CN103288898B - 新芒果苷对照品提取纯化分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新芒果苷对照品提取纯化分离方法，旨在提供一种分离方法提纯简单，得到的产品纯度高的新芒果苷对照品提取纯化分离方法，该方法依次包括下述步骤：1）首先将知母药材粗碎，加入70%乙醇后渗漉提取，收集渗漉提取液，浓缩后过滤收集滤液，加纯化水稀释得到上柱样品液，最后将样品液通入色谱柱中，洗脱，收集20%乙醇洗脱部分的洗脱液，减压浓缩，再静置过滤；2）首先采用聚酰胺吸附，再通过Sephadex？LH20吸附，制得新芒果苷提纯后粗品；3）将步骤2）制备的新芒果苷提纯后粗品，加水溶解，用半制备高效液相分离，收集第一个馏分即得；属于中草药分离技术领域。<!--1-->
Description
技术领域
本发明公开了一种新芒果苷提取纯化分离方法，具体的说，是新芒果苷对照品提取纯化分离方法，属于中草药分离技术领域。
背景技术
知母为百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的根茎，具有清热泻火，滋阴润燥的功效，用于外感热病，高热烦渴，肺热燥咳，骨蒸潮热，内热消渴，肠燥便秘。知母含有皂苷、黄酮及木脂素等多种成分；黄酮类有效成分新芒果苷、芒果苷是知母清热作用的有效成分，还具有抗炎、抗病毒、抗抑郁等药理作用。
中国专利CN03115509.X公开了一种从知母中提取新芒果苷和芒果苷的方法，但是该方法所提取的物质为混合物，没有将这两种物质分离，这给临床应用带来了一定的困难，不利于后期应用，也没有任何人对新芒果苷对照品提取纯化分离方法提出过系统有效的方法。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种分离提纯方法简单，得到的产品纯度高的新芒果苷对照品提取纯化分离方法。
为解决上述技术问题，本发明的的技术方案是这样的：该新芒果苷对照品提取纯化分离方法，依次包括下述步骤：
1)提取
首先将知母药材粗碎，在室温条件下，每千克知母药材加入一升70％乙醇浸润20～28h小时后渗漉提取，收集药材质量12倍量渗漉提取液，将得到渗漉提取液浓缩至在60℃时，相对密度为1.2的浓缩液，过滤浓缩液，收集滤液加蒸馏水稀释该体积数等于开始加入70％乙醇的体积数，即为上柱样品液，最后将样品液按0.5BV上样量通入装有树脂的色谱柱中，依次用2BV的纯化水、1BV的10％乙醇、3BV的20％乙醇、2BV的70％乙醇、2BV的95％乙醇洗脱，收集20％乙醇洗脱部分的洗脱液，减压浓缩至乙醇完全除去，静置12小时，过滤，得到样品液；
2)纯化
首先采用聚酰胺吸附
将步骤1)的得到样品液按0.1BV上样量通入装有聚酰胺的色谱柱中，用4BV的30％乙醇洗脱，收集0.5～3BV洗脱部分的洗脱液，在减压浓缩后，干燥，为新芒果苷粗品；
在新芒果苷粗品加水稀释至新芒果苷粗品质量的两倍后滤膜过滤，得上样药液；然后将该上样药液按0.15BV上样量通入装有SephadexLH20的色谱柱中，依次用12BV的纯化水、4BV甲醇、5BV纯化水洗脱，收集12BV纯化水洗脱部分的洗脱液，减压浓缩后干燥，重复SephadexLH20吸附过程3次，得到新芒果苷提纯后粗品；
3)分离
将步骤2)制备的新芒果苷提纯后粗品，加水溶解，制成含新芒果苷20mg/ml的溶液，用半制备高效液相分离，流动相为体积比为14∶86的乙腈和2％醋酸，波长为315nm，收集第一个馏分即得。
上述的新芒果苷对照品提取纯化分离方法，步骤1)所述的渗漉提取时的渗漉速度为每千克药材每分钟收集渗漉液量4ml。
上述的新芒果苷对照品提取纯化分离方法，步骤1)所述的渗漉提取液浓缩时采用旋转薄膜浓缩仪-0.06～-0.1Mpa减压浓缩。
进一步的，上述的新芒果苷对照品提取纯化分离方法，步骤2)所述的洗脱速度均为20ml/min。
进一步的，上述的新芒果苷对照品提取纯化分离方法，步骤2)所述的滤膜过滤时采用0.45um滤膜。
与现有技术相比，本发明不用甲醇为溶剂而改为用水，不仅让研发人员少接触有害物质，也有利于环保；也阻止甲醇对新芒果苷某些基团的攻击，从而达到不容易分解，不导致出现另一个峰，所纯化的新芒果苷对照品纯度可达98.5％以上。
附图说明
图1是本发明分离后的对照品的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。
实施例1
1、提取
知母药材粗碎，在室温条件下，以70％乙醇1∶1(溶剂体积升：药材重量千克)浸润20-28小时(最佳提取时间24小时)后渗漉提取，渗漉速度为每千克药材每分钟收集渗漉液量4ml提取，收集12倍量渗漉液，即为提取液。提取液用旋转薄膜浓缩仪在-0.06～-0.1Mpa减压浓缩到相对密度为1.2(60℃)；浓缩液过滤，滤液加蒸馏水稀释到1.0∶1(药材重量千克∶溶液体积升)，即为上柱样品液。将样品液按0.5BV上样量通入装有树脂的色谱柱中，依次用2BV的纯化水、1BV的10％乙醇、3BV的20％乙醇、2BV的70％乙醇、2BV的95％乙醇洗脱，收集20％乙醇洗脱部分；20％乙醇洗脱液减压浓缩至无醇味，静置12小时，过滤，得到样品液。2、纯化
2.1、聚酰胺吸附
将样品液按0.1BV上样量通入装有聚酰胺的色谱柱中，用约4BV的30％乙醇洗脱，洗脱速度为：20ml/min；收集0.5～3BV洗脱部分；洗脱液减压浓缩后，干燥，为新芒果苷粗品。
2.2、SephadexLH20吸附
将新芒果苷粗品加新芒果苷粗品质量一倍的水溶解，0.45um滤膜过滤，为上样药液。将样品液按0.15BV上样量通入装有SephadexLH20的色谱柱中，依次用约12BV的纯化水、4BV甲醇、5BV纯化水洗脱，洗脱速度为：2ml/min；收集12BV纯化水洗脱部分；洗脱液减压浓缩后，干燥，为新芒果苷粗品，依法用SephadexLH20纯化三次。
3、分离
将制备的取新芒果苷提纯后粗品，加水溶解，制成含新芒果苷20mg/ml的溶液，用半制备高效液相分离，流动相为体积比为14∶86的乙腈和2％醋酸，波长为315nm，收集第一个馏分即得。
4、结果
参阅图1和表1，可以看出经以上方法提纯得到的新芒果苷对照品纯度可达98.5％以上，符合对照品使用要求。不用甲醇为溶剂溶解样品，会致使新芒果苷分解而出现2个峰。新芒果苷加热温度不能超过50℃，会导致新芒果苷分解而出现2个峰。
表1
检测器ACh1315nm
| 峰# | 保留时间min | 面积 | 分离度 | 拖尾因子 | 理论塔板# | 面积％ |
| 1 | 3.765 | 2479712 | 0.000 | 1.109 | 3980.181 | 99.869 |
| 2 | 5.108 | 2098 | 4.438 | 0.000 | 3102.809 | 0.085 |
| 3 | 5.530 | 1143 | 0.189 | 0.000 | 29.281 | 0.046 |
| 总计 | 2482953 | 100.000 |
Claims (5)
1.一种新芒果苷对照品提取纯化分离方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
1)提取
首先将知母药材粗碎，在室温条件下，每千克知母药材加入一升70％乙醇浸润20～28h小时后渗漉提取，收集药材质量12倍量渗漉提取液，将得到渗漉提取液浓缩至在60℃时，相对密度为1.2的浓缩液，过滤浓缩液，收集滤液加蒸馏水稀释体积数等于开始加入70％乙醇的体积数，即为上柱样品液，最后将样品液按0.5BV上样量通入装有树脂的色谱柱中，依次用2BV的纯化水、1BV的10％乙醇、3BV的20％乙醇、2BV的70％乙醇、2BV的95％乙醇洗脱，收集20％乙醇洗脱部分的洗脱液，减压浓缩至乙醇完全除去，静置12小时，过滤，得到样品液；
2)纯化
首先采用聚酰胺吸附
将步骤1)的得到样品液按0.1BV上样量通入装有聚酰胺的色谱柱中，用4BV的30％乙醇洗脱，收集0.5～3BV洗脱部分的洗脱液，在减压浓缩后，干燥，为新芒果苷粗品；
在新芒果苷粗品加水稀释至新芒果苷粗品质量的两倍后滤膜过滤，得上样药液；然后将该上样药液按0.15BV上样量通入装有SephadexLH20的色谱柱中，依次用12BV的纯化水、4BV甲醇、5BV纯化水洗脱，收集12BV纯化水洗脱部分的洗脱液，减压浓缩后干燥，重复SephadexLH20吸附过程3次，得到新芒果苷提纯后粗品；
3)分离
将步骤2)制备的新芒果苷提纯后粗品，加水溶解，制成含新芒果苷20mg/ml的溶液，用半制备高效液相分离，流动相为体积比为14∶86的乙腈和2％醋酸，波长为315nm，收集第一个馏分即得。
2.根据权利要求1所述的新芒果苷对照品提取纯化分离方法，其特征在于，步骤1)所述的渗漉提取时的渗漉速度为每千克药材每分钟收集渗漉液量4ml。
3.根据权利要求1所述的新芒果苷对照品提取纯化分离方法，其特征在于，步骤1)所述的渗漉提取液浓缩时采用旋转薄膜浓缩仪-0.06～-0.1Mpa减压浓缩。
4.根据权利要求1所述的新芒果苷对照品提取纯化分离方法，其特征在于，步骤2)所述的洗脱速度均为20ml/min。
5.根据权利要求1所述的新芒果苷对照品提取纯化分离方法，其特征在于，步骤2)所述的滤膜过滤时采用0.45um滤膜。
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