CN101918400B - 一种分离和提纯埃博霉素的方法 - Google Patents

一种分离和提纯埃博霉素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种分离和提纯埃博霉素的方法，具体公开一种采用正相硅胶色谱法分离、提纯埃博霉素B和A的方法，其包括用C1-C7的烷基卤代化合物溶解含有埃博霉素B和A样品后上样或用硅胶拌样后上样，然后用正相硅胶柱洗脱溶剂梯度洗脱硅胶柱，最后得到产品。

Description

一种分离和提纯埃博霉素的方法
技术领域
本发明涉及一种埃博霉素的分离和提纯方法，具体涉及埃博霉素B和A的分离和提纯方法。
背景技术
埃博霉素(Epothilone)是由微生物粘细菌产生的一种新型天然细胞毒化合物，是一类新的稳定微管的细胞毒活性成分(参见Gerth，K.等人，J.Antibiot.(抗生素杂志)49，第560-563页(1966))。它与对人类不同实体瘤细胞有明显抗肿瘤活性的紫杉醇在生物学上具有相似性，其以同样方式诱导微管蛋白多聚体形成超稳定态，阻碍有丝分裂，阻止肿瘤细胞繁殖。
埃博霉素在来源、合成方法、亲水性、抗肿瘤活性和抗肿瘤谱等方面均优于紫杉醇类药物，与已经确立的治疗相比，尤其是在肿瘤对用紫杉醇治疗已经产生耐药性的情况下，埃博霉素，尤其是埃博霉素A且最优选埃博霉素B具有各种优势，是一类新型抗肿瘤药物，被认为是紫杉醇的更新换代产品，是具有市场潜力的新型抗癌药物，其中埃博霉素B和A的化学结构如图所示。
Figure GPA00001033438200011
自1995年发现埃博霉素的抗癌活性后，其得到了包括化学、生物学、医药学等多方面的广泛而深入的研究，并取得了一定的成果。
随着研究的深入，对高纯度埃博霉素样品的需求不断增加，如何分离和提纯埃博霉素就成为一个急需解决的问题。埃博霉素，尤其埃博霉素B和A的提取和纯化工艺，国内外已做了很多工作。如ZL01820141.5涉及分离和提纯埃坡霉素的方法，该专利披露了从树脂中解吸埃博霉素，尤其埃博霉素A和/或埃博霉素B的方法；ZL02110067.5则涉及一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法，该专利披露了利用混合树脂吸附、固液分步萃取、分子筛层析、结晶和高效液相分离等技术手段，从粘细菌发酵液中分离提取埃博霉素；专利ZL99803121.6中所公布的最终纯化埃博霉素B和A的方法是用反相制备高压液相来实现的；而专利CN03822662.6中是用正相高压液相来达到埃博霉素B和A的分离。
就目前已有的技术来看，埃博霉素B和A的分离和纯化主要还是通过制备色谱柱来实现的，这不但需要昂贵的设备，而且消耗大量的甲醇或乙腈，一次所能制备的样品量也有限。
发明内容
针对现有分离和提纯埃博霉素B和A工艺中存在的技术缺陷，本发明的目的在于提供一种新的利用正相硅胶层析法进行埃博霉素B和A的分离和提纯方法。
该方法包括：用C1-C7的烷基卤代化合物溶解含有埃博霉素B和A样品后，上样或用硅胶拌样品后上样；然后用正相硅胶柱洗脱溶剂梯度洗脱硅胶柱，收集洗脱液，最后得到产品。
本发明采用正相硅胶柱层析法进行埃博霉素B和A分离和提纯的方法进一步优选为包括如下步骤：
用C1-C7的烷基卤代化合物有机溶剂溶解含有埃博霉素B和A样品或用第一种正相硅胶柱的硅胶拌样后，上第一种正相硅胶柱，然后用正相硅胶柱洗脱溶剂进行梯度洗脱；分别收集含有埃博霉素B和A的流分，合并含有埃博霉素B和A的流分，浓缩，结晶，得含有埃博霉素B和A的结晶粗品；
用C1-C7的烷基卤代化合物有机溶剂溶解含埃博霉素B和A的结晶粗品或用第二种正相硅胶柱的硅胶拌样后，上第二种正相硅胶柱，然后用正相硅胶柱洗脱溶剂进行梯度洗脱，分别收集含有埃博霉素B的流分和含有埃博霉素A的流分。
埃博霉素B经结晶后，再用叔丁醇溶解并冻干，得到高纯度无定形粉末；埃博霉素A再用叔丁醇溶解并冻干，得到高纯度的无定形粉末。
本发明正相硅胶色谱法分离埃博霉素B和A的方法中，第一种正相硅胶柱和第二种正相硅胶柱均为本领域常用的正相硅胶柱，本发明中的第一种正相硅胶柱和第二种正相硅胶柱所使用的硅胶可以是同一种正相硅胶也可以是不同的硅胶，其中，本发明优选为同一种规格的硅胶。
在本发明的正相硅胶色谱法分离埃博霉素B和A的方法中，第一种正相硅胶柱的硅胶用量优选为：硅胶用量与样品量的质量比为5-10∶1；本发明第二种正相硅胶柱的硅胶用量为：硅胶用量与结晶样品的质量比为50-200∶1。
为了使本发明所得的埃博霉素B和埃博霉素A获得更高的收率，本发明优选在正相硅胶色谱柱使用之前，优选采用C1-C7的烷基卤代化合物溶剂平衡正相硅胶色谱柱。C1-C7的烷基卤代化合物优选为二氯甲烷、氯仿和溴乙烷中的一种或多种，更进一步优选为二氯甲烷、氯仿或其组合。
本发明中的正相硅胶色谱柱的梯度洗脱溶剂为C1-C7的烃类化合物、C1-C7的烷基卤代化合物、C1-C7的酮类化合物或C1-C7的酯类化合物或它们的任意组合，其中，
C1-C7的烃类化合物选自石油醚、正己烷、环己烷和正庚烷中的一种或多种，进一步优选为石油醚；
C1-C7的烷基卤代化合物选自二氯甲烷、氯仿和溴乙烷中的一种或多种，进一步优选为二氯甲烷；
C1-C7的酮类化合物选自丙酮、丁酮或其组合，优选为丙酮；
C1-C7的酯类化合物选自乙酸乙酯、醋酸异丁酯或其组合，优选为乙酸乙酯；
其中，本发明正相硅胶色谱柱的梯度洗脱溶剂进一步优选为石油醚、乙酸乙酯、丙酮、氯仿和二氯甲烷中的一种、两种或两种以上组合。
其中，本发明第一种正相硅胶柱的洗脱溶剂优选为丙酮与石油醚的组合或乙酸乙酯与石油醚的组合；其中，在丙酮与石油醚的组合中，丙酮与石油醚的体积比优选为1∶3-9；在乙酸乙酯与石油醚的组合中，乙酸乙酯与石油醚的体积比优选为1∶1-9。
本发明中，第二种正相硅胶柱的洗脱溶剂优选为丙酮与石油醚的组合或石油醚与丙酮与二氯甲烷或氯仿的组合，其中，在丙酮与石油醚的组合中，丙酮与石油醚的体积比为1∶3-9；在石油醚与丙酮与二氯甲烷或氯仿的组合中，丙酮与石油醚的体积比为1∶3-9，二氯甲烷或氯仿的体积为占总体积的5％-50％。
在采用正相硅胶色谱法进行埃博霉素B和A的分离和纯化过程中，埃博霉素B和A的结晶可以采用本领域常规结晶技术进行结晶，为了使本发明实现更好的技术效果，发明优选采用正庚烷或乙酸乙酯或两者的组合作为结晶溶剂对埃博霉素B和A进行结晶，本发明结晶溶剂优选为正庚烷和乙酸乙酯的混合溶剂，其体积比为1∶1。并优选采用如下方法结晶：将含有埃博霉素B和A的粗品或埃博霉素B的粗品用适量的乙酸乙酯溶解，然后加入正庚烷，室温放置，然后降温至4℃，结晶即得。
在采用正相硅胶色谱法进行埃博霉素B和A的分离和纯化过程中，上第一种正相硅胶柱所使用的含有埃博霉素B和A的样品为采用常规方法对产埃博霉素的一株粘细菌菌株的发酵液进行处理，除去杂质后获得的含有埃博霉素B和A的样品。
为了更好实现本发明目的，本发明中上第一种正相硅胶柱使用的含有埃博霉素B和A的样品为将含埃博霉素B和A的粘细菌发酵液经过非极性大孔吸附树脂分离得到的初产物，其具体的制备方法为：
向粘细菌发酵液中加入第一种非极性大孔吸附树脂柱的树脂，过振动筛，同时水洗除杂，然后将树脂装柱，用醇溶液进行梯度洗脱，合并含有埃博霉素B和A的流分；
将合并的含有埃博霉素B和A流分的洗脱液稀释到适宜浓度，上第二种非极性大孔吸附树脂柱，用醇溶液进行梯度洗脱，收集含有埃博霉素B和A的流分，合并含有埃博霉素B和A的流分，即得含有埃博霉素B和A的样品。
本发明中，上述第一种非极性大孔树脂和第二种非极性大孔树脂为用于发酵液分离的非极性大孔吸附树脂，它们可以是同一种非极性大孔树脂树脂，也可以为不同的非极性大孔吸附树脂。
其中，本发明第一种非极性大孔吸附树脂优选为XAD-1600或HP-20，如Amberlite XAD-1600(Rohm & Haas，美国)、Diaion HP-20(MitsubishiChemical，日本)，进一步优选为XAD-1600型号的非极性大孔吸附树脂。
本发明中的第二种非极性大孔吸附树脂优选为H41或H60型号的非极性大孔吸附树脂(江苏省，林化所南京科技开发总公司所产)，进一步优选为H41型号的非极性大孔吸附树脂。
本发明中第一种非极性大孔吸附树脂和第二种非极性大孔吸附树脂所使用的洗脱溶剂为醇溶液，如乙醇、甲醇的溶液，本发明优选为乙醇溶液，其中，第一种非极性大孔吸附树脂所使用的洗脱溶剂进一步优选30％-100％体积百分比的乙醇溶液；第二种非极性大孔吸附树脂所使用的洗脱溶剂为30％-80％体积百分比的乙醇溶液。
本发明采用正相硅胶层析法分离和纯化埃博霉素B和A的工艺过程中，不论是从树脂洗脱下来的流分、还是从正相硅胶柱洗脱下来的流分，都应经过HPLC检测的方法进行检测，并优选收集符合以下条件的流分：其中第一种非极性大孔吸附树脂所得的流分经过HPLC分析，埃博霉素B和A发酵单位总和在50以上的流分为需要收集的流分。
第二种非极性大孔吸附树脂所得的流分经过HPLC分析，埃博霉素B和A发酵单位总和在50以上的流分为需要收集的流分。
第一种正相硅胶柱所得的流分经过HPLC分析，埃博霉素B和A的总色谱纯度达到80％以上的流分为需要收集的流分。
第二种正相硅胶柱所得的流分经过HPLC分析，埃博霉素B的色谱纯度达到97.5％以上的流分为需要收集流分；埃博霉素A的色谱纯度达到92.5％以上的流分为需要收集的流分。
其中，HPLC分析检测方法可以采用本领域常规的检测方法进行检测，但本发明优选采用以下方法：
反相半制备柱(Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18)，规格为250*9.4mm，填料粒径为5μm，流速为1.5mL/min，249nm检测，流动相为甲醇∶水＝80∶20。或
分析柱(SHIMADZU XOD-C18)，规格为150*6.0mm，填料粒径为5μm，流速为1.0mL/min，249nm检测，流动相为乙腈∶甲醇∶水＝40∶20∶50。
按照本发明采用正相硅胶层析法进行埃博霉素B和A的分离和纯化方法的一个优选方案，具体包含以下步骤：
(1)、将加入XAD-1600型树脂的发酵液过振动筛，同时水洗除杂，然后装柱，用体积百分比为30％-100％乙醇溶液进行梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，分别收集含有埃博霉素B和A的流分，合并含有埃博霉素B和A的流分；
(2)、将合并后的含埃博霉素B和A的流分稀释成适宜浓度的醇溶液，或者经过真空蒸发浓缩至适当体积后再稀释成适宜浓度的醇溶液，上H41型树脂柱，用体积百分比为30％-80％乙醇溶液梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，分别收集含有埃博霉素B和A的流分，合并含有埃博霉素B和A的流分，真空浓缩至干，即得含有埃博霉素B和A的样品；
(3)、用氯仿或二氯甲烷溶解含有埃博霉素B和A的样品或硅胶拌样后，上第一种正相硅胶柱，用石油醚/丙酮混合溶液或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，分别收集含有埃博霉素B和A的流分，合并含有埃博霉素B和A的流分，浓缩至干，用乙酸乙酯/正庚烷的混合溶剂结晶，得含埃博霉素B和A的结晶粗品；
(4)、用氯仿或二氯甲烷溶解含埃博霉素B和A的结晶粗品或用第二种正相硅胶柱的硅胶拌样后，上第二种正相硅胶柱，用石油醚/丙酮或石油醚/丙酮/二氯甲烷或石油醚/丙酮/氯仿的混合溶剂进行梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，分别收集含有埃博霉素B的流分和含有埃博霉素A的流分；
(5)、埃博霉素B的流分经过乙酸乙酯/正庚烷结晶后，用叔丁醇溶解并冻干，得高纯度无定形粉末纯品；埃博霉素A用叔丁醇溶解并冻干，得到得高纯度无定形粉末纯品。
根据实际的纯度需要，可以对本发明(5)中所获得的埃博霉素B或埃博霉素A再进行纯化，如埃博霉素B可以采用本发明所述的重结晶方法进行纯化；埃博霉素A可以采用本发明中的第二种正相硅胶柱再进行洗脱，以得到更高纯度的埃博霉素B或埃博霉素A，如达到纯度为99.0％或纯度更高的埃博霉素B或埃博霉素A。
其中，埃博霉素B：ESIMS m/z 508[M+H]+；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：6.98(1H，s，H-19)，6.60(1H，bs，H-17)，5.42(1H，dd，J＝7.9，2.8Hz，H-15)，4.24(1H，m，H-3)，3.77(1H，dd，J＝8.4，4.2Hz，H-7)，3.30(1H，m，H-6)，2.82(1H，dd，J＝7.7，4.5Hz，H-13)，2.70(3H，s，H-21)，2.54(1H，dd，J＝14.1，10.6Hz，H-2a)，2.38(1H，dd，J＝14.1，3.0Hz，H-2b)，2.10(1H，m，H-14a)，2.09(3H，d，J＝1.0Hz，H-27)，1.90(1H，m，H-14b)，1.72(2H，m，H-8，H-11a)，1.49(2H，m，H-10)，1.41(3H，m，H-9，and H-11b)，1.39(3H，s，H-23)，1.28(3H，s，H-26)，1.17(3H，d，J＝6.8Hz，H-24)，1.08(3H，s，H-22)，1.00(3H，d，J＝7.0Hz，H-25)；13C NMR(CDCl3，100MHz)δ220.6(s，C-5)，170.6(s，C-1)，165.2(s，C-20)，151.8(s，C-18)，137.6(s，C-16)，119.6(d，C-17)，116.1(d，C-19)，76.7(d，C-15)，74.1(d，C-7)，72.8(d，C-3)，61.7(d，C-12)，61.4(s，C-13)，53.1(s，C-4)，42.9(d，C-6)，39.2(t，C-2)，36.4(d，C-8)，32.4(t，C-11)，32.1(t，C-14)，30.7(t，C-9)，22.7(q，C-26)，22.3(t，C-10)，21.5(q，C-23)，19.5(q，C-22)，19.1(q，C-21)，17.1(q，C-25)，15.9(q，C-27)，13.6(q，C-24)。
埃博霉素A：ESIMS m/z 494[M+H]+；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ6.98(1H，s，H-19)，6.60(1H，bs，H-17)，5.44(1H，dd，J＝8.7，2.1Hz，H-15)，4.20(1H，m，H-3)，4.10(1H，br s，3-OH)，3.79(1H，dd，J＝8.4，4.2Hz，H-7)，3.22(1H，m，H-6)，3.04(1H，m，H-13)，2.92(1H，m，H-12)，2.70(3H，s，H-21)，2.52(1H，dd，J＝14.5，10.6Hz，H-2a)，2.42(1H，dd，J＝14.5，3.2Hz，H-2b)，2.12(1H，m，H-14a)，2.09(3H，d，J＝1.0Hz，H-27)，1.88(1H，m，H-14b)，1.75(2H，m，H-8，H-11a)，1.56(1H，m，H-10a)，1.44(4H，m，H-9，H-10b and H-11b)，1.41(3H，s，H-23)，1.17(3H，d，J＝6.8Hz，H-24)，1.10(3H，s，H-22)，1.00(3H，d，J＝7.0Hz，H-25)；13C NMR(CDCl3，75MHz)δ220.1(s，C-5)，170.6(s，C-1)，165.1(s，C-20)，151.8(s，C-18)，137.5(s，C-16)，119.8(d，C-17)，116.2(d，C-19)，76.5(d，C-15)，74.5(d，C-7)，73.0(d，C-3)，57.5(d，C-12)，54.7(d，C-13)，53.0(s，C-4)，43.3(d，C-6)，39.0(t，C-2)，36.2(d，C-8)，31.5(t，C-14)，30.5(t，C-9)，27.2(t，C-11)，23.4(t，C-10)，21.7(q，C-23)，20.1(q，C-22)，19.1(q，C-21)，17.1(q，C-25)，15.8(q，C-27)，14.1(q，C-24)。
按照本发明，埃博霉素B和埃博霉素A的分离纯化流程图见图1。
本发明方法不仅能够很好地分离埃博霉素B和A，使埃博霉素B和A的纯度达到95.0％以上，优选可以达到99.0％以上，而且相对于现有分离埃博霉素B和A的分离技术而言，具有收率高、工艺简单，可操作性强，不需要昂贵的制备色谱柱等设备、更加适于工业化生产，且本发明不需要消耗大量的毒性较高的溶剂，如甲醇和乙腈。
附图说明
图1埃博霉素B和A的分离、纯化流程图；
图2分离纯化后色谱纯度达99.0％以上的埃博霉素B的HPLC色谱图；
图3分离纯化后色谱纯度达99.0％以上的埃博霉素A的HPLC色谱图；
图4埃博霉素B冻干所得无定形粉末的PXRD图(2θ(度)应用Cukα，λ＝0.154056nm)；
图5埃博霉素A冻干所得无定形粉末的PXRD图(2θ(度)应用Cukα，λ＝0.154056nm)。
具体实施方式
实施例1
将加入了XAD-1600树脂的3吨产埃博霉素的发酵液过振动筛，并用水洗树脂。树脂用30％乙醇溶液上柱，然后用95％乙醇溶液洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，收集并合并含有埃博霉素B和A的流分，浓缩至约10L的料液，经HPLC(外标法)分析含有54.38g的埃博霉素B和110.50g埃博霉素A。
将上述10L的料液配成30％乙醇溶液，上H41树脂柱(20cm*300cm，柱体积为70L)，分别用30％，40％，50％，60％的乙醇溶液，每浓度2柱体积洗脱，最后用70％的乙醇洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，收集需要的含有埃博霉素B和A的流分，合并含埃博霉素B和A的流分浓缩至干，即得含有埃博霉素B和A的样品。
用CHCL3溶解含有埃博霉素B和A的样品后，上第一种正相硅胶柱(硅胶和样品的比例为5∶1)，先用80∶20的石油醚/乙酸乙酯洗脱3柱体积，然后分别用体积比为(85∶15)的石油醚/丙酮梯度洗脱2柱体积和用体积比为(80∶20)的石油醚/丙酮梯度洗脱4柱体积，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，收集需要的含有埃博霉素B和A的流分，合并含有埃博霉素B和A的流分，浓缩至干；
将含有埃博霉素B和A浓缩物用比例为1∶1的乙酸乙酯/正庚烷结晶2次，得到含有埃博霉素B和A的结晶粗品，经HPLC(外标法)分析含有40.26g的埃博霉素B和31.81g埃博霉素A，埃博霉素B和埃博霉素A的总色谱纯度为97.9％。
实施例2
取实施例1所得埃博霉素B和A的混合结晶粗品5克用5毫升二氯甲烷溶解后，上第二种正相硅胶柱(4cm*80cm，硅胶量为300克)，硅胶柱用二氯甲烷平衡，然后分别用(90∶10)、(85∶15)、(83∶17)和(80∶20)的石油醚/丙酮进行梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，分别收集并合并需要的含有埃博霉素B的流分和含有埃博霉素A的流分，分别浓缩至干；最后得到98.7％的2.40克埃博霉素B(收率89％)和95.8％的1.90克埃博霉素A(收率92％)。
实施例3
取实施例1所得埃博霉素B和A的混合结晶粗品5克用5毫升氯仿溶解后，上第二种正相硅胶柱(4cm*80cm，硅胶量为300克)，硅胶柱用氯仿平衡，然后分别用(90∶10∶10)、(85∶15∶10)、(83∶17∶10)和(80∶20∶10)的石油醚/丙酮/氯仿进行梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，分别收集并合并需要的含有埃博霉素B的流分和含有埃博霉素A的流分，分别浓缩至干；最后得到98.9％的2.48克埃博霉素B(收率92％)和96.7％的1.88克埃博霉素A(收率90％)。
实施例4
取实施例1所得埃博霉素B和A的混合结晶粗品5克用5毫升二氯甲烷溶解后，上第二种正相硅胶柱(6cm*100cm，硅胶量为800克)，硅胶柱用二氯甲烷平衡，然后分别用(90∶10∶40)、(85∶15∶30)、(83∶17∶20)和(80∶20∶10)的石油醚/丙酮/二氯甲烷梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，分别收集并合并需要的含有埃博霉素B的流分和含有埃博霉素A的流分，分别浓缩至干；最后得到98.5％的2.53克埃博霉素B(收率94％)和97.8％的1.94克埃博霉素A(收率92％)。
实施例5
按实施例2-4所得埃博霉素B通过重结晶得到高纯度的埃博霉素B；所得较纯埃博霉素A通过再次硅胶得到高纯度的埃博霉素A。
取色谱纯度为98.5％的埃博霉素B样品10克用15mL乙酸乙酯加热至52℃溶解然后加入15mL正庚烷，室温放置，然后降温至4℃保持24小时，结晶过滤重复上述操作，最后得到8.7克99.4％的埃博霉素B结晶纯品。
取按实施例2-4所得埃博霉素A的较纯色谱纯度为97.5％的埃博霉素A样品5克用5毫升二氯甲烷溶解后，上第二种正相硅胶柱(硅胶量为300克)，硅胶柱用二氯甲烷平衡，然后分别用体积比为(90∶10∶40)、(85∶15∶30)、(83∶17∶20)和(80∶20∶10)的石油醚/丙酮/二氯甲烷梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，收集并合并需要的含有埃博霉素A的流分浓缩至干；最后得到99.5％的4.3克埃博霉素A。
按照上述方法得到的埃博霉素B和埃博霉素A的纯品的HPLC色谱图分别如图2和图3所示。
实施例6
埃博霉素B和埃博霉素A无定形粉末的制备
通过实施例5所得高纯度的埃博霉素B和埃博霉素A分别用叔丁醇溶解并冻干，得无定形粉末纯品。
取0.52克埃博霉素B加热溶解于50毫升叔丁醇中，放置室温然后放入VIRTIS Genesis冷冻干燥器中在-20℃下冷冻干燥48小时，然后将所得的冷冻干燥产品在30℃，在高真空下进一步干燥96小时。在52℃下，在高真空下进一步干燥48小时。所得冻干粉末通过粉末X-射线衍射法测定。
取0.41克埃博霉素A加热溶解于30毫升叔丁醇中，放置室温然后放入VIRTIS Genesis冷冻干燥器中在-20℃下冷冻干燥48小时，然后将所得的冷冻干燥产品在30℃下，在高真空下进一步干燥96小时，在50℃下，在高真空下进一步干燥48小时。所得冻干粉末通过粉末X-射线衍射法测定。
按照上述方法得到的埃博霉素B和埃博霉素A的无定形粉末的PXRD图分别如图4和5所示。(粉末X-射线衍射法测定用Rigaku D/max-2200)
对比实施例1
取实施例1所得埃博霉素B和A的混合结晶粗品5克用5毫升二氯甲烷溶解后，上第二种正相硅胶柱(4cm*80cm，硅胶量为300克)，硅胶柱用石油醚/丙酮＝90∶10平衡，然后用(90∶10)，(85∶15)，(83∶17)，(80∶20)的石油醚/丙酮梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，分别收集并合并需要的含有埃博霉素B的流分和含有埃博霉素A的流分，分别浓缩至干；最后得到98.3％的0.94克埃博霉素B(收率35％)和95.2％的0.72克埃博霉素A(收率35％)。
对比实施例2
取实施例1所得埃博霉素B和A的混合结晶粗品5克用5毫升二氯甲烷溶解后，上第二种正相硅胶柱(4cm*80cm，硅胶量为300克)，硅胶柱用石油醚/二氯甲烷＝1∶1平衡，然后用(90∶10∶10)，(85∶15∶10)，(83∶17∶10)，(80∶20∶10)的石油醚/丙酮/氯仿梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，分别收集并合并需要的含有埃博霉素B的流分和含有埃博霉素A的流分，分别浓缩至干；最后得到98.4％的0.97克埃博霉素B(收率36％)和95.7％的0.83克埃博霉素A(收率40％)。
对比实施例3
取实施例1所得埃博霉素B和A的混合结晶粗品5克用5毫升二氯甲烷溶解后，硅胶拌样，真空抽干，上第二种正相硅胶柱(4cm*80cm，硅胶量为300克)，硅胶柱干法装填真空抽严实，然后用(90∶10∶10)，(85∶15∶10)，(83∶17∶10)，(80∶20∶10)的石油醚/丙酮/二氯甲烷梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，分别收集并合并需要的含有埃博霉素B的流分和含有埃博霉素A的流分，分别浓缩至干；最后得到98.7％的0.81克埃博霉素B(收率30％)和95.4％的0.70克埃博霉素A(收率34％)。

Claims (17)

1.一种分离和提纯埃博霉素的方法，其特征在于，采用正相硅胶柱层析法进行埃博霉素B和A的分离和纯化，包括：用C1-C7的烷基卤代化合物溶解含有埃博霉素B和A的样品后上样或用硅胶拌样品后上样；然后用正相硅胶柱洗脱溶剂洗脱硅胶柱，收集洗脱液，最后得到产品；
其中，所述正相硅胶柱在使用之前采用所述C1-C7的烷基卤代化合物平衡，所述C1-C7的烷基卤代化合物为二氯甲烷、氯仿或溴乙烷中的一种或多种；
所述正相硅胶柱洗脱溶剂为C1-C7的烃类化合物、C1-C7的烷基卤代化合物、C1-C7的酮类化合物或C1-C7的酯类化合物或它们的任意组合，其中，C1-C7的烃类化合物选自石油醚、正己烷、环己烷和正庚烷中的一种或多种；C1-C7的烷基卤代化合物选自二氯甲烷、氯仿和溴乙烷中的一种或多种；C1-C7的酮类化合物选自丙酮，丁酮或其组合；C1-C7的酯类化合物选自乙酸乙酯、醋酸异丁酯或其组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：用C1-C7的烷基卤代化合物溶解含有埃博霉素B和A的样品或用第一种正相硅胶柱的硅胶拌样后，上第一种正相硅胶柱、然后用正相硅胶柱洗脱溶剂进行梯度洗脱，分别收集含有埃博霉素B和A的流分，合并含有埃博霉素B和A的流分，浓缩，结晶，得含埃博霉素B和A的结晶粗品；
用C1-C7的烷基卤代化合物溶解埃博霉素B和A的结晶粗品或用第二种正相硅胶柱的硅胶拌样后，再上第二种正相硅胶柱，然后用正相硅胶柱洗脱溶剂进行梯度洗脱，分别收集含有埃博霉素B的流分和含有埃博霉素A的流分，分别进行浓缩、并将含有埃博霉素B的流分结晶，即得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一种正相硅胶柱的硅胶用量与样品量的质量比为5-10∶1；第二种正相硅胶柱的硅胶用量与结晶样品量的质量比为50-200∶1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C1-C7的烷基卤代化合物选自二氯甲烷、氯仿或其组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正相硅胶柱洗脱溶剂为石油醚、乙酸乙酯、丙酮、氯仿和二氯甲烷中的一种或两种以上的组合。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一种正相硅胶柱的洗脱溶剂为石油醚与丙酮的组合或石油醚与乙酸乙酯的组合，其中石油醚与丙酮的体积比为3-9∶1，石油醚与乙酸乙酯的体积比为1-9∶1。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，第二种正相硅胶柱的洗脱溶剂为丙酮与石油醚的组合或石油醚与丙酮与二氯甲烷或氯仿的组合，其中，丙酮与石油醚的组合中，丙酮与石油醚的体积比为1∶3-9；石油醚与丙酮与二氯甲烷或氯仿的组合中，丙酮与石油醚的体积比为1∶3-9，二氯甲烷或氯仿的体积为占总体积的5％-50％。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，用HPLC对从硅胶柱洗脱下来的含埃博霉素B和A的流分进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，结晶使用的溶剂为正庚烷或乙酸乙酯或两者的组合。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，结晶使用的溶剂为正庚烷和乙酸乙酯的组合，其体积比为1∶1。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，结晶采用如下方法：将含有埃博霉素B和A的粗品或埃博霉素B的粗品用适量的乙酸乙酯溶解，然后加入正庚烷，室温放置，然后降温至4℃，结晶即得。
12.根据权利要求1-11任一所述的方法，其特征在于，所述含有埃博霉素B和A的样品为粘细菌发酵液经过非极性大孔吸附树脂分离得到的产物。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，含有埃博霉素B和A的样品采用如下方法制备：
向发酵液中加入第一种非极性大孔吸附树脂柱的树脂，过振动筛，同时水洗除杂，然后将树脂装柱，用醇溶液进行梯度洗脱，分别收集含有埃博霉素B和A的流分，合并含有埃博霉素B和A的流分；
将合并后的含有埃博霉素B和A流分的洗脱液稀释到适宜浓度，上第二种非极性大孔吸附树脂柱，用醇溶液进行梯度洗脱，分别收集含有埃博霉素B和A的流分，合并含有埃博霉素B和A的流分，即得含有埃博霉素B和A的样品。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，第一种非极性大孔吸附树脂为XAD-1600型树脂；第二种非极性大孔吸附树脂为H41型树脂。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，洗脱第一种非极性大孔吸附树脂柱采用的洗脱溶剂为30％-100％体积百分比的乙醇溶液；洗脱第二种非极性大孔吸附树脂柱采用的洗脱溶剂为30％-80％体积百分比的乙醇溶液。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，用HPLC对从第一种和第二种非极性大孔吸附树脂柱洗脱下来的含有埃博霉素B和A的流分进行检测。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，采用正相硅胶柱层析法进行埃博霉素B和A的分离和纯化，包括：
(1)、将加入XAD-1600型树脂的发酵液过振动筛，同时水洗除杂，然后装柱，用体积百分比为30％-100％乙醇溶液进行梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，分别收集含有埃博霉素B和A的流分，合并含有埃博霉素B和A的流分；
(2)、将合并后的含埃博霉素B和A流分的洗脱液稀释成适宜浓度的醇溶液，或者经过真空蒸发浓缩至适当体积后再稀释成适宜浓度的醇溶液，上H41型树脂柱，用体积百分比为30％-80％乙醇溶液梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，分别收集含有埃博霉素B和A的流分，合并含有埃博霉素B和A的流分，真空浓缩至干，即得含有埃博霉素B和A的样品；
(3)、用氯仿或二氯甲烷溶解含有埃博霉素B和A的样品或硅胶拌样后，上第一种正相硅胶柱，用石油醚/丙酮混合溶液或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，分别收集含有埃博霉素B和A的流分，合并含有埃博霉素B和A的流分，浓缩至干，用乙酸乙酯/正庚烷的混合溶剂结晶，得含埃博霉素B和A的结晶粗品；
(4)、用氯仿或二氯甲烷溶解含埃博霉素B和A的结晶粗品或用第二种正相硅胶柱的硅胶拌样后，上第二种正相硅胶柱，用石油醚/丙酮或石油醚/丙酮/二氯甲烷或石油醚/丙酮/氯仿的混合溶剂进行梯度洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，分别收集含有埃博霉素B的流分和含有埃博霉素A的流分；
(5)、埃博霉素B的流分经过乙酸乙酯/正庚烷结晶后，用叔丁醇溶解并冻干，得高纯度无定形粉末纯品；埃博霉素A用叔丁醇溶解并冻干，得到高纯度无定形粉末纯品。
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