CN102040500B - 一种黄腐酚和黄酮类化合物的萃取分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种黄腐酚和黄酮类化合物的萃取分离方法，步骤如下：用乙醇的溶液浸提酒花及其超临界CO₂萃余物，使其中黄酮类化合物尤其是黄腐酚充分溶出；浸提后过滤得滤液，将其减压蒸馏得浓缩液；将浓缩液离心后，取上清液，用0.45μL有机膜过滤，除去部分杂质，用洗脱剂将黄酮类化合物从大孔吸附树脂上洗脱下来，收集流出液，浓缩，冷冻干燥，得黄色粉末。本发明的原料为酒花及其超临界CO₂萃余物等，尤其是将酒花制品加工过程中的废料-超临界CO₂酒花浸膏萃余物作为主要原料，不但将有主要功效且难以分离的黄腐酚单独提取出来，而且将酒花废料富含的其他黄酮类化合物也一并提取出来，对不能用于啤酒酿造中的酒花也提供了一种开发途径，提高酒花资源利用率和附加值，延长酒花产业链具有重要意义。

Description

一种黄腐酚和黄酮类化合物的萃取分离方法

技术领域

本发明属于黄酮类化合物的分离纯化领域，尤其是一种黄腐酚和黄酮类化合物的萃取分离方法。

背景技术

啤酒花(Humulus lupulus L)又名忽布，属于桑科葆草属多年生草本植物，是酿造啤酒的主要原料之一，它能使啤酒具有独特的香气和苦味，以及防腐作用，与麦汁共沸时能促进蛋白质凝固，有利于麦汁的澄清，增强啤酒的非生物稳定性和泡持性等。啤酒花也是一种使用历史悠久的药食同源植物，酒花中含有树脂、酒花油、多酚、黄酮等多种药理成分，具有抗菌，镇静，治疗结核、神经衰弱、麻风等药理功能。

啤酒酿造中使用的酒花制品可以分为全酒花、酒花粉、颗粒酒花、酒花浸膏等。前三种制品均含有大量的黄酮化合物，采用超临界二氧化碳方法制备的酒花浸膏是将酒花中的有效成分萃取出来而制成的浓缩了5～10倍有效成分的树脂浸膏，因黄酮类化合物有一定的极性，不易被萃取，故采用超临界二氧化碳法制备的酒花浸膏中基本不含有黄酮类化合物，大量的黄酮等物质存在于二氧化碳酒花浸膏萃余物中。研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化作用、保护心血管等多种活性作用；黄腐酚是一种存在于酒花中独特的异戊二烯类黄酮化合物，它不仅具有抗氧化、抗病毒和雌激素作用，而且还具有预防癌症和抑制癌细胞增殖的作用。此外，黄腐酚还具有预防、治疗糖尿病和动脉粥样硬化的作用。超临界二氧化碳酒花萃余物目前主要被用做饲料，大量的黄酮化合物没有得到有效的利用，造成一定的资源浪费。

目前，富集、纯化酒花及其超临界CO2酒花浸膏萃余物中黄腐酚和其他黄酮类化合物的方法多采用大孔吸附树脂、柱色谱法等，但大多只注重黄腐酚的分离纯化而忽略了酒花中其他黄酮类化合物，造成了资源浪费，或提取纯度不高，工艺复杂等问题，难以满足医药、保健品等行业对黄腐酚及黄酮类化合物纯度要求较高的的需要。

据检索，发现两篇与专利相关的专利文献，其中CN101337876公开了“一种从啤酒花中提取黄腐酚的方法”，包括如下步骤：(1)将啤酒花粉碎；(2)将100g粉碎的啤酒花用800-2000mL石油醚回流提取，提取温度60-65℃，提取时间0.5-1小时，过滤除去石油醚溶液，重复提取2-3次，得到脱脂啤酒花；(3)将上述脱脂啤酒花用800-2000mL体积浓度90～100％的乙醇进行超声提取，超声功率200W，提取温度55-65℃，提取时间30-50分钟，提取液过滤，重复提取2-3次，合并滤液、减压浓缩至稠膏；(4)在上述稠膏中加入250-350mL乙酸乙酯，搅拌，溶解后加入150-250mL水进行分配，静置分层，分离两相，弃去水相，乙酸乙酯相重复加水分配2-3次，而后乙酸乙酯相减压浓缩，真空干燥，得黄腐酚粗提物；(5)将上述黄腐酚粗提物进行第一步高速逆流色谱分离，分离溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，其体积比为5∶4∶4.8∶4，上相为固定相，下相为流动相，按紫外检测图谱收集目标流分；(6)将目标流分真空浓缩回收溶剂后，进行第二步高速逆流色谱分离，分离溶剂体系为正己烷-正丁醇-甲醇-水，其体积比为3.6∶1∶1.8∶3，上相为固定相，下相为流动相，按紫外检测图谱收集黄腐酚流分，真空浓缩、冷冻干燥得到粉末状黄腐酚。专利申请CN101492357公开了“一种二氧化碳萃取酒花残渣中黄腐酚的富集方法”，该方法包括以下步骤：(1)用40～60％的低级醇或丙酮溶液浸提二氧化碳萃取后的酒花残渣，使其中含有黄腐酚的黄酮类化合物充分溶解；(2)浸提后过滤收集溶液，减压蒸馏回收低级醇或丙酮；(3)将水溶液用吸附树脂处理，含有黄腐酚的黄酮类化合物被吸附树脂吸附，杂质成分用水冲洗出吸附柱后，用有机溶剂洗脱剂将含有黄腐酚的黄酮类化合物从吸附柱上洗脱下来，洗脱剂采用50％～99％的甲醇、乙醇或丙酮水溶液；(4)洗脱液真空蒸馏回收有机溶剂，浓缩后的水溶液经喷雾干燥，得到富集了黄腐酚的黄色粉末。

经过比较，本专利的第一个专利的主要区别是：(1)CN101337876专利主要采用高速逆流色谱分离，要进行二次分离才能达到分离，较为繁琐；而用大孔吸附树脂法较为简单，并采用液滴收集器进行收集，通过全波长扫描和TLC分析来提高分离度，只需要一次分离即可达到效果；(2)不采用石油醚、甲醇等有毒的有机试剂，主要采用工业乙醇溶液，毒性和成本都比较低，更有利用黄腐酚的工业化生产。本专利的第二个专利的主要区别是：(1)本专利在装柱之前进行一定的除杂，通过离心、过有机滤膜等除去部分杂质；(2)CN101492357专利虽采用大孔吸附树脂，但流出液没有通过一些定性手段如全波长扫描和TLC分析，导致分离度不高，杂质较多，黄腐酚和总黄酮含量较低，不能满足医药、保健品等行业的需要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种纯度高、提取工艺简单的一种黄腐酚和其他黄酮化合物的萃取分离方法，本方法采用大孔吸附树脂提取酒花及其超临界CO₂萃余物中黄腐酚和其他黄酮类化合物。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种黄腐酚和黄酮类化合物的萃取分离方法，步骤如下：

(1)用3-5倍原料重量的60％-100％的乙醇水溶液浸提酒花及其超临界CO₂萃余物两次，浸提温度为50-100℃，每次1-1.5h，合并滤液后过滤，减压蒸馏浓缩并收集滤液；

(2)将浓缩液在3500r/min下离心10min，取上清液，将上清液重复2-3次，离心，最终用0.45μL膜过滤，除去滤渣，留滤液；

(3)将预处理过的大孔吸附树脂装入层析柱，将滤液加至层析柱上部，流速为1-3mL/min，先用水洗脱将部分杂质，50％-70％-100％三个梯度的乙醇溶液，所有量为柱体积的2-4倍，洗脱流速为1.5mL/min；

(4)每管收集柱体积的1％-2％，用薄层色谱法和颜色方法确定其中是否含有黄酮类物质，并经全波长扫描确定哪些流分中含有黄腐酚；

(5)合并洗脱液，真空蒸馏并回收有机试剂，浓缩后的水溶液经冷冻干燥，得到黄色的黄腐酚和黄酮类化合物粉末。

而且，所述大孔吸附树脂为非极性树脂X-5、非极性树脂ADS-8、弱极性树脂AB-8、中极性树脂ADS-17或极性较大树脂ADS-F8。

本发明的优点和效果是：

1、本发明的分离原理为依靠大孔吸附树脂和被吸附的分子(吸附质)之间的范德华引力，通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作，使有机化合物根据吸附力及其分子量大小经溶剂的洗脱而分开，达到分离、纯化、除杂、浓缩等目的，本发明分离得到黄腐酚纯度在90％以上，其他黄酮化合物的含量在30％左右，可满足分析、医药、保健品等行业的需要，其他黄酮化合物也能基本满足分析、医药、保健品等行业的需要。

2、本发明的原料为酒花及其超临界CO₂萃余物等，尤其是将酒花制品加工过程中的废料-超临界CO₂酒花浸膏萃余物作为主要原料，不但将有主要功效且难以分离的的黄腐酚单独提取出来，而且将酒花废料富含的其他黄酮类化合物也一并提取出来，对不能用于啤酒酿造中的酒花也提供了一种开发途径，提高酒花资源利用率和附加值，延长酒花产业链具有重要意义。

3、本发明在大孔吸附树脂分离过程中采用不同浓度的乙醇梯度洗脱方法，不仅有效的节约资源，而且有效地提高了黄酮化合物的洗脱率，使提取更加充分。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明思想为：将酒花及其超临界CO2萃余物在一定的溶剂体系下提取，旋蒸；提取液离心，过膜，旋蒸；将一定量的提取物装入到大孔吸附树脂中，采用不同洗脱剂进行梯度洗脱，按照一定剂量依次收集洗脱液，经全扫描波长初步检测，收集相应部分洗脱液，旋蒸，得到需要的黄腐酚和其他黄酮类化合物。

本发明根据大孔吸附树脂是以苯乙烯和丙酸酯为单体，加入乙烯苯为交联剂，甲苯、二甲苯为致孔剂，它们相互交联聚合形成了多孔骨架结构，其分离原理即依靠它和被吸附的分子(吸附质)之间的范德华引力，通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作，使有机化合物根据有吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱分开而达到分离、纯化、除杂、浓缩等目的。

一种黄腐酚和黄酮类化合物的萃取分离方法，尤其是一种从酒花及其超临界CO₂萃余物中分离纯化黄腐酚和其他黄酮化合物方法，步骤如下：

1、酒花及其超临界CO₂萃余物的提取：称取50g酒花及其超临界CO2萃余物原料，加入到1000mL的30％-60％的乙醇溶液中，在70℃水浴中搅拌下加热90min，冷却、0.45μL有机膜抽滤；按上述步骤再提取一次，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩；

2、除杂质：将浓缩液在3500r/min下离心10min，取上层溶液；将上层溶液按照上述步骤，再次离心，取上层溶液，经0.45μl膜过滤，滤液用旋转蒸发液浓缩；

3、装柱：取50-150g大孔吸附树脂，将其浸泡在95％的乙醇溶液中，搅拌，使其充分溶胀，在层析柱底部预先放入脱脂棉，加入20mL蒸馏水，将溶胀的大孔吸附度树脂缓慢倾入，待其自然沉降完全；

其中大孔吸附树脂为非极性树脂如X-5和ADS-8、弱极性树脂AB-8、中等极性树脂ADS-17和极性较大树脂ADS-F8。

4、洗脱：将大孔吸附树脂中多余的水排出，直到接近液面1cm，将5mL 0.3g/mL浓度(浓度指的是酒花粗提物粉末和水溶液液体的比例，即g/ml)的样品，用滴管滴加到柱内，先用水洗脱，再用50％-100％的溶剂体系作为洗脱剂洗脱，流速为1-2mL/min，主要采用50％-70％-100％三个梯度的乙醇溶液，所有量为柱体积的2-4倍。

5、收集：每5mL收集一管，每管样品先用全波长扫描确认是否含有黄腐酚，若无再定性确定是否为黄酮类化合物，合并滤液，真空蒸馏并回收有机试剂，浓缩后的水溶液经冷冻干燥，得到黄色具有特殊香味的黄腐酚和其他的黄酮化合物粉末。用液相色谱检测黄腐酚组分，计算黄腐酚纯度为91.3％；用亚硝酸钠-硝酸铝法检测总黄酮的含量，计算其他黄酮类化合物纯度为33.6％。

本发明中涉及的黄酮类化合物主要包括槲皮素、山奈酚及其芦丁等。

Claims (1)

1.一种黄腐酚的萃取分离方法，其特征在于：步骤如下：

⑴酒花及其超临界CO₂萃余物的提取：称取50g酒花及其超临界CO₂萃余物原料，加入到1000mL的30%-60%的乙醇溶液中，在70℃水浴中搅拌下加热90min，冷却、0.45μL有机膜抽滤；按上述步骤再提取一次，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩；

⑵除杂质：将浓缩液在3500r/min下离心10min，取上层溶液；将上层溶液按照上述步骤，再次离心，取上层溶液，经0.45μL膜过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩；

⑶装柱：取50-150g大孔吸附树脂，将其浸泡在95%的乙醇溶液中，搅拌，使其充分溶胀，在层析柱底部预先放入脱脂棉，加入20mL蒸馏水，将溶胀的大孔吸附度树脂缓慢倾入，待其自然沉降完全；

其中，所述大孔吸附树脂为非极性树脂X-5、非极性树脂ADS-8、弱极性树脂AB-8、中极性树脂ADS-17或极性较大树脂ADS-F8；                                                       

⑷洗脱：将大孔吸附树脂中多余的水排出，直到接近液面1cm，将5mL 0.3g/mL浓度的样品，用滴管滴加到柱内，先用水洗脱，再用50%-100%的溶剂体系作为洗脱剂洗脱，流速为1-2 mL/min，主要采用50%-70%-100%三个梯度的乙醇溶液，所有量为柱体积的2-4倍；

其中，所述浓度指的是酒花粗提物粉末和水溶液液体的比例，即g/ml；

⑸收集：每5mL收集一管，每管样品先用全波长扫描确认是否含有黄腐酚，若无再定性确定是否为黄酮类化合物，合并滤液，真空蒸馏并回收有机试剂，浓缩后的水溶液经冷冻干燥，得到黄色具有特殊香味的黄腐酚和黄酮类化合物粉末；用液相色谱检测黄腐酚组分，计算黄腐酚纯度为91.3%；用亚硝酸钠-硝酸铝法检测总黄酮的含量，计算黄酮类化合物纯度为33.6%；

其中，所述黄酮类化合物主要包括槲皮素、山奈酚及其芦丁等。