JP2011511277A

JP2011511277A - エポチロンの分離及び精製方法

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Publication number: JP2011511277A
Application number: JP2010544556A
Authority: JP
Inventors: 王継棟; 張輝; 王海彬; 応▲リン▼萍; 王勝; 管旭芳; 白▲ファ▼
Original assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2008-02-01
Filing date: 2008-02-01
Publication date: 2011-04-07
Anticipated expiration: 2028-02-01
Also published as: US8906947B2; WO2009100571A1; JP5180321B2; CN101918400B; EP2241566A4; US20100311796A1; EP2241566B1; CN101918400A; EP2241566A1

Abstract

本発明は、エポチロンの分離及び精製方法を開示するものであり、特には順相シリカゲルクロマトグラフィーを用いてエポチロンＢ及びＡの分離及び精製を行う方法を開示するものである。当該方法は、エポチロンＢ及びＡを含むサンプルをＣ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物に溶解した後、または上記サンプルをシリカゲルに混合した後、上記サンプルを導入する工程と、順相シリカゲルカラムの用離液によってシリカゲルカラムを勾配溶離する工程と、最終的に生成物を得る工程とを含む。

Description

発明の詳細な説明

〔発明の分野〕
本発明はエポチロンの分離及び精製方法に関する。具体的には、本発明はエポチロンＢ及びＡの分離及び精製方法に関する。

〔発明の背景〕
エポチロンは微小管を安定化する新しい細胞毒性活性成分として、粘液細菌から生産された新規の天然細胞毒性成分である（Gerth, K. et. al., J. Antibiot. 49: 560-563 (1966)参照）。エポチロンは、人間の様々な固形癌に対して顕著な抗腫瘍作用を有するパクリタキセルと生物学的に類似している。すなわち、エポチロンは微小管を極めて安定的な状態にして有糸分裂を阻害する結果、パクリタキセルと同様の方法で癌細胞の分裂を抑制する。

エポチロンはパクリタキセルから作られる薬剤よりも、原材料、合成方法、親水性、抗腫瘍作用、及び抗腫瘍スペクトル等の点において優れている。さらに、エポチロン、望ましくはエポチロンＡ、最も望ましくは、エポチロンＢは、現在の治療法よりも、特には腫瘍の薬剤耐性を引き起こすパクリタキセルを用いた治療法よりも、様々な利点を有する。したがって、エポチロンは新規な抗癌剤として大きな市場潜在力を有しており、パクリタキセルに替わる将来的な候補として見なされている。エポチロンＢ及びＡの構造を以下に示す。

１９９５年にエポチロンの抗腫瘍作用が発見されてから、エポチロンは、化学、生物、医学、及び薬学等を含む多くの分野において広く深く研究されており、一定の結果が得られている。

研究の進歩と共に、高純度のエポチロンの必要性が高まってきている。よって、エポチロンの分離及び精製方法は解決されるべき緊急の課題である。エポチロン、特にはエポシロンＢ及びＡの分離及び精製のためのプロセスに関して、中国及び海外において多くの研究が行われている。例えば、中国特許No.ZL01820141.5 はエポチロンの分離及び精製方法を開示しており、これにはエポチロン、特にはエポチロンＡ及び／またはエポチロンＢを樹脂から脱離させる方法が開示されている。中国特許No.ZL02110067.5 は粘液細菌の発酵培養液からエポチロンを分離及び精製する方法に関連するものであり、これには、粘液細菌の発酵培養液からエポチロンを分離して得るために、混合樹脂による吸着、固液段階抽出、分子ふるいクロマトグラフィー、結晶化、及びＨＰＬＣ等を含む技術的方法を利用することが開示されている。中国特許No.ZL99803121.6 には、エポチロンＢ及びＡを精製するために利用する方法としてＲＰ−ＨＰＬＣが開示されている。一方、特許No.CN03822662.6 では、エポチロンＢ及びＡを分離するためにＨＰＬＣが利用されている。

現在の技術では、エポチロンを分離及び精製するために分取クロマトグラフィーカラムを主に用いている。分取クロマトグラフィーカラムは高価な装置を必要としないが、大量のメタノールまたはアセトニトリルを消費し、一度に得られる生産量は限られた量のみである。

〔発明の概要〕
エポチロンＢ及びエポチロンＡの分離及び精製の従来技術に存在する欠点に対して、本発明の目的は、順相シリカゲルクロマトグラフィーを用いることによってエポチロンＢ及びエポチロンＡの分離及び精製のための新規方法を提供することにある。

本発明に係る方法は、
エポチロンＢ及びＡを含むサンプルをＣ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物に溶解して混合物を作り、当該混合物をシリカゲルと混合する、または混合しない工程と、
上記混合物をシリカゲルカラムに導入する工程と、
順相シリカゲルカラム溶離液を用いて上記シリカゲルカラムを勾配溶離する工程と、
画分を採取する工程と、
生成物を得る工程とを含む。

好ましくは、本発明に係る方法は、エポチロンＢ及びエポチロンＡを分離及び精製するために順相シリカゲルクロマトグラフィーを用いる方法であって、当該方法はさらに、
エポチロンＢ及びＡを含むサンプルをＣ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物に溶解して混合物を作り、当該混合物を第１順相シリカゲルカラムのシリカゲルと混合する、または混合しない工程と、
上記混合物を上記第１順相シリカゲルカラムに導入する工程と、
順相シリカゲルカラム溶離液を用いて当該シリカゲルカラムを勾配溶離する工程と、
エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分を採取する工程と、
エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分を混合する工程と、
上記混合画分を濃縮した後に結晶化を行うことによってエポチロンＢ及びＡを含む粗結晶を得る工程と、
エポチロンＢ及びＡを含む上記粗結晶をＣ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物に溶解して第２混合物を作った後、当該第２混合物を第２順相シリカゲルカラムのシリカゲルと混合する、または混合しない工程と、
上記第２混合物を第２順相シリカゲルカラムに導入する工程と、
順相シリカゲルカラム溶離液を用いて上記シリカゲルカラムを勾配溶離する工程と、
エポチロンＢを含む画分及びエポチロンＡを含む画分をそれぞれ採取する工程とを含む。

エポチロンＢを結晶化した後、ｔ−ブタノールに溶解して凍結乾燥することによって、高純度の非晶質粉末が得られる。また、エポチロンＡをｔ−ブタノールに溶解して凍結乾燥することによって、高純度の非晶質粉末が得られる。

本発明に係る方法において、エポチロンＢ及びＡを分離するために順相シリカゲルクロマトグラフィーを用いる際、上記第１及び第２順相シリカゲルカラムには一般的に普及しているものを利用することができる。本発明において、上記第１及び第２順相シリカゲルカラムに用いられるシリカゲルは、同じものであってもよいし、異なるものであってもよいが、両方のカラムに同じシリカゲルを用いることが好ましい。

本発明に係る方法において、エポチロンＢ及びＡを分離するために順相シリカゲルクロマトグラフィーを用いる際、第１順相シリカゲルカラム内に用いられるシリカゲルの量は、上記シリカゲル：上記サンプルの質量比が５〜１０：１になることが好ましい。また、第２順相シリカゲルカラム内に用いられるシリカゲルの量は、上記シリカゲル：上記結晶サンプルの質量比が５０〜２００：１になる。

エポチロンＢ及びエポチロンＡのより良い産物を得るためには、上記順相シリカゲルカラムを、使用前に、Ｃ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物の溶媒によって平衡化することが好ましい。Ｃ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物は、ジクロロメタン、トリクロロメタン、及びブロモエタンのうちの１つ以上であることが好ましく、ジクロロメタン、トリクロロメタン、またはこれらの組み合わせであることがより好ましい。

本発明における上記順相シリカゲルカラムの勾配溶離液は、Ｃ_１−Ｃ_７炭化水素、Ｃ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物、Ｃ_１−Ｃ_７ケトン、Ｃ_１−Ｃ_７エステル、またはそれらの任意の組み合わせであってもよく、
Ｃ_１−Ｃ_７炭化水素は、石油エーテル、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、及びｎ−ヘプタンから選択された１つ以上であってもよく、より好ましくは石油エーテルであり、
Ｃ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物は、ジクロロメタン、トリクロロメタン、及びブロモエタンから選択される１つ以上であってもよく、より好ましくはジクロロメタンであり、
Ｃ_１−Ｃ_７ケトンは、アセトン、ブタノン、及びこれらの組み合わせから選択されてもよく、より好ましくはアセトンであり、
Ｃ_１−Ｃ_７エステルは、酢酸エチル、酢酸イソブチル、及びこれらの組み合わせから選択されてもよく、より好ましくは酢酸エチルである。

本発明における上記順相シリカゲルカラムの勾配溶離液は、石油エーテル、酢酸エチル、アセトン、トリクロロメタン、及びジクロロメタンから選択される１つ、または２つ以上の組み合わせであることがより好ましい。

好ましくは、上記第１順相シリカゲルカラムの上記溶離液は、アセトンと石油エーテルとの組み合わせ、または酢酸エチルと石油エーテルとの組み合わせである。アセトンと石油エーテルとの組み合わせにおいて、アセトン：石油エーテルの容積比は１：３〜９であることが好ましく、酢酸エチルと石油エーテルとの組み合わせにおいて、酢酸エチル：石油エーテルの容積比は１：１〜９であることが好ましい。

好ましくは、上記第２順相シリカゲルカラムの上記溶離液は、アセトンと石油エーテルとの組み合わせ、または、ジクロロメタンまたはトリクロロメタンのいずれか一方と石油エーテルとアセトンとの組み合わせである。アセトンと石油エーテルとの組み合わせにおいて、アセトン：石油エーテルの容積比は１：３〜９である。また、ジクロロメタンまたはトリクロロメタンのいずれか一方と石油エーテルとアセトンとの組み合わせにおいて、アセトン：石油エーテルの容積比は１：３〜９であり、ジクロロメタンまたはトリクロロメタンの容積は、総容積の５％〜５０％である。

順相シリカゲルクロマトグラフィーによってエポチロンＢ及びエポチロンＡを分離及び精製するために、エポチロンＢ及びＡの結晶化は任意の従来技術によって行われてもよい。より良く行うためには、結晶化のための溶媒として、ｎ−ヘプタン、酢酸エチル、またはそれらの組み合わせを用いることが好ましい。結晶化のための溶媒は、容積比が１：１のｎ−ヘプタンと酢酸エチルとの組み合わせであることがより好ましい。結晶化は、エポチロンＢ及びＡを含む上記粗生成物、またはエポチロンＢを含む上記粗生成物を、適当量の酢酸エチルに溶解し、そこにｎ−ヘプタンを加え、得られた溶液を室温に静置した後、４℃まで冷却して結晶を得ることによって行われることが好ましい。

順相シリカゲルクロマトグラフィーによってエポチロンＢ及びエポチロンＡを分離及び精製するために、上記第１順相シリカゲルカラムに導入するエポチロンＢ及びＡを含む上記サンプルは、エポチロンＢ及びＡを含む発酵培養液を非極性マクロ多孔質ポリマー吸着剤と共に処理して得られた粗生成物である。具体的には、当該方法は、
粘液細菌の上記発酵培養液中に、第１非極性マクロ多孔質ポリマー吸着剤カラムの樹脂を添加し、振動ふるい分けによって濾過し、同時に水で洗浄して不純物を除去した後、当該樹脂をカラム内に導入し、アルコール溶液を用いて勾配溶離し、エポチロンＢ及びＡを含む画分を混合する工程と、
エポチロンＢ及びＡを含む上記混合画分を適切な濃度に希釈した後、当該希釈液を第２非極性マクロ多孔質ポリマー吸着剤カラムに導入し、アルコール溶液を用いて勾配溶離し、エポチロンＢ及びＡを含む画分を採取し、エポチロンＢ及びＡを含む当該画分を混合した後、エポチロンＢ及びＡを含む上記サンプルを得る工程とによって行われる。

本発明において、上記第１非極性マクロ多孔性樹脂及び上記第２非極性マクロ多孔性樹脂は、発酵培養液からエポチロンを分離するために用いられる非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材である。上記非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材は同じものでもよいし、異なるものでもよい。

本発明に係る上記第１非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材は、好ましくは、例えばAmberlite XAD-1600（Rohm & Haas 、アメリカ）及びDiaion HP-20（三菱化学、日本）などの、ＸＡＤ−１６００またはＨＰ−２０であり、より好ましくはＸＡＤ−１６００である。

本発明に係る上記第２非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材は、好ましくは、Ｈ４１またはＨ６０の非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材（Chinese Academy of Forestry Institute of Chemical Engineering, Nanjing Science and Technology Development Corporationにより生産）であり、より好ましくはＨ４１の非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材である。

上記第１非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材及び上記第２非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材に用いられる溶離液は、例えばエタノール溶液またはメタノール溶液などのアルコール溶液であり、好ましくはエタノール溶液である。上記第１非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材に用いる溶離液は、より好ましくは、容積で３０％〜１００％のエタノール溶液であり、上記第２非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材に用いる溶離液は、容積で３０％〜８０％のエタノール溶液である。

順相シリカゲルクロマトグラフィーによって、エポチロンＢ及びエポチロンＡを分離及び精製するために、上記吸着剤から溶出された上記画分、及び上記順相シリカゲルカラムから溶出された上記画分をＨＰＬＣによって測定する。採取すべき好ましい画分は以下の通りである：
上記第１非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材からの画分は、ＨＰＬＣの分析により、エポチロンＢ及びＡの総量に基づいて５０以上の発酵ユニットを有する；
上記第２非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材からの画分は、ＨＰＬＣの分析により、エポチロンＢ及びＡの総量に基づいて５０以上の発酵ユニットを有する；
上記第１順相シリカゲルカラムからの画分は、ＨＰＬＣの分析により、エポチロンＢ及びＡの総量に基づいて８０％以上のクロマトグラフィー純度を有する；
上記第２順相シリカゲルカラムからの画分は、ＨＰＬＣの分析により、エポチロンＢについて９７．５％以上のクロマトグラフィー純度を有し、また、エポチロンＡについて９２．５％以上のクロマトグラフィー純度を有する。

ＨＰＬＣの分析は任意の従来技術を用いて実施可能であるが、以下の方法が好ましい：
逆相セミ分取カラム（Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18）、２５０＊９．４ｍｍ、フィルター粒径５μｍ、流速１．５ｍＬ／分、２４９ｎｍで測定、移動相としてメタノール：水＝８０：２０を使用する方法；または、
分析カラム（SHIMADZU XOD-C18）、１５０＊６．０ｍｍ、フィルター粒径５μｍ、流速１．０ｍＬ／分、２４９ｎｍで測定、移動相としてアセトニトリル：メタノール：水＝４０：２０：５０を使用する方法。

本発明の好ましい実施形態によれば、順相シリカゲルクロマトグラフィーによってエポチロンＢ及びエポチロンＡを分離及び精製するために、上記方法は以下の工程を含む：
（１）ＸＡＤ−１６００型樹脂が加えられた上記粘液細菌培養液を振動ふるいによって濾過し、同時に不純物を除くために水で洗浄した後、上記樹脂をカラムに導入し、容積で３０％〜１００％のエタノール溶液を用いて勾配溶離し、区分に分けて画分を採取し、ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分をそれぞれ集め、エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分を混合する工程と、
（２）エポチロンＢ及びＡを含む混合画分を希釈して適切な濃度のアルコール溶液を作る、または、上記混合画分を真空蒸発によって適切な容積まで濃縮した後に希釈して適切な濃度のアルコール溶液を作った後、上記アルコール溶液をＨ４１型樹脂カラムに導入し、容積で３０％〜８０％のアルコール溶液を用いて勾配溶離し、区分に分けて画分を採取し、ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分を集め、エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分を混合し、当該混合画分を真空蒸発によって乾燥するまで濃縮してエポチロンＢ及びＡを含むサンプルを得る工程と、
（３）エポチロンＢ及びＡを含む上記サンプルをトリクロロメタンまたはジクロロメタンに溶解し、上記混合物を第１順相シリカゲルカラムのシリカゲルと混合する、または混合せずに、上記混合物を上記第１順相シリカゲルカラムに導入し、石油エーテル／アセトンの混合物または石油エーテル／酢酸エチルの混合物によって勾配溶離し、区分に分けて画分を採取し、ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分を集め、エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分を混合し、当該混合画分を真空蒸発によって乾燥するまで濃縮し、酢酸エチル／ｎ−ヘプタンの混合溶媒によって結晶化を行ってエポチロンＢ及びＡを含む粗結晶を得る工程と、
（４）エポチロンＢ及びＡを含む上記粗結晶をトリクロロメタンまたはジクロロメタンに溶解し、上記第２混合物を第２順相シリカゲルカラムのシリカゲルと混合する、または混合せずに、上記第２混合物を上記第２順相シリカゲルカラムに導入し、石油エーテル／アセトンの混合物、または石油エーテル／アセトン／トリクロロメタンの混合物によって勾配溶離し、区分に分けて画分を採取し、ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢを含む画分及びエポチロンＡを含む画分をそれぞれ集める工程と、
（５）酢酸エチル／ｎ−ヘプタンによってエポチロンＢを含む画分の結晶化を行い、エポチロンＢを含む上記結晶をｔ−ブタノールに溶解し、当該溶液を凍結乾燥して、非晶質粉末の状態の高純度エポチロンＢ生成物を得る工程、及びエポチロンＡをｔ−ブタノールに溶解した後、凍結乾燥して、非晶質粉末の状態の高純度エポチロンＡ生成物を得る工程。

実際に要求される純度に従って、工程（５）から得られるエポチロンＢまたはエポチロンＡは、より高い純度を有してもよい。例えば、本発明に記載された再結晶化によってエポチロンＢをさらに精製してもよい。また、本発明の第２順相シリカゲルカラムによって、エポチロンＡを再び精製してもよい。これによって、例えば９９．０％またはそれ以上のより高い純度を有するエポチロンＢまたはエポチロンＡを得てもよい。

エポチロンＢ：ESIMS m/z 508 [M+H]⁺; ^１H NMR (CDCl_３, 400 MHz) δ: 6.98 (1H, s, H-19), 6.60 (1H, bs, H-17), 5.42 (1H, dd, J= 7.9, 2.8 Hz, H-15), 4.24 (1H, m, H-3), 3.77 (1H, dd, J= 8.4, 4.2 Hz, H-7), 3.30 (1H, m, H-6), 2.82 (1H, dd, J= 7.7, 4.5 Hz, H-13), 2.70 (3H, s, H-21), 2.54 (1H, dd, J= 14.1, 10.6 Hz, H-2a), 2.38 (1H, dd, J= 14.1, 3.0 Hz, H-2b),2.10 (1H, m, H-14a), 2.09 (3H, d, J= 1.0 Hz, H-27), 1.90 (1H, m, H-14b), 1.72 (2H, m, H-8, H-11a), 1.49 (2H, m, H-10), 1.41 (3H, m, H-9, and H-11b), 1.39 (3H, s, H-23), 1.28 (3H, s, H-26), 1.17 (3H, d, J= 6.8 Hz, H-24), 1.08 (3H, s, H-22), 1.00 (3H, d, J= 7.0 Hz, H-25); ^１３C NMR (CDCl_３, 100 MHz) δ 220.6 (s, C-5), 170.6 (s, C-1), 165.2 (s, C-20), 151.8 (s, C-18), 137.6 (s, C-16), 119.6 (d, C-17), 116.1 (d, C-19), 76.7 (d, C-15), 74.1 (d, C-7), 72.8 (d, C-3), 61.7 (d, C-12), 61.4 (s, C-13), 53.1 (s, C-4), 42.9 (d, C-6), 39.2 (t, C-2), 36.4 (d, C-8), 32.4 (t, C-11), 32.1 (t, C-14), 30.7 (t, C-9), 22.7 (q, C-26), 22.3 (t, C-10), 21.5 (q, C-23), 19.5 (q, C-22), 19.1 (q, C-21), 17.1 (q, C-25), 15.9 (q, C-27), 13.6 (q, C-24)。

エポチロンＡ：ESIMS m/z 494 [M+H]⁺; ^１H NMR (CDCl_３, 400 MHz) δ 6.98 (1H, s, H-19), 6.60 (1H, bs, H-17), 5.44 (1H, dd, J= 8.7, 2.1 Hz, H-15), 4.20 (1H, m, H-3), 4.10 (1H, br s, 3-OH), 3.79 (1H, dd, J= 8.4, 4.2 Hz, H-7), 3.22 (1H, m, H-6), 3.04 (1H, m, H-13), 2.92 (1H, m, H-12), 2.70 (3H, s, H-21), 2.52 (1H, dd, J= 14.5, 10.6 Hz, H-2a), 2.42 (1H, dd, J= 14.5, 3.2 Hz, H-2b), 2.12 (1H, m, H-14a), 2.09 (3H, d, J= 1.0 Hz, H-27), 1.88 (1H, m, H-14b), 1.75 (2H, m, H-8, H-11a), 1.56 (1H, m, H-10a), 1.44 (4H, m, H-9, H-10b and H-11b), 1.41 (3H, s, H-23), 1.17 (3H, d, J= 6.8 Hz, H-24), 1.10 (3H, s, H-22), 1.00 (3H, d, J= 7.0 Hz, H-25); ^１３C NMR (CDCl_３, 75 MHz) δ 220.1 (s, C-5), 170.6 (s, C-1), 165.1 (s, C-20), 151.8 (s, C-18), 137.5 (s, C-16), 119.8 (d, C-17), 116.2 (d, C-19), 76.5 (d, C-15), 74.5 (d, C-7), 73.0 (d, C-3), 57.5 (d, C-12), 54.7 (d, C-13), 53.0 (s, C-4), 43.3 (d, C-6), 39.0 (t, C-2), 36.2 (d, C-8), 31.5 (t, C-14), 30.5 (t, C-9), 27.2 (t, C-11), 23.4 (t, C-10), 21.7 (q, C-23), 20.1 (q, C-22), 19.1 (q, C-21), 17.1 (q, C-25), 15.8 (q, C-27), 14.1 (q, C-24)。

本発明によるエポチロンＢ及びＡの分離及び精製を示すフローチャートを図１に示す。

本発明に係る方法は、９５．０％以上の純度、好ましくは９９．０％以上の純度を有するエポチロンＢ及びＡを得るために、エポチロンＡからエポチロンＢを十分に分離することができる。さらに、エポチロンＢ及びＡを分離する従来技術と比較して、本発明に係る方法は、例えば高収率、簡単なプロセス、及びより良い操作性など、多くの利点を有する。本発明に係る方法は、クロマトグラフィーカラムを準備するために高価な装置を必要とせず、工業的生産により適している。加えて、本発明に係る方法は、例えばメタノール及びアセトニトリルなど、高い毒性を有する溶媒を多量に消費することがない。

〔図面の簡単な説明〕
図１は、エポチロンＢ及びエポチロンＡの分離及び精製を示すフローチャートである。

図２は、分離及び精製後における９９．０％よりも高いクロマトグラフィー純度を有するエポチロンＢのＨＰＬＣクロマトグラムである。

図３は、分離及び精製後における９９．０％よりも高いクロマトグラフィー純度を有するエポチロンＡのＨＰＬＣクロマトグラムである。

図４は、凍結乾燥されたエポチロンＢの非晶質粉末のＰＸＲＤグラフ（２θ（度）、Cukα使用、λ＝0.154056nm）である。

図５は、凍結乾燥されたエポチロンＡの非晶質粉末のＰＸＲＤグラフ（２θ（度）、Cukα使用、λ＝0.154056nm）である。

〔発明の詳細な説明〕
（実施例１）
ＸＡＤ−１６００型の樹脂が加えられたエポチロンの発酵培養液３ｔを振動ふるい分けによって濾過し、水により洗浄した。３０％エタノール溶液を用いて上記樹脂をカラムに導入し、その後カラムを９５％エタノール溶液によって溶出した。区分に分けて画分を採取し、ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢ及びＡを含む画分を集めて混合した。ＨＰＬＣ（外部標準法）による分析の後、混合画分を、５４．３８ｇのエポチロンＢ及び１１０．５０ｇのエポチロンＡを含む１０Ｌに濃縮した。

得られた１０Ｌの溶液を３０％エタノール溶液にして準備した。当該エタノール溶液をＨ４１型樹脂カラム（２０ｃｍ＊３００ｃｍ、ベッド量：７０Ｌ）に導入し、その後、３０％、４０％、５０％、及び６０％のエタノール溶液を順に、１濃度当たりベッド量の２倍量を用いて、カラムを溶出した。最終的に、７０％エタノール溶液によってカラムを溶出した。区分に分けて画分を採取し、ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢ及びＡを含む画分を集めて混合した。混合画分を乾燥するまで濃縮し、エポチロンＢ及びＡを含むサンプルを得た。

エポチロンＢ及びＡを含むサンプルをＣＨＣｌ_３に溶解した。溶解したサンプルを第１順相シリカゲルカラムに導入し（シリカ：サンプル＝５：１）、その後、最初にベッド量の３倍量の石油エーテル／酢酸エチル（容積で８０：２０）によって溶出し、続いてベッド量の２倍量の石油エーテル／アセトン（容積で８５：１５）、及びベッド量の４倍量の石油エーテル／アセトン（容積で８０：２０）によって順に溶出した。区分に分けて画分を採取した。ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢ及びＡを含む所望の画分を集めて混合し、その後乾燥するまで濃縮した。

濃縮した生成物を、比率が１：１のエチル酢酸／ｎ−ヘプタンを用いて２回、結晶化させ、エポチロンＢ及びＡを含む粗結晶を得た。ＨＰＬＣ（外部標準法）の測定によれば、得られた粗結晶は、エポチロンＢ４０．２６ｇ、及びエポチロンＡ３１．８１ｇを含んでおり、総合的には９７．９％のクロマトグラフィー純度を有していた。

（実施例２）
実施例１により得られたエポチロンＢ及びＡを含む粗結晶５ｇを、ジクロロメタン５ｍｌに溶解した後、この溶液を第２順相シリカゲルカラム（４ｃｍ＊８０ｃｍ、シリカゲル３００ｇ）に導入した。ジクロロメタンによってシリカゲルカラムを平衡化し、その後、比率が９０：１０、８５：１５、８３：１７、及び８０：２０の石油エーテル／アセトンを順に用いて勾配溶離した。区分に分けて画分を採取した。ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢを含む所望の画分、及びエポチロンＡを含む所望の画分をそれぞれ集めて混合し、その後、それぞれ乾燥するまで濃縮した。最終的に、９８．７％のエポチロンＢ２．４０ｇ（収率８９％）、及び９５．８％のエポチロンＡ１．９０ｇ（収率９２％）が得られた。

（実施例３）
実施例１により得られたエポチロンＢ及びＡを含む粗結晶５ｇをトリクロロメタン５ｍｌに溶解した後、この溶液を第２順相シリカゲルカラム（４ｃｍ＊８０ｃｍ、シリカゲル３００ｇ）に導入した。トリクロロメタンによってシリカゲルカラムを平衡化し、その後、比率が９０：１０：１０、８５：１５：１０、８３：１７：１０、及び８０：２０：１０の石油エーテル／アセトン／トリクロロメタンを順に用いて勾配溶離した。区分に分けて画分を採取した。ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢを含む所望の画分、及びエポチロンＡを含む所望の画分をそれぞれ集めて混合し、その後、それぞれ乾燥するまで濃縮した。最終的に、９８．９％のエポチロンＢ２．４８ｇ（収率９２％）、及び９６．７％のエポチロンＡ１．８８ｇ（収率９０％）が得られた。

（実施例４）
実施例１により得られたエポチロンＢ及びＡを含む粗結晶５ｇをジクロロメタン５ｍｌに溶解した後、この溶液を第２順相シリカゲルカラム（６ｃｍ＊１００ｃｍ、シリカゲル８００ｇ）に導入した。ジクロロメタンによってシリカゲルカラムを平衡化し、その後、比率が９０：１０：４０、８５：１５：３０、８３：１７：２０、及び８０：２０：１０の石油エーテル／アセトン／ジクロロメタンを順に用いて勾配溶離した。区分に分けて画分を採取した。ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢを含む所望の画分、及びエポチロンＡを含む所望の画分をそれぞれ集めて貯留し、その後、それぞれ乾燥するまで濃縮した。最終的に、９８．５％のエポチロンＢ２．５３ｇ（収率９４％）、及び９７．８％のエポチロンＡ１．９４ｇ（収率９２％）が得られた。

（実施例５）
実施例２〜４で得られたエポチロンＢの再結晶化によって高純度のエポチロンＢが得られた。また、得られたエポチロンＡをシリカゲルにより再び精製することによって高純度のエポチロンＡが得られた。

９８．５％のＨＰＬＣクロマトグラフィー純度を有するエポチロンＢのサンプル１０ｇを、５２℃に加熱することにより酢酸エチル１５ｍｌに溶解した後、ｎ−ヘプタン１５ｍｌを加えた。得られた液体を室温に静置した後、２４時間かけて４℃まで冷却した。当該液体を濾過し、得られた結晶に対して上述の工程を繰り返した。最終的には、９９．４％の結晶性の純エポチロンＢ８．７ｇが得られた。

実施例２〜４で得られた９７．５％のＨＰＬＣクロマトグラフィー純度を有するエポチロンＡ５ｇをジクロロメタン５ｍｌに溶解した後、この溶液を第２順相シリカゲルカラム（シリカゲル３００ｇ）に導入した。ジクロロメタンによってシリカゲルカラムを平衡化し、その後、比率が９０：１０：４０、８５：１５：３０、８３：１７：２０、及び８０：２０：１０の石油エーテル／アセトン／ジクロロメタンを順に用いて勾配溶離した。区分に分けて画分を採取した。ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＡを含む所望の画分を集めて混合し、その後、乾燥するまで濃縮した。最終的に、９９．５％のエポチロンＡ４．３ｇが得られた。

上述の方法によって得られたエポチロンＢ及びエポチロンＡの純生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを、図２及び図３にそれぞれ示す。

（実施例６）
エポチロンＢ及びエポチロンＡの非晶質粉末の作成
非晶質粉末を得るために、実施例５で得られた高純度のエポチロンＢ及びエポチロンＡをそれぞれｔ−ブタノールに溶解して凍結乾燥した。

エポチロンＢ０．５２ｇを、ｔ−ブタノール５０ｍｌに加熱して溶解した後、室温まで冷却した。その後、当該溶液をVIRTIS Genesis凍結乾燥機内で４８時間、−２０℃で凍結乾燥した。さらに、凍結乾燥生成物を高真空下で９６時間、３０℃で乾燥した後、高真空下で４８時間、５２℃で乾燥した。得られた非晶質粉末をＸ線回折により測定した。

エポチロンＡ０．４１ｇを、ｔ−ブタノール３０ｍｌに加熱して溶解した後、室温まで冷却した。その後、当該溶液をVIRTIS Genesis凍結乾燥機内で４８時間、−２０℃で凍結乾燥した。さらに、凍結乾燥生成物を高真空下で９６時間、３０℃で乾燥した後、高真空下で４８時間、５２℃で乾燥した。得られた非晶質粉末をＸ線回折により測定した。

上述の方法によって得られたエポチロンＢ及びエポチロンＡのＰＸＲＤグラフを図４及び図５に示す（Ｘ線回折による粉末の測定はRigaku D/max-2200 で行った）。

（比較例１）
実施例１で得られたエポチロンＢ及びＡを含む粗結晶５ｇをジクロロメタン５ｍｌに溶解した後、この溶液を第２順相シリカゲルカラム（４ｃｍ＊８０ｃｍ、シリカゲル３００ｇ）に導入した。比率１：１の石油エーテル／アセトンによってシリカゲルカラムを平衡化し、その後、比率が９０：１０、８５：１５、８３：１７、及び８０：２０の石油エーテル／アセトンを順に用いて勾配溶離した。区分に分けて画分を採取した。ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢを含む所望の画分、及びエポチロンＡを含む所望の画分をそれぞれ集めて混合し、その後、それぞれ乾燥するまで濃縮した。最終的に、９８．３％のエポチロンＢ０．９４ｇ（収率３５％）、及び９５．２％のエポチロンＡ０．７２ｇ（収率３５％）が得られた。

（比較例２）
実施例１で得られたエポチロンＢ及びＡを含む粗結晶５ｇをジクロロメタン５ｍｌに溶解した後、この溶液を第２順相シリカゲルカラム（４ｃｍ＊８０ｃｍ、シリカゲル３００ｇ）に導入した。比率１：１の石油エーテル／ジクロロメタンによってシリカゲルカラムを平衡化し、その後、比率が９０：１０：１０、８５：１５：１０、８３：１７：１０、及び８０：２０：１０の石油エーテル／アセトン／トリクロロメタンを順に用いて勾配溶離した。区分に分けて画分を採取した。ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢを含む所望の画分、及びエポチロンＡを含む所望の画分をそれぞれ集めて混合し、その後、それぞれ乾燥するまで濃縮した。最終的に、９８．４％のエポチロンＢ０．９７ｇ（収率３６％）、及び９５．７％のエポチロンＡ０．８３ｇ（収率４０％）が得られた。

（比較例３）
実施例１で得られたエポチロンＢ及びＡを含む粗結晶５ｇをジクロロメタン５ｍｌに溶解した後、この溶液をシリカゲルと混合し、この混合物を真空化で乾燥させた。乾燥した混合物を第２順相シリカゲルカラム（４ｃｍ＊８０ｃｍ、シリカゲル３００ｇ）に導入した。上記シリカゲルカラムを乾式工程によって充填し、真空引きによって凝集させ、その後、比率９０：１０：１０、８５：１５：１０、８３：１７：１０、及び８０：２０：１０の石油エーテル／アセトン／ジクロロメタンを順に用いて勾配溶離した。区分に分けて画分を採取した。ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢを含む所望の画分、及びエポチロンＡを含む所望の画分をそれぞれ集めて混合し、その後、それぞれ乾燥するまで濃縮した。最終的に、９８．７％のエポチロンＢ０．８１ｇ（収率３０％）、及び９５．４％のエポチロンＡ０．７９ｇ（収率３４％）が得られた。

エポチロンＢ及びエポチロンＡの分離及び精製を示すフローチャートである。分離及び精製後における９９．０％よりも高いクロマトグラフィー純度を有するエポチロンＢのＨＰＬＣクロマトグラムである。分離及び精製後における９９．０％よりも高いクロマトグラフィー純度を有するエポチロンＡのＨＰＬＣクロマトグラムである。凍結乾燥されたエポチロンＢの非晶質粉末のＰＸＲＤグラフ（２θ（度）、Cukα使用、λ＝0.154056nm）である。凍結乾燥されたエポチロンＡの非晶質粉末のＰＸＲＤグラフ（２θ（度）、Cukα使用、λ＝0.154056nm）である。

Claims

エポチロンを分離及び精製する方法であって、
エポチロンＢ及びＡの分離及び精製を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって行う方法であり、上記方法は、
エポチロンＢ及びＡを含むサンプルをＣ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物に溶解して混合物を作り、当該混合物をシリカゲルと混合する、または混合しない工程と、
上記混合物をシリカゲルカラムに導入する工程と、
順相シリカゲルカラム溶離液を用いて上記シリカゲルカラムを勾配溶離する工程と、
画分を採取する工程と、
生成物を得る工程とを含むことを特徴とする方法。
エポチロンＢ及びＡを含むサンプルをＣ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物に溶解して混合物を作り、当該混合物を第１順相シリカゲルカラムのシリカゲルと混合する、または混合しない工程と、
上記混合物を上記第１順相シリカゲルカラムに導入する工程と、
順相シリカゲルカラム溶離液を用いて当該シリカゲルカラムを勾配溶離する工程と、
エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分を採取する工程と、
エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分を混合する工程と、
上記混合した画分を濃縮した後に結晶化を行うことによってエポチロンＢ及びＡを含む粗結晶を得る工程と、
エポチロンＢ及びＡを含む上記粗結晶をＣ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物に溶解して第２混合物を作った後、当該第２混合物を第２順相シリカゲルカラムのシリカゲルと混合する、または混合しない工程と、
上記第２混合物を第２順相シリカゲルカラムに導入する工程と、
順相シリカゲルカラム溶離液を用いて当該シリカゲルカラムを勾配溶離する工程と、
エポチロンＢを含む画分及びエポチロンＡを含む画分をそれぞれ採取する工程と、
エポチロンＢを含む画分及びエポチロンＡを含む画分をそれぞれ濃縮し、エポチロンＢを含む画分を結晶化する工程とを含む、請求項１に記載の方法。
上記第１順相シリカゲルカラムに用いられる上記シリカゲル：上記サンプルの質量比は、５〜１０：１であり、
上記第２順相シリカゲルカラムに用いられる上記シリカゲル：上記粗結晶の質量比は、５０〜２００：１である、請求項２に記載の方法。
上記順相シリカゲルカラムを使用前にＣ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物によって平衡化する、請求項３に記載の方法。
上記Ｃ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物は、ジクロロメタン、トリクロロメタン、及びこれらの組み合わせから選択される１つである、請求項４に記載の方法。
上記順相シリカゲルカラム溶離液は、Ｃ_１−Ｃ_７炭化水素、Ｃ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物、Ｃ_１−Ｃ_７ケトン、Ｃ_１−Ｃ_７エステル、またはそれらの任意の組み合わせであり、
Ｃ_１−Ｃ_７炭化水素は、石油エーテル、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、及びｎ−ヘプタンから選択された１つ以上であり、
Ｃ_１−Ｃ_７ハロゲン化アルキル化合物は、ジクロロメタン、トリクロロメタン、及びブロモエタンから選択される１つ以上であり、
Ｃ_１−Ｃ_７ケトンは、アセトン、ブタノン、及びこれらの組み合わせから選択され、
Ｃ_１−Ｃ_７エステルは、酢酸エチル、酢酸イソブチル、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項５に記載の方法。
上記順相シリカゲルカラム溶離液は、石油エーテル、酢酸エチル、アセトン、トリクロロメタン、及びジクロロメタンから選択される１つ、または２つ以上の組み合わせである、請求項６に記載の方法。
上記第１順相シリカゲルカラムの上記溶離液は、石油エーテルとアセトンとの組み合わせ、または石油エーテルと酢酸エチルとの組み合わせであり、
石油エーテル：アセトンの容積比は、３〜９：１であり、
石油エーテル：酢酸エチルの容積比は、１〜９：１である、請求項７に記載の方法。
上記第２順相シリカゲルカラムの上記溶離液は、アセトンと石油エーテルとの組み合わせ、または、ジクロロメタンもしくはトリクロロメタンのいずれか一方と石油エーテルとアセトンとの組み合わせであり、
アセトンと石油エーテルとの上記組み合わせにおいて、アセトン：石油エーテルの容積比は１：３〜９であり、
ジクロロメタンまたはトリクロロメタンのいずれか一方と石油エーテルとアセトンとの上記組み合わせにおいて、アセトン：石油エーテルの容積比は１：３〜９であり、ジクロロメタンまたはトリクロロメタンの容積は総容積の５％〜５０％である、請求項８に記載の方法。
上記シリカゲルカラムから溶出されたエポチロンＢ及びＡを含む上記画分をＨＰＬＣにより測定する、請求項９に記載の方法。
結晶化のために用いる溶媒は、ｎ−ヘプタン、酢酸エチル、またはそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の方法。
結晶化のために用いる上記溶媒は、容積比が１：１のｎ−ヘプタンと酢酸エチルとの組み合わせである、請求項１１に記載の方法。
結晶化は、エポチロンＢ及びＡを含む粗生成物、またはエポチロンＢを含む粗生成物を、適当量の酢酸エチルに溶解したものにｎ−ヘプタンを加えて得られた溶液を室温に静置した後、４℃まで冷却して結晶を得ることによって行われる、請求項１２に記載の方法。
エポチロンＢ及びＡを含む上記サンプルは、非極性マクロ多孔質ポリマー吸着剤を介して、粘液細菌の発酵培養液から分離された生成物である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
エポチロンＢ及びＡを含む上記サンプルを、
粘液細菌の上記発酵培養液中に、第１非極性マクロ多孔質ポリマー吸着剤カラムの樹脂を添加し、振動ふるい分けによって濾過し、同時に水で洗浄して不純物を除去した後、当該樹脂をカラム内に導入し、アルコール溶液を用いて勾配溶離し、エポチロンＢ及びＡを含む画分を混合する工程と、
エポチロンＢ及びＡを含む当該混合した画分を適切な濃度に希釈した後、当該希釈液を第２非極性マクロ多孔質ポリマー吸着剤カラムに導入し、アルコール溶液を用いて勾配溶離し、エポチロンＢ及びＡを含む画分を採取し、エポチロンＢ及びＡを含む当該画分を混合した後、エポチロンＢ及びＡを含む上記サンプルを得る工程と、
を含むプロセスによって準備する、請求項１４に記載の方法。
上記第１非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材は、ＸＡＤ−１６００型樹脂であり、
上記第２非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材は、Ｈ４１型樹脂である、請求項１５に記載の方法。
上記第１非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材カラムに使用される溶離液は、容積で３０％〜１００％のエタノール溶液であり、
上記第２非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材カラムに使用される溶離液は、容積で３０％〜８０％のエタノール溶液である、請求項１６に記載の方法。
上記第１及び上記第２非極性マクロ多孔質ポリマー吸着材カラムから溶出されたエポチロンＢ及びＡを含む上記画分をＨＰＬＣによって測定する、請求項１７に記載の方法。
上記順相シリカゲルカラムのクロマトグラフィーによってエポチロンＢ及びエポチロンＡの精製及び分離を行う、請求項１８に記載の方法であって、当該方法は、
（１）ＸＡＤ−１６００型樹脂が加えられた上記粘液細菌培養液を振動ふるいによって濾過し、同時に不純物を除くために水で洗浄した後、
上記樹脂をカラムに導入し、
容積で３０％〜１００％のエタノール溶液を用いて勾配溶離し、
区分に分けて画分を採取し、
ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分をそれぞれ集め、
エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分を混合する工程と、
（２）エポチロンＢ及びＡを含む混合画分を希釈して適切な濃度のアルコール溶液を作る、または、上記混合画分を真空蒸発によって適切な容積まで濃縮した後に希釈して適切な濃度のアルコール溶液を作った後、
上記アルコール溶液をＨ４１型樹脂カラムに導入し、
容積で３０％〜８０％のアルコール溶液を用いて勾配溶離し、
区分に分けて画分を採取し、
ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分を集め、
エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分を混合し、
当該混合画分を真空蒸発によって乾燥するまで濃縮してエポチロンＢ及びＡを含むサンプルを得る工程と、
（３）エポチロンＢ及びＡを含む上記サンプルをトリクロロメタンまたはジクロロメタンに溶解し、上記混合物を第１順相シリカゲルカラムのシリカゲルと混合する、または混合せずに、
上記混合物を上記第１順相シリカゲルカラムに導入し、
石油エーテル／アセトンの混合物または石油エーテル／酢酸エチルの混合物によって勾配溶離し、
区分に分けて画分を採取し、
ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分を集め、
エポチロンＢ及びエポチロンＡを含む画分を混合し、
当該混合画分を真空蒸発によって乾燥するまで濃縮し、
酢酸エチル／ｎ−ヘプタンの混合溶媒によって結晶化を行ってエポチロンＢ及びＡを含む粗結晶を得る工程と、
（４）エポチロンＢ及びＡを含む上記粗結晶をトリクロロメタンまたはジクロロメタンに溶解し、上記第２混合物を第２順相シリカゲルカラムのシリカゲルと混合する、または混合せずに、
上記第２混合物を上記第２順相シリカゲルカラムに導入し、
石油エーテル／アセトンの混合物、または石油エーテル／アセトン／トリクロロメタンの混合物によって勾配溶離し、
区分に分けて画分を採取し、
ＨＰＬＣによる分析の後、エポチロンＢを含む画分及びエポチロンＡを含む画分をそれぞれ集める工程と、
（５）酢酸エチル／ｎ−ヘプタンによってエポチロンＢを含む画分の結晶化を行い、
エポチロンＢを含む上記結晶をｔ−ブタノールに溶解し、当該溶液を凍結乾燥して、非晶質粉末の状態の高純度エポチロンＢ生成物を得る工程、及び、
エポチロンＡをｔ−ブタノールに溶解した後、凍結乾燥して、非晶質粉末の状態の高純度エポチロンＡ生成物を得る工程とを含む方法。