CN104586945A - 啤酒花总黄酮提取物、制备方法及其作为制备预防和治疗肝损伤、癌症药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及啤酒花总黄酮提取物制备方法及其在保肝、抑制肿瘤细胞生长、醌还原酶诱导等方面的应用。可用于预防和治疗肝损伤、癌症药物的开发。

Description

啤酒花总黄酮提取物、制备方法及其作为制备预防和治疗肝损伤、癌症药物的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及啤酒花(Humunus Lupulus L)总黄酮、制备方法和用于制备预防和治疗肝损伤、癌症药物的应用。

背景技术

啤酒花(Humulus Lupulus L.)又称忽布，香蛇麻，性味甘苦，微平。是桑科葎草属多年生草质蔓生藤本,雌雄异株,花单性,雌性球穗花序简称酒花。它是一种较耐寒不耐热的植物,主要分布于我国西北地区、新疆北部、东北、华东及山东、甘肃、陕西等地。目前,我国啤酒花产量约占全世界的13％,仅次于美国和德国,居世界第三位。

啤酒花是酿造啤酒的主要原料之一，它能够赋予啤酒特殊的苦味和独特的风味，增强啤酒的非生物稳定性和泡持性，并具有一定的防腐性能，被誉为“啤酒的灵魂”。除主要用于啤酒酿造外，啤酒花作为一种重要的药用植物，它的应用历史也很悠久。13世纪开始，啤酒花开始作为草药来使用。我国明代李时珍的《本草纲目》所引的宋代《开宝本草》中的一种中药“陀得花”指的就是啤酒花。据报道，啤酒花可用于防腐、健胃、安神、镇定、催眠、杀菌、抗炎和利尿，还可用于治疗消化不良、失眠、肺结核、麻风病等。

近年来对啤酒花提取物或其中所含有的化合物的药理作用多集中在抗菌、抗氧化、镇静和雌激素样作用等方面。对啤酒花中的主成分啤酒花总黄酮的保肝和癌症化学预防、治疗方面尚未报道。

发明内容

本发明的目的在于提供啤酒花总黄酮提取物，主要由黄腐酚、黄腐酚B、黄腐酚C、黄腐酚G、黄腐酚I组成，其中黄腐酚含量>60％。

本发明的目的还在于提供啤酒花总黄酮制备方法。该方法包括如下步骤：

(1)干燥啤酒花，粉碎后用乙醇或甲醇提取，减压回收提取液得粗提物；

(2)将上述提取物经非极性大孔吸附树脂处理，用溶剂进行梯度洗脱，收集合并含啤酒花总黄酮的洗脱液，减压浓缩，得啤酒花粗总黄酮；

或将上述提取液依次用石油醚或环己烷、二氯甲烷或氯仿、乙酸乙酯萃取，减压浓缩二氯甲烷或氯仿、乙酸乙酯萃取液得啤酒花粗总黄酮；

(3)步骤(2)所得啤酒花粗总黄酮经聚酰胺柱色谱处理，用溶剂进行梯度洗脱，收集合并含啤酒花总黄酮的洗脱液，减压浓缩，干燥，得精制啤酒花总黄酮；

或将啤酒花粗总黄酮经硅胶柱色谱处理，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集合并含啤酒花总黄酮的洗脱液，减压浓缩、干燥得精制啤酒花总黄酮。

本发明提供的啤酒花总黄酮制备方法，其中步骤(1)中所述的提取方法为加热回流提取或加热超声提取1-3次。所用溶剂为：体积浓度为60％-100％的乙醇或甲醇。药材与溶剂重量体积比为1:5～1:15，优选1:6～1:10。步骤(2)中所述大孔吸附树脂洗脱剂为甲醇/水或乙醇/水，混合体积比例为1：9～9：1，甲醇/水或乙醇/水混合体积比优选3：7～7：3。步骤(2)用石油醚或环己烷、二氯甲烷或氯仿、乙酸乙酯依次萃取的次数为1-4次，萃取溶剂与提取液的体积比为1:1～3:1。

步骤(3)中所述聚酰胺柱色谱流动相为甲醇和水混合溶剂、或乙醇和水混合溶剂，混合溶剂体积比为1：9～9：1，甲醇和水混合溶剂或乙醇和水混合溶剂体积比优选3：7～7：3洗脱部分得啤酒花总黄酮。

步骤(3)中所述硅胶柱色谱流动相为二氯甲烷和丙酮、氯仿和丙酮、二氯甲烷和甲醇、氯仿和甲醇、二氯甲烷和乙酸乙酯或氯仿和乙酸乙酯混合溶剂，混合溶剂体积比为比例为100：1～1：1，优选20：1～3:1洗脱部分得啤酒花总黄酮。

本发明提供的总黄酮具有保肝、抑制肿瘤细胞生长、醌还原酶诱导作用，可用于预防和治疗肝损伤、癌症药物的开发和应用。

本发明以四氯化碳所致急性肝损伤小鼠模型、体外抗肿瘤实验模型、醌还原酶诱导活性测试模型，对制备得到的啤酒花总黄酮的肝保护、抗癌、癌症化学预防活性进行了评价。结果显示，啤酒花总黄酮能够显著抑制四氯化碳所致小鼠急性肝损伤、显著抑制人肺癌细胞系A549，H292，H358，H226，人白血病细胞HL60的生长，显著诱导醌还原酶活性。因此，本发明中制备的啤酒花总黄酮可用于预防和治疗肝损伤、抗癌药物的开发和应用。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

(1)干燥啤酒花1kg，用100％甲醇加热回流提取2次，药材与溶剂重量体积比为1:10，减压回收提取液得粗提物；

(2)将(1)所得提取液经非极性大孔吸附树脂处理，用甲醇和水溶剂：1:9,3:7,5:5,7:3,9:1进行梯度洗脱，收集3:7，5:5，7:3三个流分的洗脱液，减压浓缩，得啤酒花粗总黄酮；

(3)步骤(2)所得啤酒花粗总黄酮经聚酰胺柱色谱处理，用甲醇和水混合溶剂：1:9，3:7，5:5，7:3，9:1进行梯度洗脱，收集合并含3:7，5:5，7:3三个流分洗脱液，减压浓缩，干燥，得精制啤酒花总黄酮，其中黄腐酚含量为69.2％。

(4)步骤(3)中所得啤酒花总黄酮，经硅胶柱色谱分离，以石油醚，丙酮混合溶剂梯度洗脱，制备得到总黄酮中的5个主要成分，经波谱数据分析鉴定为黄腐酚、黄腐酚B、黄腐酚C、黄腐酚G、黄腐酚I。化合物的结构鉴定数据如下(表1-6)

化合物1：xanthohumol

表1Xanthohumol的¹H NMR和¹³CNMR数据(测试溶剂：DMSO)

化合物2：xanthohumol B

表2Xanthohumol B的¹H NMR和¹³CNMR数据(测试溶剂：CDCl₃)

化合物3：xanthohumol C

表3Xanthohumol C的¹H NMR和¹³CNMR数据(测试溶剂：CDCl₃)

化合物4：xanthohumol G

表4Xanthohumol G的¹H NMR和¹³CNMR数据(测试溶剂：DMSO)

化合物5：xanthohumol I

表5Xanthohumol I的¹H NMR和¹³CNMR数据(测试溶剂：DMSO)

实施例2

(1)干燥啤酒花2kg，用60％乙醇加热回流提取3次，药材：溶剂重量体积比为1:5，减压回收提取液得粗提物；

(2)将(1)所得提取液经非极性大孔吸附树脂处理，用甲醇和水溶剂：2:8，4:6，6:4，8:2进行梯度洗脱，收集4:6，6:4三个流分的洗脱液，减压浓缩，得啤酒花粗总黄酮；

(3)步骤(2)所得啤酒花粗总黄酮经聚酰胺柱色谱处理，用甲醇和水混合溶剂：2:8,4:6，6:4,7:3进行梯度洗脱，收集合并含4:6，6:4三个流分洗脱液，减压浓缩，干燥，的精制啤酒花总黄酮。

所得啤酒花总黄酮，以实施例1中所得化合物为对照品，经薄层色谱检识，确认其主要黄酮斑点为：黄腐酚、黄腐酚B、黄腐酚C、黄腐酚G、黄腐酚I，其中黄腐酚含量为63.7％。

实施例3

(1)干燥啤酒花1.5kg，用90％乙醇加热回流提取1次，药材：溶剂重量体积比为1:15，减压回收提取液得粗提物；

(2)将(1)所得提取液经石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取3次，萃取溶剂与提取液的体积比为1:1，减压浓缩二氯甲烷和乙酸乙酯萃取液，得啤酒花粗总黄酮；

(3)步骤(2)所得啤酒花粗总黄酮经硅胶柱色谱处理，用氯仿和甲醇混合溶剂：100：1,20:1，5:1进行梯度洗脱，收集合并含20:1，5:1两个流分洗脱液，减压浓缩，干燥，的精制啤酒花总黄酮。

(4)步骤(3)所得啤酒花总黄酮，以实施例1中所得化合物为对照品，经薄层色谱检识，确认其主要黄酮斑点为：黄腐酚、黄腐酚B、黄腐酚C、黄腐酚G、黄腐酚I，其中黄腐酚含量为70.9％。

实施例4

(1)干燥啤酒花3kg，用70％甲醇加热回流提取3次，药材：溶剂重量体积比为1:8，减压回收提取液得粗提物；

(2)将(1)所得提取液经环己烷、氯仿、乙酸乙酯萃取1次，萃取溶剂与提取液的体积比为3:1，减压浓缩氯仿和乙酸乙酯萃取液，得啤酒花粗总黄酮；

(3)步骤(2)所得啤酒花粗总黄酮经硅胶柱色谱处理，用二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂：10:1,5:1，3:1，1:1进行梯度洗脱，收集合并5:1，3:1两个流分洗脱液，减压浓缩，干燥，的精制啤酒花总黄酮。

所得啤酒花总黄酮，以实施例1中所得化合物为对照品，经薄层色谱检识，确认其主要黄酮斑点为：黄腐酚、黄腐酚B、黄腐酚C、黄腐酚G、黄腐酚I，其中黄腐酚含量为64.5％。

实施例5

(1)干燥啤酒花4kg，用70％甲醇加热回流提取2次，药材：溶剂重量体积比为1:10，减压回收提取液得粗提物；

(2)将(1)所得提取液经石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取2次，萃取溶剂与提取液的体积比为2:1，减压浓缩氯仿和乙酸乙酯萃取液，得啤酒花粗总黄酮；

(3)步骤(2)所得啤酒花粗总黄酮经聚酰胺柱色谱流动相为乙醇和水，混合溶剂体积比为1:9，3:7，6:4，9:1，甲醇/水或乙醇/水体积比为3:7，6:4洗脱流分得啤酒花总黄酮。

所得啤酒花总黄酮，以实施例1中所得化合物为对照品，经薄层色谱检识，确认其主要黄酮斑点为：黄腐酚、黄腐酚B、黄腐酚C、黄腐酚G、黄腐酚I，其中黄腐酚含量为66.4％。

实施例6实施例1、3、5中制备得到的啤酒花总黄酮对四氯化碳致急性肝损伤小鼠肝脏指数和TNF-α的影响

(1)实验材料

受试药物：实施例1、3、5中制备得到的啤酒花总黄酮

所用试剂：联苯双酯滴丸，浙江安邦药业股份有限公司，生产批号：A020140107。ELISA试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司。

实验动物：昆明雄性小鼠(18-22g),购自沈阳药科大学动物实验中心,合格证号：SYXK(辽)2014-0004，饲养温度：22±2，饲养三天后进行试验。

实验仪器：Thermo scientific sorvall legend micro 21R微量离心机(美国Thermofisher公司)，Thermo多功能酶标仪。

(2)实验方法:

将小鼠随机分为6组，每组8只，分别为：空白对照组、模型组、阳性药(联苯双酯300mg/kg)、啤酒花低、中、高剂量组分别为：25、50、100mg/kg。连续灌胃给药7天，末次给药后1小时，除空白对照组外，其余小鼠按0.1ml/10g体重腹腔注射0.2％的CCl₄植物油溶液(大豆油作为溶剂)造模，禁食不禁水，24小时后摘眼球取血，取血清，按照ELISA试剂盒说明书操作进行，用酶标仪测定各孔的吸光度值，测定波长为450nm，然后分别带入TNF-α标准曲线计算各样品中TNF-α水平。

用ELISA试剂盒测定血清中TNF-α水平。另剖取肝脏，肝脏用预冷的生理盐水漂洗，除去多余的血液，用滤纸拭干，称重，按肝脏指数(％)＝[肝脏重量(g)/体重(g)]*100％计算肝脏指数。

(3)统计方法：

用SPSS17.0统计软件，各组数据用Mean±SE表示，用单因素方差进行分析(ANOVA)，采用LSD进行组间均数的两两比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

(4)实验结果：见表1

表1实施例1、3、5中所得啤酒花总黄酮对小鼠肝脏指数和TNF-α的影响

注:^***P<0.001，与空白组相比；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001，与模型组相比

结果显示：与空白组相比，模型组显著提高小鼠肝脏指数和血清TNF-α水平(P<0.001)；与模型组相比,联苯双酯组显著降低了肝脏指数(P<0.01)，但TNF-α没有显著性差异；与模型组相比，实施例1、3、5所得啤酒花总黄酮低、中、高三个剂量组均显著降低了肝脏指数，啤酒花总黄酮高剂量组显著降低了血清TNF-α水平。。

实施例7实施例1、2、4中制备得到的啤酒花总黄酮对四氯化碳致急性肝损伤小鼠血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的酶活力的影响

(1)实验材料

受试药物：实施例1、2、4中制备所得啤酒花总黄酮

所用试剂：联苯双酯滴丸，浙江安邦药业股份有限公司，生产批号：A020140107。AST，ALT均购自南京建成生物工程研究所，货号分别为：C0010-2，C009-2。

实验动物：昆明雄性小鼠(18-22g),购自沈阳药科大学动物实验中心,合格证号：SYXK(辽)2014-0004，饲养温度：22±2，饲养三天后进行试验。

实验仪器：Thermo scientific sorvall legend micro 21R微量离心机(美国Thermofisher公司)，Thermo多功能酶标仪。

(2)实验方法:

将小鼠随机分为6组，每组8只，分别为：空白对照组、模型组、阳性药(联苯双酯300mg/kg)、啤酒花低、中、高剂量组分别为：25、50、100mg/kg。连续灌胃给药7天，末次给药后1小时，除空白对照组外，其余小鼠按0.1ml/10g体重腹腔注射0.2％的CCl₄植物油溶液(大豆油作为溶剂)造模，禁食不禁水，24小时后摘眼球取血，取血清，采用赖氏法，按谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)试剂盒说明书操作表进行，用酶标仪测定各孔的吸光度值，测定波长均为510nm，然后分别带入谷草转氨酶和谷丙转氨酶标准曲线进行计算。

(3)统计方法：

用SPSS17.0统计软件，各组数据用Mean±SE表示，用单因素方差进行分析(ANOVA)，采用LSD进行组间均数的两两比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

(4)实验结果：见表2

表2实施例1、2、4所得啤酒花总黄酮对CCl4所致急性肝损伤小鼠血清中AST和ALT水平的影响

注：^***P<0.001，与空白组相比；^##P<0.01，^###P<0.001，与模型组相比。

结果显示：模型组显著提高小鼠血清AST和ALT水平(与空白组相比，P<0.001)。与模型组相比联苯双酯组显著降低了血清AST和ALT水平(与模型组相比，P<0.01)。与模型组相比，实施例1、2、4所得啤酒花总黄酮低、中、高三个剂量组均显著降低了血清AST和ALT水平(与模型组相比，P<0.001)。

实施例8实施例2、3、4中制备得到的啤酒花总黄酮对四氯化碳致急性肝损伤小鼠肝脏组织中CAT、GSH-PX、SOD、MDA活力的影响

(1)实验材料

受试药物：实施例2、3、4所得啤酒花总黄酮

所用试剂：联苯双酯滴丸，浙江安邦药业股份有限公司，生产批号：A020140107。CAT，GSH-PX，SOD和MDA均购自南京建成生物工程研究所，货号分别为：A007-1，A005，A001-1，A003-1。

实验动物：昆明雄性小鼠(18-22g),购自沈阳药科大学动物实验中心,合格证号：SYXK(辽)2014-0004，饲养温度：22±2，饲养三天后进行试验。

实验仪器：Thermo scientific sorvall legend micro 21R微量离心机(美国Thermofisher公司)，Thermo多功能酶标仪。

(2)实验方法:

将小鼠随机分为6组，每组8只，分别为：空白对照组、模型组、阳性药(联苯双酯300mg/kg)、啤酒花低、中、高剂量组分别为：25、50、100mg/kg。连续灌胃给药7天，末次给药后1小时，除空白对照组外，其余小鼠按0.1ml/10g体重腹腔注射0.2％的CCl₄植物油溶液(大豆油作为溶剂)造模，禁食不禁水，24小时后取肝脏组织。

①测肝组织中的过氧化氢酶(CAT)活力：用0.9％的生理盐水将10％肝组织匀浆液稀释至浓度为0.5％，采用可见光法，按照CAT试剂盒说明书中的步骤进行操作以测定小鼠肝组织匀浆中CAT活力，在405nm波长处，测定其吸光度值，根据组织CAT活力计算公式进行计算。

②测肝组织中的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力：用0.9％生理盐水将10％的肝组织匀浆液稀释至浓度为2.5％，然后按照GSH-PX试剂盒说明书中的步骤进行操作以测定小鼠肝组织匀浆中GSH-PX活力，在412nm波长处测其吸光度，根据组织中GSH-PX活力计算公式进行计算。

③测肝组织中的超氧化物歧化酶(SOD)活力：采用黄嘌呤氧化酶法，取10％肝组织匀浆液50ul,按照SOD试剂盒说明书中的步骤进行操作以测定小鼠肝组织匀浆中SOD活力，在550nm处，测定其吸光度，根据SOD活力计算公式进行计算，结果见表3，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

④测肝组织中的MDA的含量:采用硫代巴比妥酸法，取10％肝组织匀浆液150ul,按照MDA试剂盒说明书中的步骤进行操作以测定小鼠肝组织匀浆中MDA的含量，在532nm波长处，测其吸光度，根据组织MDA含量计算公式进行计算。

(3)统计方法：

用SPSS17.0统计软件，各组数据用Mean±SE表示，用单因素方差进行分析(ANOVA)，采用LSD进行组间均数的两两比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

(4)实验结果：见表3

表3实施例2、3、4所得啤酒花总黄酮对CCl₄致急性肝损伤小鼠肝脏组织中CAT、GSH-PX、SOD、MDA活力的影响

注：^*P<0.05,^**p<0.01,^***P<0.001，与空白组相比；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001，与模型组相比

结果显示：与空白组相比，模型组显著降低小鼠肝组织中CAT、GSH-PX(与空白组相比，P<0.001)和SOD(P<0.05)的水平。同时，模型组显著升高小鼠肝组织中的MDA含量(与空白组相比，P<0.001)。与模型组相比，联苯双酯组显著升高小鼠肝组织中CAT(P<0.001)、GSH-PX(P<0.05)和SOD(P<0.01)的水平，同时，模型组显著降低小鼠肝组织中MDA的含量(P<0.001)。与模型组相比，实施例2、3、4所得啤酒花总黄酮低、中、高三个剂量组均显著升高小鼠肝脏组织中CAT、GSH-PX和SOD水平(P<O.O5，P<0.01,P<0.001),同啤酒花中、高剂量组时显著降低小鼠肝脏组织中MDA水平(P<0.05，P<0.001)。

实施例9实施例1、5中制备得到的啤酒花总黄酮的体外抗肿瘤活性测试

(1)实验材料

受试药物：实施例1和5所得啤酒花总黄酮

小牛血清(购自Hyclone)；胎牛血清(TBD公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)美国Sigma(St.Louis,MO)；96孔细胞培养板(Costar公司)；人肺癌细胞A549；人肺癌细胞H292；人肺癌细胞H358；人肺癌细胞H226；人白血病细胞HL-60均购自ATCC。

(2)实验方法

①细胞培养方法

取对数生长期的癌细胞，以内含10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum)的RPMI-1640培养液稀释为6×10³个/L的细胞悬浮液，接种于96孔板中，100μL/孔，置于37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱中培养48h。

②药物配置

样品均为粉末状，使用DMSO溶解。配成浓度为100mg/mL的母液，储存于-20℃。临用时用相应的培养液将其稀释，稀释为100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL及0.1μg/mL进行实验。DMSO配置的样品进行实验时，DMSO的终浓度为1‰。阳性药依托泊苷浓度为100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L和0.1μmol/L。

③MTT法检测受试药物的细胞毒活性

细胞成活率测定采用MTT分析法，以活细胞代谢还原四甲基偶氮唑盐(3-(4，5-dimethyl-2thiahiazoy1)-3，5-di-phenyl-tetrazolium bromide，MTT)为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下四氮唑环开裂，生成蓝色的Formazan结晶，Formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。死细胞中此酶消失，不能和20％的十二烷基磺酸钠(pH4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定492nm出的光密度OD值，OD值的大小与所生成的Formazan结晶的量成正比，从而反应出药物对细胞成活率的影响。

取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100μl/well，培养于37℃，5％CO2的培养箱内。培养24h后加药，作用48h。分设空白组、给药组和阳性对照组，每组设6个复孔。药物作用48h后，将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育3-4h，离心，小心吸除培养液后每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，完全溶解后使用酶标仪于492nm测定其光密度OD值。最后以空白组OD值为100％，计算各组细胞抑制率。

(3)统计方法

全部资料采用SPSS(16.0)统计软件包进行检验分析。各组数据用均值±标准误(Mean±S.E.)表示，采用One-Way ANOVA评价整体性差异，并进行Dunnett或Dunnett’s T3检验进行组间比较。

(4)IC50的计算方法

将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC50。

(5)实验结果：见表4

表4实施例1和5所得啤酒花总黄酮对A549，H292，H358，H226，HL-60人癌细胞的生长抑制活性

CDDP(顺铂)为阳性对照药物

结果表明实施例1和5中所制备得到的啤酒花总黄酮具有显著的体外抗肿瘤活性，可显著抑制A549，H292，H358，H226，HL-60人癌细胞系的生长，表现出体外抗肿瘤活性。

实施例10实施例2、3、5所得啤酒花总黄酮的醌还原酶诱导活性测试

(1)实验材料：

受试药物：实施例2、3、5所得啤酒花总黄酮

试剂：小牛血清(购自Hyclone)；胎牛血清(TBD公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)美国Sigma(St.Louis,MO)；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(上海生工)；96孔细胞培养板(Costar公司)；细胞株：鼠肝癌细胞株Hepa 1c1c7

(2)实验方法：

①细胞的培养：

每孔种10⁴个细胞，在包含10％(v/v)胎牛血清、0.01％青霉素G、0.15％碳酸氢钠、0.01％硫酸链霉素的培养液中生长24小时，环境条件为37℃、含5％CO₂的潮湿空气。

②药物的配制

待测化合物使用DMSO溶解，配成浓度为50mmol/L的母液，储存于－20℃。

③结晶紫法确定细胞存活率

将已知浓度的待测化合物溶解在DMSO中加入各孔并保持24小时。每孔加入DMSO后应保证DMSO的终浓度≤0.5％(v/v)。之后弃掉培养液，每孔加入200μL 0.2μM结晶紫(2％乙醇溶液)。常温下放置染色10分钟左右，弃掉结晶紫溶液，用水迅速洗涤3次，将水甩干并用吹风机吹干。每孔加入200μL 0.5％SDS(50％乙醇溶液)，常温下振荡5～10分钟，595nm下测定吸光度。测得的吸光度经空白组(没有种细胞的孔)进行校正，并以相当于对照组(没有处理的孔中细胞)吸光度的百分率表示细胞存活率。每组实验应至少独立重复3次并取平均值作为最后结果。

细胞成活率％＝给药组OD值的平均值/空白乳组OD值的平均值×100％

④醌还原酶诱导活性测定

QR诱导测定的基本原理是葡萄糖-6-磷酸可在辅因子NADP存在的条件下被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶还原，这时可产生NADPH，NADPH一旦形成便作为一种供电子体使甲萘醌还原为甲萘氢醌，甲萘氢醌可使MTT还原为甲臜，最后可对甲臜进行吸光度的测定。NADP和甲萘醌在该催化循环过程中可再生，所以实验中不用对其进行补充。QR诱导剂可增加甲萘氢醌的产生，从而使更多的甲臜形成。在该实验中，所采用化合物的浓度要预先经过Hepa 1c1c7细胞筛选，其浓度应满足使细胞存活率≥55％。

醌还原酶活性的测定在96孔板上用鼠肝癌细胞进行，过程如下所述：细胞培养后将已知浓度的待测化合物溶解在DMSO中加入各孔并保持24小时。每孔加入DMSO后应保证DMSO的终浓度≤0.5％(v/v)。在这之后，将培养液倒出并加入含有0.8％(w/v)洋地黄皂苷和2mM EDTA，搅动10分钟以消化细胞。在每孔加入“完全反应混和液”200μl。该混和液应临用前配置，配置方法如下：将7.5mL 0.5M的Tris-Cl(pH＝7.4)、100mg小牛血清、1mL 1.5％的吐温20、0.1mL 7.5mM的FAD、1mL 150mM的葡萄糖-6-磷酸、90μL 50mM的NADP、300单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、45mgMTT用去离子水配置成150mL的溶液。在加入混和液之前加入0.2μL甲萘醌(50mM，溶解在乙腈中)。待加入完成后96孔板轻轻振摇5分钟。将0.3mM双香豆素溶解在0.5％DMSO和5mM磷酸二氢钾中(pH＝7.4)吸取50μL加入板上每孔中以终止反应。在590nm波长下测定吸光度。空白组中不含细胞，对照组为Hepa 1c1c7细胞和含0.5％DMSO基质液但不含待测化合物。待测化合物的QR诱导活性的计算方法：先将给药组和对照组的吸光度减去空白组的吸光度，然后用给药组的吸光度指比上对照组的吸光度值(IR)作为QR诱导活性的指标。每组实验应至少独立重复3次。

(3)实验结果：见表5

表5实施例2、3、5所得啤酒花总黄酮QR诱导活性测试结果

注：4’-溴黄酮为阳性对照药

在保证细胞存活率高于50％的情况下，IR大于2即表明测试样品具有QR诱导作用。由上表结果可知，实施例2、3、5所得啤酒花总黄酮与啤酒花总提取物相比，具有更显著的QR诱导活性，且毒性更低。

Claims (11)

1.啤酒花总黄酮提取物，其特征在于，主要由黄腐酚、黄腐酚B、黄腐酚C、黄腐酚G、黄腐酚I组成。

2.如权利要求1所述的提取物，其特征在于黄腐酚含量>60%。

3.一种如权利要求1所述啤酒花总黄酮的制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：

（1）干燥啤酒花，粉碎后用乙醇或甲醇提取，减压回收提取液得粗提物；

（2）将上述提取物经非极性大孔吸附树脂处理，用溶剂进行梯度洗脱，收集合并含啤酒花总黄酮的洗脱液，减压浓缩，得啤酒花粗总黄酮；

或将上述提取液依次用石油醚或环己烷、二氯甲烷或氯仿、乙酸乙酯萃取，减压浓缩二氯甲烷或氯仿、乙酸乙酯萃取液得啤酒花粗总黄酮；

（3）步骤（2）所得啤酒花粗总黄酮经聚酰胺柱色谱处理，用溶剂进行梯度洗脱，收集合并含啤酒花总黄酮的洗脱液，减压浓缩，干燥，得精制啤酒花总黄酮；

或将啤酒花粗总黄酮经硅胶柱色谱处理，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集合并含啤酒花总黄酮的洗脱液，减压浓缩、干燥得精制啤酒花总黄酮。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中提取溶剂为体积比60%～100%的乙醇或甲醇，提取次数为1～3次，药材和提取溶剂的重量体积比为1:5～1:15。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中大孔吸附树脂色谱的流动相为甲醇和水混合溶剂或乙醇和水混合溶剂，甲醇和水或乙醇和水混合体积比为3：7～7：3。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中萃取溶剂为石油醚或环己烷、二氯甲烷或氯仿、乙酸乙酯，萃取次数为1-4次，萃取溶剂与提取液的体积比为1:1～3:1。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中聚酰胺柱色谱流动相为甲醇和水混合溶剂、或乙醇和水混合溶剂，甲醇和水混合溶剂或乙醇和水混合溶剂体积比为3：7～7：3。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中硅胶柱色谱流动相为二氯甲烷和丙酮、氯仿和丙酮、二氯甲烷和甲醇、氯仿和甲醇、二氯甲烷和乙酸乙酯或氯仿和乙酸乙酯混合溶剂，混合溶剂比例为20：1～3：1。

9.权利要求1所述的啤酒花黄酮提取物在保肝药物的应用。

10.权利要求1所述的啤酒花黄酮提取物在制备抗癌药物的应用。

11.权利要求1所述的啤酒花黄酮提取物在制备具有癌症预防作用的药物的应用。