CN109810014A - 一种枸杞子中二咖啡酰亚精胺类化合物选择性富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枸杞子中二咖啡酰亚精胺类化合物的选择性富集方法，具体为将所述的二咖啡酰亚精胺类化合物在低pH条件下洗脱，以保证该类化合物的稳定性，枸杞子乙醇提取物经过强阳离子交换固相萃取法进行分离得到二咖啡酰亚精胺粗组分，之后，将得到的二咖啡酰亚精胺类组分经反相固相萃取柱脱盐制备得到精组分；该方法可以实现复杂体系中二咖啡酰亚精胺类化合物的选择性富集，解决了该类化合物与杂质在反相材料上“共流出”的问题，实现了该类化合物的类分离。因此，本发明建立了一种二咖啡酰亚精胺类化合物选择性富集的新方法，为该类化合物的新药研发提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种枸杞子中二咖啡酰亚精胺类化合物的选择性富集方法，具体地说是一种采用强阳离子交换固相萃取柱在低pH条件下选择性地富集二咖啡酰亚精胺类化合物的新方法，该方法对复杂体系中二咖啡酰亚精胺类化合物的富集表现出较优的分离效果。
背景技术
二咖啡酰亚精胺是一种存在于茄科植物中的植物次生代谢产物。二咖啡酰亚精胺属于酰胺类化合物。据文献报道，该类化学成分具有清除体内自由基、抗衰老、神经保护、抗肿瘤、抗癌、抗炎、预防老年痴呆症等多种药理活性。(Li Y Y,Di R,Baibado J T,etal.Identification of kukoamines as the novel markers for quality assessmentof Lycii Cortex[J].Food Research International,2014,55(2):373-380；Zhou,Z.Q.,Fan,H.X.,et al.Lycibarbarspermidines A-O,New Dicaffeoylspermidine Derivativesfrom Wolfberry,with Activities against Alzheimer's Disease and Oxidation.JAgric Food Chem,64(11),2223-2237)。然而，目前分离、分析得到的二咖啡酰亚精胺化合物鲜有报道，多数活性实验采用的是二咖啡酰亚精胺粗提物，由于大量非二咖啡酰亚精胺化合物的存在，严重影响了二咖啡酰亚精胺类化合物生物分离纯化与活性的研究。
最新研究表明，枸杞子中含有丰富的二咖啡酰亚精胺类物质，且具有较强的抗氧化和抗老年痴呆等活性作用，值得深入研究。然而，由于二咖啡酰亚精胺类化合物与样品中非二咖啡酰亚精胺类杂质疏水性相似，常规反相方法制备二咖啡酰亚精胺组分较为低效、耗时，且选择性较差。因此，采用高效的类分离方法从枸杞子中制备二咖啡酰亚精胺类组分，对于开展相关生物活性研究和新药研发具有重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的技术目的是提供一种利用强阳离子交换固相萃取柱选择性富集枸杞子中二咖啡酰亚精胺类化合物的方法。
本发明的具体技术方案为：
本发明提供一种枸杞子中二咖啡酰亚精胺类化合物的选择性富集方法：
1)枸杞子提取液的制备：50％-95％(v/v)乙醇-水溶液作提取溶剂，超声提取法进行提取，经过滤、离心处理，得枸杞子提取液；
2)二咖啡酰亚精胺类化合物粗组分的制备：将得到的枸杞子提取液过强阳离子交换固相萃取柱，富集样品中的二咖啡酰亚精胺类化合物粗组分；
所述的固相萃取柱为为C8SCX、C18SCX固相萃取柱或XCharge SCX固相萃取柱。
3)二咖啡酰亚精胺类化合物精组分的制备：将得到的二咖啡酰亚精胺类化合物粗组分经过反相固相萃取柱脱盐制备得到精组分。
所述的固相萃取柱为为常规C8、C18固相萃取柱或极性修饰的C18固相萃取柱。
步骤1)所述的枸杞子提取物的制备方法为：称取一定量的枸杞子果实，用3-20倍量的50％-95％(v/v)乙醇-水溶液浸泡超声提取1-5次，每次浸泡超声时间为1-3小时，合并提取液，抽滤、离心，得到枸杞子提取液，
固相萃取柱为强阳离子交换固相萃取柱(SCX SPE)，固相萃取柱参数为0.5-20g，1-60mL，dp＝10μm-100μm。
步骤2)中所述的二咖啡酰亚精胺类化合物粗组分的制备方法为：提取液样品浓度为1mg/mL-20mg/mL，用3-10倍柱体积量的甲醇溶液活化及平衡SCX SPE柱，上样，上样量为1mg-50mg，采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式，枸杞子提取液经过两次淋洗，淋洗1：1-100mL 50％-100％(v/v)甲醇-水溶液，流速为1mL/min-30mL/min；淋洗2：1-100mL 10％-60％(v/v)乙腈水溶液，溶液中加入0.1M-2M磷酸二氢钠，使淋洗2的pH值保持在1-3，流速为1mL/min-30mL/min，收集洗脱液，减压浓缩，至有机溶剂完全除去，即得二咖啡酰亚精胺粗组分，干燥过程中物料温度不得超过70℃，真空度为20-50Pa。
步骤3)中所述的二咖啡酰亚精胺类化合物精组分的制备过程为，二咖啡酰亚精胺粗组分上所述的固相萃取柱为常规C8、C18固相萃取柱或极性修饰的C18固相萃取柱，先用3-10倍柱体积的蒸馏水或0％-20％(v/v)乙醇水溶液淋洗，然后用3-10倍柱体积20％-90％的乙醇水洗脱二咖啡酰亚精胺，收集洗脱液，减压浓缩，过程中物料温度不得超过70℃，最后真空冷冻干燥，即枸杞子精组分，真空度为20-50Pa。
本发明的有益效果
该方法可以实现复杂体系中二咖啡酰亚精胺类化合物的选择性富集，解决了该类化合物与杂质在反相材料上“共流出”的问题，实现了该类化合物的类分离。因此，本发明建立了一种二咖啡酰亚精胺类化合物选择性富集的新方法，为该类化合物生物活性的深入研究和新药研发提供技术支撑。
附图说明
图1中(A)、(B)、(C)分别为枸杞子提取物、分离得到的非二咖啡酰亚精胺和二咖啡酰亚精胺精组分液相分析结果。
图2为枸杞子提取物和二咖啡酰亚精胺精组分的总二咖啡酰亚精胺含量测定结果。
具体实施方式
现结合实例，对本发明做进一步说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
本发明使用的强阳离子固相萃取柱和反相固相萃取柱为北京华谱新创科技有限公司生产。
实施例1
1)5g枸杞子用90％(v/v)乙醇-水溶液作提取溶剂(固液比：1：10)，超声提取3h，抽滤，离心，得枸杞子提取液。
2)针对枸杞子提取液，采用强阳离子交换固相萃取柱选择性富集二咖啡酰亚精胺粗组分，固相萃取条件：固相萃取柱为强阳离子固相萃取柱(1g/6mL，60μm)；上样量为：4ml(枸杞子提取液)；淋洗条件为：淋洗1：90％(v/v)甲醇-水溶液5mL；淋洗2：30％(v/v)乙腈-水5mL，淋洗2溶液用1.0M磷酸二氢钠调节pH值为2.5，收集洗脱液，减压浓缩，至有机溶剂完全去除，即得二咖啡酰亚精胺粗组分。
3)针对二咖啡酰亚精胺粗组分，利用反相固相萃取柱进行脱盐。分离条件：分离材料为反相固相萃取柱(1g/6mL，60μm)；上样量为：～3ml(全部)；淋洗条件为：淋洗1：纯水6mL；淋洗2：60％(v/v)乙醇-水5mL，收集洗脱液，减压浓缩，最后真空冷冻干燥，即得二咖啡酰亚精胺精组分，总二咖啡酰亚精胺含量见图2。
该方法可以实现二咖啡酰亚精胺类化合物的选择性富集，提供了一种高效分离二咖啡酰亚精胺类化合物的新方法，为该类化合物定性定量分析、活性研究和新药研发的深入研究提供技术支撑。
Claims (6)
1.一种枸杞子中二咖啡酰亚精胺类化合物选择性富集方法，其特征在于：
1)枸杞子提取液的制备：50％-95％(v/v)乙醇-水溶液作提取溶剂，超声提取法进行枸杞子样品的提取，经过滤、离心，得枸杞子提取液；
2)二咖啡酰亚精胺类化合物粗组分的制备：将得到的枸杞子提取液过强阳离子交换固相萃取柱，富集其中的二咖啡酰亚精胺类化合物，既得粗组分；
3)二咖啡酰亚精胺类化合物精组分的制备：将得到的二咖啡酰亚精胺类化合物粗组分过反相固相萃取柱分离即得到精组分。
2.按照权利要求1所述的选择性富集方法，其特征在于：所述的制备二咖啡酰亚精胺粗组分所使用的强阳离子固相萃取柱为C8SCX、C18SCX固相萃取柱或XCharge SCX固相萃取柱，固相萃取柱参数为0.5-20g，1-60mL，dp＝10-100μm。
3.按照权利要求1所述的选择性富集方法，其特征在于：所述的制备二咖啡酰亚精胺精组分所使用的反向固相萃取柱为常规C8、C18固相萃取柱或极性修饰的C18固相萃取柱，固相萃取柱参数为0.5-20g，1-60mL，dp＝10-100μm。
4.按照权利要求1所述的选择性富集方法，其特征在于：步骤1)所述的枸杞子提取液的制备方法为：称取一定量的枸杞子果实，用5-30倍量的50％-95％(v/v)乙醇-水溶液超声提取1-5次，每次超声提取时间为1-3小时，合并提取液、抽滤，得到样品溶液。
5.按照权利要求1所述的选择性富集方法，其特征在于：步骤2)中所述的二咖啡酰亚精胺类化合物粗组分的制备方法为：样品溶液中固体浓度为1mg/mL-100mg/mL，用3-10倍柱体积量的甲醇溶液活化及平衡强阳离子固相萃取柱，上样，上样量为1mg-50mg，采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式，枸杞子样品经过两次淋洗，淋洗1：1-100mL 50％-100％(v/v)甲醇-水溶液，流速为1mL/min-30mL/min；淋洗2：10-100mL 10％-60％(v/v)乙腈水溶液，在淋洗2的淋洗溶液中加入0.1M-2M磷酸二氢钠，使淋洗2的pH值保持在1-3，流速为1mL/min-30mL/min，收集洗脱液，减压浓缩至有机溶剂完全除去，即得二咖啡酰亚精胺粗组分，干燥过程中物料温度不得超过70℃，真空度为20-50Pa。
6.按照权利要求1所述的选择性富集方法，其特征在于：步骤3)中所述的二咖啡酰亚精胺类化合物精组分的制备过程为，二咖啡酰亚精胺粗组分上反向固相萃取柱，上样量为1mg-50mg，先用3-10倍柱体积的蒸馏水或0％-20％(v/v)乙醇水溶液淋洗，然后用3-10倍柱体积20％-95％(v/v)的乙醇水洗脱二咖啡酰亚精胺，流速为1mL/min-30mL/min，收集洗脱液，减压浓缩，过程中物料温度不得超过70℃；最后真空冷冻干燥，即得二咖啡酰亚精胺精组分，真空度为20-50Pa。
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