CN101575356A - 一种从东北红豆杉提取纯化7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中草药功能性成分的提取纯化方法，目的是要提供一种简便安全经济高效地从东北红豆杉中提取纯化得到单体化合物7－木糖－10－去乙酰基紫杉醇的方法，所采取的技术方案是：以东北红豆杉新鲜或干燥枝叶为原料，采用大孔吸附树脂富集技术、常压制备色谱技术和高压制备液相分离技术相结合，得到纯度达到99.9.0％以上的7－木糖－10－去乙酰基紫杉醇，其提取率为0.05％。本发明所用原料可为在提取紫杉醇生产中剩余的废料，充分利用自然资源。而且该方法经提取、初步除杂及再纯化，简单易行，目标化合物损失少。
Description
技术领域
本发明涉及从植物中分离纯化功能成分的一种方法，具体是从东北红豆杉的新鲜或干燥枝叶中提取纯化7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇。
背景技术
紫杉醇广泛用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤的治疗。但由于其难溶于水，需溶于聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL)与无水乙醇混合溶媒中增加水溶性，而聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL)在体内降解时释放组胺，导致不同程度的过敏反应，亦可引起神经细胞内颗粒释放及脱髓鞘改变而加重紫杉醇的外周神经毒性。为降低毒性，提高其疗效，合成及半合成紫杉醇类化合物是解决紫杉醇水溶性的差的的方法之一，同时从植物筛选含量较高天然的新的亲水性紫杉醇衍生物，弥补紫杉醇在水溶性衍生物开发方面的不足(傅喆暾等，2006；杨涛等，2007)。
7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇是存在红豆杉科植物内的天然木糖甙(图1是7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的结构式)，由于在分子中引进了亲水性的木糖基团，同时去除了亲脂性基团乙酰基，其水溶性比紫杉醇大大增强，在水中的溶解度为1mg/mL(Parmar VS.et al，1999)。7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的结构与紫杉醇仅在C7和C10的取代基团不同，根据已经确认的紫杉醇的构效关系，紫杉醇C7成甙，或C10位去乙酰基的结构修饰对活性几乎不产生影响(李燕等，2008)，而且根据7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇体内外对抑瘤作用的结果是与目前研究的紫杉醇构效关系相互认证的(Shougang Jiang et al，2008；姜守刚，2008)。7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇是一个十分有潜力的先导化合物。
目前，7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的应用为制备紫杉醇的原料。7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇含量在50％以下。传统的制备7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇提纯过程漫长且目标化合物损失较多，采用多次硅胶柱层析，操作步骤繁多且洗脱液毒性较大、价格较高的试剂为主(Senilh V.et al，1984；陈未名等，1991；Shen YC.etal，2000)。目前，尚未见到从红豆杉中大量快速提取纯化7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇单体的报道。
综上所述，在利用植物资源分离纯化7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的过程中，主要的影响因素在于提取工艺落后、原料处理和分离过程中普遍存在7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的流失、纯化过程漫长，使得成本升高。因此，有必要寻找一种简便安全经济高效地提取纯化7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的方法。本发明旨在建立一种通过多种现代分离纯化技术相结合的方法，实现简单快速、损失少的分离纯化7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以东北红豆杉新鲜或者干燥枝叶为原料，通过大孔吸附树脂富集技术、常压硅胶柱层析分离技术及制备液相技术，从而大量、快速获得高纯度7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇产品的工艺方法。本发明的目的是通过以下方案来达到的：
东北红豆杉新鲜或者干燥枝叶经过50～60℃温水提取二次，所得到溶液经大孔吸附树脂富集和常压硅胶柱层析后，上制备液相得到7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的产品，得到纯度大于99.9％的纯品。
上述的7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的提取纯化方法，其特征在于：取一定量的新鲜或干燥东北红豆杉枝叶，加入50～60℃水溶液(体积为固体质量的8～10倍)连续提取2次，每次30min。同时将大孔吸附树脂采用湿法装柱，保留液面，将提取药液通过吸附柱，上样液体积与大孔吸附树脂吸附剂质量比为10∶1，以流速为每小时6～8mL/g(树脂)条件下过吸附柱。吸附后用3～4BV30％乙醇洗杂质，然后用80％乙醇6～8BV解吸，收集解吸液，浓缩得浸膏，将浸膏按照质量比1∶1加入硅胶拌样，上300-400目硅胶柱精制，上样量与吸附剂硅胶比为1∶10。当洗脱液(氯仿∶甲醇)组分的体积比为12∶1时，洗脱得7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇粗品。7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇粗品上制备液相，流动相(乙氰∶水＝2∶3)，流速为2mL/min，检测波长为227nm，进样量为5mL，进样前把7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇粗品溶于流动相，过0.45uM微孔滤膜，制备柱填料为ODS(15μ，300×7.8mm)。上述的7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的提取纯化方法所用的大孔吸附树脂为AB-8型、D101型、AL-9型及NKA系列等。
上述的常压硅胶柱色谱技术，其特征在于：洗脱液的溶剂除三氯甲烷和甲醇外，还包括石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈和乙醇，比例为三氯甲烷(或二氯甲烷、石油醚)∶甲醇(或丙酮、乙腈、乙醇、乙酸乙酯)＝15∶1～10∶1。
上述的制备液相的流动相除乙氰和水外，还包括甲醇和水，比例为乙氰(甲醇)∶水＝1∶5～4∶5。
本发明的优点：
1.本发明可以应用生产紫杉醇过程中的废料为原料，对植物资源进行高效合理的利用。
2.该方法简单易行，周期短，可实现大规模的产业化生产。
3.产品得率高、纯度高。
具体实施方案
实施例1
称取1000g东北红豆杉新鲜枝叶(干重为200g)，加入2000mL的50～60℃温水提取二次后，连续提取2次，每次30min。
同时将400g大孔吸附树脂AB-8采用湿法装柱，保留液面，将提取药液4000ml通过吸附柱，以流速为每小时2400～3200mL过吸附柱。用2BV 30％的乙醇洗杂质，之后用6BV 80％的乙醇洗脱，收集流出液，浓缩得浓缩液。
200克300-400目硅胶用氯仿湿法上柱，取洗脱液浓缩至干的粉末与硅胶等比例拌样，上硅胶柱精制。当洗脱液(氯仿∶甲醇)组分的体积比为12∶1时，洗脱得200mg7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇粗品。
该7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇粗品溶于的流动相，用制备液相制备。流动相(乙氰∶水＝2∶3)，流速为2mL/min，检测波长为227nm，进样量为5mL。得7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇100mg，进样前把7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇粗品溶于流动相，过0.45uM微孔滤膜，制备柱为Waters DELTA PAK C18-100A(15μ，300×7.8mm)。收集保留时间23min-30min的二号峰，减压回收得100mg 7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇单体，提取率为0.05％，纯度99.9％。
实施例2
称取东北红豆杉烘干枝叶2kg，加入18L的50～60℃温水提取二次后，连续提取2次，每次30min。
同时将4kg大孔吸附树脂AB-8采用湿法装柱，保留液面，将提取药液36L通过吸附柱，以流速为每小时24～32L过吸附柱。用2BV 30％的乙醇洗杂质，之后用6BV 80％的乙醇洗脱，收集流出液，浓缩得浓缩液。
2kg 300-400目硅胶用氯仿湿法上柱，取洗脱液浓缩至干的粉末与硅胶等比例拌样，上硅胶柱精制。当洗脱液(氯仿∶甲醇)组分的体积比为12∶1时，洗脱得2g 7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇粗品。
该7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇粗品溶于的流动相，用制备液相制备。流动相(乙氰∶水＝2∶3)，流速为2mL/min，检测波长为227nm，进样量为5mL。进样前把7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇粗品溶于流动相，过0.45uM微孔滤膜，制备柱为Waters DELTAPAK C18-100A(15μ，300×7.8mm)。收集保留时间23min-30min的二号峰，减压回收得1.01g 7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇单体，提取率为0.0505％，纯度99.9％。
本试验中所用到的标准品购自Sigma公司。
结果定量检测分析采用下表条件：
| 仪器 | Waters高效液相色谱仪(Waters600泵) |
| 色谱柱 | Curosil-PFP(5μ，4.6×250mm) |
| 柱温 | 25℃ |
| 流动相 | 流动相(乙氰∶水＝2∶3) |
| 流速 | 1mL/min |
| 进样体积 | 10μL |
| 检测器及波长 | Waters2996二极管阵列检测器，检测波长为227nm |
Claims (6)
1.一种从东北红豆杉新鲜或干燥枝叶中提取纯化7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的方法，其主要特征在于：东北红豆杉新鲜或干燥枝叶中经水提取二次，所得到水提液上大孔吸附树脂富集，先用30％乙醇洗脱去杂，再用80％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至干。取洗脱液浓缩至干的粉末与硅胶等比例拌样，上硅胶柱精制。用洗脱液洗脱得7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇粗品。该粗品溶于的流动相，用制备液相制备。得纯度99.9％的7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇。
2.按照权利要求1所述的红豆杉枝叶，其特征在于：红豆杉枝叶主要来源于东北红豆杉植株的新鲜或者干燥枝叶。
3.按照权利要求1所述的提取技术，其特征在于：提取所用的溶剂为50-60℃水，提取溶剂的体积为溶质固体质量的8～10倍，连续提取2次，每次30min。采用50-60℃水提取，加快了胞内物质向溶剂中的释放，而且安全、无毒、经济。
4.按照权利要求1所述的大孔吸附树脂富集法，其特征在于：所用树脂包括D101、AB-8、AL-9及NKA系列大孔吸附树脂，该方法中大孔树脂吸附步骤采用湿法装柱，保留液面，上样液体积与大孔吸附树脂吸附剂质量比为10∶1。去杂液为3～4BV 30％乙醇洗脱去杂，洗脱液为6～8BV 80％乙醇，流速为每小时6～8mL/g树脂，收集解吸液，浓缩得浸膏。
5.按照权利要求1所述的常压硅胶柱层析技术，其特征在于：所用样品为树脂富集后得到的目标化合物浓缩膏。将该浓缩膏与硅胶等比例拌样，上300-400目硅胶柱精制，上样量与吸附剂硅胶比为1∶10。当洗脱液(氯仿∶甲醇)组分的体积比为12∶1时，洗脱得7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇粗品。
6.按照权利要求1所述的制备液相技术，其特征在于：流动相(乙氰∶水＝2∶3)，流速为2mL/min，检测波长为227nm，进样量为5mL。
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