CN117603229A - 一种bousigonine D的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种bousigonine D的制备方法，属于生物碱制备技术领域。本发明首次从闷奶果中分离制备得到bousigonine D，通过对闷奶果进行醇‑水提取及石油醚和乙酸乙酯萃取，使目标化合物bousigonine D最大程度溶出，再依次进行硅胶柱色谱分离、凝胶柱色谱分离和反相柱色谱分离，制备得到的bousigonine D的收率高达0.25％且纯度高达98％，有利于进一步挖掘药物分子先导化合物bousigonine D更多的生物学功能，为开发临床用药小分子提供了选择模板。
Description
技术领域
本发明属于生物碱制备技术领域，具体涉及一种bousigonine D的制备方法。
背景技术
天然产物bousigonine D属于eburnane-aspidosperma型单萜吲哚生物碱二聚体，其结构中环系复杂，手性众多，利用全合成或仿生合成的方式在实验室或工厂化制备不具备现实意义，因此，bousigonine D的提取制备在植物资源替代利用和药物先导发现过程中具有广泛应用前景。
目前bousigonine D的提取制备方法为中从奶子藤中(Bousigonia mekongensis)分离，例如，现有技术(Zhi-Wei Wang,et al.Monoterpene indole alkaloids from theroots of Bousigonia mekongensis and their anti-diabetic nephropathy activity,Fitoterapia,2021,153,104964)公开了一种从奶子藤中分离bousigonine D的方法。然而，上述现有技术中bousigonine D的收率较低(仅为0.000183％)，导致其活性研究仅能停留在细胞水平。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种bousigonine D的制备方法，采用本发明提供的制备方法制备得到的bousigonine D收率高。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种bousigonine D的制备方法，包括以下步骤：
将闷奶果与醇-水混合提取后浓缩，得到醇浸取膏；所述醇-水中醇的体积分数为90～100％；
将所述醇浸取膏分散于水中，依次采用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯萃取相；
将所述乙酸乙酯萃取相进行硅胶柱色谱分离，得到组分Fr.2；所述硅胶柱色谱分离采用的洗脱剂包括二氯甲烷-甲醇；所述二氯甲烷-甲醇中二氯甲烷和甲醇的体积比为50:1～1:1；
将所述组分Fr.2进行凝胶柱色谱分离，得到生物碱组分；所述凝胶柱色谱分离采用的洗脱剂为二氯甲烷-甲醇混合物；所述二氯甲烷-甲醇混合物中二氯甲烷的体积分数为50％；
将所述生物碱组分进行反相柱色谱分离，得到bousigonine D；所述反相柱色谱分离采用的洗脱剂为甲醇-水，所述甲醇-水中甲醇的体积分数依次为20～30％、40～50％、60～70％和85～100％；
所述bousigonine D的结构如式I所示：
优选的，所述闷奶果干重与单次混合提取用醇-水的固液比为1g:4～10mL；
所述醇-水中的醇包括甲醇和/或乙醇。
优选的，所述混合提取的温度为45～50℃；所述混合提取的次数为3～4次，单次混合提取的时间为3～4h。
所述混合提取得到的提取液的质量与所述醇浸取膏的质量之比为40～80:1。
优选的，所述分散用水的质量为醇浸取膏质量的2～5％。
优选的，所述石油醚萃取的次数为3～5次，醇浸取膏的质量与单次石油醚萃取用石油醚的体积之比为1g:3～10mL。
优选的，所述乙酸乙酯萃取的次数为3～5次，醇浸取膏的质量与单次乙酸乙酯萃取用乙酸乙酯的体积之比为1g:3～10mL。
优选的，所述硅胶柱色谱分离过程中，二氯甲烷-甲醇中二氯甲烷和甲醇的体积比依次为50:1、30:1、20:1、10:1、5:1和1:1。
优选的，所述硅胶柱色谱分离采用的洗脱剂还包括石油醚-丙酮、二氯甲烷-丙酮和石油醚-乙酸乙酯中的一种或几种。
优选的，所述反相柱色谱分离后，还包括：收集甲醇体积分数为85～100％的洗脱液进行结晶，得到bousigonine D。
本发明提供了一种bousigonine D的制备方法。本发明首次从闷奶果中分离制备得到bousigonine D，通过对闷奶果进行醇-水提取及石油醚和乙酸乙酯萃取，使目标化合物bousigonine D最大程度溶出，再依次进行硅胶柱色谱分离、凝胶柱色谱分离和反相柱色谱分离，制备得到的bousigonine D的收率高达0.25％且纯度高达98％，有利于进一步挖掘药物分子先导化合物bousigonine D更多的生物学功能，为开发临床用药小分子提供了选择模板。而且，本发明提供的制备方法简单，成本低，适宜工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中bousigonine D的制备工艺流程图；
图2为实施例1制备得到的bousigonine D 1H谱图(500MHz，DMSO-d6)；
图3为实施例1制备得到的bousigonine D 13C谱图(125MHz，DMSO-d6)。
具体实施方式
本发明提供了一种bousigonine D的制备方法，包括以下步骤：
将闷奶果与醇-水混合提取后浓缩，得到醇浸取膏；所述醇-水中醇的体积分数为90～100％；
将所述醇浸取膏分散于水中，依次采用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯萃取相；
将所述乙酸乙酯萃取相进行硅胶柱色谱分离，得到组分Fr.2；所述硅胶柱色谱分离采用的洗脱剂包括二氯甲烷-甲醇；所述二氯甲烷-甲醇中二氯甲烷和甲醇的体积比为50:1～1:1；
将所述组分Fr.2进行凝胶柱色谱分离，得到生物碱组分；所述凝胶柱色谱分离采用的洗脱剂为二氯甲烷-甲醇混合物；所述二氯甲烷-甲醇混合物中二氯甲烷的体积分数为50％；
将所述生物碱组分进行反相柱色谱分离，得到bousigonine D；所述反相柱色谱分离采用的洗脱剂为甲醇-水，所述甲醇-水中甲醇的体积分数依次为20～30％、40～50％、60～70％和85～100％；
所述bousigonine D的结构如式I所示：
在本发明中，如无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。
本发明将闷奶果与醇-水混合提取后浓缩，得到醇浸取膏；所述醇-水中醇的体积分数为90～100％。
在本发明中，所述闷奶果优选为干燥的闷奶果枝叶和/或果实；所述闷奶果优选来源于云南省。在本发明中，所述闷奶果在使用前优选先粉碎至粒径为1～10mm，更优选为3～7mm，最优选为4～6mm。
在本发明中，所述醇-水中的醇优选包括甲醇和/或乙醇，更优选为甲醇。在本发明中，所述醇-水中醇的体积分数为90～100％，优选为91～98％，更优选为92～96％，最优选为93～95％。
在本发明中，所述混合提取的温度优选为45～50℃，更优选为46～49℃，最优选为47～48℃；所述混合提取的次数优选为3～4次；单次混合提取的时间优选为3～4h，更优选为3.2～3.8h，最优选为3.4～3.6h。
在本发明中，所述闷奶果干重与单次混合提取用醇-水的固液比优选为1g:4～10mL，更优选为1g:5～8mL，最优选为1g:6～7mL。
在本发明中，所述混合提取得到的提取液的质量与所述醇浸取膏的质量之比优选为40～80:1，更优选为50～70:1，最优选为55～65:1。在本发明中，所述浓缩的温度优选为35～45℃，更优选为38～42℃，最优选为39～40℃；所述浓缩优选为减压浓缩；所述减压浓缩的压力优选为0.03～0.06MPa，更优选为0.04～0.05MPa。本发明对所述浓缩的时间没有特殊限定，能够使所述醇浸取膏和提取液的质量之比在上述范围内即可。
得到醇浸取膏后，本发明将所述醇浸取膏分散于水中，依次采用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯萃取相。
在本发明中，所述分散用水优选为蒸馏水；所述分散用水的质量优选为醇浸取膏质量的2～5％，更优选为3～4％。
在本发明中，所述石油醚萃取的次数优选为3～5次，更优选为3～4次，最优选为3次；所述醇浸取膏的质量与单次石油醚萃取用石油醚的体积之比优选为1g:3～10mL，更优选为1g:4～8mL，最优选为1g:5～6mL。
在本发明中，所述乙酸乙酯萃取的次数优选为3次，更优选为3～4次，最优选为3次；所述醇浸取膏的质量与单次乙酸乙酯萃取用乙酸乙酯的体积之比优选为1g:3～10mL，更优选为1g:4～8mL，最优选为1g:5～6mL。
得到乙酸乙酯萃取相后，本发明将所述乙酸乙酯萃取相进行硅胶柱色谱分离，得到组分Fr.2；所述硅胶柱色谱分离采用的洗脱剂包括二氯甲烷-甲醇；所述二氯甲烷-甲醇中二氯甲烷和甲醇的体积比为50:1～1:1。
在本发明中，所述硅胶柱色谱分离过程中，二氯甲烷-甲醇中二氯甲烷和甲醇的体积比优选依次为50:1、30:1、20:1、10:1、5:1和1:1。
在本发明中，所述硅胶柱色谱分离采用的洗脱剂优选还包括石油醚-丙酮、二氯甲烷-丙酮和石油醚-乙酸乙酯中的一种或几种。在本发明中，当所述硅胶柱色谱分离采用的洗脱剂还包括石油醚-丙酮时，所述硅胶柱色谱分离优选依次采用石油醚-丙酮和二氯甲烷-甲醇进行洗脱。在本发明中，所述硅胶柱色谱分离过程中，二氯甲烷-甲醇中二氯甲烷和甲醇的体积比优选与前述相同，在此不再赘述。在本发明中，所述硅胶柱色谱分离过程中，石油醚-丙酮中石油醚和丙酮的体积比优选1:0～0:1，更优选依次为1:0、20:1、10:1和5:1。
在本发明中，所述硅胶柱色谱分离采用的硅胶粒径优选为100～300目，更优选为100～200目，最优选为200目。在本发明中，当所述硅胶柱色谱分离依次采用石油醚-丙酮和二氯甲烷-甲醇进行洗脱时，所述硅胶柱色谱分离采用的硅胶粒径优选依次为100～200目和200～300目。在本发明中，所述硅胶柱色谱分离过程中优选还包括薄层色谱检测，合并显色相似的洗脱部位，得到5个组分，依次记为组分Fr.1、组分Fr.2、组分Fr.3、组分Fr.4和组分Fr.5，将所述组分Fr.2进行进一步分离。
得到组分Fr.2后，本发明将所述组分Fr.2进行凝胶柱色谱分离，得到生物碱组分；所述凝胶柱色谱分离采用的洗脱剂为二氯甲烷-甲醇混合物；所述二氯甲烷-甲醇混合物中二氯甲烷的体积分数为50％。
在本发明中，所述凝胶柱色谱分离采用的色谱柱优选为Sephadex LH-20凝胶色谱柱。在发明中，所述组分Fr.2在进行凝胶柱色谱分离前，优选采用二氯甲烷-甲醇混合溶液对所述组分Fr.2进行溶解。在本发明中，所述二氯甲烷-甲醇混合溶液中二氯甲烷和甲醇的体积比优选为1：1～3，更优选为1：2。在本发明中，所述凝胶柱色谱分离过程中优选还包括薄层色谱检测。
得到生物碱组分后，本发明将所述生物碱组分进行反相柱色谱分离，得到bousigonine D；所述反相柱色谱分离采用的洗脱剂为甲醇-水，所述甲醇-水中甲醇的体积分数依次为20～30％、40～50％、60～70％和85～100％。
在本发明中，所述反相柱色谱分离采用的色谱柱优选为反相-C18色谱柱。所述反相柱色谱分离后，本发明优选还包括收集甲醇体积分数为85～100％的洗脱液进行结晶，得到bousigonine D。在本发明中，所述收集的洗脱液优选为甲醇体积分数90％的洗脱液。在本发明中，所述结晶优选为在室温下静置结晶；所述结晶的时间优选为24～48h，更优选为30～45h，最优选为35～40h。本发明通过对洗脱液进行静置结晶，甲醇水溶液在静置状态下挥发，得到结晶的bousigonine D。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的bousigonine D的制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
图1为本实施例中bousigonine D的制备工艺流程图，具体步骤如下：
将8.0kg干燥的闷奶果枝叶粉碎至粒径为1～10mm范围内，用95％甲醇-水(v/v)热提3次，每次4h，经减压浓缩后回收甲醇-水，得到甲醇浸取膏。其中，热提的温度为45℃；闷奶果枝叶的干重与单次热提用甲醇-水的固液比为1g：6mL；减压浓缩的温度为40℃，压力为0.05MPa。
将甲醇浸取膏加水分散，依次用石油醚，乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯萃取相。其中，水的质量为甲醇浸取膏质量的3％；甲醇浸取膏的质量与单次萃取用石油醚的体积之比为1g：5mL；甲醇浸取膏的质量与单次萃取用乙酸乙酯的体积之比为1g：5mL。
将乙酸乙酯萃取相用硅胶拌样后装柱，依次采用两相体系石油醚-丙酮和二氯甲烷-甲醇进行洗脱，洗脱流份经TLC检测，合并相同流份，依次记为组分Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4和Fr.5。其中，乙酸乙酯萃取相和硅胶的质量比为1:1.5；采用石油醚-丙酮进行洗脱时，石油醚和丙酮的体积比依次为1:0、20:1、10:1和5:1；采用二氯甲烷-甲醇进行洗脱时，二氯甲烷和甲醇的体积比依次为50:1、30:1、20:1、10:1、5:1和1:1。
将所得的组分Fr.2用二氯甲烷-甲醇溶解，Sephadex LH-20凝胶上样，二氯甲烷-甲醇洗脱，经薄层色谱(TLC)检测，除去非碱，得到生物碱组分。其中，二氯甲烷-甲醇中二氯甲烷和甲醇的体积比为1:1。
将生物碱组分进行反相-C18色谱柱(RP-C18)分离，经上柱处理后，采用甲醇-水进行洗脱，甲醇-水中甲醇的体积分数依次为30％、50％、70％、90％、100％。收集甲醇的体积分数为90％的洗脱液，在室温下缓慢挥发，结晶36h，得到bousigonine D纯品2.0g，呈无色透明针晶，收率为0.25％，纯度为98％。
对上述制备所得的纯品bousigonine D进行结构鉴定，具体如下：
采用Shimazu UV2401PC紫外可见光分光光度计进行紫外测定，利用TLC，产物在254nm处显示强荧光；碘化铋钾显色剂显色呈橘黄色，证明提取物为生物碱。
采用BrukerAvance-600 MHz核磁共振仪进行核磁测定(内标为TMS)。图2为bousigonine D 1H谱图(500MHz，DMSO-d6)；图3为实施例1制备得到的bousigonine D 13C谱图(125MHz，DMSO-d6)。具体的核磁结果如下：
1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：5.62(1H,br s,1-NH)，3.35(1H,br s,H-2)，2.17(1H,m,H-3a)，3.01(1H,m,H-3b)，1.98(1H,m,H-5a)，2.93(1H,m,5b)，1.00(1H,m,H-6a)，1.89(1H,m,H-6b)，6.53(1H,d,J＝10.0Hz,H-9)，6.48(1H,br s,H-10)，8.91(1H,br s,12-OH)，1.41(1H,m,H-14a)，1.91(1H,m,H-14b)，1.56(1H,m,H-15a)，2.04(1H,m,H-15b)，1.41(1H,m,H-16a)，1.75(1H,m,H-16b)，1.01(1H,m,H-17a)，1.89(1H,m,H-17b)，0.74(3H,t,like,H-18)，1.08(1H,m,H-19a)，1.87(1H,m,H-19b)，2.88(1H,s,H-21)，2.28(1H,t,J＝11.5Hz,H-3'a)；2.48(1H,m,H-3'b)，3.16(2H,m,H-5')，2.44(1H,m,H-6'a)，2.88(1H,m,H-6'b)，7.31(1H,d,J＝10.0Hz,H-9')，6.86(1H,t,J＝5.0Hz,H-10')，6.64(1H,t,J＝5.0Hz,H-11')，6.02(1H,br s,H-12')，1.32(1H,m,H-14'a)，1.61(1H,m,H-14'b)，1.17(1H,m,H-15'a)，1.32(1H,m,H-15'b)，5.22(1H,dd,J＝5.0,10.0Hz,H-16)，1.70(1H,m,H-17'a)，1.95(1H,m,H-17'b)，0.82(3H,t,J＝5.0Hz,H-18')，1.40(1H,m,H-19'a)，2.07(1H,m,H-19'b)，3.91(1H,s,H-21')；
13C-NMR(DMSO-d6，125MHz)δ：64.4(C-2)，52.4(C-3)，53.6(C-5)，34.4(C-6)，53.1(C-7)，118.6(C-8)，111.9(C-9)，125.8(C-10)，114.4(C-11)，149.7(C-12)，153.1(C-13)，21.4(C-14)，35.9(C-15)，28.6(C-16)，22.2(C-17)，6.7(C-18)，27.7(C-19)，35.2(C-20)，68.3(C-21)，134.1(C-2')，44.2(C-3')，50.4(C-5')，16.7(C-6')，103.5(C-7')，128.2(C-8')，117.3(C-9')，118.5(C-10')，119.2(C-11')，107.2(C-12')，136.1(C-13')，20.4(C-14')，24.2(C-15')，49.0(C-16')，42.5(C-17')，7.5(C-18')，28.3(C-19')，34.6(C-20')，58.8(C-21')。
由图2、图3的核磁结果可知，本发明制备得到的产物为bousigonine D纯品。
实施例2
将8.0kg干燥的闷奶果枝叶粉碎至粒径为4～6mm后，用无水甲醇热提3次，每次3h，经减压浓缩后回收甲醇-水，得到甲醇浸取膏。其中，热提的温度为45℃；闷奶果枝叶的干重与单次热提用无水甲醇的固液比为1g：6mL；减压浓缩的温度为40℃，压力为0.05MPa。
将甲醇浸取膏加水分散，依次用石油醚，乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯萃取相。其中，水的质量为甲醇浸取膏质量的4％；甲醇浸取膏的质量与单次萃取用石油醚的体积之比为1g：5mL；甲醇浸取膏的质量与单次萃取用乙酸乙酯的体积之比为1g：5mL。
将乙酸乙酯萃取相用硅胶拌样后装柱，采用两相体系二氯甲烷-甲醇进行洗脱，洗脱流份经TLC检测，合并相同流份，依次记为组分Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4和Fr.5。其中，乙酸乙酯萃取相和硅胶的质量比为1:1.5；洗脱过程中二氯甲烷和甲醇的体积比依次为50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、1:1。
将所得的组分Fr.2用二氯甲烷-甲醇溶解，Sephadex LH-20凝胶上样，二氯甲烷-甲醇洗脱，经薄层色谱(TLC)检测，除去非碱，得到生物碱组分。其中，二氯甲烷-甲醇中二氯甲烷和甲醇的体积比为1:1。
将生物碱组分进行反相-C18色谱柱(RP-C18)分离，采用甲醇-水进行洗脱，甲醇-水中甲醇的体积分数依次为30％、50％、70％、90％、100％。收集甲醇的体积分数为90％的洗脱液，在室温下缓慢挥发，结晶36h，得到bousigonine D纯品2.0g，收率为0.25％，纯度为98％。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种bousigonine D的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将闷奶果与醇-水混合提取后浓缩，得到醇浸取膏；所述醇-水中醇的体积分数为90～100％；
将所述醇浸取膏分散于水中，依次采用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯萃取相；
将所述乙酸乙酯萃取相进行硅胶柱色谱分离，得到组分Fr.2；所述硅胶柱色谱分离采用的洗脱剂包括二氯甲烷-甲醇；所述二氯甲烷-甲醇中二氯甲烷和甲醇的体积比为50:1～1:1；
将所述组分Fr.2进行凝胶柱色谱分离，得到生物碱组分；所述凝胶柱色谱分离采用的洗脱剂为二氯甲烷-甲醇混合物；所述二氯甲烷-甲醇混合物中二氯甲烷的体积分数为50％；
将所述生物碱组分进行反相柱色谱分离，得到bousigonine D；所述反相柱色谱分离采用的洗脱剂为甲醇-水，所述甲醇-水中甲醇的体积分数依次为20～30％、40～50％、60～70％和85～100％；
所述bousigonine D的结构如式I所示：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述闷奶果干重与单次混合提取用醇-水的固液比为1g:4～10mL；
所述醇-水中的醇包括甲醇和/或乙醇。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述混合提取的温度为45～50℃；所述混合提取的次数为3～4次，单次混合提取的时间为3～4h。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述混合提取得到的提取液的质量与所述醇浸取膏的质量之比为40～80:1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分散用水的质量为醇浸取膏质量的2～5％。
6.根据权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，所述石油醚萃取的次数为3～5次，醇浸取膏的质量与单次石油醚萃取用石油醚的体积之比为1g:3～10mL。
7.根据权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，所述乙酸乙酯萃取的次数为3～5次，醇浸取膏的质量与单次乙酸乙酯萃取用乙酸乙酯的体积之比为1g:3～10mL。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硅胶柱色谱分离过程中，二氯甲烷-甲醇中二氯甲烷和甲醇的体积比依次为50:1、30:1、20:1、10:1、5:1和1:1。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硅胶柱色谱分离采用的洗脱剂还包括石油醚-丙酮、二氯甲烷-丙酮和石油醚-乙酸乙酯中的一种或几种。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反相柱色谱分离后，还包括：收集甲醇体积分数为85～100％的洗脱液进行结晶，得到bousigonine D。
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