CN103554133B - 一种制备高纯度他克莫司的工艺 - Google Patents
一种制备高纯度他克莫司的工艺 Download PDFInfo
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- CN103554133B CN103554133B CN201310534184.5A CN201310534184A CN103554133B CN 103554133 B CN103554133 B CN 103554133B CN 201310534184 A CN201310534184 A CN 201310534184A CN 103554133 B CN103554133 B CN 103554133B
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Abstract
本发明提供一种制备高纯度他克莫司的工艺，包括如下步骤，（1）取干燥他克莫司粗品1-2重量份加入7-9体积份的四氢呋喃，加热溶解，加纯水，过滤；（2）分离纯化：C18反相色谱柱，柱高15～40cm，直径15～50cm；径高比1:0.8～1:4；流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=3～5:0.5～1.5：6～8:0.01～0.05；温度20～50℃；流速1-5L/min；检测波长220nm；（3）合并收集液，蒸发浓缩、结晶、干燥。通过本发明的工艺，显著提高他克莫司纯度和收率，纯度可达99.5%以上，单个杂质含量不大于0.3%，总杂质含量不大于0.5%，收率可达50-80%。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种用高压制备系统制备高纯度的他克莫司的工艺。
背景技术
他克莫司（Tacrolimus）也译为他克雷姆，实验室命名为FK506，商品名为普乐可复，是从链霉菌属（streptomyces tsukubaensis）中分离出的发酵产物，其化学结构属23元大环内酯类抗生素。为一种强力的新型免疫抑制剂，主要通过抑制白介素-2（L-2）的释放，全面抑制T淋巴细胞的作用，较环孢素（CsA）强100倍。近年来，作为肝、肾移植的一线用药，已在日本、美国等14个国家上市。临床实验表明，其在心、肺、肠、骨髓等移植中作用应用有很好的疗效。同时FK506在治疗特应性皮炎（AD）、系统性红斑狼疮（SLE）、自身免疫性眼病等自身免疫性疾病中也发挥着积极的。
目前，他克莫司主要是从发酵液中分离提取得到，如中国专利文献CN101712686A中公开的一种发酵液中他克莫司的分离纯化方法，具体公开了将链霉菌发酵液用板框压滤得到菌体，用有机溶剂多次室温浸提菌体，得到浸提液，将浸提液浓缩后进行大孔树脂和硅胶柱层析，柱层析所得他克莫司用混合溶剂进行浓缩结晶，得到的他克莫司晶体纯度达96.5%。由于在发酵过程中还产生了一些他克莫司异构体和类似物，如二氢他克莫司和子囊霉素等，使得分离纯化的他克莫司纯度不高，满足不了现有技术中对他克莫司纯度的要求，因此在现有技术中为提高他克莫司晶体的纯度，经发酵分离纯化后的他克莫司晶体还需要进一步的进行分离纯化步骤。
中国专利文献CN101712685A公开的一种他克莫司粗品精制方法，具体公开了将经发酵分离纯化后获得的他克莫司粗品加入有机溶剂中溶解，用C18反相制备液相色谱法实现他克莫司和二氢他克莫司、子囊霉素的分离纯化，最后获得的他克莫司晶体经HPLC检测纯度可达98.5%以上，提纯纯度大幅提高。但是，随着医药领域产业标准的不断提高，仅仅接近99%的纯度已无法 满足目前产业化要求，尤其是作为标准品的纯度要求。然而，现有技术中还没有更好的方法可以一次性仅仅通过制备步骤获得99%以上甚至99.5%以上的他克莫司产品。而且，就目前分离纯化工艺而言，不仅他克莫司的纯度有待提高，同时该工艺的产品收率也并不理想。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有技术中的他克莫司的纯度仍然存在的不足，进而提供一种用高压制备系统制备高纯度他克莫司的工艺进一步提高他克莫司的纯度和收率。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种用高压制备系统制备高纯度他克莫司的工艺，包括如下步骤：
（1）取干燥的他克莫司粗品晶体1～2重量份加入7～9体积份的四氢呋喃中，加热直至溶解，加水得到他克莫司浓度为45～55mg/ml的样品溶液，精密过滤得到所需的进样溶液；
（2）采用高压液相色谱分离所述进样溶液的他克莫司，所述色谱条件为：
色谱柱：C18反相色谱柱，
柱高为15～40cm，直径为15～50cm；径高比为1:0.8～1:4；
流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=3～5:0.5～1.5:6～8:0.01～0.05；
运行温度为20℃～50℃；
流速为1L/min～5L/min；
检测波长为220nm；
收集出峰时间为19～24min下的流出液，并合并HPLC检测后单个杂质含量低于0.1%部分的他克莫司流出液；
（3）蒸发浓缩：将收集的所述流出液于60～70℃蒸发，析出他克莫司后过滤，将滤出的他克莫司加无水乙醇溶解，并精密过滤后浓缩至干品；
（4）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入1～4体积份的无水乙醇中加 热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入他克莫司晶种，搅拌冷却，静置6～10h，3～5℃冷藏10～14h，至结晶完全；
（5）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入55～65%的乙醇洗涤、抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2～3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空38～42℃干燥21～24h，即得；
所述重量份与所述体积份的关系为g/ml的关系。
上述述制备高纯度他克莫司的工艺，包括如下步骤：
（1）取干燥的他克莫司粗品1重量份加入8体积份的四氢呋喃中，水浴回流加热至55～65℃直至溶解，停止加热后，加入12体积份的纯水得到他克莫司浓度为45～55mg/ml的样品溶液，精密过滤得到所需的进样溶液；
（2）采用高压液相色谱分离所述进样溶液的他克莫司，所述色谱条件为：
色谱柱：C18反相色谱柱，
柱高为25cm，直径为30cm；径高比为1:0.8；
流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=4:1：7:0.01；
运行温度为40℃；
流速为3.5L/min；
检测波长为220nm；
收集出峰时间为23.16min下的流出液，并合并HPLC检测后单个杂质含量低于0.1%部分的他克莫司流出液；
（3）蒸发浓缩：将收集的所述流出液于65℃旋转蒸发，析出他克莫司后过滤，弃水将滤出的他克莫司加无水乙醇溶解，并精密过滤后浓缩至干品；
（4）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入2体积份的无水乙醇中，水浴加热65℃至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入他克莫司晶种，搅拌30min后冷却，静置8h，4℃冷藏结晶 液12h，至结晶完全；
（5）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入60%的乙醇洗涤、抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2～3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空40℃干燥24h，即得。
上述的制备高纯度他克莫司的工艺，其中所述步骤（1）中，所述四氢呋喃的浓度为50%～100%，优选的四氢呋喃浓度为80%。
上述的制备高纯度他克莫司的工艺，其中所述步骤（4）中，所述晶种的重量占所述他克莫司干品的0.01～0.02%。
上述的制备高纯度他克莫司的工艺，其中所述步骤（1）之前还包括以中压层析柱对他克莫司粗品进行前处理以得到所述他克莫司粗品晶体的步骤。
上述制备高纯度他克莫司的工艺，还包括所述前处理步骤，包括：
（a）取含他克莫司粗品加入2～4体积份的乙腈溶液，加热至溶解，缓慢加入2.5～3体积份纯水至溶液变浑浊且无油状物析出止，得到上柱溶液；
（b）采用中压反相层析柱分离所述上柱溶液，具体层析参数包括：
层析柱：C18反相层析柱，所述层析柱柱高为60～100cm，直径为6cm～30cm；径高比为1:3～1:10；
流动相组成体积比为乙腈：水：乙酸=50～54:50～46:0.01～0.05；
运行温度：25～40℃；
装柱：装填好的层析柱用2～3倍柱体积的54～56%乙腈溶液以每小时2～3倍柱体积流速平衡；将上柱溶液以每小时0.4～0.6倍柱体积加入层析柱中；上柱样为所述填料重量的3%～6%，上柱样浓度为100～250mg/ml；
洗脱：用上述流动相溶液进行等度洗脱，流速为每小时0.25～1.2倍柱体积，洗脱1.5～2.5倍柱体积后开始分部收集，每次收集0.2～0.5柱体积，以TLC法进行检测，所述TLC检测条件为：
展开剂组成体积比为乙酸乙酯：己烷=3～5:7～5，展开板为硅胶薄层板， 显色检测为紫外照射法，TLC检测到样品出现后，HPLC检测，HPLC检测条件为：
分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=3～5:0.5～1.5：6～8:0.01～0.05，运行温度为20℃～50℃，流速为1m L/min～5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19～24min，收集含有他克莫司的流份；
（c）将上述收集的各部分流出液分别蒸发浓缩：蒸发温度为60～70℃，析出他克莫司，过滤，滤出的他克莫司用无水乙醇溶解后，浓缩至干品；
（d）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入1～4体积份的无水乙醇中，加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入他克莫司晶体，搅拌冷却，静置6～10h，3～5℃冷藏10～14h，至结晶完全；
（e）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入体积比为55～65%的乙醇洗涤，抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2～3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空38～42℃干燥21～24h，即得用于高压制备柱层析的他克莫司粗品晶体样品。
优选的，上述前处理步骤还包括如下步骤：
（a）取含他克莫司粗品加入3体积份的乙腈溶液中，加热至溶解，缓慢加入2.8体积份纯水至溶液变浑浊且无油状物析出止，得到上柱溶液；
（b）采用中压反相层析柱分离所述上柱溶液，具体层析参数包括：
层析柱：C18反相层析柱，所述层析柱柱高为100cm，直径为30cm；径高比为1:3.33；
流动相组成体积比为乙腈：水：乙酸=52:48:0.01；
运行温度：40℃；
装柱：装填好的层析柱用2倍柱体积的55%乙腈溶液以每小时2倍柱体积流速平衡；将上柱溶液以每小时0.5倍柱体积加入层析柱中；上柱样为所述 填料重量的4%，上柱样浓度为180mg/ml；
洗脱：随后用上述流动相溶液进行等度洗脱，流速为每小时1倍柱体积，洗脱2倍柱体积后开始分部收集，每次收集0.3倍柱体积，以TLC法进行检测，所述TLC检测条件为：
展开剂组成体积比为乙酸乙酯：己烷=3:7，展开板为硅胶薄层板，显色检测为紫外照射法，TLC检测到样品出现后；HPLC检测，HPLC检测条件为：
分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=4:1:7:0.01，运行温度为40℃，流速为3.5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，收集含有他克莫司的流份；
（c）将上述收集的各部分流出液分别蒸发浓缩：蒸发温度为65℃，析出他克莫司，过滤，滤出的他克莫司用无水乙醇溶解后，浓缩至干；
（d）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入2体积份的无水乙醇中，加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入他克莫司晶体，搅拌冷却，静置8h，4℃冷藏12h，至结晶完全；
（e）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入体积比为60%的乙醇溶液中洗涤，抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2～3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空40℃干燥24h，即得用于高压制备柱层析的他克莫司粗品晶体样品。
上述制备高纯度他克莫司的工艺，还包括如下所述前处理步骤，包括：
（A）取含他克莫司粗品加入2～4体积份的乙腈溶液，加热至溶解，缓慢加入2.5～3体积份纯水至溶液变浑浊且无油状物析出止，得到上柱溶液；
（B）采用中压反相层析柱分离所述上柱溶液，具体层析参数包括：
层析柱：C18反相层析柱，所述层析柱柱高为60～100cm，直径为6cm～30cm；径高比为1:3～1:10；
流动相组成体积比为乙腈：水：乙酸=50～54:50～46:0.01；
运行温度：25～40℃；
装柱：装填好的层析柱用2～3倍柱体积的54～56%乙腈溶液以每小时2～3倍柱体积流速平衡；将上柱溶液以每小时0.4～0.6倍柱体积加入层析柱中；上柱样为所述填料重量的3%～6%，上柱样浓度为100～250mg/ml；
洗脱：用流动相溶液进行梯度洗脱，具体洗脱程序为，用体积比为52:48:0.01的乙腈、水和乙酸组成的流动相洗脱1～2倍柱体积，再用体积比为54:46:0.01的乙腈、水和乙酸组成的流动相洗脱1～2倍柱体积，再用体积比为56:44:0.01的乙腈、水和乙酸组成的流动相洗脱1～2倍柱体积，每次洗脱流速均为每小时0.8～1.2倍柱体积，洗脱1.5～2.5倍柱体积后开始分部收集，每次收集0.2～0.5倍柱体积，以TLC法进行检测，所述TLC检测条件为：
展开剂组成体积比为乙酸乙酯：己烷=3～5:7～5，展开板为硅胶薄层板，显色检测为紫外照射法，TLC检测到样品出现后，以HPLC检测，HPLC检测条件为：
分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=3～5:0.5～1.5：6～8:0.01～0.05，运行温度为20℃～50℃，流速为1mL/min～5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，收集含有他克莫司的流份；
（C）将上述收集的各部分流出液分别蒸发浓缩：蒸发温度为60～70℃，析出他克莫司，过滤，滤出的他克莫司用无水乙醇溶解后，浓缩至干品；
（D）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入2～4体积份的无水乙醇中，加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入上述浓缩的他克莫司干品研磨成的细粉的晶体作为晶种，搅拌冷却，静置6～10h，3～5℃冷藏10～14h，至结晶完全；
（E）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入体积比为55～65%的乙醇洗涤，抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2～3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空38～42℃干燥21～24h，即得用于高压制备柱 层析的他克莫司粗品晶体样品。
优选的，所述前处理步骤包括：
（A）取含他克莫司粗品加入3体积份的乙腈溶液，加热至溶解，缓慢加入2.8体积份纯水至溶液变浑浊且无油状物析出止，得到上柱溶液；
（B）采用中压反相层析柱分离所述上柱溶液，具体层析参数包括：
层析柱：C18反相层析柱，所述层析柱柱高为100cm，直径为30cm；径高比为1:3.33；
流动相组成体积比为乙腈：水：乙酸=50～54:50～46:0.01；
运行温度：40℃；
装柱：装填好的层析柱用2倍柱体积的55%乙腈溶液以每小时2倍柱体积流速平衡；将上柱溶液以每小时0.5倍柱体积加入层析柱中；上柱样为所述填料重量的4%，上柱样浓度为180mg/ml；
洗脱：用由乙腈、水和乙酸组成的流动相溶液梯度洗脱，具体洗脱程序为，以体积比为52:48:0.01的乙腈、水和乙酸组成的流动相洗脱2倍柱体积，再用体积比为54:46:0.01的乙腈、水和乙酸组成的流动相洗脱2倍柱体积，再用体积比为56:44:0.01的乙腈、水和乙酸组成的流动相洗脱1.5倍柱体积，每次洗脱程序的流速为每小时1倍柱体积，洗脱2倍柱体积后开始分部收集，每次收集0.3倍柱体积，进行TLC检测，所述TLC检测条件为：
展开剂组成体积比为乙酸乙酯：己烷=3:7，展开板为硅胶薄层板，显色检测为紫外照射法，TLC检测到样品出现后，HPLC检测，HPLC检测条件为：
分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=4:1:7:0.01，运行温度为40℃，流速为3.5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，收集含有他克莫司的流份；
（C）将上述收集的各部分流出液分别蒸发浓缩：蒸发温度为65℃，析出他克莫司，过滤，滤出的他克莫司用无水乙醇溶解后，浓缩至干品；
（D）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入2体积份的无水乙醇中，加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入上述浓缩的他克莫司干品重量0.01%～0.02%研磨成细粉的晶体作为晶种，搅拌冷却，静置8h，4℃冷藏12h，至结晶完全；
（E）干燥：所述他克莫司晶体经体积比为60%的乙醇洗涤，抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2～3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空40℃干燥24h，即得用于高压制备柱层析的他克莫司粗品晶体样品。
本发明通过上述方法制备得到的高纯度他克莫司。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有如下优点：
（1）本发明所述的制备高纯度他克莫司的工艺中，通过优化他克莫司晶体的分离纯化步骤，获得了纯度高达99.5%以上的他克莫司晶体，单个杂质含量不大于0.%，总杂质含量为0.4%，且收率达到80%以上，显著提高了他克莫司晶体的纯度和收率，有关杂质含量低，足以满足目前他克莫司标准的产品需要；
（2）本发明所述的制备高纯度他克莫司工艺中，通过选择合适的流动相组成四氢呋喃：乙腈：水：乙酸（4:1：7:0.01）以及其他合适的色谱条件，大大提高了他克莫司晶体的分离纯化纯度，纯度高达99.7%，单个杂质含量不大于0.2%，总杂质含量不大于0.3%；
（3）本发明所述的制备高纯度得他克莫司工艺中，通过将他克莫司粗品经四氢呋喃加热溶解、加纯水、过滤等步骤，使得他克莫司晶体的纯度和收率提高；
（4）本发明所述的制备高纯度他克莫司工艺中，通过优化整个分离纯化工艺步骤，使得他克莫司晶体的纯度和收率得到显著提高，并获得了节省了大量有机溶剂，获得了降低成本，降低对环境污染的有益效果；
（5）本发明所述的制备高纯度他克莫司工艺中，通过他克莫司粗品的前处理步骤，大大降低了他克莫司粗品中的有关杂质的含量，进一步提高了他克莫司的纯度，尤其使得他克莫司产品的收率大幅提高，达到80%左右。
具体实施方式
实施例1
本实施例的他克莫司晶体经以下步骤制备：
（1）称取他克莫司晶体粗品100g加入到700ml的浓度为45%的四氢呋喃中，加热直至溶解，加热温度为50℃，溶解后，停止加热，边搅拌边缓慢加入10倍晶体重量的纯水，得到澄清透明的溶液，浓度为45mg/ml，将上述溶液精密过滤得到进样溶液；
（2）将上述进样溶液经高压液相色谱分离，色谱柱为制备型C18反相色谱柱，色谱柱型号为DAC-50，色谱柱高15cm，直径为15cm，径高比为1:1，柱分离填料C18，粒径为10um，孔径为120A，运行温度为50℃，流速为5L/min，流动相为四氢呋喃-乙腈-水-乙酸，流动相组成体积比为3:1.5:8:0.01，检测波长为220nm，出峰时间范围为19-24min，收集他克莫司流出液，合并用HPLC检测后单个杂质含量低于0.1%的部分的他克莫司流出液；
（3）蒸发浓缩：将上述收集的所述流出液用50L旋转蒸发仪，在水浴温度为60℃下浓缩，待除去溶媒后，他克莫司晶体析出，将水倒出冷却后过滤，弃去水，合并滤出的样品，用无水乙醇溶解上述样品，并经精密过滤后浓缩至干品（泡沫状物），称重；
（4）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入1体积份的无水乙醇中，55℃加热溶解，迅速搅拌，同时滴加纯化水至溶液液呈微浑浊，静置不澄清，返滴加无水乙醇至溶液刚刚澄清即停止，加入他克莫司晶种，停止加热，缓慢搅拌30分钟后自然冷却，静置6小时，然后将结晶液在3℃冷藏10小时使其结晶完全；
（5）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入55%乙醇水溶液中洗涤，将洗涤后的结晶液用布氏漏斗抽滤，过滤完毕，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体充分混合均匀后再抽滤，重复洗涤2-3次，洗去色素和杂质，抽干洗涤液，得到湿晶体，湿晶体称重后置于真空干燥箱中38℃干燥21小时，称重，得到他克莫司晶体成品。最后所得产品经HPLC检测，分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋 喃：乙腈：水：乙酸=3:1.5:8:0.01，运行温度为50℃，流速为5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间范围为19-24min，检测他克莫司纯度为99.5%，单个杂质含量不大于0.3%，总杂质含量不大于0.5%，收率为72%。
结晶母液和洗涤液浓缩回收后HPLC检测可以重新进行高压制备柱分离纯化。
成品保存：遮光，密封、干燥处冷藏保存。以上所有操作如无特别说明，均指在环境温度在20-26℃下进行操作。
实施例2
本实施例的他克莫司晶体经以下步骤制备：
（1）称取他克莫司晶体粗品100g加入到800ml的浓度为80%的四氢呋喃中，加热直至溶解，加热温度为55℃，溶解后，停止加热，边搅拌边缓慢加入12倍晶体重量的纯水，得到澄清透明的溶液，浓度为50mg/ml，用孔径为0.45um的精密过滤器将上述溶液精密过滤得到进样溶液；
（2）将上述进样溶液经高压液相色谱分离，色谱柱为制备型C18反相色谱柱，色谱柱高25cm，直径为30cm，径高比为1:0.83，色谱柱型号为DAC-100，柱分离填料C18，粒径为10um，孔径为120A，运行温度为40℃，流速为3.5L/min，流动相为四氢呋喃-乙腈-水-乙酸，流动相组成体积比为4:1:7:0.01，检测波长为220nm，出峰时间为23.16min，收集他克莫司流出液，合并用HPLC检测后单个杂质含量低于0.1%的部分的他克莫司流出液；
（3）蒸发浓缩：将上述收集的所述流出液用50L旋转蒸发仪，在水浴温度为65℃下浓缩，待除去溶媒后，他克莫司晶体析出，将水倒出冷却后过滤，弃去水，合并滤出的样品，用无水乙醇溶解上述样品，并经孔径为0.45um的精密过滤器精密过滤后浓缩至干品（泡沫状物），称重；
（4）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入2体积份的无水乙醇中，65℃加热溶解，迅速搅拌，同时滴加纯化水至溶液液呈微浑浊，静置不澄清，返滴加无水乙醇至溶液刚刚澄清即停止，加入浓缩后的他克莫司干品重量的0.02%研磨成细粉作为的他克莫司晶种，停止加热，缓慢搅拌30分钟后自然冷却，静置8小时，然后将结晶液在4℃冷藏12小时使其结晶完全；
（5）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入60%乙醇水溶液中洗涤，将洗涤后的结晶液用布氏漏斗抽滤，过滤完毕，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体充分混合均匀后再抽滤，重复洗涤2-3次，洗去色素和杂质，抽干洗涤液，得到湿晶体，湿晶体称重后置于真空干燥箱中40℃干燥24小时，称重，得到他克莫司晶体成品。最后所得产品经HPLC检测，色谱柱为分析型C18反相色谱柱，粒径为5um，柱子规格4.6*250mm，运行温度为40℃，流速为3.5mL/min，流动相为四氢呋喃-乙腈-水-乙酸，流动相组成体积比为4:1:7:0.01，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，收集他克莫司流出液，用HPLC检测他克莫司纯度为99.7%，单个杂质含量不大于0.2%，总杂质含量不大于0.3%，收率为74%。
结晶母液和洗涤液浓缩回收后HPLC检测可以重新进行高压制备柱分离纯化。
成品保存：遮光，密封、干燥处冷藏保存。以上所有操作如无特别说明，均指在环境温度在20-26℃下进行操作。
实施例3
本实施例的他克莫司晶体经以下步骤制备：
（1）称取他克莫司晶体粗品100g加入到900ml的浓度为55%的四氢呋喃中，加热直至溶解，加热温度为65℃，溶解后，停止加热，边搅拌边缓慢加入12倍晶体重量的纯水，得到澄清透明的溶液，浓度为55mg/ml，将上述溶液精密过滤得到进样溶液；
（2）将上述进样溶液经高压液相色谱分离，色谱柱为制备型C18反相色谱柱，色谱柱高40cm，直径为50cm，径高比为1:1.25柱分离填料C18，色谱柱型号为DAC-300，粒径为10um，孔径为120A，运行温度为20℃，流速为1L/min，流动相为四氢呋喃-乙腈-水-乙酸，流动相组成体积比为5:0.5:6:0.05，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，收集他克莫司流出液，合并用HPLC检测后单个杂质含量低于0.1%的部分的他克莫司流出液；
（3）蒸发浓缩：将上述收集的所述流出液用50L旋转蒸发仪，在水浴温度为70℃下浓缩，待除去溶媒后，他克莫司晶体析出，将水倒出冷却后过滤， 弃去水，合并滤出的样品，用无水乙醇溶解上述样品，并经孔径为0.45um精密过滤器精密过滤后浓缩至干品（泡沫状物），称重；
（4）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入4体积份的无水乙醇中，65℃加热溶解，迅速搅拌，同时滴加纯化水至溶液液呈微浑浊，静置不澄清，返滴加无水乙醇至溶液刚刚澄清即停止，加入上述浓缩他克莫司干品重量的0.01%研磨成细粉作为的他克莫司晶种，停止加热，缓慢搅拌30分钟后自然冷却，静置10小时，然后将结晶液在5℃冷藏14小时使其结晶完全；
（5）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入65%乙醇水溶液中洗涤，将洗涤后的结晶液用布氏漏斗抽滤，过滤完毕，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体充分混合均匀后再抽滤，重复洗涤2-3次，洗去色素和杂质，抽干洗涤液，得到湿晶体，湿晶体称重后置于真空干燥箱中42℃干燥23小时，称重，得到他克莫司晶体成品。最后所得产品经HPLC检测，分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径为5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=5:0.5:6:0.05，运行温度为20℃，流速为1mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，他克莫司纯度为99.5%，单个杂质含量不大于0.3%，总杂质含量不大于0.5%，收率为75%。
结晶母液和洗涤液浓缩回收后HPLC检测可以重新进行高压制备柱分离纯化。
成品保存：遮光，密封、干燥处冷藏保存。以上所有操作如无特别说明，均指在环境温度在20-26℃下进行操作。
实施例4
本实施例的他克莫司经如下步骤分离纯化：
他克莫司粗品的前处理步骤：
（a）取含他克莫司粗品加入2体积份的乙腈溶液，加热至溶解，缓慢加入2.5体积份纯水至溶液变浑浊且无油状物析出止，得到上柱溶液；
（b）采用中压反相层析柱分离所述上柱溶液，具体层析参数包括：
层析柱：C18反相层析柱，粒径为30um，所述层析柱柱高为60cm，直径为 6cm；径高比为1:10;
流动相组成体积比为乙腈：水：乙酸=50:50:0.01；
运行温度：25℃；
装柱；装填好的层析柱用3倍柱体积的56%乙腈溶液以每小时2倍柱体积流速平衡；将上柱溶液以每小时0.6倍柱体积加入层析柱中；上柱样为所述填料重量的3%，上柱样浓度为250mg/ml；洗脱，用上述流动相溶液洗脱，流速为每小时0.25倍柱体积，洗脱2.5倍柱体积后开始分部收集，每次收集0.2倍柱体积，TLC检测，所述TLC检测条件为展开剂组成体积比为乙酸乙酯：己烷=4:6，展开板为硅胶薄层板，显色检测为紫外照射法，TLC检测到样品出现后，HPLC检测，HPLC检测条件为分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径为5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=3:1.5：6:0.05，运行温度为20℃，流速为5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，收集含有他克莫司的流份；
（c）将上述收集的各部分流出液分别蒸发浓缩：蒸发温度为60℃，析出他克莫司，过滤，滤出的他克莫司用无水乙醇溶解后，浓缩至干品；
（d）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入4体积份的无水乙醇中，加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入他克莫司晶体作为晶种，搅拌冷却，静置6h，5℃冷藏10h，至结晶完全；
（e）干燥：所述他克莫司晶体加入体积比为65%的乙醇溶液中洗涤，用布氏漏斗抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2～3次，以洗去色素和其他杂质，抽干洗涤液，得到的晶体真空38℃干燥22h，即得高压制备柱层析样品，结晶母液和洗涤液浓缩回收后HPLC检测可以重新进行柱层析分离纯化。
他克莫司粗品的分离纯化步骤与实施例1他克莫司粗品的分离纯化步骤相同，其区别在于最后所得产品经HPLC检测，分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径为5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水： 乙酸=3:1.5：6:0.05，运行温度为20℃，流速为5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，检测的他克莫司纯度为99.6%，单个杂质含量不大于0.2%，总杂质含量不大于0.4%，收率为85%。
实施例5
本实施例的他克莫司经如下步骤分离纯化：
他克莫司粗品的前处理步骤：
（a）取含他克莫司粗品加入4体积份的乙腈溶液，加热至溶解，缓慢加入3体积份纯水至溶液变浑浊且无油状物析出止，得到上柱溶液；
（b）采用中压反相层析柱分离所述上柱溶液，具体层析参数包括：
层析柱：C18反相层析柱，粒径为50um，所述层析柱柱高为80cm，直径为18cm；径高比为1:4.44；
流动相组成体积比为乙腈：水：乙酸=54:46:0.01；
运行温度：30℃；
装柱，采用湿法装柱，填料与乙醇溶剂混合搅拌拌匀，边搅拌边上柱；装填好的层析柱用2.5倍柱体积的54%乙腈溶液以每小时2.5倍柱体积流速平衡；将上柱溶液以每小时0.4倍柱体积加入层析柱中；上柱样为所述填料重量的6%，上柱样浓度为100mg/ml；洗脱，用上述流动相溶液洗脱，流速为每小时1.2倍柱体积，洗脱1.5倍柱体积后开始分部收集，每次收集0.5倍柱体积，TLC检测，所述TLC检测条件为展开剂组成体积比为乙酸乙酯：己烷=5:5，展开板为硅胶薄层板，显色检测为紫外照射法，TLC检测到样品出现后，HPLC检测，HPLC检测条件为分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径为5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=5:0.5：8:0.01，运行温度为50℃，流速为1mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，收集含有他克莫司的流份；
（c）将上述收集的各部分流出液分别蒸发浓缩：蒸发温度为70℃，析出他克莫司，过滤，滤出的他克莫司用无水乙醇溶解后，浓缩至干品；
（d）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入1体积份的无水乙醇中，加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入上述他克莫司干品重量的0.01%研磨成细粉作为晶种，搅拌冷却，静置10h，3℃冷藏14h，至结晶完全；
（e）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入体积比为55%的乙醇溶液中洗涤，用布氏漏斗抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2-3次，以洗去色素和其他杂质，抽干洗涤液，得到的晶体真空42℃干燥21h，即得高压制备柱层析样品，结晶母液和洗涤液浓缩回收后HPLC检测可以重新进行柱层析分离纯化。
他克莫司粗品的分离纯化步骤与实施例2他克莫司粗品的分离纯化步骤相同，其区别在于最后所得产品经HPLC检测，色谱柱为分析型C18反相色谱柱，C18反相色谱柱，粒径为5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=5:0.5：8:0.01，运行温度为50℃，流速为1mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，收集他克莫司流出液，检测他克莫司纯度为99.8%，单个杂质含量不大于0.1%，总杂质含量不大于0.2%，收率为88%。
实施例6
本实施例的他克莫司经如下步骤分离纯化：
他克莫司粗品的前处理步骤：
（a）取含他克莫司粗品加入3体积份的乙腈溶液，加热至溶解，缓慢加入2.8体积份纯水至溶液变浑浊且无油状物析出止，得到上柱溶液；
（b）采用中压反相层析柱分离所述上柱溶液，具体层析参数包括：
层析柱：C18反相层析柱，粒径为40um，所述层析柱柱高为100cm，直径为30cm；径高比为1:3.33；
流动相组成体积比为乙腈：水：乙酸=52:48:0.01；
运行温度：40℃；
装柱；装填好的层析柱用2倍柱体积的55%乙腈溶液以每小时2倍柱体积 流速平衡；将上柱溶液以每小时0.5倍柱体积加入层析柱中；上柱样为所述填料重量的4%，上柱样浓度为180mg/ml；洗脱，用上述流动相溶液洗脱，流速为每小时1倍柱体积，洗脱2倍柱体积后开始分部收集，每次收集0.3倍柱体积，TLC检测，所述TLC检测条件为展开剂组成体积比为乙酸乙酯：己烷=3:7，展开板为硅胶薄层板，显色检测为紫外照射法，TLC检测到样品出现后，HPLC检测，HPLC检测条件为分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径为5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=4:1：7:0.01，运行温度为40℃，流速为3.5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为23min，收集含有他克莫司的流份；
（c）将上述收集的各部分流出液分别蒸发浓缩：蒸发温度为65℃，析出他克莫司，过滤，滤出的他克莫司用无水乙醇溶解后，浓缩至干品；
（d）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入2体积份的无水乙醇中，加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入上述他克莫司干品重量的0.02%研磨成细粉作为晶种，搅拌冷却，静置8h，4℃冷藏12h，至结晶完全；
（e）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入体积比为60%的乙醇溶液中洗涤，用布氏漏斗抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2-3次，以洗去色素和其他杂质，抽干洗涤液，得到的晶体真空40℃干燥24h，即得高压制备柱层析样品，结晶母液和洗涤液浓缩回收后HPLC检测可以重新进行柱层析分离纯化。
他克莫司粗品的分离纯化步骤与实施例3他克莫司粗品的分离纯化步骤相同，其区别在于最后所得产品经HPLC检测，色谱柱为分析型C18反相色谱柱，C18反相色谱柱，粒径为5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=4:1：7:0.01，运行温度为40℃，流速为3.5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间范围为19-24min，收集他克莫司流出液，检测他克莫司纯度为99.8%，单个杂质含量不大于0.1%，总杂质含量不大于0.2%，收率为87%。
实施例7
本实施例的他克莫司经如下步骤分离纯化：
他克莫司粗品的前处理步骤：
（A）取含他克莫司粗品加入4体积份的乙腈溶液，加热至溶解，缓慢加入2.5体积份纯水至溶液变浑浊且无油状物析出止，得到上柱溶液；
（B）采用中压反相层析柱分离所述上柱溶液，具体层析参数包括：
层析柱：C18反相层析柱，粒径为30um，所述层析柱柱高为80cm，直径为18cm；径高比为1:4.44；
流动相组成为乙腈：水：乙酸；
运行温度：30℃；
装柱；平衡：装填好的层析柱用3倍柱体积的56%乙腈溶液以每小时2倍柱体积流速平衡；将上柱溶液以每小时0.6倍柱体积加入层析柱中；上柱样为所述填料重量的3%，上柱样浓度为250mg/ml；洗脱，用上述流动相溶液梯度洗脱，洗脱时用乙腈、水和乙酸体积比为52:48:0.01洗脱1倍柱体积，再用乙腈、水和乙酸体积比为54:46:0.01洗脱1倍柱体积，再用乙腈、水和乙酸体积比为56:44:0.01洗脱1倍柱体积，流速为每小时0.8倍柱体积，洗脱2.5倍柱体积后开始分部收集，每次收集0.2倍柱体积，TLC检测，所述TLC检测条件为展开剂组成体积比为乙酸乙酯：己烷=4:6，展开板为硅胶薄层板，显色检测为紫外照射法，TLC检测到样品出现后，HPLC检测，HPLC检测条件为色谱柱：分析型色谱柱：C18反相色谱柱，5um柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=3:1.5：6:0.05，运行温度为20℃，流速为1mL/min，检测波长为220nm，出峰时间范围为19-24min，收集含有他克莫司的流份；
（C）将上述收集的各部分流出液分别蒸发浓缩：蒸发温度为70℃，析出他克莫司，过滤，滤出的他克莫司用无水乙醇溶解后，浓缩至干品；
（D）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入3体积份的无水乙醇中，加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停 止，加入他克莫司干品作为晶种，搅拌冷却，静置10h，3℃冷藏14h，至结晶完全；
（E）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入体积比为65%的乙醇洗涤，抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2-3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空38℃干燥24h，即得高压制备柱层析样品。
他克莫司粗品的分离纯化步骤与实施例1他克莫司粗品的分离纯化步骤相同，其区别在于最后所得产品经HPLC检测，分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=3:1.5：6:0.05，运行温度为20℃，流速为1mL/min，检测波长为220nm，，出峰时间为19-24min，检测他克莫司纯度为99.9%，单个杂质含量不大于0.1%，总杂质含量不大于0.1%，收率为85%。
实施例8
本实施例的他克莫司经如下步骤分离纯化：
他克莫司粗品的前处理步骤：
（A）取含他克莫司粗品加入2体积份的乙腈溶液，加热至溶解，缓慢加入3体积份纯水至溶液变浑浊且无油状物析出止，得到上柱溶液；
（B）采用中压反相层析柱分离所述上柱溶液，具体层析参数包括：
层析柱：C18反相层析柱，粒径为50um，所述层析柱柱高为60cm，直径为6cm；径高比为1:10；
流动相组成为乙腈：水：乙酸；
运行温度：25℃；
装柱；平衡：装填好的层析柱用2倍柱体积的54%乙腈溶液以每小时3倍柱体积流速平衡；将上柱溶液以每小时0.4倍柱体积加入层析柱中；上柱样为所述填料重量的6%，上柱样浓度为100mg/ml；洗脱，用上述流动相溶液梯度洗脱，洗脱时用乙腈、水和乙酸体积比为52:48:0.01洗脱2倍柱体积，再用乙腈、水和乙酸体积比为54:46:0.01洗脱2倍柱体积，再用乙腈、水和乙酸体积比为56:44:0.01洗脱2倍柱体积，流速为每小时1.2倍柱体积，洗脱 1.5倍柱体积后开始分部收集，每次收集0.5倍柱体积，TLC检测，所述TLC检测条件为展开剂组成体积比为乙酸乙酯：己烷=5:5，展开板为硅胶薄层板，显色检测为紫外照射法，TLC检测到样品出现后，HPLC检测，HPLC检测条件为色谱柱：分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径为5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=5:0.5：8:0.03，运行温度为50℃，流速为5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，收集含有他克莫司的流份；
（C）将上述收集的各部分流出液分别蒸发浓缩：蒸发温度为60℃，析出他克莫司，过滤，滤出的他克莫司用无水乙醇溶解后，浓缩至干品；
（D）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入4体积份的无水乙醇中，加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入他克莫司干品重量0.01%研磨成细粉作为晶种，搅拌冷却，静置6h，5℃冷藏10h，至结晶完全；
（E）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入体积比为55%的乙醇洗涤，抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2-3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空42℃干燥21h，即得高压制备柱层析样品。
他克莫司粗品的分离纯化步骤与实施例2他克莫司粗品的分离纯化步骤相同，其区别在于最后所得产品经HPLC检测，分析型色谱柱：C18反相色谱柱，5um柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=5:0.5：8:0.03，运行温度为50℃，流速为5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间范围为19-24min，检测他克莫司纯度为99.9%，单个杂质含量不大于0.1%，总杂质含量不大于0.1%，收率为65%。
实施例9
本实施例的他克莫司经如下步骤分离纯化：
他克莫司粗品的前处理步骤：
（A）取含他克莫司粗品加入3体积份的乙腈溶液，加热至溶解，缓慢加入2.8体积份纯水至溶液变浑浊且无油状物析出止，得到上柱溶液；
（B）采用中压反相层析柱分离所述上柱溶液，具体层析参数包括：
层析柱：C18反相层析柱，粒径为40um，所述层析柱柱高为100cm，直径为30cm；径高比为1:3.33；
流动相组成为乙腈：水：乙酸；
运行温度：40℃；
装柱，采用湿法装柱，填料与乙醇溶剂混合搅拌拌匀，上柱；平衡：装填好的层析柱用2倍柱体积的55%乙腈溶液以每小时2倍柱体积流速平衡；将上柱溶液以每小时0.5倍柱体积加入层析柱中；上柱样为所述填料重量的4%，上柱样浓度为180mg/ml；洗脱，用上述流动相溶液梯度洗脱，洗脱时用乙腈、水和乙酸体积比为52:48:0.01洗脱2倍柱体积，再用乙腈、水和乙酸体积比为54:46:0.01洗脱2倍柱体积，再用乙腈、水和乙酸体积比为56:44:0.01洗脱1.5倍柱体积，流速为每小时1倍柱体积，洗脱2倍柱体积后开始分部收集，每次收集0.3倍柱体积，TLC检测，所述TLC检测条件为展开剂组成体积比为乙酸乙酯：己烷=3:7，展开板为硅胶薄层板，显色检测为紫外照射法，TLC检测到样品出现后，HPLC检测，HPLC检测条件为色谱柱：分析型色谱柱：C18反相色谱柱，5um柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=4:1：7：0.01，运行温度为40℃，流速为3.5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，收集含有他克莫司的流份；
（C）将上述收集的各部分流出液分别蒸发浓缩：蒸发温度为65℃，析出他克莫司，过滤，滤出的他克莫司用无水乙醇溶解后，浓缩至干品；
（D）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入2体积份的无水乙醇中，加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入上述浓缩的他克莫司干品重量0.01%研磨成细粉的晶体作为晶种，搅拌冷却，静置8h，4℃冷藏12h，至结晶完全；
（E）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入体积比为60%的乙醇洗涤，抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2-3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空40℃干燥24h，即得高压制备柱层析样品。
他克莫司粗品的分离纯化步骤与实施例3他克莫司粗品的分离纯化步骤相同，其区别在于最后所得产品经HPLC检测，分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径为5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=4:0.5：7：0.02，运行温度为50℃，流速为1mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min,检测他克莫司纯度为99.9%，单个杂质含量不大于0.1%，总杂质含量不大于0.1%，收率为65%。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明权利要求的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种制备高纯度他克莫司的工艺，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取干燥的他克莫司粗品晶体1-2重量份加入7-9体积份的四氢呋喃中，加热直至溶解，加水得到他克莫司浓度为45-55mg/ml的样品溶液，精密过滤得到所需的进样溶液；
（2）采用高压液相色谱分离所述进样溶液的他克莫司，所述色谱条件为：
色谱柱：C18反相色谱柱，
柱高为15～40cm，直径为15～50cm；径高比为1:0.8～1:4；
流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=3～5:0.5～1.5:6～8:0.01～0.05；
运行温度为20℃～50℃；
流速为1 L/min～5L/min；
检测波长为220nm；
收集出峰时间为19～24min下的流出液，并合并HPLC检测后单个杂质含量低于0.1%部分的他克莫司流出液；
（3）蒸发浓缩：将收集的所述流出液于60～70℃蒸发，析出他克莫司后过滤，将滤出的他克莫司加无水乙醇溶解，并精密过滤后浓缩至干品；
（4）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入1～4体积份的无水乙醇中加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入他克莫司晶种，搅拌冷却，静置6～10h，3～5℃冷藏10～14h，至结晶完全；
（5）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入55～65%的乙醇洗涤、抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2～3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空38～42℃干燥21～24h，即得；
所述重量份与所述体积份的关系为g/ml的关系。
2.根据权利要求1所述制备高纯度他克莫司的工艺，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取干燥的他克莫司粗品1重量份加入8体积份的四氢呋喃中，水浴回流加热至55～65℃直至溶解，停止加热后，加入12体积份的纯水得到他克莫司浓度为45～55mg/ml的样品溶液，精密过滤得到所需的进样溶液；
（2）采用高压液相色谱分离所述进样溶液的他克莫司，所述色谱条件为：
色谱柱：C18反相色谱柱，
柱高为25cm，直径为30cm；径高比为1:0.83；
流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=4:1:7:0.01；
运行温度为40℃；
流速为3.5L/min；
检测波长为220nm；
收集出峰时间为23.16min下的流出液，并合并HPLC检测后单个杂质含量低于0.1%部分的他克莫司流出液；
（3）蒸发浓缩：将收集的所述流出液于65℃旋转蒸发，析出他克莫司后过滤，弃水将滤出的他克莫司加无水乙醇溶解，并精密过滤后浓缩至干品；
（4）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入2体积份的无水乙醇中，水浴加热65℃至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入他克莫司晶种，搅拌30min后冷却，静置8h，4℃冷藏结晶液12h，至结晶完全；
（5）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入60%的乙醇洗涤、抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2～3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空40℃干燥24h，即得。
3.根据权利要求 1或2所述的制备高纯度他克莫司的工艺，其特征在于，所述步骤（1）中，所述四氢呋喃的浓度为50%～100%。
4.根据权利要求 3所述的制备高纯度他克莫司的工艺，其特征在于，所述步骤（4）中，所述晶种的重量占所述他克莫司干品的0.01～0.02%。
5.根据权利要求1-2或4任一所述的制备高纯度他克莫司的工艺，其特征在于，所述步骤（1）之前还包括以中压层析柱对他克莫司粗品进行前处理以得到所述他克莫司粗品晶体的步骤。
6.根据权利要求5所述制备高纯度他克莫司的工艺，其特征在于，所述前处理步骤包括：
（a）取含他克莫司粗品加入2～4体积份的乙腈溶液，加热至溶解，缓慢加入2.5～3体积份纯水至溶液变浑浊且无油状物析出止，得到上柱溶液；
（b）采用中压反相层析柱分离所述上柱溶液，具体层析参数包括：
层析柱：C18反相层析柱，粒径为30-50um,所述层析柱柱高为60～100cm，直径为6cm～30cm；径高比为1:3～1:10；
流动相组成体积比为乙腈：水：乙酸=50～54:50～46:0.01～0.05；
运行温度：25～40℃；
装柱：装填好的层析柱用2～3倍柱体积的54～56%乙腈溶液以每小时2～3倍柱体积流速平衡；将上柱溶液以每小时0.4～0.6倍柱体积加入层析柱中；上柱样为所述填料重量的3%～6%，上柱样浓度为100～250mg/ml；
洗脱：用上述流动相溶液进行等度洗脱，流速为每小时0.25～1.2倍柱体积，洗脱1.5～2.5倍柱体积后开始分部收集，每次收集0.2～0.5柱体积，以TLC法进行检测，所述TLC检测条件为：
展开剂组成体积比为乙酸乙酯：己烷=3～5:5～7，展开板为硅胶薄层板，显色检测为紫外照射法，TLC检测到样品出现后，HPLC检测，HPLC检测条件为：
分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=3～5:0.5～1.5：6～8:0.01～0.05，运行温度为20℃～50℃，流速为1mL/min～5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19～24min，收集含有他克莫司的流分；
（c）将上述收集的各部分流出液分别蒸发浓缩：蒸发温度为60～70℃，析出他克莫司，过滤，滤出的他克莫司用无水乙醇溶解后，浓缩至干品；
（d）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入1～4体积份的无水乙醇中，加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入他克莫司晶体，搅拌冷却，静置6～10h，3～5℃冷藏10～14h，至结晶完全；
（e）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入体积比为55～65%的乙醇洗涤，抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2～3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空38～42℃干燥21～24h，即得用于高压制备柱层析的他克莫司粗品晶体样品。
7.根据权利要求6所述制备高纯度他克莫司的工艺，其特征在于，所述前处理步骤包括如下步骤：
（a）取含他克莫司粗品加入3体积份的乙腈溶液中，加热至溶解，缓慢加入2.8体积份纯水至溶液变浑浊且无油状物析出止，得到上柱溶液；
（b）采用中压反相层析柱分离所述上柱溶液，具体层析参数包括：
层析柱：C18反相层析柱，粒径为40um，所述层析柱柱高为100cm，直径为30cm；径高比为1:3.33；
流动相组成体积比为乙腈：水：乙酸=52:48:0.01；
运行温度：40℃；
装柱：装填好的层析柱用2倍柱体积的55%乙腈溶液以每小时2倍柱体积流速平衡；将上柱溶液以每小时0.5倍柱体积加入层析柱中；上柱样为所述填料重量的4%，上柱样浓度为180mg/ml；
洗脱：随后用上述流动相溶液进行等度洗脱，流速为每小时1倍柱体积，洗脱2倍柱体积后开始分部收集，每次收集0.3倍柱体积，以TLC法进行检测，所述TLC检测条件为：
展开剂组成体积比为乙酸乙酯：己烷=3:7，展开板为硅胶薄层板，显色检测为紫外照射法，TLC检测到样品出现后；HPLC检测，HPLC检测条件为：
分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=4:1:7:0.01，运行温度为40℃，流速为3.5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，收集含有他克莫司的流份；
（c）将上述收集的各部分流出液分别蒸发浓缩：蒸发温度为65℃，析出他克莫司，过滤，滤出的他克莫司用无水乙醇溶解后，浓缩至干；
（d）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入2体积份的无水乙醇中，加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入他克莫司晶体，搅拌冷却，静置8h，4℃冷藏12h，至结晶完全；
（e）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入体积比为60%的乙醇溶液中洗涤，抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2～3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空40℃干燥24h，即得用于高压制备柱层析的他克莫司粗品晶体样品。
8.根据权利要求5所述制备高纯度他克莫司的工艺，其特征在于，所述前处理步骤包括：
（A）取含他克莫司粗品加入2～4体积份的乙腈溶液，加热至溶解，缓慢加入2.5～3体积份纯水至溶液变浑浊且无油状物析出止，得到上柱溶液；
（B）采用中压反相层析柱分离所述上柱溶液，具体层析参数包括：
层析柱：C18反相层析柱，粒径为30-50um，所述层析柱柱高为60～100cm，直径为6cm～30cm；径高比为1:3～1:10
流动相组成为乙腈：水：乙酸；
运行温度：25～40℃；
装柱：装填好的层析柱用2～3倍柱体积的54～56%乙腈溶液以每小时2～3倍柱体积流速平衡；将上柱溶液以每小时0.4～0.6倍柱体积加入层析柱中；上柱样为所述填料重量的3%～6%，上柱样浓度为100～250mg/ml；
洗脱：用流动相溶液进行梯度洗脱，具体洗脱程序为，用体积比为52:48:0.01的乙腈、水和乙酸组成的流动相洗脱1～2倍柱体积，再用体积比为54:46:0.01的乙腈、水和乙酸组成的流动相洗脱1～2倍柱体积，再用体积比为56:44:0.01的乙腈、水和乙酸组成的流动相洗脱1～2倍柱体积，每次洗脱流速均为每小时0.8～1.2倍柱体积，洗脱1.5～2.5倍柱体积后开始分部收集，每次收集0.2～0.5倍柱体积，以TLC法进行检测，所述TLC检测条件为：
展开剂组成体积比为乙酸乙酯：己烷=3～5:5～7，展开板为硅胶薄层板，显色检测为紫外照射法，TLC检测到样品出现后，以HPLC检测，HPLC检测条件为：
分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=3～5:0.5～1.5：6～8:0.01～0.05，运行温度为20℃～50℃，流速为1mL/min～5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，收集含有他克莫司的流份；
（C）将上述收集的各部分流出液分别蒸发浓缩：蒸发温度为60～70℃，析出他克莫司，过滤，滤出的他克莫司用无水乙醇溶解后，浓缩至干品；
（D）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入2～4体积份的无水乙醇中，加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入上述浓缩的他克莫司干品研磨成的细粉的晶体作为晶种，搅拌冷却，静置6～10h，3～5℃冷藏10～14h，至结晶完全；
（E）干燥：取析出的所述他克莫司晶体加入体积比为55～65%的乙醇洗涤，抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2～3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空38～42℃干燥21～24h，即得用于高压制备柱层析的他克莫司粗品晶体样品。
9.根据权利要求8所述的制备高纯度他克莫司的工艺，其特征在于，所述前处理步骤包括：
（A）取含他克莫司粗品加入3体积份的乙腈溶液，加热至溶解，缓慢加入2.8体积份纯水至溶液变浑浊且无油状物析出止，得到上柱溶液；
（B）采用中压反相层析柱分离所述上柱溶液，具体层析参数包括：
层析柱：C18反相层析柱，粒径为40um，所述层析柱柱高为100cm，直径为30cm；径高比为1:3.33
流动相组成为乙腈：水：乙酸；
运行温度：40℃；
装柱：装填好的层析柱用2倍柱体积的55%乙腈溶液以每小时2倍柱体积流速平衡；将上柱溶液以每小时0.5倍柱体积加入层析柱中；上柱样为所述填料重量的4%，上柱样浓度为180mg/ml；
洗脱：用由乙腈、水和乙酸组成的流动相溶液梯度洗脱，具体洗脱程序为，以体积比为52:48:0.01的乙腈、水和乙酸组成的流动相洗脱2倍柱体积，再用体积比为54:46:0.01的乙腈、水和乙酸组成的流动相洗脱2倍柱体积，再用体积比为56:44:0.01的乙腈、水和乙酸组成的流动相洗脱1.5倍柱体积，每次洗脱程序的流速为每小时1倍柱体积，洗脱2倍柱体积后开始分部收集，每次收集0.3倍柱体积，进行TLC检测，所述TLC检测条件为：
展开剂组成体积比为乙酸乙酯：己烷=3:7，展开板为硅胶薄层板，显色检测为紫外照射法，TLC检测到样品出现后，HPLC检测，HPLC检测条件为：
分析型色谱柱：C18反相色谱柱，粒径5um，柱子规格4.6*250mm，流动相组成体积比为四氢呋喃：乙腈：水：乙酸=4:1：7:0.01，运行温度为40℃，流速为3.5mL/min，检测波长为220nm，出峰时间为19-24min，收集含有他克莫司的流份；
（C）将上述收集的各部分流出液分别蒸发浓缩：蒸发温度为65℃，析出他克莫司，过滤，滤出的他克莫司用无水乙醇溶解后，浓缩至干品；
（D）结晶：取浓缩后的他克莫司干品加入2体积份的无水乙醇中，加热至溶解，滴加纯水至微浑浊且静置不澄清，返滴加无水乙醇至刚刚澄清即停止，加入上述浓缩的他克莫司干品重量0.01%～0.02%研磨成细粉的晶体作为晶种，搅拌冷却，静置8h，4℃冷藏12h，至结晶完全；
（E）干燥：所述他克莫司晶体经体积比为60%的乙醇洗涤，抽滤，真空除去洗涤液，然后再将洗涤液与晶体混合，重复洗涤2～3次，抽干洗涤液，得到的晶体真空40℃干燥24h，即得用于高压制备柱层析的他克莫司粗品晶体样品。
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