CN100596297C - 从石蒜属植物中提取力可拉敏的工艺方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从石蒜属植物中提取力可拉敏的工艺方法，主要是从石蒜属植物提取出的生物碱中，有效地分离得到力可拉敏精品的方法，是一种由酶技术与层析法相结合的方法，包括提取和分离粗石蒜碱的工艺步骤和工艺条件，然后利用沉淀分离粗石蒜碱的滤液进行萃取、浓缩、制备上柱物料，装柱、洗脱、浓缩、重结晶工艺步骤制备纯度99%以上力可拉敏精品，本发明不同于完全用有机溶剂萃取提取力可拉敏的方法，本发明工艺可同时获得粗石蒜碱、粗加兰他敏和纯度大于99%的力可拉敏。

Description

从石蒜属植物中提取力可拉敏的工艺方法

技术领域：

本发明涉及从石蒜属植物中提取有效药用成分的方法。主要是从石蒜属植物提取出的石蒜科生物碱中，有效地分离得到力可拉敏的方法。

背景技术：

力可拉敏，英文名：Lycoramine.别名：二氢加兰他敏(Dihydrogalantnamine)，石蒜胺碱。其结构式如下图所示：

力可拉敏具有胆碱酯酶抑制剂的药理特性，它是可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂。可用于治疗重症肌无力，脊髓灰质炎后遗症性瘫痪，脑血管意外所致的偏瘫，坐骨神经炎等症状，属神经系统类药物，且在该领域有着十分重要的用途。力可拉敏的结构类似加兰他敏，但两者的作用强度和毒性均不相同。它的急性毒性比加兰他敏小，作用强度弱于加兰他敏，故治疗指数接近或更高。

力可拉敏常常并存于国产石蒜中，主要是从分布在石蒜属、雪花莲属、文殊兰属、水仙属、网球花属、水鬼蕉属等领域的天然植物中提取分离出来的有效药用成分。其中以石蒜属植物最具代表性。

现有技术从植物提取物中分离力可拉敏的方法主要是有机溶剂萃取法。即利用亲脂性生物碱溶于亲脂性有机溶剂，而其盐溶于水的性质，以及总生物碱中各种单体生物碱之间碱性的差异，在不同的pH条件下进行分离。运用该法提取、分离力可拉敏却存在有机溶剂消耗大、萃取过程中易发生乳化现象影响分离提取效果等缺点和不足。

结合现代生物技术中，层析法在多组分混合物分离纯化过程中的应用，以及石蒜科生物碱力可拉敏的特性，本发明采用酶解法及吸附剂柱层析法，从含石蒜属植物中有效地提取分离得到高纯度的力可拉敏纯品结晶。上述专利文献和非专利文献均未见到与本发明相同的力可拉敏原料药生产方法的记载。

发明内容：

从石蒜属植物中提取得到的石蒜科生物碱中主要含有石蒜碱(Lycorine)、加兰他敏(Galanthamine)、力可拉敏(Lycoramine)等数十种生物碱，本发明提供一种利用酶技术与柱层析法相结合的办法来提取其中有效药用成分力可拉敏的工艺方法，运用本法可分离得到高纯度的力可拉敏纯品结晶，同时还制取粗加兰他敏和粗石蒜碱。

本发明的任务是按以下技术方案实现的。

石蒜属植物鳞茎经清洗、切片、加水后用纤维素复合酶对其进行酶解处理，目的是将其细胞壁分解，酶解后经过滤、调PH、离心过滤、萃取、浓缩、反萃取、调碱、抽滤等一系列工艺过程后，将粗石蒜碱分离，沉淀分离粗石蒜碱后的滤液中含力可拉敏和加兰他敏及其他一些杂质，将粗石蒜碱沉淀分离后的滤液经萃取、浓缩、制备上柱物料、装柱、梯度洗脱，分别得力可拉敏粗品和加兰他敏粗品，将力可拉敏粗品浓缩干燥，重结晶得到纯度大于99％的力可拉敏纯品结晶。

本发明在获得石蒜碱粗品前的工艺步骤和工艺条件与本发明人另一个专利申请《从石蒜属植物中提取石蒜碱的工艺方法》申请号200610051215.1相同，其后利用沉淀分离粗石蒜碱后的含力可拉敏、加兰他敏和一些杂质的滤液用乙酸乙酯反复萃取至滤液中无力可拉敏为止，萃取液减压浓缩烘干得浸膏，用浸膏和氧化铝混合研磨制备上柱物料，将上柱物料装上氧化铝层析柱，用洗脱液如乙醚或环己烷——甲醇——二乙胺或乙醚——甲醇——氨水或二氯甲烷——甲醇——氨水洗脱，收集含力可拉敏组分的洗脱液并浓缩得力可拉敏粗品，将力可拉敏粗品经丙酮溶解、过滤结晶直至得到力可拉敏精品。还可收集含加兰他敏的洗脱液并干燥得加兰他敏粗品。

前面所述的纤维素复合酶，是木霉经发酵提取而得的一种复合酶(含C₁酶、Cx酶、β-葡萄糖苷酶；还有半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶等)，其作用是降解植物纤维，使纤维转化为葡萄糖。作用条件：最适温度45～55℃；最适PH4.0～5.5；固体酶：浅黄色，酶活力1500u/g以上；液体酶：浅褐色液体，酶活力2000u/ml以上。本实验采用的是液体纤维素复合酶。

前面所述的层析法，是一种物理分离方法，可以用于分离纯化和鉴定中药有效成分。根据其分离原理可分为：吸附层析法、离子交换层析法、柱层析法、纸层析法和薄层层析法等。常采用吸附柱层析法分离纯化生物碱成分，吸附柱层析法是利用被分离物质在吸附剂上被吸附能力的不同，用溶剂洗脱使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质，其中，硅胶：多孔，微酸，其吸附稍弱于氧化铝，关于氧化铝，根据其制备和处理方法差异，分为碱性，中性和酸性，其中碱性氧化铝适用于碳氢化合物，生物碱以及其它碱性氧化物的分离。

本发明根据力可拉敏的性质选用碱性氧化铝柱层析，装柱后，各种成分吸附在吸附剂上，选用合适的洗脱液对柱进行洗脱，可用接于层析柱出口处的各种检测器对流份进行检测，也可收集流出液后采用适宜方法检测，根据检测结果或根据各成份的比移值Rf不同，可收集得到所需的有效成份。

本发明基本工艺流程见说明书附图1。

附图说明

附图1.从石蒜属植物中提取力可拉敏工艺流程图；从图可知，工艺步骤为：

1.酶解：将黄花石蒜鲜球茎经清洗后切片，放入多功能提取罐中，放入4倍重的水，加入液体纤维素酶，加入量1.3L/100Kg原料，酶活力2000u/ml以上，在多功能提取罐中酶解6小时，酶解温度40～55℃，被酶解溶液PH4.0～5.5。

2.过滤：将酶解后的酶解液过滤，弃滤渣，(滤渣可转化成肥料用)，保留滤液。

3.调滤液PH：用40％的NaoH溶液调滤液PH至9～10，使滤液混浊。

4.离心分离：将混浊液用GQ75高速管式分离机离心分离，弃离心渣(离心渣可转化成肥料用)，取清液。

5.萃取：用3倍体积的乙酸乙酯分数次萃取离心分离后的清液，最后弃水相，保留有机相，废弃的水相可排放到沉淀池，调其PH达到7，放置24小时后排放。

6.浓缩：将有机相浓缩至原体积的0.6～0.7％。

7.反萃取：用2％的稀硫酸溶液对浓缩后的乙酸乙酯有机相进行反萃取，2％稀硫酸体积为乙酸乙酯体积的一半，分三次反萃取，保留酸水相，有机相乙酸乙酯作回收再用。

8.调碱：用40％NaoH溶液调酸水相PH至9～10，产生粗石蒜碱沉淀。

9.抽滤：将调PH9～10后的溶液经抽滤，滤液可用作提取力可拉敏和加兰他敏，沉淀为石蒜碱粗品。以上工艺和工艺条件请看另一专利申请《从石蒜属植物中提取石蒜碱的工艺方法》，申请号200610051215.1。

10.萃取滤液：以乙酸乙酯做萃取剂，分六次对上述滤液进行萃取，直至被萃取液中无力可拉敏为止，保留有机相，弃水相。

11.浓缩：对萃取所得的有机相进行减压浓缩，烘干得到成分为含力可拉敏、加兰他敏和部分杂质的总生物碱浸膏，回收有机溶剂。

12.制备上柱物料：每100g总生物碱浸膏加120g氧化铝研磨混匀，加水拌匀，水量为氧化铝重的6％制成上柱物料。

13.装柱：将称量好的氧化铝，加6％的水，拌匀装入层析柱中，再装入上柱物料，装料必须密实，最后在其顶部覆盖一层厚约0.5cm石英砂(或滤纸或棉花)，要求柱中无空气泡；

14.梯度洗脱及洗脱流份的检测与收集，将制备好的洗脱液自顶部加入层析柱中进行洗脱，流速2～3ml/min，采用优选梯度洗脱法进行洗脱，所谓优选梯度洗脱法是指流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中溶剂的组成比例来改变流动相的极性，使每个流出组分都有合适的容量因子，从而使吸附到吸附剂中的组分可在最短时间实现最佳的分离，在洗脱流份时，应进行有效物质力可拉敏或加兰他敏的跟踪检测，用薄层层析手段监测流出液洗脱情况，用碘作显色剂测加兰他敏，用碘化铋钾作显色剂测力可拉敏。

15.浓缩，将收集到的力可拉敏洗脱液在50～65℃减压蒸馏至干，得到力可拉敏粗品。

16.重结晶，用丙酮将力可拉敏粗产品完全溶解、过滤、除去不溶物，溶液在60℃加热5分钟，在0～50℃条件下结晶72小时，结晶物抽滤至干，重复进行重结晶，直至HPLC(高效液相色谱)分析力可拉敏含量大于99％为止。

附图2，实施例1、的力可拉敏高效液相色谱图；

附图3，实施例2、的力可拉敏高效液相色谱图；

附图4，实施例3、4的高效液相色谱图。

色谱条件：紫外检测波长232nm，PH＝9.0

流动相：甲醇-水-三乙胺(15∶85∶0.595)

扫尾剂：三乙胺(TEA)可降低色谱柱中少量裸露硅醇基的干扰.

附图5，力可拉敏样品的高效液相色谱图.

色谱条件：

紫外检测波长232nm，PH＝9.0

流动相：甲醇-水-三乙胺(15∶85∶0.595)，扫尾剂：三乙胺(TEA)可降低色谱柱中少量裸露硅醇基干扰。

力可拉敏标准来源于SIGMA公司。

从附图2、附图3、附图4和附图5可知，本产品通过高效液相色谱分析，从图谱判断，相同的色谱条件，样品出峰时间与标样相同，判断为同一物质力可拉敏，图谱上看，杂质峰很小，主峰单一，通过外标法计算，力可拉敏含量99.15％。

在上述工艺中，采用氧化铝层析柱，吸附剂用碱性氧化铝，活性级别为III级(氧化铝的活性分为I～V级，I级吸附作用太强，V级吸附作用太弱，本发明采用III～IV级洗脱液用乙醚或乙醚+甲醇+氨水或环己烷+氯仿+二乙胺或＝氯甲烷+甲醇+氨水。

本发明装柱操作：

氧化铝加入适量的水调成糊状，装入层析柱中，再装入上柱物料，装料必须密实，装料密实后在其顶部覆盖一层厚约0.5Cm的石英砂或用一张比柱直径略小的滤纸代替，石英砂盖上以免在淋洗时将装在顶上的上柱物料冲翻。吸附剂氧化铝活性和水含量关系如下表：

活性等级	I	II	III	IV	V
						氧化铝加水量(％)	0	3	6	10	15

层析柱中上柱物料与吸附剂氧化铝重量比为1∶7～10，柱高度可根据要分离成份比移值Rf的大小估算，比移值Rf可用纸层析或氧化铝薄层层析法实验求出，比移值Rf大小计算：

实验证明，用氧化铝薄层层析法在35℃时，以乙醚作展开剂，加兰他敏，Rf(g)＝0.73，力可拉敏Rf(L)＝0.44，若用乙醚作氧化铝层析柱洗脱液，要求加兰他敏和力可拉敏洗脱峰间距离为6Cm，则可估算出装柱高度约21Cm，层析柱高度的最后决定，要根据洗脱曲线，足以让干扰力可拉敏的物质与力可拉敏充分分开为止。

实验证明，本发明用碱性氧化铝粒度180～200目最佳，将III-IV级碱性氧化铝，通过100、150、180、200目的筛孔，分别制成0.2mm的薄层，以环己烷-氯仿-二乙胺(体积比5∶4∶1)作展开剂，结果证明粒度为180～200目的分离力可拉敏和加兰他敏的效果更好，高于200目效果会更好，但展开时间太长，如用作柱层析，则洗脱时间会拉得很长。

具体实施方式：

实施例1：取200Kg洗净的新鲜黄花石蒜球茎切片，浸于多功能提取罐中，加入1.3L液体纤维素酶(酶活力不低于2000u/ml)，再加入800Kg水，在温度55℃、PH＝5，酶解6小时。酶解完成后过滤，弃滤渣(滤渣可作肥料)，得滤液900Kg，将滤液用40％的氢氧化钠水溶液调酶解液PH9～10，至酶解液混浊。用GQ75高速管式分离机离心分离去渣(渣用作肥料)，得离心液880Kg，取离心液，用2540L乙酸乙酯平均分6次于萃取，萃取操作在萃取塔内进行连续萃取，取有机相，弃水相，废弃的水相可排放到沉淀池，调PH＝7放置24小时后排放(实施例中所有废弃的水相均采用此法处理至标准后排放)。将有机相用刮板薄膜浓缩器浓缩至10Kg左右，浓缩过程中回收乙酸乙酯，用2％硫酸水溶液15L分3次对浓缩液进行反萃取，取酸水相，回收有机相可重复使用。用40％的氢氧化钠溶液调节所得酸水相PH9～10，至溶液混浊，抽滤，沉淀为粗石蒜碱，用乙酸乙酯15L平均分6次萃取滤液，萃取操作在萃取塔中进行连续萃取，直至被萃取滤液中无力可拉敏为止，减压浓缩含力可拉敏的乙酸乙酯萃取液最后烘干得115g浸膏，经分析力可拉敏含量为40％，浓缩过程中回收有机溶剂。按100g浸膏加120g氧化铝吸附剂计算，115g浸膏拌入138g活动级别为III氧化铝，研磨混匀，加水为氧化铝重的6％拌匀，制成上柱物料，另外称取7倍重的180～200目活动级别为III级的碱性氧化铝1725g，加水为氧化铝重的6％拌匀装入层析柱，(柱直径φ8Cm，H82Cm)敲打密实后装入上柱物料，密实后在其顶部覆盖一层厚约0.5Cm的石英砂，装好柱后，用洗脱液洗脱，洗脱液配方为环己烷+氯仿+二乙胺(体积比5∶4∶1)，洗脱力可拉敏时，应跟踪检测，当PH＝4.4时，用稀碘化铋钾作显色液，收集洗脱力可拉敏流分，在65℃减压蒸馏至干，得力可拉敏粗品42g，用丙酮将力可拉敏粗产品溶解，过滤除去不溶物，滤液在60℃加热5分钟，在0～50℃条件下结晶72小时，结晶物抽提近干，重复进行重结晶直到力可拉敏含量大于99％为止.得精品21g，经高效液相色谱检验纯度大于99％，本发明产品高效液相色谱图，见附图2。

从上可知，前面在获得石蒜碱粗产品以前的全部工艺流程和工艺条件，同本发明人专利申请《从石蒜属植物中提取石蒜碱的工艺方法》申请号200610051215.1完全相同，只是其后增加在沉淀分离石蒜碱粗产品后的溶液中进一步提取力可拉敏的工艺步骤和条件，为叙述方便，以后实施例从沉淀分离粗石蒜碱后的工艺步骤叙述起。

实施例2：取石蒜经前加工所得的115g浸膏，经分析力可拉敏含量为40％，加兰他敏58％，在与138g活性级别III级的氧化铝(比例为1∶1.2，粒度180-200目)研磨混匀，加水为氧化铝重的6％，拌匀，制成上柱物料，称取7倍重活动级别为III级的碱性氧化铝1725g加入氧化铝重6％的水拌匀(比例为1∶7，粒度180-200目)装入层析柱(氧化铝粒度：180-200目，φ为8cm，长82cm)，敲打密实后装入上柱物料，密实后在其顶部覆盖一层厚约0.5cm的石英砂(或用一张比柱直径略小的滤纸代替)装好后用洗脱液进行洗脱，洗脱液为乙醚，洗脱液用薄层层析跟踪检测，收集含力可拉敏的洗脱液，在65℃减压蒸发至干，得力可拉敏粗品44g，粗品用丙酮进行两次结晶，得力可拉敏含量99％的精品22g，高效液相色谱分析图见说明书附图3。

实施例3：取石蒜经前加工所得的115g浸膏，在与138g活性级别III级的碱性氧化铝(比例为1∶1.2，粒度180-200目)研磨混匀，加入氧化铝重6％的水拌匀，制成上柱物料，称取7倍重活性级别为III级的碱性氧化铝1725g加入氧化铝重6％的水拌匀，(比例为1∶7，粒度180-200目)装入层析柱(氧化铝粒度：180-200目，φ为8cm，长82cm)，敲打密实后装入上柱物料，密实后在其顶部覆盖一层厚约0.5cm的石英砂(或用一张比柱直径略小的滤纸代替)装好后用洗脱液进行洗脱，洗脱液配方为乙醚-甲醇-氨水(100∶10∶0.5)，洗脱液用薄层层析跟踪检测，收集含力可拉敏的洗脱液，在65℃减压蒸发至干，得力可拉敏粗品46g，粗品用丙酮进行两次结晶，得力可拉敏含量99％的精品23g，产品高效液相色谱图见说明书附图4。

实施例4：取石蒜经前加工所得的115g浸膏，在与1388活性级别III级的碱性氧化铝(比例为1∶1.2，粒度180-200目)研磨混匀，加氧化铝重6％的水拌匀制成上柱物料，称取1725g活性级别III级的碱性氧化铝(比例为1∶7，粒度为180-200目)加氧化铝重6％的水拌匀，装入层析柱(氧化铝粒度：180-200目，φ为8cm，长82cm)，敲打密实后装入上柱物料，密实后在其顶部覆盖一层厚约0.5cm的石英砂(或用一张比柱直径略小的滤纸代替)装好后用洗脱液进行洗脱，洗脱液配方为二氯甲烷-甲醇-氨水(90∶10∶0.5)，洗脱液用薄层层析跟踪检测，收集含力可拉敏的洗脱液，在65℃蒸发减压至干，得力可拉敏粗品40g，粗品用丙酮进行两次结晶，得力可拉敏含量99％的精品20g。产品高效液相色谱图见说明书附图4。

本发明用硅胶代替氧化铝作吸附剂，同样能获得力可拉敏和加兰他敏，但效果不如氧化铝。

本发明不同于完全用有机溶剂萃取法提取力可拉敏的方法，采用萃取和层析柱相结合的方法生产力可拉敏，克服了有机溶剂消耗大，萃取过程中易发生乳化现象影响分离提取效果的缺点，本工艺从石蒜属植物中将生产粗石蒜碱，生产力可拉敏和粗加兰他敏变成一条流水线，原料酶解提取后一次可得三种产品。从石蒜属植物中有效提取分离得到高纯度的力可拉敏纯品结晶，具有得率高，省原材料，省工时，操作简便等优点，适应工业化生产要求。

Claims (8)

1.一种从石蒜属植物中提取力可拉敏的方法，其是一种由酶技术与层析法相结合的方法，包括提取和分离粗石蒜碱的工艺步骤和工艺条件，其特征在于利用沉淀分离粗石蒜碱后的滤液进行萃取、浓缩、制备上柱物料、装柱、梯度洗脱及力可拉敏流份的检测与收集、浓缩、重结晶工艺步骤后制备纯度为99.15％力可拉敏精品，其中利用沉淀分离粗石蒜碱后滤液的制备方法为：将石蒜属植物鳞茎经清洗、切片、加水后用纤维素复合酶对其进行酶解，经过滤、调PH、离心过滤、萃取、浓缩、反萃取、调碱和抽滤一系列过程后，将粗石蒜碱分离，分离粗石蒜碱后的工艺步骤，操作条件包括萃取剂是乙酸乙酯，反复萃取至滤液中无力可拉敏为止，萃取液减压浓缩烘干得浸膏，用浸膏和吸附剂碱性氧化铝混合研磨制备上柱物料，将上柱物料装上装有吸附剂碱性氧化铝的层析柱、用洗脱液进行洗脱，收集含力可拉敏洗脱液并浓缩干燥得力可拉敏粗品，将力可拉敏粗品经丙酮溶解、过滤、重结晶直至得到力可拉敏精品，所述洗脱液为乙醚、由环己烷、氯仿和二乙胺混合组成的洗脱液、由乙醚、甲醇和氨水混合组成的洗脱液或者由二氯甲烷、甲醇和氨水混合组成的洗脱液，所述混合组成洗脱液各组分的体积比为：环己烷∶氯仿∶二乙胺＝5∶4∶1；乙醚∶甲醇∶氨水＝100∶10∶0.5；二氯甲烷∶甲醇∶氨水＝90∶10∶0.5。

2.根据权利要求1所述的从石蒜属植物中提取力可拉敏的方法，其特征是用浸膏和吸附剂碱性氧化铝混合研磨制备的上柱物料中，浸膏重∶氧化铝重＝1∶1.2，加氧化铝重6％的水拌匀。

3.根据权利要求1所述的从石蒜属植物中提取力可拉敏的方法，其特征是氧化铝层析柱中，吸附剂氧化铝重∶上柱物料重＝7～10∶1，加氧化铝重6％的水拌匀。

4.根据权利要求1或2或3所述的从石蒜属植物中提取力可拉敏的方法，其特征是碱性氧化铝的活性为III～IV级、粒度180～200目。

5.根据权利要求1所述的从石蒜属植物中提取力可拉敏的方法，其特征是洗脱液流速为2～3ml/min。

6.根据权利要求1所述的从石蒜属植物中提取力可拉敏的方法，其特征是含力可拉敏洗脱液的浓缩是在50～65℃减压蒸发浓缩干燥。

7.根据权利要求1所述的从石蒜属植物中提取力可拉敏的方法，其特征是重结晶是用丙酮将力可拉敏完全溶解、过滤、除去不溶物，溶液在60℃加热5分钟，在0～50℃条件下结晶72小时。

8.根据权利要求1所述的从石蒜属植物中提取力可拉敏的方法，其特征是吸附剂除氧化铝外，还可用硅胶代替。

Images