CN101337876A - 一种从啤酒花中提取黄腐酚的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从啤酒花中提取黄腐酚的方法，首先将啤酒花粉碎，加入石油醚充分脱脂后用乙醇进行提取，过滤，所得滤液经减压浓缩为稠膏，将此稠膏用乙酸乙酯/水进行分配，取酯相进行减压浓缩，真空干燥，获得啤酒花黄腐酚粗提物，将啤酒花黄腐酚粗提物用两步高速逆流色谱法进一步分离纯化，最终得到高纯度的黄腐酚。本发明克服了传统分离方法对样品的不可逆吸附作用，使得样品回收率高，从啤酒花制备黄腐酚得率高达到0.17％以上，制备的黄腐酚纯度高达98％以上。

Description

一种从啤酒花中提取黄腐酚的方法
技术领域
本发明涉及黄腐酚(xanthohumol)的提取，具体是一种从啤酒花中提取黄腐酚的方法。
背景技术
啤酒花(Humunus Lupulus L)是桑科葎草属多年生草质蔓生藤本，雌雄异株，花单性，雌性球穗花序简称酒花。酒花主要用作啤酒酿造原料，赋予啤酒苦味和香味及防腐作用，其有效成分为酒花树脂、酒花油和多酚。黄腐酚(xanthohumol XN)是啤酒花中的一种黄酮类物质，为酒花异戊二烯基查耳酮，其化学结构如下：
Figure A20081007920500031
近年来对黄腐酚的研究备受关注，发现黄腐酚有着多种有益作用，如抗艾滋病毒、抗癌、抗氧化、抗炎、雌激素作用等，由于其重要的生物活性，急需要大量的纯品进行深入的研究，而目前国内还没有黄腐酚标准品，国外也极少且价格相当昂贵，如何高效、简便、快速地从啤酒花中提取分离到高纯度的黄腐酚是人们关注的课题。
CN 1459281公开了一种用70％乙醇浸提啤酒花并经硅胶柱层析提纯酒花查尔酮(黄腐酚)的方法。该方法所使用的硅胶固定相对样品有不可逆吸附作用，导致黄腐酚损失较多，从啤酒花中提取分离黄腐酚的得率较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种从啤酒花中提取黄腐酚的方法，该方法黄腐酚得率高、纯度高。
本发明提供的一种从啤酒花中提取黄腐酚的方法，包括如下步骤：
(1)将啤酒花粉碎；
(2)将100g粉碎的啤酒花用800-2000mL石油醚(沸程为60～90℃)回流提取，提取温度60-65℃，提取时间0.5-1小时，过滤除去石油醚溶液(随之除去啤酒花中的脂溶性成分)，重复提取2-3次，得到脱脂啤酒花；
(3)将上述脱脂啤酒花用800-2000mL体积浓度90～100％的乙醇进行超声提取，超声功率200W，提取温度55-65℃，提取时间30-50分钟，提取液过滤，重复提取2-3次，合并滤液、减压浓缩至稠膏；
(4)在上述稠膏中加入250-350mL乙酸乙酯，搅拌，溶解后加入150-250mL水进行分配，静置分层，分离两相，弃去水相(除去极性杂质)，乙酸乙酯相重复加水分配2-3次，而后乙酸乙酯相减压浓缩，真空干燥，得黄腐酚粗提物；
(5)将上述黄腐酚粗提物进行第一步高速逆流色谱分离，分离溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，其体积比为5∶4∶4.8∶4，上相为固定相，下相为流动相，按紫外检测图谱收集目标流分；
(6)将目标流分真空浓缩回收溶剂后，进行第二步高速逆流色谱分离，分离溶剂体系为正己烷-正丁醇-甲醇-水，其体积比为3.6∶1∶1.8∶3，上相为固定相，下相为流动相，按紫外检测图谱收集黄腐酚流分，真空浓缩、冷冻干燥得到粉末状黄腐酚。用高效液相色谱法(HPLC)分析其纯度，达98％以上，得率达0.17％(g黄腐酚/100g酒花)以上。
所述的步骤(2)中提取温度优选为63℃，提取时间优选为45分钟。所述的步骤(3)中提取温度优选为60℃，提取时间优选为40分钟。
以黄腐酚标准品(购自ALEXIS公司，瑞士，纯度98％以上)作参比，对本发明得到的样品进行紫外光谱、HPLC和红外光谱的定性鉴定，证明其为黄腐酚(见图4、图5、图6)。
与现有技术相比本发明的优点和效果：本发明先将啤酒花脱脂、再除去极性杂质，然后采用高速逆流色谱(HSCCC)液-液分配技术提取得到黄腐酚，提取过程中不使用固体支撑体或载体，克服了传统分离方法对样品的不可逆吸附作用，使得样品回收率高，从啤酒花制备黄腐酚得率高，达到0.17％以上，制备的黄腐酚纯度高，达98％以上。
附图说明
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细说明。
图1为实施例1步骤(5)中经第一步分离的HSCCC分离图谱
图2实施例1步骤(6)中经第二步分离的HSCCC分离图谱
图3为图2中XN(黄腐酚)峰的HPLC分析图谱
图4为本发明黄腐酚样品和标准品的紫外-可见扫描图谱
图5为本发明黄腐酚样品与标准品的红外图谱
图6为本发明黄腐酚样品和标准品的HPLC图谱
具体实施方式
实施例1
(1)取啤酒厂的酿造颗粒啤酒花用植物粉碎机粉碎成粉状；
(2)将上述100g粉粹的啤酒花用1000ml石油醚(沸程60～90℃)水浴回流提取啤酒花中的脂溶性成分，提取温度63℃，提取时间45分钟，重复提取2次，过滤分离石油醚溶液，得到脱脂啤酒花；
(3)在脱脂啤酒花中加入1000ml 95％(v/v)乙醇超声提取黄腐酚，提取温度60℃，提取时间40分钟，超声功率200W，重复提取2次。过滤，合并提取液，减压浓缩至稠膏；(稠膏真空干燥后，HPLC测定其黄腐酚含量为4.09％)。
(4)在上述稠膏中加入300ml乙酸乙酯，搅拌，溶解后加入200ml水进行分配，静置分层，分离两相，向酯相中再次加入200ml水进行分配，分离两相，重复操作2次。分配后的乙酸乙酯相减压浓缩、真空干燥得到黄腐酚粗提物3.93g；
采用HPLC测定黄腐酚粗提物中黄腐酚含量为7.53％，同时对分配后的水相也进行同样的HPLC分析，分析结果表明，采用乙酸乙酯/水的体系进行分配，可以高选择地将黄腐酚富集到乙酸乙酯相中，有效地去除了大量水溶性杂质，使粗提物中的黄腐酚含量由4.09％提高到7.53％，而水相中黄腐酚残留量很低，为0.08ppm。
HPLC的色谱条件为：Symmetry C18，5μm，4.6×150mm色谱柱；温度：室温；2487双波长紫外检测器，检测波长为370nm；流速1ml/min；流动相：乙腈和1％乙酸溶液；
梯度洗脱：
Figure A20081007920500051
(5)第一步高速逆流色谱对黄腐酚粗提物进行分离纯化
经醇提、乙酸乙酯/水分配后得到的黄腐酚粗提物仍然是一个复杂的混合物，本发明采用了两步高速逆流色谱的分离纯化，得到了高纯度黄腐酚单体。首先在第一步中，采用由石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶4∶4.8∶4，V/V/V/V)组成的两相溶剂体系进行分离：称取步骤(4)的黄腐酚粗提物150mg溶于10ml等体积的上下相溶剂混合物中进样，按紫外图谱检测峰(图1)收集各流分，经HPLC检测，2号流分中含有目标成份；
(6)第二步高速逆流色谱对2号流分进行分离纯化
采用正己烷-正丁醇-甲醇-水(3.6∶1∶1.8∶3，V/V/V/V)体系对步骤(5)的2号流分进行第二步分离纯化：将收集的2号流分真空浓缩回收溶剂后，溶于10ml等体积的第二步溶剂体系(正己烷-正丁醇-甲醇-水)的上下相混合物中进样，按紫外图谱检测峰(图2)收集XN流分，经HPLC测定，XN流分中黄腐酚的纯度为99.35％(图3)，黄腐酚含量为7.9mg。由此可计算出本发明啤酒花中黄腐酚的提取得率达0.21％。
高速逆流色谱仪及其操作：
采用上海同田生化技术有限公司的TBE-300A型高速逆流色谱仪，聚四氟乙烯柱，20ml进样阀，柱体积为300ml；AKTAPrime泵、检测器和记录仪。
预先配制溶剂体系于分液漏斗中，摇匀后静置分层。使用前，将上相和下相分开，取上相作为固定相，下相作为流动相。
进样前，先将固定相充满整个柱子；调整主机转速800rpm，检测波长254nm，以1.5ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图接收目标流份。
对高速逆流色谱分离纯化得到的XN流分真空浓缩、冷冻干燥得到橙黄色粉末状黄腐酚样品，然后对黄腐酚样品进行紫外光谱、红外光谱和HPLC的分析鉴定，其结果如下：
紫外光谱数据(图4)：UVλ(max)(MeOH)(logε)：214(5.05)，367(4.72)。
红外光谱数据(图5)：IRvmax KBr：3423.80，2966.10，2925.83，2855.62，1621.46，1606.30，1559.08，1512.61，1436.21，1340.88，1289.91，1230.02，1196.61，1170.32，1140.89，1103.57，1056.65，980.39，922.26，900.94，867.87，832.28，806.62，780.55，622.12，542.33，516.68。
HPLC数据(图6)：黄腐酚样品和标准品的保留时间一致，均为9.7min。
结果表明，黄腐酚样品的紫外光谱和红外光谱与标准黄腐酚的光谱完全一致，高效液相色谱测定样品与黄腐酚标准品的保留时间完全一致，从而确定本发明分离得到的样品为黄腐酚。

Claims (3)

1、一种从啤酒花中提取黄腐酚的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将啤酒花粉碎；
(2)将100g粉碎的啤酒花用800-2000mL石油醚回流提取，提取温度60-65℃，提取时间0.5-1小时，过滤除去石油醚溶液，重复提取2-3次，得到脱脂啤酒花；
(3)将上述脱脂啤酒花用800-2000mL体积浓度90～100％的乙醇进行超声提取，超声功率200W，提取温度55-65℃，提取时间30-50分钟，提取液过滤，重复提取2-3次，合并滤液、减压浓缩至稠膏；
(4)在上述稠膏中加入250-350mL乙酸乙酯，搅拌，溶解后加入150-250mL水进行分配，静置分层，分离两相，弃去水相，乙酸乙酯相重复加水分配2-3次，而后乙酸乙酯相减压浓缩，真空干燥，得黄腐酚粗提物；
(5)将上述黄腐酚粗提物进行第一步高速逆流色谱分离，分离溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，其体积比为5∶4∶4.8∶4，上相为固定相，下相为流动相，按紫外检测图谱收集目标流分；
(6)将目标流分真空浓缩回收溶剂后，进行第二步高速逆流色谱分离，分离溶剂体系为正己烷-正丁醇-甲醇-水，其体积比为3.6∶1∶1.8∶3，上相为固定相，下相为流动相，按紫外检测图谱收集黄腐酚流分，真空浓缩、冷冻干燥得到粉末状黄腐酚。
2、如权利要求1所述的从啤酒花中提取黄腐酚的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中提取温度为63℃，提取时间45分钟。
3、如权利要求1所述的从啤酒花中提取黄腐酚的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中提取温度60℃，提取时间40分钟。
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