CN108250216A - 一步精制他克莫司粗品中他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种一步精制他克莫司粗品中他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素的方法，步骤如下：将他克莫司粗品展层于装有特制填料体的不锈钢层析柱柱头，用溶剂：水为60；40,酸调PH值为4.5加展层剂5％为洗脱剂进行层析洗脱，分布收集，浓缩纯品，结晶，重结晶得他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素纯品。本发明方法得到的他克莫司，双氢他克莫司，子囊霉素检测HPLC纯度〉98％，本发明操作方便，工艺简单，成本低廉，已运用与中试投产，非常适合工业化生产。

Description

一步精制他克莫司粗品中他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素 的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及发酵产物分离，纯化方法，特别涉及到一步精制他克莫司粗品中药效组分他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素的方法。

背景技术

他克莫司(tacrolimus,FK506)是由日本藤泽药品工业公司在1984年自日本筑波山土壤中分离的筑波链霉菌(streptomyces tsukubaensis)No.9993的发酵液中提取得到的一种新型二十三元大环内酯聚酮免疫抑制剂。临床研究表明，其免疫抑制活性是传统免疫剂环孢素A的10-100倍。目前已广泛应用于肝脏，骨髓移植，对其它药物耐药肾移植的排斥防治，白塞氏病，变性性皮炎，银屑病，鱼鳞病，斑秃，类风湿性关节炎，牛皮藓，多发性硬化病，糖尿病等多种自身免疫疾病的治疗。自在中国上市的短短时间内，市场份额迅速上升，已成为肝脏及肾移植后排斥反应的临床一线药物。子囊霉素(FK520)是发酵他克莫司的副产物，也是一种生物免疫抑制剂，可作为多种新药物的中间体，开发成功典型的有吡美莫司。近年市场需求量逐年上升。双氢他克莫司也是发酵他克莫司中的一个副产物，国外也作为新药的中间体来开发新型抗癌药物，抑制剂等。

国内在提取精制他克莫司时几乎没有厂家研究一步精制他克莫司药效组分他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素的方法。国外分离提取他克莫司时也未报道一步精制他克莫司药效组分他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素的研究，而且其在分离精制他克莫司时工艺往往复杂，用到两部或多部层析提纯，溶媒消耗多，产品收率少，关键是不能得到小产物子囊霉素及双氢他克莫司纯品物。一步精制高效他克莫司药效组分他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素在国内外未见报道，此技术研究尚属空白。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的缺陷或不捉，提供一种采用一步精制他克莫司粗品中药效组分他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素的独特方法。

本发明的技术方案为：

本发明为利用自主设计的不锈钢层析柱,高经比1：10，内置特制树脂填料体为层析柱。将80％含量的他克莫司粗粉通过特制溶剂溶解并过滤后定溶于他克莫司粗品含量为30万单位/ml由柱头上样，洗脱剂洗脱，分布收集他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素单组份，将纯组分浓缩后结晶，重结晶。他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素检测HPLC纯度都〉98％。本发明操作方便，工艺简单，成本低廉，收率高。已运用与中试投产，非常适合工业化生产。

本发明的具体技术方案：

一步法提纯精制他克莫司粗品中他克莫司，子囊霉素，双氢他克莫司的新方法其特征在于设计一种不锈钢层析柱,高经比1：10，内置特制树脂填料体为层析柱。将80％含量的他克莫司粗粉通过特制溶剂溶解并过滤后定溶于他克莫司粗品含量为30万单位/ml由柱头上样，分布收集他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素单组份，将纯组分浓缩后结晶，重结晶，他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素检测HPLC纯度〉98％。

具体步骤如下：

1)根据他克莫司，子囊霉素，双氢他克莫司分子结构及其物性开发出150目聚苯乙烯-二乙烯苯基质高分子网状结构微球。该多孔微球设计原理根据他克莫司，子囊霉素，双氢他克莫司分子结构中含双键数目的多少形成各自配合物，双键多的结合力牢固与双键较少的，利用合适洗脱剂最终会将其完全分离。首先将特制的多孔微球填料用含5％酸浸泡过夜，然后进行淋洗通柱，继用3-4倍树脂体积同浓度的酸溶液通柱，然后用净水洗至中性；再用5％氢氧化钠溶液浸泡过夜，最后淋洗通柱；用同样浓度的3-4倍树脂体积的氢氧化钠浓液通柱，最后用净水洗至PH为中性。

2)将酸碱处理后的中性特制树脂浸泡在乙醇中浸泡4小时，然后用甲醇置换浸泡4小时并用甲醇淋洗至出液与纯水互混不浑浊为好。

3)配置溶剂：水为55；45,用酸调PH值为4.5加药用展层剂5％置换并浸泡12小时，将药用展层剂充分吸附于树脂填料体，形成特殊层析填料柱，再用溶剂：水为60；40,酸调PH值为4.5加展层剂5％为洗脱剂进行树脂填料平衡，做成备用层析柱。

4)将80％含量的他克莫司粗粉通过特制溶剂溶解并过滤后定溶于他克莫司粗品含量为30万单位/ml，由柱头上样，用5倍层析柱体积的洗脱剂进行洗脱，分布收集他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素单活性组份。

5)真空浓缩他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素各活性组分，回收溶剂，产品不溶于水而产生沉淀，将含沉淀产物的水溶液用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯用量与水溶液体积为1：1，将含产物的乙酸乙酯液浓缩至30万单位/ML，加无水硫酸钠脱水，过滤，再浓缩产物至油膏状。

6)将纯产物油膏用无水乙醇溶解至30万单位/ML，加粉目活性炭脱色45分钟后过滤。脱色滤液再次浓缩产物至油膏状用乙醇溶液作结晶剂，常温结晶得到他克莫司，子囊霉素及双氢他克莫司结晶品。用乙醚重结晶并洗晶后的得到纯品。

有益效益：

采用开发150目聚苯乙烯-二乙烯苯基质高分子网状结构微球层析填料，加展层剂于甲醇：水洗脱剂中一步精制他克莫司粗品中药效组分他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素的方法操作方便，工艺简单，成本低廉，产品纯度高，收率多。已运用与中试投产，非常适合工业化生产。

附图说明

图1：本发明中子囊霉素的液相色谱图；

图2：本发明中他克莫司的液相色谱图；

图3：本发明中双氢他克莫司的液相色谱图。

具体实施方式

本发明提供一种一步精制他克莫司粗品中药效组分他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素的方法，下面列举实施例予以进一步说明。

1)在不锈钢层析柱中填装150目自制聚苯乙烯-二乙烯苯基质高分子网状结构微球层析填料，配置洗脱剂溶液：甲醇：水60：40，加药用展层剂5％KH2PO4后用磷酸调PH＝4.5。配置总量为5倍不锈钢层析柱体积。用一倍层析柱床体积的洗脱剂进行通柱平衡。

2)将80％含量的他克莫司粗粉用80％甲醇溶液50度条件下充分溶解至他克莫司浓度为25万单位/mL，加药用展层剂5％KH2PO4溶解后过滤的上柱物料。

3)将层析柱下柱流速控好，由层析柱柱头将溶解过滤好后的粗粉溶液缓缓均匀地加入后通柱层析。

4)用分布收集器按2小时为一个收集单位进行分布收集，将分布收集得到的单组份进行浓缩去除甲醇。

5)脱除甲醇后产品溶液因微溶于水而沉淀，用总量1:1体积的乙酸乙酯分别萃取3次，收集乙酸乙酯产品相，浓缩脱除多余乙酸乙酯至30万单位/ML产品浓度，加无水硫酸钠搅拌干燥。

6)将去除水份的乙酸乙酯产品相真空浓缩，去除乙酸乙酯至油膏体出现，将纯产物油膏用无水乙醇溶解至30万单位/ML，加粉目活性炭脱色45分钟后过滤。脱色滤液再次浓缩产物至油膏状用乙醇溶液作结晶剂，常温结晶得到他克莫司，子囊霉素及双氢他克莫司结晶品。用乙醚重结晶并洗晶后的得到纯品。产品纯度〉98％，收率80％

实例2

1)在不锈钢层析柱中填装150目自制聚苯乙烯-二乙烯苯基质高分子网状结构微球层析填料，配置洗脱剂溶液：丙酮：水60：40，加药用展层剂5％KH2PO4后用磷酸调PH＝4.5。配置总量为5倍不锈钢层析柱体积。用一倍层析柱床体积的洗脱剂进行通柱平衡。

2)将80％含量的他克莫司粗粉用80％丙酮溶液50度条件下充分溶解至他克莫司浓度为25万单位/mL，加药用展层剂5％KH2PO4溶解后过滤的上柱物料。

3)将层析柱下柱流速控好，由层析柱柱头将溶解过滤好后的粗粉溶液缓缓均匀地加入后通柱层析。

4)用分布收集器按2小时为一个收集单位进行分布收集，将分布收集得到的单组份进行浓缩去除丙酮。

5)脱除丙酮后产品溶液因微溶于水而沉淀，用总量1:1体积的乙酸乙酯分别萃取3次，收集乙酸乙酯产品相，浓缩脱除多余乙酸乙酯至30万单位/ML产品浓度，加无水硫酸钠搅拌干燥。

6)将去除水份的乙酸乙酯产品相真空浓缩，去除乙酸乙酯至油膏体出现，将纯产物油膏用无水乙醇溶解至30万单位/ML，加粉目活性炭脱色45分钟后过滤。脱色滤液再次浓缩产物至油膏状用乙醇溶液作结晶剂，常温结晶得到他克莫司，子囊霉素及双氢他克莫司结晶品。用乙腈重结晶并洗晶后的得到纯品。产品纯度〉98％，收率90％

实例3

1)在不锈钢层析柱中填装150目自制聚苯乙烯-二乙烯苯基质高分子网状结构微球层析填料，配置洗脱剂溶液：1)丙酮：水57：43，加药用展层剂5％KH2PO4后用磷酸调PH＝4.5，体积为3个柱床体积。2)配置洗脱剂溶液：丙酮：水62：38，加药用展层剂5％KH2PO4后用磷酸调PH＝4.5体积为2个柱床体积3)配置洗脱剂溶液：丙酮：水70：30，加药用展层剂5％KH2PO4后用磷酸调PH＝4.5，体积为1.5个柱床体积。首先用丙酮：水57：43一倍层析柱床体积的洗脱剂进行通柱平衡。

2)将80％含量的他克莫司粗粉用80％丙酮溶液50度条件下充分溶解至他克莫司浓度为25万单位/mL，加药用展层剂5％KH2PO4溶解后过滤的上柱物料。

3)将层析柱下柱流速控好，由层析柱柱头将溶解过滤好后的粗粉溶液缓缓均匀地加入后通柱层析。

4)用分布收集器按2小时为一个收集单位进行分布收集，将分布收集得到的先下柱单组份他克莫司回收。

5)用丙酮：水62：38，加药用展层剂5％KH2PO4后用磷酸调PH＝4.5的洗脱剂继续洗脱，分布收集得到子囊霉素单组份。

6)用丙酮：水70：30，加药用展层剂5％KH2PO4后用磷酸调PH＝4.5的洗脱剂继续洗脱，分布收集得到双氢他克莫司单单组份。

7)将回收到的单组份进行分别真空浓缩，脱除丙酮后产品溶液因微溶于水而沉淀，用总量1:1体积的乙酸乙酯分别萃取3次，收集乙酸乙酯产品相，将多余乙酸乙酯真空去除，至产品在乙酸乙酯中浓度为30万单位/ML，加无水硫酸钠搅拌2小时去除残余水分后过滤。

6)将去除水份的乙酸乙酯产品相真空浓缩，去净乙酸乙酯至油膏体出现，将纯产物油膏用无水乙醇溶解至30万单位/ML，加粉目活性炭脱色45分钟后过滤。脱色滤液再次浓缩产物至油膏状用乙醇溶液作结晶剂，常温结晶得到目标产物，将白色产物放置40度真空干燥箱内真空干燥24小时的他克莫司结晶品。用乙腈重结晶并用异丙醚洗晶后的得到他克莫司纯品。产品纯度〉98％，收率大于85％。

Claims (5)

1.一种一步精制他克莫司粗品中他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素的方法，其特征在于：步骤如下：

将他克莫司粗品展层于装有特制填料体的不锈钢层析柱柱头，用溶剂：水为60；40,酸调PH值为4.5加展层剂5％为洗脱剂进行层析洗脱，分布收集，浓缩纯品，结晶，重结晶得他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素纯品。

2.根据权利要求1所述的一步精制他克莫司粗品中他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素的方法，其特征在于：具体步骤如下：

1)将特制树脂填料用含5％酸浸泡过夜，然后进行淋洗通柱，继用3-4倍树脂体积同浓度的酸溶液通柱，然后用净水洗至中性；再用5％氢氧化钠溶液浸泡过夜，最后淋洗通柱；用同样浓度的3-4倍树脂体积的氢氧化钠浓液通柱，最后用净水洗至PH为中性；

2)将酸碱处理后的中性特制树脂浸泡在乙醇中浸泡4小时，然后用甲醇置换浸泡4小时并用甲醇淋洗至出液与纯水互混不浑浊为好；

3)配置溶剂：水为55；45,用酸调PH值为4.5加药用展层剂5％置换并浸泡12小时，将药用展层剂充分吸附于树脂填料体，形成特殊层析填料柱，再用溶剂：水为60；40,酸调PH值为4.5加展层剂5％为洗脱剂进行树脂填料平衡，做成备用层析柱；

4)将80％含量的他克莫司粗粉通过特制溶剂溶解并过滤后定溶于他克莫司粗品含量为30万单位/ml，由柱头上样，用5倍层析柱体积的洗脱剂进行洗脱，分布收集他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素单活性组份；

5)真空浓缩他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素各活性组分，用醇溶液作结晶剂，常温结晶得到他克莫司，子囊霉素及双氢他克莫司结晶品；用乙醚重结晶并洗晶后的得到纯品。

3.根据权利要求2所述的一步精制他克莫司粗品中他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素的方法，其特征在于：所述步骤1)中特制树脂填料为自制高分子多孔微球。

4.根据权利要求2所述的一步精制他克莫司粗品中他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素的方法，其特征在于：所述步骤2)所用的酸为硝酸。

5.根据权利要求2所述的一步精制他克莫司粗品中他克莫司、双氢他克莫司、子囊霉素的方法，其特征在于：所述步骤3)中所用溶剂为甲醇，所用酸为磷酸，展层剂为磷酸二氢钾。