CN111704640B

CN111704640B - 采用高速逆流色谱制备钩藤中喜果苷的方法

Info

Publication number: CN111704640B
Application number: CN202010629920.5A
Authority: CN
Inventors: 蒋海强; 陈振山; 田振华; 王小明; 李运伦
Original assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shandong Gujin Traditional Chinese Medicine Technology Co ltd
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2040-07-03
Also published as: CN111704640A

Abstract

本发明属于化学医药领域，其公开了一种采用高速逆流色谱制备钩藤中喜果苷的方法，其步骤如下：(1)取钩藤，提取得粗提物；(2)将粗提物经萃取得乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取物过硅胶柱，梯度洗脱，回收洗脱液，干燥，得粗品；将粗品通过高速逆流色谱，一次制备得到式1化合物。本发明的方法可以规模化、高效、快速提纯得到喜果苷。并且制备过程中的流动相和固定相可以反复利用，节约了制备成本。

Description

采用高速逆流色谱制备钩藤中喜果苷的方法

技术领域

本发明属于化学医药领域，具体涉及工业化快速制备中药钩藤中得单体化合物喜果苷的方法。

背景技术

钩藤(Uncariarhynchophylla)，又被称为双钩藤，倒挂刺，鹰爪凤等，为茜草科钩藤属常绿藤本植物。钩藤又分为大叶钩藤(Uncariamacrophylla Wall)，.毛钩藤(UncariahirsutaHavil.)，华钩藤(Uncariasinensis(Oliv.)Havil)或无柄果钩藤(UncariasessilifructusRoxb.)。钩藤的适宜生长环境为温暖湿润、疏松肥沃的土壤，在广东、贵州、广西、福建、江西等均有种植。钩藤的药用部位通常为其带钩的枝条，其味甘苦、微寒，归心包经，具有清热透邪的作用。目前已报道的从钩藤中分离出的化学成分有100多种，包括生物碱类、黄酮类、三萜类和苷类等，其中以生物碱的含量尤为丰富，如钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱等。钩藤的药理作用，如消炎、止痛、降压、抗癌、抗癫痫等，与其化学成分密切相关。

中药成分快速分离纯化技术对于理解中药复杂的物质基础、控制重要质量和发现潜在的活性物质具有重要意义。HSCCC在保证无样品损失、溶剂体系可循环利用、载样量大的前提下，可以快速实现中药化学成分的分离。而且由于其被分离物质与液相固定相之间能够充分接触，使得样品的分离制备量大大提高。是一种理想的工业化制备中药单体物质的手段。该特点使得高速逆流色谱在中药、生物药、生物制品、食品等样品的分离研究中得到广泛应用。

发明内容

基于上述现有技术，本发明提供了一种采用高速逆流色谱制备钩藤中喜果苷的方法，其可以适用于快速工业化制备中药钩藤中喜果苷化合物。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种采用高速逆流色谱制备钩藤中喜果苷的方法，其结构式为：

包括以下步骤：

(1)取钩藤，提取得粗提物；

(2)将粗提物经萃取得乙酸乙酯萃取物；

(4)将乙酸乙酯萃取物过硅胶柱，梯度洗脱，回收洗脱液，干燥，得粗品；

(4)将粗品通过高速逆流色谱，一次制备得到式1化合物。

优选的，所述步骤(1)中提取为乙醇冷浸提取。

优选的，所述钩藤与乙醇的质量体积比为：1:10，质量体积比的单位为kg/L。

优选的，所述步骤(2)具体是：将粗提物溶于蒸馏水得混悬液，依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，保留乙酸乙酯萃取相，得乙酸乙酯萃取液，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物。

优选的，所述钩藤与蒸馏水的质量体积比为1:10，质量体积比的单位为kg/L。

优选的，所述步骤(3)中梯度洗脱共分为10个组分，分别命名为Fr.1-Fr.10；取Fr.5回收洗脱液。

优选的，所述乙酸乙酯萃取物过硅胶柱时采用乙酸乙酯与二氯甲烷的混合洗脱体系，乙酸乙酯与二氯甲烷的体积比依次为100:1，99:1，98:2，97:3，95:5，9:1，4:1，7:3，3:2，1:1；每五个柱体积更换一次洗脱体系。

优选的，所述步骤(4)中，所述高速逆流色谱采用得溶剂体系为正丁醇：乙酸乙酯：甲醇：水(4:0.5:1:5，v/v/v/v)。

优选的，所述高速逆流色谱上相为固定相，下相为流动相，转速为800r/min，流速采用10ml/min，温度为30℃，检测波长为254nm。

本发明的有益效果是：

本发明取茜草科科植物钩藤的干燥带钩茎枝钩藤为原料，经过简单的硅胶柱色谱分离得到粗品后，利用高速逆流色谱工业化制备得到高纯度的喜果苷。该方法可以规模化、高效、快速提纯得到喜果苷；并且制备过程中的流动相和固定相可以反复利用，节约了制备成本。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1喜果苷的HSCCC色谱图；

图2喜果苷的HSCCC色谱图(溶剂体系为正丁醇：乙酸乙酯：甲醇：水(4:0.3:1:5，v/v/v/v))；

图3喜果苷的HSCCC色谱图(溶剂体系为正丁醇：乙酸乙酯：甲醇：水(4:0.7:1:5，v/v/v/v))；

图4化合物1核磁共振¹H谱图；

图5化合物1核磁共振¹³C谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

同田TBE-300C高速逆流色谱仪(上海同田公司)；普析TU-1950紫外分光光度计(北京普析公司)；METTLER AE240型电子天平(梅特勒--托利多(上海)有限公司)，KQ-250B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。其他试剂为分析纯，水为蒸馏水。

实施例1

一种采用高速逆流色谱制备钩藤中喜果苷的方法，包括以下步骤：

(1)称取钩藤10kg，加入100L乙醇，冷浸15天，重复3次，合并提取液，减压浓缩，干燥得粗提物1.17kg。

(2)将粗提物溶于蒸馏水1L，置于3L分液漏斗中，加入正己烷1L萃取，共3次，合并萃取液，减压浓缩，干燥得正己烷萃取物70.6g。采用相同方法，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到乙酸乙酯萃取物19.4g和正丁醇萃取物247.5g，水层为540g。

(3)将乙酸乙酯萃取物过硅胶柱(乙酸乙酯：二氯甲烷100:1，99:1，98:2，97:3，95:5，9:1，4:1，7:3，3:2，1:1)每五个柱体积更换一次洗脱体系，梯度洗脱，共分为10个组分，分别命名为Fr.1-Fr.10。取Fr.5过HSCCC，溶剂体系为正丁醇：乙酸乙酯：甲醇：水(4：0.5：1：5，v/v/v/v)，上相为固定相，下相为流动相，转速为800r/min，流速采用10ml/min，温度为30℃，检测波长为254nm。得式1化合物，即为喜果苷，纯度为98.5％。图1为本实施例喜果苷的HSCCC色谱图。

对比例

其它条件不变，将步骤(3)溶剂体系分别替换为正丁醇：乙酸乙酯：甲醇：水(4:0.3:1:5，v/v/v/v)和(4:0.7:1:5，v/v/v/v)。得到化合物喜果苷的HSCCC色谱图如图2、3所示。

实施例2

对实施例1得到的化合物进行结构鉴定

淡黄色针晶(甲醇)，碘化铋钾试剂反应呈阳性，提示该化合物为生物碱。UVλ_max在225nm和272nm处有最大吸收，显示吲哚母环的特征吸收。

核磁共振¹H谱图和核磁共振¹³C谱图如图4、5所示。

氢谱：¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:10.96(1H,s,N-H),4.91(1H,m,H-3),5.00(1H,dd,J＝5.4,12.6Hz,H-5a),2.89(1H,dd,J＝5.4,12.6Hz,H-5b),3.00(1H,m,H-6a),2.61(1H,m,H-6b),7.43(1H,d,J＝8.4Hz,H-9),6.97(1H,td,J＝1.2,8.4Hz,H-10),7.07(1H,td,J＝1.2,8.4Hz,H-11),7.33(1H,d,J＝8.4Hz,H-12),2.51(1H,m,H-14a),1.30(1H,dd,J＝11.4,13.2Hz,H-14b),2.73(1H,m,H-15),7.32(1H,s,H-17),5.34(1H,dd,J＝2.4,17.2Hz,H-18a),5.17(1H,dd,J＝2.4,11.4Hz,H-18b),5.48(1H,dt,J＝11.2,17.4Hz,H-19),2.68(1H,m,H-20),5.41(1H,d,J＝2.4Hz,H-21),4.52(1H,d,J＝7.8Hz,H-1′),3.04(1H,m,H-2′),3.18(1H,m,H-3′),3.12(1H,m,H-4′),3.21(1H,m,H-5′),3.67(1H,m,H-6′a),3.44(1H,m,H-6′b)；

碳谱：¹³C-NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ:136.2(C-2),52.4(C-3),42.4(C-5),20.6(C-6),108.5(C-7),126.2(C-8),117.9(C-9),118.5(C-10),121.2(C-11),111.1(C-12),136.2(C-13),31.0(C-14),25.8(C-15),107.2(C-16),146.5(C-17),119.9(C-18),133.9(C-19),42.4(C-20),94.9(C-21),162.5(C-22),97.9(C-1′),73.2(C-2′),77.2(C-3′),69.9(C-4′),76.5(C-5′),61.1(C-6′).

¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)中10.96(1H,s,N-H)表明该化合物为生物碱类化合物，印证了碘化铋钾显色结果。两个亚甲基相互耦合5.00(1H,dd,J＝5.4,12.6Hz,H-5a),2.89(1H,dd,J＝5.4,12.6Hz,H-5b),3.00(1H,m,H-6a),2.61(1H,m,H-6b)表明5，6位没有取代。7.43(1H,d,J＝8.4Hz,H-9),6.97(1H,td,J＝1.2,8.4Hz,H-10),7.07(1H,td,J＝1.2,8.4Hz,H-11),7.33(1H,d,J＝8.4Hz,H-12)表明吲哚母环未存在取代基。一个亚甲基信号5.34(1H,dd,J＝2.4,17.2Hz,H-18a),5.17(1H,dd,J＝2.4,11.4Hz,H-18b)表明该位置存在双键。7.32(1H,s,H-17)表明该位置周围不存在邻位氢。¹³C-NMR(151MHz,DMSO-d₆)中162.5(C-22)说明存在一个羰基，97.9(C-1′),73.2(C-2′),77.2(C-3′),69.9(C-4′),76.5(C-5′),61.1(C-6′)表明存在一个糖分子，且连接位置在21位。通过以上分析确定该化合物为喜果苷。

其结构式为：

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种采用高速逆流色谱制备钩藤中喜果苷的方法，其结构式为：

其特征在于，包括以下步骤：

(1)取钩藤，提取得粗提物；

(2)将粗提物经萃取得乙酸乙酯萃取物；

(3)将乙酸乙酯萃取物过硅胶柱，梯度洗脱，回收洗脱液，干燥，得粗品；

(4)将粗品通过高速逆流色谱，一次制备得到式1化合物；

所述步骤(4)中，所述高速逆流色谱采用得溶剂体系为正丁醇：乙酸乙酯：甲醇：水(4:0.5:1:5，v/v/v/v)。

2.根据权利要求1所述的采用高速逆流色谱制备钩藤中喜果苷的方法，其特征在于，所述步骤(1)中提取为乙醇冷浸提取。

3.根据权利要求2所述的采用高速逆流色谱制备钩藤中喜果苷的方法，其特征在于，所述钩藤与乙醇的质量体积比为：1:10，质量体积比的单位为kg/L。

4.根据权利要求1所述的采用高速逆流色谱制备钩藤中喜果苷的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体是：将粗提物溶于蒸馏水得混悬液，依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，保留乙酸乙酯萃取相，得乙酸乙酯萃取液，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物。

5.根据权利要求4所述的采用高速逆流色谱制备钩藤中喜果苷的方法，其特征在于，所述钩藤与蒸馏水的质量体积比为：1:10，质量体积比的单位为kg/L。

6.根据权利要求1所述的采用高速逆流色谱制备钩藤中喜果苷的方法，其特征在于，所述步骤(3)中梯度洗脱共分为10个组分，分别命名为Fr.1-Fr.10；取Fr.5回收洗脱液。

7.根据权利要求6所述的采用高速逆流色谱制备钩藤中喜果苷的方法，其特征在于，所述乙酸乙酯萃取物过硅胶柱时采用乙酸乙酯与二氯甲烷的混合洗脱体系，乙酸乙酯与二氯甲烷的体积比依次为100:1，99:1，98:2，97:3，95:5，9:1，4:1，7:3，3:2，1:1；每五个柱体积更换一次洗脱体系。

8.根据权利要求1所述的采用高速逆流色谱制备钩藤中喜果苷的方法，其特征在于，所述高速逆流色谱上相为固定相，下相为流动相，转速为800r/min，流速采用10ml/min，温度为30℃，检测波长为254nm。