CN108003214B - 一种从土贝母中提取的皂苷化合物及其方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从土贝母中提取的皂苷化合物及其方法和应用，以土贝母干燥块茎为原料，经乙醇提取、减压浓缩、萃取、水解、硅胶拌样、正相硅胶柱层析等步骤后提取得到的一种具有药理活性的新的药用化合物，自命名为毛果一枝黄花皂苷元F，可作为抑制肿瘤细胞生长的用途，不仅为现有肿瘤细胞的研究提供治理方案，更以土贝母为来源开发新药提供了依据。

Description

一种从土贝母中提取的皂苷化合物及其方法和应用

技术领域

本发明是一种从土贝母中提取的皂苷化合物及其方法和应用，具体涉及从土贝母药材中提取分离的具有药理活性的皂苷化合物及其方法和用途，属于植物化学技术领域。

背景技术

土贝母【Bolbostemma paniculatum (Maxim.) Franquet】为葫芦科假贝母属植物，系攀援性蔓生草本，生丁山坡或平地，是一种传统中药。假贝母属有2种、1变种，为我国特有，主产于河南、河北、山西、内蒙古、山东、陕两、甘肃、云南、四川等地，野生分布广，人工种植已获成功，产量颇丰。块茎供药用，干燥块茎质地坚硬，可长期保存。《中华人民共和国药典》2000年版记载土贝母具有散结，消肿，解毒之功效，可用于乳痈，乳腺炎，颈淋巴结结核，慢性淋巴结炎，肥厚性鼻炎等。从中分离出来的土贝母皂苷经实验证明具有抗肿瘤、抗病毒、抗促瘤等药理作用引起广泛的关注。

现有技术中，专利文献CN1273113A（土贝母苷乙用于制备预防和治疗肿瘤的药物，2000.11.15）公开了如下式（1）所示的土贝母苷乙及含该土贝母苷乙的土贝母皂苷可用于制备预防和治疗肿瘤的药物的用途。

（1）

该专利中记载了苷乙是从土贝母中提取出来的一种化学成分，是土贝母苷甲的天然衍生物；土贝母皂苷是不含土贝母苷丙的土贝母中的皂苷组分。苷乙和皂苷表现了特别的抗炎症作用，能显著抑制人恶性肿瘤细胞和小鼠移植性肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠生存期，对HL-60细胞有诱导分化效果，能对抗促癌剂对小鼠皮肤肿瘤发生的促进作用。苷乙和皂苷可用于预防和治疗哺乳动物，特别是人的各种肿瘤。

除此之外，专利文献CN1559419（土贝母皂苷丙在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用，2005.01.05）还公开了如下式（2）所示的土贝母皂苷丙在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。

（2）

该专利中，通过药效及急性毒性试验证明，从土贝母中分离纯化出的土贝母皂苷丙具有更高活性的抗癌作用，并具备广谱抗肿瘤效果，对膀胱癌、胃癌、急性髓性白血病、红白血病、肝癌、卵巢癌、直肠癌、肺癌细胞均有杀伤作用，毒副作用低，且活性比土贝母皂苷甲强，机理研究证明其主要是通过诱导细胞凋亡和影响细胞脂代谢导致坏死而对癌细胞产生作用。

由于植物来源的化合物对发现新药具有巨大的潜力，因此，近年来从植物来源的抗肿瘤药物逐渐被人们所重视，并随着对皂苷类化合物抗肿瘤机制研究的深入，人们发现，土贝母的活性成分中还尚有很大的开发前景及空间，为此，开发和研制土贝母中新的抗肿瘤药物成分势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从土贝母中提取的皂苷化合物，通过从土贝母中提取分离得到具有药理活性的新的药用化合物，为以土贝母为来源开发新药提供依据。

本发明的另一目的在于提供一种从土贝母中提取皂苷化合物的方法，以土贝母干燥块茎为原料，经乙醇提取、减压浓缩、萃取、水解、硅胶拌样、正相硅胶柱层析等步骤后提取得到一种新的药用化合物，操作步骤简单易控制，实际操作过程中，皂苷化合物的提取率可以控制在20%以上，纯度可以控制在95%以上。

本发明的另一目的在于提一种从土贝母中提取的皂苷化合物在抑制肿瘤细胞中的用途，为现有肿瘤细胞的研究提供治理方案。

本发明通过下述技术方案实现：一种从土贝母中提取的皂苷化合物，所述皂苷化合物是从土贝母干燥块茎中提取分离而得到，其结构式为：

，

其化学名称为：Olean-12-en-28-oic acid, 2,3,16,23-tetrahydroxy-, (2β,3β,4α,16α)- ，其自命名为：毛果一枝黄花皂苷元F。

所述皂苷化合物为白色粉末，无味。

所述皂苷化合物的分子式为C₃₀H₄₈O₆。

一种从土贝母中提取皂苷化合物的方法，包括以下提取步骤：

A．以土贝母干燥块茎为原料，依次经粉碎、乙醇提取、减压浓缩、萃取、过滤后，得到土贝母总皂苷；

B．将土贝母总皂苷在硫酸水浴中水解，冷却过滤后，得到水解固体；

C．将水解固体用甲醇溶解后用硅胶拌样，取硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，将含有目标化合物的收集液合并后，减压浓缩至固体，

D．将所述固体用甲醇溶解，经滤膜过滤、C18反相色谱填料高压制备分离后，收集相对应的色谱峰, 再经减压浓缩拉干后，得到皂苷化合物，所述皂苷化合物的结构式为：

。

所述步骤A中，粉碎后的土贝母干燥块茎用其重量6～12倍的浓度为60～80%W/W乙醇加热回流提取3～5次，再经减压浓缩至无醇后得到浸膏，将所述浸膏用水分散后使用正丁醇等体积萃取3～4次，正丁醇相45°浓缩至小体积后析出，过滤后，得到土贝母总皂苷。

所述步骤B中，将土贝母总皂苷用浓度为10～15%的硫酸在60～80℃的水浴中水解2～4h，静止冷却至室温，过滤后得到水解固体。

所述步骤C中，将水解固体用浓度为90～100%的甲醇溶解后，用溶解液重量2～3倍硅胶拌样。

所述步骤C中，正相硅胶柱层析的条件包括：

填料：10～20倍硅胶；

脱洗剂：二氯甲烷：甲醇=15：1～3：1；

展开剂：二氯甲烷：甲醇=7：1。

所述步骤D中，将所述固体用浓度为85～90%的甲醇溶解后，再用0.35～0.55μm滤膜过滤。

一种从土贝母中提取的皂苷化合物的应用，其特征在于：包括结构式为：

的皂苷化合物在抑制肿瘤细胞的用途。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

（1）本发明涉及的皂苷类化合物是采用提取分离的方式从现有土贝母中药材（如土贝母干燥块茎）中获得的一种新的具有药理活性的化合物，其分子式为C₃₀H₄₈O₆，自命名为毛果一枝黄花皂苷元F。

（2）本发明通过对新化合物—皂苷类化合物结构式的确定，明确了其具有药理活性，例如其结构中的五环三萜，具有广泛的消炎和抗肿瘤的生物活性，特别是3位上的羟基和28位上的羧基也具有明显的生物活性。

（3）现代药理研究表明，总皂苷提取物具有明显的抗肿瘤效果，如人参总皂苷、三七总皂苷、西洋参总皂苷以及土贝母总皂苷等，随着人们对土贝母中药材的深入研究，目前从土贝母中药材中分离出来的土贝母皂苷乙和土贝母皂苷丙都具有抗肿瘤作用，而本发明涉及的皂苷类化合物，则是从土贝母中提取得到的新的具有不同于现有提取物结构的，且同样具有抗肿瘤用途的药用化合物，丰富了现有土贝母抗肿瘤药理研究的多样性，对于制备抑制肿瘤细胞生长药物具有很好的参考价值。

（4）本发明以土贝母干燥块茎为原料，采用乙醇提取、减压浓缩、萃取、水解、硅胶拌样、正相硅胶柱层析等方式提取得到毛果一枝黄花皂苷元F，由于毛果一枝黄花皂苷元F作为一种首次报道其结构，并根据核磁二维等相关数据确定了其相对构型的新化合物，药理研究表明其对神经母细胞瘤细胞(neuroblastoma，NB)生长具有很好的抑制效果，在研制新型抗肿瘤物方面，能够作为一种潜体结构进行开发利用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

本实施例提出了一种从土贝母中提取的皂苷化合物，该皂苷化合物的分子式为C₃₀H₄₈O₆，为白色粉末，无味，具体结构如下式：

。

该皂苷化合物是从土贝母干燥块茎中提取分离而得到的，具体提取步骤如下：

A．以土贝母干燥块茎为原料，依次经粉碎、乙醇提取、减压浓缩、萃取、过滤后，得到土贝母总皂苷；

B．将土贝母总皂苷在硫酸水浴中水解，冷却过滤后，得到水解固体；

C．将水解固体用甲醇溶解后用硅胶拌样，取硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，将含有目标化合物的收集液合并后，减压浓缩至固体，

D．将所述固体用甲醇溶解，经滤膜过滤、C18反相色谱填料高压制备分离后，收集相对应的色谱峰, 再经减压浓缩拉干后，得到上述皂苷化合物。

实施例2：

本实施例提出了一种从土贝母中提取的皂苷化合物，该皂苷化合物的分子式为C₃₀H₄₈O₆，为白色粉末，无味，具体结构如下式：

。

该皂苷化合物是从土贝母干燥块茎中提取分离而得到的，具体提取步骤如下：

A．以土贝母干燥块茎为原料，粉碎后用其重量6倍的浓度为60%W/W乙醇加热回流提取3次，再经减压浓缩至无醇后得到浸膏，将所得浸膏用水分散后使用正丁醇等体积萃取3次，正丁醇相45°浓缩至小体积后析出，过滤后，得到土贝母总皂苷。

B．将步骤A得到的土贝母总皂苷，用浓度为10%的硫酸在60℃的水浴中水解2h，静止冷却至室温，过滤后得到水解固体。

C．将步骤B得到的水解固体用浓度为90%的甲醇溶解后，再用溶解液重量2倍硅胶拌样，取硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，将含有目标化合物的收集液合并后，减压浓缩至固体，其中，正相硅胶柱层析的条件包括：

填料：10倍硅胶；

脱洗剂：二氯甲烷：甲醇=15：1～3：1；

展开剂：二氯甲烷：甲醇=7：1。

D．将步骤C得到的固体用浓度为85%的甲醇溶解后，再用0.35μm滤膜过滤，C18反相色谱填料高压制备分离（A：甲醇 B：水，A：B 70:30 V/V为流动相；检测波长214nm）后，收集相对应的色谱峰, 再经减压浓缩拉干后，得到上述皂苷化合物。

实施例3：

本实施例提出了一种从土贝母中提取的皂苷化合物，该皂苷化合物的分子式为C₃₀H₄₈O₆，为白色粉末，无味，具体结构如下式：

。

该皂苷化合物是从土贝母干燥块茎中提取分离而得到的，具体提取步骤如下：

A．以土贝母干燥块茎为原料，粉碎后用其重量12倍的浓度为80%W/W乙醇加热回流提取5次，再经减压浓缩至无醇后得到浸膏，将所得浸膏用水分散后使用正丁醇等体积萃取4次，正丁醇相45°浓缩至小体积后析出，过滤后，得到土贝母总皂苷。

B．将步骤A得到的土贝母总皂苷，用浓度为15%的硫酸在80℃的水浴中水解4h，静止冷却至室温，过滤后得到水解固体。

C．将步骤B得到的水解固体用浓度为100%的甲醇溶解后，再用溶解液重量3倍硅胶拌样，取硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，将含有目标化合物的收集液合并后，减压浓缩至固体，其中，正相硅胶柱层析的条件包括：

填料：20倍硅胶；

脱洗剂：二氯甲烷：甲醇=15：1～3：1；

展开剂：二氯甲烷：甲醇=7：1。

D．将步骤C得到的固体用浓度为90%的甲醇溶解后，再用0.55μm滤膜过滤，C18反相色谱填料高压制备分离（A：甲醇 B：水，A：B 70:30 V/V为流动相；检测波长214nm）后，收集相对应的色谱峰, 再经减压浓缩拉干后，得到上述皂苷化合物。

实施例4：

本实施例提出了一种从土贝母中提取的皂苷化合物，该皂苷化合物的分子式为C₃₀H₄₈O₆，为白色粉末，无味，具体结构如下式：

。

该皂苷化合物是从土贝母干燥块茎中提取分离而得到的，具体提取步骤如下：

A．以土贝母干燥块茎为原料，粉碎后用其重量8倍的浓度为65%W/W乙醇加热回流提取4次，再经减压浓缩至无醇后得到浸膏，将所得浸膏用水分散后使用正丁醇等体积萃取3次，正丁醇相45°浓缩至小体积后析出，过滤后，得到土贝母总皂苷。

B．将步骤A得到的土贝母总皂苷，用浓度为12%的硫酸在70℃的水浴中水解4h，静止冷却至室温，过滤后得到水解固体。

C．将步骤B得到的水解固体用浓度为90%的甲醇溶解后，再用溶解液重量3倍硅胶拌样，取硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，将含有目标化合物的收集液合并后，减压浓缩至固体，其中，正相硅胶柱层析的条件包括：

填料：10倍硅胶；

脱洗剂：二氯甲烷：甲醇=15：1～3：1；

展开剂：二氯甲烷：甲醇=7：1。

D．将步骤C得到的固体用浓度为90%的甲醇溶解后，再用0.45μm滤膜过滤，C18反相色谱填料高压制备分离（A：甲醇 B：水，A：B 70:30 V/V为流动相；检测波长214nm）后，收集相对应的色谱峰, 再经减压浓缩拉干后，得到上述皂苷化合物。

实施例5：

本实施例提出了一种从土贝母中提取的皂苷化合物，该皂苷化合物的分子式为C₃₀H₄₈O₆，为白色粉末，无味，具体结构如下式：

。

该皂苷化合物是从土贝母干燥块茎中提取分离而得到的，具体提取步骤如下：

A．以土贝母干燥块茎为原料，粉碎后用其重量10倍的浓度为70%W/W乙醇加热回流提取4次，再经减压浓缩至无醇后得到浸膏，将所得浸膏用水分散后使用正丁醇等体积萃取3次，正丁醇相45°浓缩至小体积后析出，过滤后，得到土贝母总皂苷。

B．将步骤A得到的土贝母总皂苷，用浓度为10%的硫酸在70℃的水浴中水解3h，静止冷却至室温，过滤后得到水解固体。

C．将步骤B得到的水解固体用浓度为90%的甲醇溶解后，再用溶解液重量3倍硅胶拌样，取硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，将含有目标化合物的收集液合并后，减压浓缩至固体，其中，正相硅胶柱层析的条件包括：

填料：20倍硅胶；

脱洗剂：二氯甲烷：甲醇=15：1～3：1；

展开剂：二氯甲烷：甲醇=7：1。

D．将步骤C得到的固体用浓度为90%的甲醇溶解后，再用0.45μm滤膜过滤，C18反相色谱填料高压制备分离（A：甲醇 B：水，A：B 70:30 V/V为流动相；检测波长214nm）后，收集相对应的色谱峰, 再经减压浓缩拉干后，得到上述皂苷化合物。

实施例6：

本实施例提出了一种从土贝母中提取皂苷化合物的方法，具体提取步骤如下：

A．取500g土贝母干燥块茎，粉碎后加入其重量6倍的浓度为70%W/W乙醇加热回流提取5次，合并提取液后减压浓缩至无醇味，得到浓缩液300ml,将浓缩液用水分散后使用正丁醇等体积萃取3次，正丁醇相45°浓缩至小体积后析出，过滤后，得到52g土贝母总皂苷。

B．将步骤A得到的土贝母总皂苷，用浓度为15%的硫酸在80℃的水浴中水解4h，静止冷却至室温，过滤后得到水解固体。

C．将步骤B得到的水解固体用浓度为90%的甲醇溶解后，再用溶解液重量2倍硅胶拌样，所得硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，以10倍的硅胶为填料，湿法装柱，干法上样，用二氯甲烷：甲醇=15：1～3：1为洗脱剂进行常压洗脱，分管收集，每管约100ml，根据薄层层析（二氯甲烷：甲醇=7：1为展开剂，10%硫酸乙醇显色）结果，将含有目标化合物的收集液合并，于45℃减压浓缩至固体,固体重5g。

D．将步骤C得到的固体用浓度为90%的甲醇溶解后，再用0.45μm滤膜过滤，滤液经C18反相色谱填料高压制备分离（A：甲醇 B：水，A：B 70:30 V/V为流动相；检测波长214nm）后，收集相对应的色谱峰,回收甲醇，再经45℃减压浓缩拉干后，得到白色粉末0.48g，该白色粉末经分析即为皂苷化合物。

该皂苷化合物无味，分子式为C₃₀H₄₈O₆，具体结构如下式：

。

实施例7

本实施例提出了一种从土贝母中提取皂苷化合物的方法，具体提取步骤如下：

A．取500g土贝母干燥块茎，粉碎后加入其重量10倍的浓度为70%W/W乙醇加热回流提取3次，合并提取液后减压浓缩至无醇味，得到浓缩液300ml,将浓缩液用水分散后使用正丁醇等体积萃取3次，正丁醇相45°浓缩至小体积后析出，过滤后，得到60g土贝母总皂苷。

B．将步骤A得到的土贝母总皂苷，用浓度为15%的硫酸在70℃的水浴中水解3h，静止冷却至室温，过滤后得到水解固体。

C．将步骤B得到的水解固体用浓度为100%的甲醇溶解后，再用溶解液重量2倍硅胶拌样，所得硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，以10倍的硅胶为填料，湿法装柱，干法上样，用二氯甲烷：甲醇=15：1～3：1为洗脱剂进行常压洗脱，分管收集，每管约100ml，根据薄层层析（二氯甲烷：甲醇=7：1为展开剂，10%硫酸乙醇显色）结果，将含有目标化合物的收集液合并，于45℃减压浓缩至固体,固体重5.8g。

D．将步骤C得到的固体用浓度为90%的甲醇溶解后，再用0.45μm滤膜过滤，滤液经C18反相色谱填料高压制备分离（A：甲醇 B：水，A：B 70:30 V/V为流动相；检测波长214nm）后，收集相对应的色谱峰,回收甲醇，再经45℃减压浓缩拉干后，得到白色粉末0.53g，该白色粉末经分析即为皂苷化合物。

该皂苷化合物无味，分子式为C₃₀H₄₈O₆，具体结构如下式：

。

实施例8：

本实施例提出了一种从土贝母中提取皂苷化合物的方法，具体提取步骤如下：

A．取1000g土贝母干燥块茎，粉碎后加入其重量10倍的浓度为70%W/W乙醇加热回流提取3次，合并提取液后减压浓缩至无醇味，得到浓缩液300ml,将浓缩液用水分散后使用正丁醇等体积萃取3次，正丁醇相45°浓缩至小体积后析出，过滤后，得到123g土贝母总皂苷。

B．将步骤A得到的土贝母总皂苷，用浓度为12%的硫酸在70℃的水浴中水解3h，静止冷却至室温，过滤后得到水解固体。

C．将步骤B得到的水解固体用浓度为90%的甲醇溶解后，再用溶解液重量2倍硅胶拌样，所得硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，以10倍的硅胶为填料，湿法装柱，干法上样，用二氯甲烷：甲醇=15：1～3：1为洗脱剂进行常压洗脱，分管收集，每管约100ml，根据薄层层析（二氯甲烷：甲醇=7：1为展开剂，10%硫酸乙醇显色）结果，将含有目标化合物的收集液合并，于45℃减压浓缩至固体,固体重13g。

D．将步骤C得到的固体用浓度为90%的甲醇溶解后，再用0.45μm滤膜过滤，滤液经C18反相色谱填料高压制备分离（A：甲醇 B：水，A：B 70:30 V/V为流动相；检测波长214nm）后，收集相对应的色谱峰,回收甲醇，再经45℃减压浓缩拉干后，得到白色粉末1.2g，该白色粉末经分析即为皂苷化合物。

该皂苷化合物无味，分子式为C₃₀H₄₈O₆，具体结构如下式：

。

实施例9：

本实施例提出了一种从土贝母中提取皂苷化合物的方法，具体提取步骤如下：

A．取1000g土贝母干燥块茎，粉碎后加入其重量12倍的浓度为80%W/W乙醇加热回流提取5次，合并提取液后减压浓缩至无醇味，得到浓缩液300ml,将浓缩液用水分散后使用正丁醇等体积萃取4次，正丁醇相45°浓缩至小体积后析出，过滤后，得到130g土贝母总皂苷。

B．将步骤A得到的土贝母总皂苷，用浓度为10%的硫酸在60℃的水浴中水解4h，静止冷却至室温，过滤后得到水解固体。

C．将步骤B得到的水解固体用浓度为90%的甲醇溶解后，再用溶解液重量3倍硅胶拌样，所得硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，以10倍的硅胶为填料，湿法装柱，干法上样，用二氯甲烷：甲醇=15：1～3：1为洗脱剂进行常压洗脱，分管收集，每管约100ml，根据薄层层析（二氯甲烷：甲醇=7：1为展开剂，10%硫酸乙醇显色）结果，将含有目标化合物的收集液合并，于45℃减压浓缩至固体,固体重13.4g。

D．将步骤C得到的固体用浓度为90%的甲醇溶解后，再用0.45μm滤膜过滤，滤液经C18反相色谱填料高压制备分离（A：甲醇 B：水，A：B 70:30 V/V为流动相；检测波长214nm）后，收集相对应的色谱峰,回收甲醇，再经45℃减压浓缩拉干后，得到白色粉末1.4g，该白色粉末经分析即为皂苷化合物。

该皂苷化合物无味，分子式为C₃₀H₄₈O₆，具体结构如下式：

。

上述实施例6～9涉及的分析过程如下：

该皂苷化合物的电喷雾电离质谱ESI-MS显示：正离子 527.34[M+Na]⁺，负离子503.37[M-H]^-,即该化合物分子量为504；且高分辨质谱给出的准分子离子峰为：527.3426[M+Na]⁺，计算值为527.3433 [M+Na]⁺，分子式为C₃₀H₄₈O₆。

在¹HNMR ^δppm中1.57（3H，s），1.55（3H，s），1.32（3H，s），1.30（3H，s），1.00（3H，s），0.96（3H，s）均为甲基氢信号，其中各个峰均为单峰，说明它们是与一个季碳相连。

13CNMR给出了30个碳信号，结合DEPT135。δ45.1，42.7，37.5，45.2，54.2，33.6为季碳信号，δ71.6，72.9，48.3，51.6，70.7为次甲基碳信号，δ45.4，18.3，34.8，22.8，25.9，36.4，42.2，36.9，28.0，67.4为亚甲基碳信号，δ14.3，18.4，18.8，25.2，32.6，24.9为甲基碳信号。其中δ179.0为羰基碳信号，δ136.7，127.0为双键碳信号。

根据HSQC与HMBC，δ_H 1.00（δ_C 32.6）与δ_C 34.5相关，δ_H 1.55（δ_C25.2）与δ_C34.5相关，说明δ_H 1.00，1.55这两个甲基是与季碳δ_C34.5相连；δ_H 1.32（δ_C 14.3）与δ_C 45.1相关，提示δ_H 1.32该甲基信号是与季碳δ_C 45.1相连；δ_H 1.57（δ_C 18.4）与δ_C 37.5相关，提示δ_H 1.57该甲基信号是与季碳δ_C 37.5相连；δ_H 1.30（δ_C 18.8）与δ_C 45.2相关，提示δ_H 1.30该甲基信号是与季碳δ_C 45.2相连。

通过核磁二维HSQC，HMBC，H-HCOSY，NOESY等分析技术手段，对该化合物碳氢进行了全归属（见下表1），并根据它们的相关性，确定该化合物的结构。

表1 化合物NMR数据归属

通过以上数据分析，该化合物为：

Olean-12-en-28-oic acid, 2,3,16,23-tetrahydroxy-, (2β,3β,4α,16α)- ，其自命名为：毛果一枝黄花皂苷元F。

实施例10：

本实施例提出了一种从土贝母中提取的皂苷化合物在抑制肿瘤细胞的用途。

本实施例中涉及的皂苷化合物是采用提取分离方式从土贝母干燥块茎中得到的新的具有药理活性的化合物。具体涉及的提取分离过程如下：

A．取800g土贝母干燥块茎，粉碎后加入其重量10倍的浓度为70%W/W乙醇加热回流提取4次，合并提取液后减压浓缩至无醇味，得到浓缩液300ml,将浓缩液用水分散后使用正丁醇等体积萃取3次，正丁醇相45°浓缩至小体积后析出，过滤后，得到8.3g土贝母总皂苷。

B．将步骤A得到的土贝母总皂苷，用浓度为10%的硫酸在70℃的水浴中水解4h，静止冷却至室温，过滤后得到水解固体。

C．将步骤B得到的水解固体用浓度为100%的甲醇溶解后，再用溶解液重量2倍硅胶拌样，所得硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，以20倍的硅胶为填料，湿法装柱，干法上样，用二氯甲烷：甲醇=15：1～3：1为洗脱剂进行常压洗脱，分管收集，每管约100ml，根据薄层层析（二氯甲烷：甲醇=7：1为展开剂，10%硫酸乙醇显色）结果，将含有目标化合物的收集液合并，于45℃减压浓缩至固体,固体重7.8g。

D．将步骤C得到的固体用浓度为88%的甲醇溶解后，再用0.45μm滤膜过滤，滤液经C18反相色谱填料高压制备分离（A：甲醇 B：水，A：B 70:30 V/V为流动相；检测波长214nm）后，收集相对应的色谱峰,回收甲醇，再经45℃减压浓缩拉干后，得到白色粉末0.92g，该白色粉末即为皂苷化合物，无味，分子式为C₃₀H₄₈O₆，具体结构如下式：

。

对上述皂苷化合物进行的研究表明，该化合物具有一定的药理活性，例如其结构中的五环三萜，具有广泛的消炎和抗肿瘤的生物活性，特别是3位上的羟基和28位上的羧基也具有明显的生物活性等，其药物用途有抑制肿瘤细胞的生长。

对本实施例涉及的皂苷化合物进行抑制肿瘤细胞实验：

用MTT法测定化合物对神经母细胞瘤细胞(neuroblastoma，NB)的抑制效果。把培养好的神经母细胞瘤细胞制成单细胞悬液，用细胞板计数并稀释至细胞浓度为6×10⁴个/mL.于96孔板中接种细胞，每孔80uL。另设2孔无细胞、仅有80uL培养液[Dulbecco’smodified Eagle’s media (DMEM,Gibeo,USA)+10%小牛血情]的用于仪器调零的空白对照孔。置37℃,5%CO₂的培养箱中培养24h，然后加入20uL用培养液稀释好的样品。同时，往阳性对照孔加20uL顺铂，往阴性对照孔和空白对照孔各加入20uL培养液。继续培养72h，每孔加10uL5mg/mL MTT。37℃反应4h，每孔加100uL 10%SDS-0.01moL/L HCL溶液过夜。酶标仪比色测定（测定波长570nm，参考波长655nm）。对肿瘤细胞的抑制率计算方法为（阴性对照组0D值-实验组OD值）/（阴性对照组0D值-空白组OD值）×100%。采用SPSS软件计算IC₅₀值。实验表明，化合物对神经母细胞瘤细胞的IC₅₀值为0.162mM，化合物显示了较强的抑制神经母细胞瘤细胞的活性。可见，本实施例所述的皂苷化合物可作为抗肿瘤药物或其他生物活性先导物。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从土贝母中提取的皂苷化合物，其特征在于：所述皂苷化合物是从土贝母干燥块茎中提取分离而得到，其结构式为：

。

2.根据权利要求1所述的一种从土贝母中提取的皂苷化合物，其特征在于：所述皂苷化合物为白色粉末，无味。

3.根据权利要求1所述的一种从土贝母中提取的皂苷化合物，其特征在于：所述皂苷化合物的分子式为C₃₀H₄₈O₆。

4.一种从土贝母中提取皂苷化合物的方法，其特征在于：包括以下提取步骤：

A．以土贝母干燥块茎为原料，依次经粉碎、乙醇提取、减压浓缩、萃取、过滤后，得到土贝母总皂苷；

B．将土贝母总皂苷在硫酸水浴中水解，冷却过滤后，得到水解固体；

C．将水解固体用甲醇溶解后用硅胶拌样，取硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，将含有目标化合物的收集液合并后，减压浓缩至固体，

D．将所述固体用甲醇溶解，经滤膜过滤、C18反相色谱填料高压制备分离后，收集相对应的色谱峰, 再经减压浓缩拉干后，得到皂苷化合物，所述皂苷化合物的结构式为：

。

5.根据权利要求4所述的一种从土贝母中提取皂苷化合物的方法，其特征在于：所述步骤A中，粉碎后的土贝母干燥块茎用其重量6～12倍的浓度为60～80%W/W乙醇加热回流提取3～5次，再经减压浓缩至无醇后得到浸膏，将所述浸膏用水分散后使用正丁醇等体积萃取3～4次，正丁醇相45℃浓缩至小体积后析出，过滤后，得到土贝母总皂苷。

6.根据权利要求4所述的一种从土贝母中提取皂苷化合物的方法，其特征在于：所述步骤B中，将土贝母总皂苷用浓度为10～15%的硫酸在60～80℃的水浴中水解2～4h，静止冷却至室温，过滤后得到水解固体。

7.根据权利要求4所述的一种从土贝母中提取皂苷化合物的方法，其特征在于：所述步骤C中，将水解固体用浓度为90～100%的甲醇溶解后，用溶解液重量2～3倍硅胶拌样。

8.根据权利要求4所述的一种从土贝母中提取皂苷化合物的方法，其特征在于：所述步骤C中，正相硅胶柱层析的条件包括：

填料：10～20倍硅胶；

脱洗剂：二氯甲烷：甲醇=15：1～3：1；

展开剂：二氯甲烷：甲醇=7：1。

9.根据权利要求4所述的一种从土贝母中提取皂苷化合物的方法，其特征在于：所述步骤D中，将所述固体用浓度为85～90%的甲醇溶解后，再用0.35～0.55μm滤膜过滤。

10.一种从土贝母中提取的皂苷化合物的应用，其特征在于：包括结构式为：

的皂苷化合物在制备抑制肿瘤细胞药物中的用途。