)을 공급하였다. 샷 사이의 간격은 60분으로 시작하고 12시간 마다 최소 12분까지 감소시켰다. 프로피온산염을 탈이온수 2,800 L에 첨가하고 용액을 17 psig, 124 ℃에서 75분 동안 멸균하였다. 바람직한 실시태양에서는, 프로피온산 나트륨 공급액을 다른 배지 성분을 함유하는 공급액과 분리하였다.
발효조에 14.5 L의 샷 크기로 말트린-M040 및 태스톤-154를 공급하였다. 샷 사이의 간격은 60분으로 시작하고 104시간에서 40분으로 변화시켰다. 성분들을 탈이온수 3,000 L에 첨가하고 용액을 17 psig, 124 ℃에서 75분 동안 멸균하였다. 공급액은 다음 성분을 포함한다.
Figure 112012044011939-pat00031
진행 중에, 배지 성분의 일부, 예를 들면 탈지분유, 말트린-M040 및 글리세롤이 배출되었다. 약 115 시간에서 시작하여, 이전의 공급을 중단하고 14.5 L의 샷 크기로 다음 혼합물을 40분 간격으로 생산 발효조에 첨가하였다. 성분들을 탈이온수 (3,000 L)에 첨가하고 혼합물 (pH 8.7 내지 8.9)을 17 psig, 124 ℃에서 75분 동안 멸균하였다.
Figure 112012044011939-pat00032
목적하는 에포틸론 B 농도가 얻어졌을 때 (일반적으로 9 내지 21일 후), 용기의 내용물을 수확하였다. 에포틸론 B 역가 범위는 약 5 내지 24 ㎎/g 수지이며, B/A 비 범위는 약 1.5 내지 4이다.
실시예 5
MTBE 로 XAD -16 수지로부터 에포틸론 B를 추출하고 결정화하여
고체 에포틸론 B를 제공하고;
역상 크로마토그래피에 의해 정제하고;
고품질 에포틸론 B를 최종 분리한다
수확되어 수-세척된 에포틸론 (약 5.03 ㎏ 에포틸론 B) 함유 XAD-16 수지 (약 550 ㎏)를 수성 메탄올과 혼합하고 슬러리로서 추출 컬럼내에 로딩하였다. 채워진 수지를 수성 메탄올 (각 30％ 이후 50％ MeOH 마다 1 층 부피)로 세척하여 고극성의 불필요한 물질을 제거하였다. 에포틸론을 MTBE 세척액 (약 4 층 부피)으로 제거하였다. 풍부 용출액을 모으고 연마 여과하였다. 임의의 수성상을 제거하기 위한 중력 침강 후에, 풍부 MTBE를 농축시켰다. 농축액을 중력 침강시키고, 수성상을 제거하고 추가의 MTBE (2층 부피)를 배치에 첨가하였다. 배치를 L 당 약 5 내지 15 g 에포틸론 B의 농도로 재농축시켰다. 배치를 약 0 ℃에서 5 내지 6시간에 걸쳐 점차적으로 냉각시켜 결정화하였다. 결정성 고체를 여과시키고, 세척하고 건조시켰다. 형성된 생성물 케이크를 가온된 에틸 아세테이트에 용해시키고 연마 여과하였다. 풍부 여액을 L 당 20 내지 45 g 에포틸론 B의 농도로 진공하에 농축시켰다. 70 ℃로 가열한 후에, 배치를 0 ℃로 서서히 냉각시켜 결정성 슬러리를 제공하고, 그것을 여과하고, 냉각된 EtOAc로 세척하고, 40 ℃ 미만에서 건조시켜 분리된 재결정화 에포틸론 B를 제공하였다 (수지로부터 84％ 수율). 그후에, 이 생성물을 역상 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
역상 고정 지지체 RP/C-18로 채워진 크로마토그래피 컬럼 (11 ㎝ 직경 x 40 ㎝ 층 길이)을 수성 아세토니트릴 (30 내지 50％ v/v)로 평형화하였다. 재결정화 생성물을 디메틸 술폭시드 (DMSO, 1 내지 1.5 L/㎏)에 용해시키고, 혼합물을 여과하여 불용성 물질을 제거하고, 분취량의 100％ DMSO에 의해 이전에 채워지고 동일 부피의 DMSO에 의해 말기에 채워지는 컬럼 상에 로딩하여 수성 이동상의 도입시에 시료의 침전을 감소시켰다. 시료를 수성 아세토니트릴 (30 내지 50％ v/v)을 사용하여 컬럼으로부터 용출시키고 유출물을 UV 검출기로 290 ㎚에서 탐지하였다. 에포틸론 B 생성물 피크를 다수의 분획으로 수집하였다. 분획을 에포틸론 A 및 B 및 기타 관련 불순물에 대해 HPLC로 분석하였다.
목적하는 푸울된 컬럼 분획을 증류 패키지에 채우고, 배치를 진공 농축시켜 40 ℃ 미만의 온도에서 아세토니트릴을 제거하였다. 결과의 수성상을 에틸 아세테이트로 3회까지 추출하고, 유기 용액을 40 ℃ 미만의 온도에서 진공 농축시켜 0.1 내지 0.2 g/mL 농도의 에포틸론 B를 제공하였다. n-헵탄 (또는 헵탄들)을 40 ℃에서 배치에 첨가하고, 그후에 배치를 2 내지 -10 ℃로 서서히 냉각시켜 2시간 이상 동안 유지하였다. 결정 슬러리를 여과시키고 에틸 아세테이트/n-헵탄 용액으로 세척하고, 그후에 최종 에포틸론 B 케이크를 35 내지 40 ℃에서 진공하에 건조시켜 3.09 ㎏의 에포틸론 B 활성과 동등한 91.7％의 효력을 가진 3.367 ㎏을 생산하였다. 수지로부터의 수율은 61.4％였다. HPLC는 99.6 면적％ 에포틸론 B 및 0.4 면적％ 에포틸론 A를 나타내었으며, 기타 불순물은 >0.1 면적％로 존재하지 않았다.
실시예 6
에틸 아세테이트로 XAD -16 수지로부터 에포틸론 B를 추출하고
역용매로서 톨루엔으로 결정화하여 고체 에포틸론 B를 제공하고;
역상 크로마토그래피에 의해 정제하고; 고품질 에포틸론 B를 최종 분리한다
에포틸론 B를 함유하는 XAD-16 수지를 진동 스크린 (SWECO TM) 상에서 물로 세척하여 수지를 세정하였다. 이의 일부 (약 6.6 L, 에포틸론 B 15.6 g 함유, 수지 g 당 에포틸론 B 2.36 ㎎ 분석)을 약 5 L의 물을 사용하여 20 L 용기에 옮겨 물로 수지를 헹구었다. 그후에, 에틸 아세테이트 (유입 수지의 약 2 층 부피 (BV))를 용기에 첨가하였다. 슬러리를 약 1시간 동안 교반시키고, 600 mL 스크류 캡 원심분리 용기를 사용하여 3,500 rpm에서 5분 동안 원심분리시켜 층을 분리하였다. 제1 풍부 에틸 아세테이트 상등액을 따라내고, 그의 부피를 측정하였다. 다음에, 빈약한 수성 수지 함유 하부층을 용기에서 푸울하고, 에틸 아세테이트 (2 BV)를 용기에 첨가하였다. 슬러리를 약 1시간 동안 교반시키고 원심분리하여 층을 분리하였다. 제2 풍부 에틸 아세테이트 상등액을 따라내고, 그의 부피를 측정하였다.
물 (유입 수지의 ~0.3 BV)을 합해진 제1 및 제2 풍부 에틸 아세테이트 스트림에 첨가하고, 약 5분 동안 교반시켰다. 층들을 약 30분 동안 침강되도록 하였다. 다음에, 하부 수성층을 상부의 풍부 에틸 아세테이트 층으로부터 분리하였다. 풍부한 세척된 에틸 아세테이트 층을 45 ℃ 미만의 온도에서 리터 당 약 10 g 에포틸론 B 활성 농도로 농축시켰다. 농축된 풍부 에틸 아세테이트 용액을 연마 여과하고 20 내지 25 g/L의 에포틸론 B로 농축시켰다.
농축시킨 후, 톨루엔을 첨가하고 배치를 50 ℃ 아래에서 진공을 이용하여 톨루엔 첨가 전의 배치의 부피로 재농축시켰다. 배치를 약 1시간에 걸쳐 약 18 ℃로 냉각되도록 하고, 그후에 이 온도에서 약 16시간 동안 교반시켜 생성물 결정을 얻었다. 다음에, 결정화 배치를 여과시키고 톨루엔 (~0.2 BV)으로 세척하고 고체를 건조시켜 13.5 g의 에포틸론 B 활성을 함유하는 고체 약 30.4 g을 생산하였다. 출발 수지로부터의 활성 수율은 87％이다.
상기 방법을 이용하여 수지로부터 추출된 고체 에포틸론 B에 대해 역상 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하였다. 컬럼 (Phenomenex Luna, 15, C18(2), 5.0 ㎝ x 25 ㎝, 컬럼 BV 400 mL)을 40％ (v/v) 아세토니트릴-물 3 BV로 예비-평형화하였다. 약 4 내지 6 g의 고체 에포틸론 B를 약 40 ℃에서 약 6 mL의 DMSO에 용해시키고, 혼합물을 여과지를 통해 여과시켜 입상물질을 제거하였다. 튜브 내의 에포틸론의 침전을 방지하기 위해 약 1.5 mL의 DMSO를 시료 루프에 주입하였다. 그후에, 에포틸론-풍부 여액을 시료 루프에 주입하였다. 주입 이후에, 에포틸론 여액 용기를 약 0.5 mL의 DMSO로 세척하고 약 1 mL의 DMSO와 함께 시료 루프에 주입하였다. 에포틸론 시료의 주입 후에 DMSO를 주입함으로써 튜브 내의 침전을 방지한다. 시료 루프의 내용물을 약 5 mL/분의 유속으로 컬럼 상에 로딩하였다.
에포틸론을 컬럼 상에 로딩한 후에, 40％ 아세토니트릴-물 용액을 컬럼을 통해 펌핑하였다. 3 내지 4분 후에, 유속을 약 60 mL/분으로 증가시켰다. 에포틸론 A 및 B 피크를 분획으로 수집하였다. 풍부 에포틸론 B 함유 분획은 일반적으로 약 2.5 L와 3.25 L 용출 부피 사이의 절단부에서 얻어진다 (에포틸론 B 피크는 일반적으로 약 6 및 8 층 부피 사이에서 용출된다). 푸울 분획의 부피는 약 0.75 L이다. 에포틸론 B에 대한 피크가 거의 기저선에 도달한 후에 (피크 높이의 <10％), 100％ 아세토니트릴을 컬럼을 통해 펌핑하였다. 크로마토그램이 290 ㎚에서의 흡광도가 거의 기저선으로 되돌아갔음을 나타낼 때, 40％ 아세토니트릴-물 용액을 컬럼 상에 펌핑하여 다음 진행을 위해 컬럼의 재평형화를 시작하였다. 일반적으로, 2 BV의 100％ 아세토니트릴 및 3 BV의 40％ 아세토니트릴을 사용하여 컬럼을 세척하고 재평형화하였다.
분획을 HPLC 분석법을 이용하여 순도를 확인하고, 목적하는 분획을 푸울하였다. 전형적인 수율은 90 내지 98％이다.
푸울된 에포틸론 B 분획을 40 ℃ 아래에서 진공 하에 초기 부피의 약 50％로 농축시켰다. 농축된 분획을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 푸울된 에틸 아세테이트 추출물을 약 40 ℃의 배치 온도에서 약 0.1 g/mL 에포틸론 B로 농축시켰다. 교반하면서, n-헵탄 (또는 헵탄들) (에틸 아세테이트 용액의 50％ 부피를 이용)을 약 15분에 걸쳐 첨가하였다. 추출물을 5 ℃로 냉각하고 2시간 이상 동안 그 온도에서 유지하였다. 생성물 결정을 여과시키고 1:2 (v:v) n-헵탄:에틸 아세테이트 용액으로 세척하였다. 마지막으로, 결정을 약 12시간 동안 약 40 ℃에서 진공하에 건조시켰다. HPLC는 각종 배치에 대해 99.5 내지 99.7 면적％ 에포틸론 B 및 0.3 내지 0.5 면적％ 에포틸론 A를 나타내었다.
실시예 7
에틸 아세테이트로 XAD -16 수지로부터 에포틸론 B를 추출하고 역용매로서
톨루엔으로 결정화하고, 이어서 재결정화하여 일차 등급 에포틸론 B를 제공하고;
정상 크로마토그래피에 의해 정제하고; 고품질 에포틸론 B를 최종 분리한다
단계 A, EtOAc 추출-톨루엔 결정화를 이용한 일차 등급 에포틸론 B의 제조:
수 세척된 에포틸론 B 풍부 수지 (1350 g)를 컬럼 상에 로딩하였다. 물 (2700 mL)을 사용하여 컬럼을 로딩하고 헹구었다. 컬럼에 에틸 아세테이트 9450 mL (7 층 부피)를 통과시켜 에포틸론 활성을 용출하였다. 에틸 아세테이트 용출액을 1시간 이상 동안 침전되도록 하였다. 암갈색 수성층 및 에멀젼층을 제거하였다. 풍부 에틸 아세테이트 용액을 L 당 약 20 g의 에포틸론 B의 표적 농도로 진공하에 농축시켰다. 농축액을 2시간 동안 정치시키고 20 ℃로 냉각하였다. 냉각된 농축액을 연마 여과하고, 필터를 에틸 아세테이트 (36 mL)로 세척하였다. 합한 여액 및 세척액을 L 당 약 80 g의 에포틸론 B로 농축시키고 65 ℃로 가열하였다. 동일한 부피의 톨루엔을 60 ℃ 이상의 온도를 유지하면서 10 내지 15분에 걸쳐 교반시키며 첨가하였다. 온도를 65 ℃에서 30분 동안 유지하고, 이어서 1.5시간에 걸쳐 온도를 40 ℃로 낮추고 그후에 2시간에 걸쳐 온도를 1 ℃로 낮추었다. 결과의 결정성 슬러리를 1 ℃에서 60분 이상 동안 교반하였다. 고체를 여과시키고 톨루엔 (슬러리 부피의 20％)으로 세척하였다. (이 방법의 다양한 반복에서, 모액은 일반적으로 유입 에포틸론 B 활성의 2 내지 6％를 함유한다). 고체를 40 내지 45 ℃에서 4시간 이상 동안 오븐에서 진공 건조시켰다. 다르게는, 고체를 약 40 ℃와 실온 사이의 온도에서 4시간 이상 동안 오븐에서 진공 건조시켰다.
건조 일차 에포틸론 B 케이크 중량 범위는 8.4 내지 20 g이며, 에포틸론 B 효력 범위는 650 내지 713 ㎍/㎎이었다. 케이크는 또한 12 내지 26％ 에포틸론 A (면적 ％)를 함유하였다. 잔류 용매 농도는 0.7％ (w/w) EtOAc 및 13％ (w/w) 톨루엔이었다.
5개 로트에 대해 평가하였다.
Figure 112012044011939-pat00033
분리 공정에 대한 총 손실은 평균 9.4％였다. 수지에서 일차 케이크까지의 에포틸론 B 피크에 대한 에포틸론 A 피크의 백분율은 평균 49％에서 19％로 저하되었다. 이 단계에 기재된 방법에 따라서 얻어진 결정 용매화물에 대한 PXRD 패턴 및 열 분석은 각각 도 9 및 10에 도시되어 있다. 도 9의 PXRD 패턴은 상기 표 6에 보고된 데이타에 의해 더 특징화된다.
단계 B, 에포틸론 B의 재결정화
EtOAc (0.14 L)를 15 g 일차 등급 에포틸론 B (710 ㎍/㎎)에 첨가하고, 교반시키며 65 내지 68 ℃로 가열하였다. (에포틸론 B의 표적 농도는 L 당 75 내지 80 g 활성이었다). 톨루엔 (0.14 L)을 60 ℃ 이상의 온도를 유지하면서 20분에 걸쳐 첨가하였다. 결과 슬러리를 0.25시간 내지 1시간 동안 65 ℃에서 유지하였다. 그후에, 배치를 3시간에 걸쳐 40 ℃로 냉각하였다. 배치의 냉각을 2시간에 걸쳐 0 내지 2 ℃까지 계속하였다. 배치를 12시간 동안 0 내지 2 ℃에서 유지하였다. 결과의 결정성 슬러리를 여과시키고 케이크를 톨루엔 (2 x 0.028 L)으로 세척하였다. 일반적으로, 유입 에포틸론 B 활성의 3％ 미만이 합해진 모액 및 세척액에 손실되었다. 케이크를 42 ℃ 및 29 in. Hg에서 2시간 동안 진공 오븐에서 건조시켰다. 다르게는, 케이크를 40 ℃와 실온 사이의 온도 및 29 in. Hg에서 2시간 동안 진공 오븐에서 건조시켰다. 건조 케이크 중량은 13.6 g이고, 효력은 764 ㎍/㎎이었다. 잔류 용매는 EtOAc (0.9 중량％) 및 톨루엔 (13.2％)을 포함한다. 일반적으로, EtOAc 및 톨루엔은 13 내지 14 중량％의 총합 농도로 존재하였다. 재결정화 케이크의 경우 에포틸론 B 피크에 대한 에포틸론 A 피크의 면적 백분율은 평균 6.9％로 저하되었다.
이 단계에 기재된 방법에 따라서 얻어진 결정 용매화물에 대한 PXRD 패턴 및 열 분석은 각각 도 11 및 12에 도시되어 있다. 도 11의 PXRD 패턴은 상기 표 7에 보고된 데이타에 의해 더 특징화된다.
정상 크로마토그래피
다음 이동상을 제조하였다:
20％ (v/v) 에틸 아세테이트/n-헵탄 용액 (~10 L),
40％ 에틸 아세테이트/n-헵탄 (~10 L) 및
100％ 에틸 아세테이트 (~10 L).
다음 장치를 셋업하였다.
워터스 델타 프레프 (Waters Delta Prep) 4000; 검출기: 290 ㎚에서 UV 세트; 컬럼: 페노메넥스 루나 (Phenomenex Luna), 10 마이크론, 실리카 (2), 5.0 ㎝ x 25 ㎝ (컬럼 부피 ~ 490 mL).
컬럼을 에포틸론 용액의 주입 전에 3층 부피의 20％ (v/v) 에틸 아세테이트/n-헵탄 용액으로 평형화하였다.
에포틸론 B 케이크 (5.5 g)를 염화 메틸렌 55 mL에 용해시켰다. 배치를 1 내지 마이크론 PTFE 필터를 통해 여과시켜 존재할 수 있는 임의의 입상물질을 제거하였다. 염화 메틸렌 (2 내지 5 mL)을 사용하여 필터를 헹구었다. 풍부 염화 메틸렌 여액을 처음 30초 동안 5 mL/분의 초기 유속으로 컬럼 상에 주입하고, 이어서 시료가 완전히 로딩될 때까지 유속을 20 mL/분으로 증가시켰다. 에포틸론 여액을 함유하는 용기를 염화 메틸렌 (2 내지 5 mL)으로 헹구고, 헹굼액을 또한 컬럼 상에 로딩하였다.
유속을 118 mL/분으로 증가시키면서 20％ EtOAc/헵탄으로 용출을 시작하였다. 유속이 118 mL/분에 도달한 후에, 펌프 프로그램 조절기를 사용하여 목적하는 펌프 프로그램을 진행하였다. 다음 펌프 프로그램을 이용하였다.
Figure 112012044011939-pat00034
분획을 수집하고 HPLC를 사용하여 순도에 대해 분석하였다.
5개 배치에서, 수집된 분획 중의 에포틸론 B의 면적％는 99.59 내지 99.93％였으며, 수율 평균은 91％였다.
임의로, 크로마토그래피를 등용매 40％ 에틸 아세테이트/n-헵탄 용출 단계와, 유사한 100％ 에틸 아세테이트 컬럼 세척 단계에 이어서 40％ 에틸 아세테이트에 의한 재평형화를 이용하여 유사하게 수행하였다. 더 작은 직경 컬럼 1.0 ㎝ x 25 ㎝를 가진 동일한 크로마토그래피 장치를 사용하였다. 중심 절단 분획 중의 에포틸론 B (164 ㎎)에 대한 크로마토그래피 수율은 86％였으며 수집된 분획 중의 에포틸론 B의 면적％는 99.4％였다. 상기 등용매 과정은 또한 중심 절단에서 용출된 epo B 31 내지 35 gm을 가진 11 ㎝ 축 압축 컬럼 상에서 90 내지 94％의 크로마토그래피 수율로 수행하였다. 수집된 중심 절단 분획 중의 에포틸론 B의 면적％는 99.6 내지 99.9％였다. 컬럼은 여러번 재사용될 수 있다.
단계 C, 최종 결정화:
목적하는 중심 절단 분획을 함께 푸울하여 1.62 내지 1.73 L의 배치 부피를 얻었다. 용매를 40 내지 45 ℃에서 진공하에 제거하였다. 표적 증류 부피는 25 내지 28 mL였다 (약 200 내지 210 g/L의 에포틸론 B 농도). 농축액에 가온된 (약 40 ℃) 헵탄 (50 mL)을 첨가하였다. 다르게는, 가온된 (약 40 ℃) EtOAc (50 mL)를 이 단계에서 농축액에 첨가할 수 있다. 결과 슬러리를 약 40 ℃에서 약 2시간 동안 교반시키고, 그후에 약 5시간에 걸쳐 약 0 ℃로 냉각하고 약 0 ℃에서 최소 5시간 동안 더 교반시켰다. 결정화 동안 보통 속도로 기계적 교반시켰다. 결정성 슬러리를 여과시키고 케이크를 냉각 1:1 EtOAc/헵탄 (25 mL)으로 세척하였다. 고체를 40 내지 45 ℃에서 5 내지 6시간 동안 진공 오븐에서 건조시켰다. 다르게는, 고체를 약 40 ℃와 실온 사이의 온도에서 5 내지 6시간 동안 진공 오븐에서 건조시켰다. 재결정화된 (한번) 에포틸론 B로부터 분리된 에포틸론 B의 중량은 약 4.2 내지 5.0 g (83.5 내지 85.6％ 활성 수율)이었으며, HPLC 순도는 99.78 내지 99.93 면적％ (평균 99.80％)였다. 모액에 손실된 에포틸론 B는 크로마토그래피로 유입된 에포틸론 B 활성에 대해 약 4％였다. 케이크 중의 잔류 용매는 EtOAc (5.8 내지 6.0％ w/w) 및 헵탄 (0.6 내지 0.7％ w/w)이었다. 최종 에포틸론 B 케이크의 효력 범위는 91.5 내지 92.7％ w/w였다. HPLC 순도는 99.7 면적％ 이상이었다. 이 단계에 기재된 방법에 따라서 얻어진 결정 용매화물에 대한 PXRD 패턴 및 열 분석은 각각 도 13 및 14에 도시되어 있다. 도 14에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 절차에 따라서 제조되고 건조된 에틸 아세테이트 용매화물에 대한 융점은 약 102 ℃이다. 도 13의 PXRD 패턴은 상기 표 8에 보고된 데이타에 의해 더 특징화된다.
다르게는, 4.83 ㎏의 Epo B (1790 L)를 함유하는 푸울된 중심 절단 분획을 <30 ℃에서 200 내지 210 g/L의 표적 농도로 진공하에 농축시키고 그후에 n-헵탄 (60 ㎏)을 첨가하였다. 이러한 농축을 반복하고 추가의 헵탄 60 ㎏을 첨가하였다. 슬러리를 3시간에 걸쳐 20 ℃로 냉각하고, 그후에 수집하고 헵탄 30 ㎏으로 세척하였다. 고체를 20 내지 36 ℃에서 16시간에 걸쳐 진공하에 건조시켰다. >99.6 면적％의 HPLC 순도로 총 5.141 ㎏의 고체를 얻었다. 케이크 중의 잔류 용매는 10.6％ 에틸 아세테이트 및 1.4％ 헵탄이었다.
실시예 7A
수지로부터 에포틸론 B의 추출에 이은 반복된 재결정화
추정된 4.10 ㎏의 에포틸론 B 활성을 함유하는 수 세척된 에포틸론 풍부 수지 (549.8 ㎏) (에포틸론 B에 대한 면적％ = 58.0％; 에포틸론 A = 29.2％)을 물로 슬러리화하고 컬럼 (700 L)에 채웠다. 컬럼을 배액하고 질소로 취입하였다. 그후에, 에틸 아세테이트 (2969 ㎏)를 총 ~6 층 부피에 대해 시간 당 ~1 층 부피의 속도로 컬럼을 통해 용출시켰다. 합해진 풍부 에틸 아세테이트 용출액을 하부 수성상 제거 전에 ~1시간 동안 중력 침강되도록 하였다. 그후에, 풍부 에틸 아세테이트를 연마 여과 전에 ~2일 동안 ~20 ℃에서 정치되도록 하였다. 필터 및 라인을 에틸 아세테이트 (총 ~115 ㎏)로 세척하였다. 연마 여액 및 세척액을 ~64 L의 부피로 농축시키고, ~65 ℃로 가온하였다. 동일 부피의 가온된 톨루엔을 교반시키며 첨가하고 재료를 ~65 ℃에서 ~30분 동안 유지하였다. 그후에, 배치를 ~4시간에 걸쳐 ~40 ℃로 서서히 냉각하고, 이어서 ~2.5시간에 걸쳐 0 ℃로 냉각하였다. 그후에, 냉각 슬러리를 ~0 ℃에서 ~1시간 동안 유지하였다. 그후에, 결과의 결정성 슬러리를 여과시키고 케이크를 톨루엔 (~64 L)으로 세척하였다. 결과 케이크를 진공하에 간단하게 건조시키고, 그후에 가온된 에틸 아세테이트 (~200 ㎏)를 사용하여 필터 건조기로부터 재용해시켰다.
첫번째 결정화는 풍부 에틸 아세테이트를 ~65 L로 농축시켜 유사하게 수행하였다. 65 ℃로 가온한 후에, 동일 부피의 톨루엔을 교반시키며 첨가하고 재료를 ~65 ℃에서 ~30분 동안 유지하였다. 그후에, 배치를 상기한 바와 유사하게 냉각시키고 결과의 결정성 슬러리를 상기한 바와 동일한 절차 및 장치를 이용하여 여과시키고 세척하였다.
상기한 바와 같은 2회의 추가의 유사한 재결정화를 수행하여 에포틸론 B 결정성 케이크를 생산하였다 (4.384 ㎏)(81.5 ％ w/w)(3.573 ㎏ 에포틸론 B)(HPLC 면적％: 에포틸론 B = 97.18; 에포틸론 A = 1.40; 에포틸론 F = 0.30; 옥사졸 유사체 = 0.30 및 에틸 티아졸 유사체 = 0.56). 0.1 면적％에 대해 HPLC에 의해 기타 불순물이 검출되지 않았다. 생성물은 13.8％ w/w 톨루엔 및 0.8％ w/w 에틸 아세테이트를 함유하였다. 수지에서부터 분리 정제된 에포틸론 B까지의 전체 활성 수율은 87％였다.
실시예 7B
모액 스트림으로부터 epo B의 회수
MTBE 또는 EtOAc 추출물에서의 epo B의 결정화에서 얻은 모액을 합하였으며 그것은 용액 L 당 2.2 g의 epo B 및 4.8 g의 Epo A를 함유하였다. 이 용액 10 L를 ≤50 ℃에서 진공하에 L 당 11 내지 15 g의 Epo B의 농도로 농축시켰다. 1 부피의 톨루엔을 첨가하여 고체가 형성되기 시작하였으며 다시 11 내지 15 g Epo B/L의 농도가 얻어질 때까지 증류를 계속하였다. 1 부피의 톨루엔을 다시 첨가하고 증류를 다시 한번 반복하여 11 내지 15 g Epo B/L에 도달하게 하였다. 슬러리를 1시간에 걸쳐 실온으로 냉각시키고, 90분 동안 교반시켰다. 그후에, 혼합물을 ~50 ℃로 재가열하고, 1시간 동안 교반하고 1시간에 걸쳐 실온으로 냉각하였다. 최소 3시간 동안 교반시킨 후에, 고체를 여과시켜 모으고, 톨루엔으로 세척하고 ~40 ℃에서 진공하에 건조시켜 ~92％의 Epo B 활성의 회수율을 얻었다. 고체 분석 결과 42.9％ w/w Epo B와 16％ w/w 톨루엔이었다. 모액은 66％의 유입 에포틸론 A 및 5％ 만의 유입 에포틸론 B를 함유하였다.
실시예 7C
실시예 7에 기재된 정상 크로마토그래피 절차로부터의, Epo B 646 ㎎을 함유하는 푸울된 중심 절단 분획 (200 mL)을 ~65 ℃의 재킷 온도로 진공 하에 ~43 mL로 농축시키면서 톨루엔 43 mL에 서서히 첨가하였다. 톨루엔 43 mL를 ~65 ℃의 재킷 온도로 증류를 계속하면서 진공하에 첨가하였다. 슬러리를 ~43 mL로 농축하고 ~3시간에 걸쳐 ~20 ℃로 냉각되도록 하였다. 결정을 모으고, 2x5 mL 톨루엔으로 세척하고 ~40 ℃에서 진공 (29" Hg)하에 30분 동안 건조시켜 분리된 결정성 케이크 (85.3％ w/w Epo B) 729 ㎎을 얻었다. HPLC 순도는 99.77 면적％였다 (톨루엔 면적％ 제외). 케이크 중의 잔류 용매는 15.3％ w/w 톨루엔 및 0.3％ w/w EtOAc였다. 모액 및 세척액은 유입 에포틸론 B 활성의 0.5％ 만을 함유하였다.
이 단계에 기재된 방법에 따라서 얻어진 결정 용매화물에 대한 관찰된 PXRD 패턴은 실온에서 톨루엔 용매화물에 대한 모의된 PXRD 패턴 (하부 패턴)과 함께 도 15 (상부 패턴)에 도시되어 있다. 이 결정 용매화물에 대한 열 분석 결과는 도 16에 기재되어 있다.
실시예 8
특정 결정 형태의 제조
실시예 8A: epo B- TO β의 제조
에포틸론 B 톨루엔 용매화물의 제조
Epo B를 ~40 ℃에서 ~13 mL의 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 1 부피의 톨루엔을 첨가하고, 이어서 <40 ℃의 배쓰 온도에서 9 mL로 농축시켰다. 이것을 ~ 55 ℃로 재가열하고, 이어서 다른 부피의 톨루엔을 첨가하였다. 그후에, 이것을 ~10 mL로 농축시키고 18 ℃로 냉각되도록 하였다. 슬러리를 이용하여 x-선 구조를 확인하였다.
상기 방법에 따라서 얻어진, epo B-TOβ의 단사결정 단위 셀의 분자 구조 및 epo B-TOβ의 PXRD 패턴은 각각 도 4 및 6에 나타내어져 있다.
실시예 8B: epo B- AN β의 제조
에포틸론 B 아세토니트릴 용매화물의 제조
수성 아세토니트릴 중의 본질적으로 순수한 에포틸론 B의 용액 (실시예 5에서 역상 크로마토그래피로부터 얻은 푸울된 컬럼 분획으로부터)을 실온에서 서서히 증발되도록 하여 아세토니트릴-물로부터 결정 슬러리를 생산하였다. 결정 슬러리를 x-선 회절에 의해 직접 시험하였다.
상기 방법에 따라서 얻어진, epo B-ANβ의 단사결정 단위 셀의 분자 구조 및 epo B-ANβ의 PXRD 패턴은 각각 도 2 및 7에 나타내어져 있다.
실시예 8C: epo B- EA β의 제조
에포틸론 B EtOAc 용매화물의 제조
1:1 EtOAc/헵탄 중의 에포틸론 B의 용액을 ~190 내지 195 g/L의 표적 농도로 농축시켰다. 이러한 에포틸론 B의 농후한 슬러리에 ~40 ℃에서 10 부피의 EtOAc를 교반시키며 첨가하였다. 결과 슬러리를 40 ℃에서 2시간 동안 교반시키고, 5시간에 걸쳐 0 ℃로 냉각시키고 0 ℃에서 최소 5시간 동안 더 교반시켰다. 그후에, 슬러리를 여과시키고 케이크를 냉각된 1:1 EtOAc/헵탄으로 세척하였다. 케이크를 진공 오븐에서 5 내지 6시간 동안 건조시켜 ~5 내지 14％ EtOAc를 가진 최종 에포틸론 B를 제공하였다.
상기 방법에 따라서 얻어진, epo B-EAβ의 단사결정 단위 셀의 분자 구조 및 epo B-EAβ의 PXRD 패턴은 각각 도 1 및 5에 나타내어져 있다.
실시예 8D: epo B- IP β의 제조
에포틸론 B IPA 용매화물의 제조
에포틸론 B (70 ㎎)를 맑은 용액이 형성될 때까지 용액을 가열시켜 IPA 4 mL에 용해시켰다. 이 용액을 주위 온도로 냉각시켰다. 바로 형성된 임의의 고체를 여과시켜 제거하였다. 맑은 여액을 작은 바이알에 놓고 몇개의 핀홀이 있는 알루미늄 호일로 덮었다. 실질적인 결정 성장이 관찰될 때까지 용매가 몇일에 걸쳐 주위 온도에서 아주 서서히 증발되도록 하였다. 결정을 습윤 슬러리로서 X-선 분석하였다.
상기 방법에 따라서 얻어진, epo B-IPβ의 단사결정 단위 셀의 분자 구조 및 epo B-IPβ의 PXRD 패턴은 각각 도 3 및 8에 나타내어져 있다.
실시예 9
에포틸론 B (락톤)으로부터 유도체 2 (락탐)의 형성
염화 테트라부틸암모늄 및 소듐 아지드를 THF/DMF에서 혼합하여 테트라부틸암모늄 아지드 (TBA 아지드) 용액을 제조하였다. 결과의 TBA 아지드 용액을 여과시켜 NaCl 결정을 제거하여 회수하였다. 촉매량의 제제, 예를 들면 트리스(디벤질레덴아세톤)-디팔라듐 또는 알릴 양이온을 안정화하도록 선택된 이 촉매의 클로로포름 부가물, 염화 암모늄, 에포틸론 B 및 TBA 아지드의 THF/DMF 용액을 교반시키며 플라스크에 채워넣었다. 슬러리를 0 내지 5 ℃에서 약 25분 동안 질소 버블링시키며 탈산소화하였다. 트리메틸포스핀을 0 내지 5 ℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 32 내지 38 ℃로 가열하고 4 내지 16시간 동안 교반을 계속하여 에스테르 관능기의 분해에 의해 형성된 아미노산 중간체를 생산하였다. 반응 혼합물을 18 내지 24 ℃로 냉각하고 여과시켜 고체를 제거하였다. 고체를 THF로 세척하고 여액을 풍부 여액과 합하였다. 이 용액을 30 내지 37 ℃에서 1-히드록시벤조트리아졸 수화물, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염 및 탄산 칼륨의 THF-DMF 슬러리에 9 내지 10시간에 걸쳐 적가하였다. 결과 혼합물을 0 내지 12 ℃로 냉각하고, 온도를 <10 ℃로 유지하면서 물로 급냉시켰다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 3 내지 4회 추출하고, 합한 에틸 아세테이트 층을 시클로헥산 (3:1 에틸 아세테이트-시클로헥산 비)으로 희석하고 물로 역추출하였다. 유기층을 추가의 시클로헥산을 사용하여 2:1 에틸 아세테이트-시클로헥산 비로 더 희석하고 제타 패드 (Zeta Pad) R51SP 또는 R53SP와 같은 활성화 목탄 함침 카트리지에 통과시켜 잔류 Pd의 양을 감소시켰다. 트리에틸아민 (1％)을 유기 여액에 첨가하고 이 용액을 1％ 트리에틸아민을 함유하는 2:1 에틸 아세테이트-시클로헥산으로 짧은 실리카겔 여과에 의해 정제하였다. 풍부 용리액을 모으고 <37 ℃에서 11 내지 14 mL/g의 최종 농도로 농축시켰다. 추가의 시클로헥산을 첨가하고 슬러리를 67 내지 78 ℃에서 45 내지 60분 동안 가열하였다. 슬러리를 약 21 ℃로 서서히 냉각시키고, 여과시키고 결정성 고체를 1:1 에틸 아세테이트-시클로헥산으로 세척하였다. 습윤 케이크를 <45 ℃에서 진공 건조시켜 에포틸론 B의 결정성 락탐 유사체를 약 56 M％ 수율로 생산하였다.
실시예 10
에포틸론 B로부터 아미노-치환된 에포틸론 유도체 (유도체 1)의 형성
에포틸론 B를 에포틸론 B의 티아졸 고리 상의 2-메틸기의 효소적 히드록실화에 의해 에포틸론 F로 전환시켰다. 에포틸론 B에 대한 악티노마이세트 (actinomycete) 균주의 작용에 의해 전환이 이루어졌다. 이 단계에 사용하기 위한 악티노마이세트 균주는 본원에 참고로 포함된, 2002년 12월 17일자로 출원된 미국 특허 출원 제10/321,188호, 및 WO 00/39276호에 개시되어 있다.
에탄올 (5％ v/w) 중의 에포틸론 B를 미생물에 첨가하고, 16 내지 18 ℃에서 적당한 배지에서 성장시키고, 50％ w/v 수산화 나트륨 또는 30％ w/v 황산을 이용하여 pH를 6.9 내지 7.1로 유지하였다. 에포틸론 B의 농도가 그의 초기 값의 3 내지 5％로 감소될 때까지 생체전환을 계속하였다. 에포틸론 F를 흡착할 수 있는 XAD-16 또는 SP207과 같은 수지를 발효 탱크 (5％ v/w)에 첨가하고 10 내지 18 ℃에서 16 내지 72시간 동안 교반시켰다. 발효 브로쓰를 따라내고 수지를 물 (2:1 물-수지 비)로 세척하였다. 세척을 2번 더 반복하였다. 잔류수의 대부분을 부흐너 깔대기에서 여과에 의해 제거하였다.
예비-흡착된 에포틸론 F를 갖고 있는 XAD-16 수지를 물로 슬러리화하고 컬럼 상에 로딩하였다. 수지 컬럼을 에틸 아세테이트로 추출하고 풍부 용출액을 모았다. 수성층을 배액하고 그후에 풍부 에틸 아세테이트 분획을 5％ 중탄산 나트륨 용액 및 물로 세척하여 색을 제거하였다. 풍부 유기 분획을 감압하에 농축시키고, 그후에 실리카로 예비코팅된 필터에 통과시키고 이어서 10 μM 연마 여과시켰다. 그후에, 생성물을 진공 하에 증류시키고 일차 에포틸론 F를 역용매로서 톨루엔을 교반시키며 첨가하여 결정화하였다. 풍부 톨루엔 혼합물을 더 농축시켜 에틸 아세테이트 함량을 감소시키고 더 많은 톨루엔을 첨가하였다. 결정성 슬러리를 여과시키고 톨루엔으로 세척하였다.
에포틸론 F를 염화 메틸렌 또는 염화 메틸렌/에틸 아세테이트 혼합물에 용해시키고, 그후에 60 내지 80:40 내지 20 에틸 아세테이트:n-헵탄 혼합물 (v/v)로 평형화된 HPLC-등급 실리카로 충전된 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩하였다.
생성물을 60 내지 80:40 내지 20 에틸 아세테이트:n-헵탄 혼합물 (v/v)에 이어서 60 내지 80:40 내지 20 에틸 아세테이트:n-헵탄 혼합물 (v/v)의 등용매 또는 단계 구배로 컬럼으로부터 용출하였다. 시료 및 공정을 290 ㎚에서 UV 검출을 통해 탐지하였다. 에포틸론 F 생성물 피크를 분획화하여 밀접하게 용출되는 불순물을 최소화하였다. 풍부 푸울 분획을 진공하에 약 100 g/L의 표적 농도로 증류시켰다. 에포틸론 F의 슬러리에 동일 부피의 n-헵탄을 교반시키며 첨가하였다. 배치를 진공하에서 약 100 g/L의 표적 농도로 재증류하고, 에틸 아세테이트를 첨가하고, 슬러리를 40 ℃로 유지하였다. 배치를 2 내지 -10 ℃로 냉각하고 그 온도에서 5시간 이상 동안 유지하여 생성물을 용액으로부터 결정화하였다. 결과 슬러리를 여과시키고 냉각된 1:1 에틸 아세테이트/n-헵탄 용액으로 세척하였다. 최종 에포틸론 F 케이크를 35 내지 40 ℃에서 진공 건조시켰다.
1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔 (DBU, 1.8 당량)을 테트라히드로푸란 (3A MS 상에서 이미 건조됨) 중의 에포틸론 F 및 디페닐포스포릴 아지드 (1.5 당량)의 현탁액에 서서히 첨가하고 반응물을 15 내지 25 ℃에서 12 내지 24시간 동안 교반시켰다. 트리메틸포스핀/테트라히드로푸란 용액 (1.0 M, 1.1 당량)을 반응 혼합물에 서서히 첨가하였다. 물 및 수산화 암모늄을 첨가하고 혼합물을 추가로 30분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 물로 희석하고 수성상을 3 부분의 디클로로메탄으로 추출하였다. 그후에, 유기상을 희석된 수산화 암모늄 및 반-포화된 염화 나트륨 용액으로 세척하고, 증발 건조시켜 티아졸 메틸기 상에 관능화된 조 아미노 유도체 (유도체 1)를 얻었다.
조 생성물을 2.5％ 메탄올-0.2％ 트리에틸아민-디클로로메탄으로 예비-처리된 실리카겔을 사용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 적당한 품질의 분획을 합하고, 미세 여과하고 증발 건조시켜 크로마토그래피된 유도체 1을 얻었다. 이 물질을 에틸 아세테이트에 첨가하고 결과 현탁액을 72 내지 75 ℃에서 가열하여 용액을 얻었다. 역용매 n-헵탄을 서서히 첨가하고 혼합물을 15 내지 25 ℃에서 교반시키며 종자 존재하에 서서히 냉각되도록 하였다. 냉각시키고 ~5 ℃에서 유지한 후에, 결과 고체를 여과시키고, 이어서 진공 건조시켜 분리하여 정제된 결정성 아미노 유도체 (유도체 1)를 에포틸론 F로부터 약 70 M％ 평균 수율로 얻었다.
실시예 11
에포틸론 B로부터 에포틸론 D (유도체 3)의 제조
Figure 112012044011939-pat00035
[4S-[4R*,7S*,8R*,9R*,15R*(E)]]-4,8-디히드록시-5,5,7,9,13-펜타메틸-16[1-메틸-2-(2-메틸-4-티아졸릴)에테닐]-1-옥사-13(Z)-시클로헥사데센-2,6-디온 [에포틸론 D, 유도체 3]
-78 ℃에서 아르곤 하에 무수 THF (5 ㎖)에 WCl6 (198 ㎎, 0.5 mmol)에 이어서 nBuLi (헥산 중의 1.6 M 용액 0.625 ㎖, 1.0 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 20분에 걸쳐 실온으로 가온되도록 하였다. 텅스텐 시약 분취량 (0.50 ㎖, 0.05 mmol)을 제거하고 아르곤 하에 에포틸론 B (9.0 ㎎, 0.018 mmol)에 첨가하고 반응 혼합물을 15분 동안 교반시키고, 그후에 포화 NaHCO3 (1 ㎖)를 첨가하여 급냉시켰다. 반응 혼합물을 EtOAc (3 x 1 ㎖)로 추출하고, 합한 추출물을 건조시키고 (Na3SO4), 여과시키고 휘발물을 진공하에 제거하였다. 잔류물을 35％ EtOAc/헥산으로 크로마토그래피하여 표제 화합물 (7.0 ㎎, 0.014 mmol)을 제공하였다. MS m/z: 492.3 (M++H).
아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 PTA03880 20011127 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 PTA03881 20011127

Claims (10)

  1. (a) 소수성 상호작용에 의해 에포틸론 B를 흡착하는 수지의 존재하에 에포틸론 생성 미생물의 균주를 발효시키는 단계;
    (b) 수성 배지내의 수지를 수집하는 단계;
    (c) 에포틸론 B를 추출하여 그것을 수성 배지에서 분리하도록 선택된 용매로 수지를 추출하는 단계; 및
    (d) 추출 상으로부터 에포틸론 B를 결정화하는 단계
    를 포함하며, 상기 에포틸론 생성 미생물이 ATCC PTA 3880호 및 ATCC PTA 3881호로 기탁된 소란쥼 셀룰로숨 균주로부터 선택된 것인, 에포틸론 생성 미생물로부터 에포틸론 B의 분리 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 발효 단계가, 첨가제의 공급 없이 수행되는 경우와 비교하여, 발효로부터의 에포틸론 A 생성에 대한 에포틸론 B 생성의 비율을 증가시키는 첨가제를 공급하는 것을 더 포함하며, 상기 첨가제는 프로피온산 염 또는 에스테르인, 에포틸론 B의 분리 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 첨가제가 프로피온산 나트륨, 프로피온산 메틸 에스테르 또는 프로피온산 에틸 에스테르인 에포틸론 B의 분리 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 에포틸론 A의 양이 추출 단계 (c) 후에 존재하는 에포틸론 A의 양의 55 중량％ 이하로 감소되도록 결정화 단계 (d)를 수행하는 에포틸론 B의 분리 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    (e) 에포틸론 A의 양이 결정화 단계 (d) 후에 존재하는 에포틸론 A의 양의 55 중량％ 이하로 감소되는데 효과적인 결정화 단계를 하나 이상 더 포함하는 에포틸론 B의 분리 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 (d)가
    (i) 에포틸론 B가 불용성이거나 난용성인 제2 용매를 첨가하고;
    (ii) 추출 용매의 적어도 일부분을 제거하고;
    (iii) 얻어진 용매 또는 용매 혼합물을 에포틸론 B가 결정화되는 온도로 전이시키는 것
    을 포함하는 에포틸론 B의 분리 방법.
  7. 제6항에 있어서, 추출 용매가 에틸 아세테이트 또는 MTBE이고, 제2 용매가 톨루엔인 에포틸론 B의 분리 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 에포틸론 B 및 에포틸론 A가 에포틸론 B/A 비율 1.5 이상으로 생성되는 에포틸론 B의 분리 방법.
  9. ATCC PTA 3880호로 기탁된 소란쥼 셀룰로숨 균주.
  10. ATCC PTA 3881호로 기탁된 소란쥼 셀룰로숨 균주.
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