CN101496845B - 一种白花蛇舌草提取物及其分离制备方法 - Google Patents
一种白花蛇舌草提取物及其分离制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种白花蛇舌草提取物及其分离制备方法,其中主要成分为鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷,所述的四种主要成分总含量在60%-75%。白花蛇舌草药材经提取、醇沉、膜分离、非极性大孔树脂分离和工业色谱分离等步骤,获得提取物。本制备方法可有效的去除糖蛋白、多糖、氨基酸等杂质,提高了主要活性成分的含量。制备过程重复性高和可操作性好,易于实现标准化和产业化,同时对于白花蛇舌草药材的质量控制也有一定的指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物的分离,具体的说是白花蛇舌草提取物分离制备方法,该组分主要成分是鸡矢藤苷甲酯,去乙酰基车叶草苷酸甲酯,车叶草苷酸和车叶草苷四个化合物。
背景技术
中药白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草Hedyotis diffusaWilld.又名Oldenlandia diffusa Roxb.的全草。始载于《广西中药志》,具有清热解毒、活血化瘀、利水渗湿、消肿止痛、抗肿瘤等作用,广泛用于肿瘤、黄疸性肝炎、肠炎和肺炎等的治疗。主产于广东、广西、福建等地。白花蛇舌草的主要成分是环烯醚萜类、黄酮类和蒽醌类化合物,其次为有机酸类、甾醇类化合物等。白花蛇舌草中常见的环烯醚萜类化合物主要有鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷和鸡矢藤苷等。药理研究表明,白花蛇舌草具有抗氧化,消炎抗菌、抗肿瘤、免疫调节等多种药理活性(Lin C.C.,Ng L.T.and Yang J.J.,Am.J.Chin.Med.,2004,32:339-349;Lin C.C.,Ng L.T.,Yang J.J.and Hsu Y.F,Am.J.Chin.Med.,2002,30:225-234;赵浩如等,中国药科大学学报,2002,33(6):510-513;Yoshida Y.,Wang M.Q.et al.,Int.J.Immunopharmaclo.1997,19:359-370)。同时白花蛇舌草中环烯醚萜类化合物还具有神经保护作用(KimY.,Park E.J.,et al.,J.Nat.Prod.,2001,64:75-78)。由于白花蛇舌草在抗肿瘤方面的功效,越来越引起人们的关注。
白花蛇舌草及其制剂主要用于呼吸系统感染、肝炎、肺炎、肿瘤等的治疗。环烯醚萜类化合物是白花蛇舌草中主要活性成分之一,而目前报道的分离制备烯醚萜类化合物的方法,基本上都是采取传统的溶剂萃取、硅胶柱层析等方法,这些方法存在重现性差、耗时长、有机残留严重、检测手段落后、自动化程度低、无法大规模生产等缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种白花蛇舌草提取物及其分离制备方法,其中主要成分为鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷四个主要的化合物。
本发明提供一种白花蛇舌草提取物,其中主要成分为鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷,所述的四种主要成分总含量在60%-75%。
本发明提供的白花蛇舌草提取物,其中鸡矢藤苷甲酯的含量在10%-15%,去乙酰基车叶草苷酸甲酯含量在10%-20%,车叶草苷酸含量在20%-25%,车叶草苷含量在20%-25%。
本发明提供了一种白花蛇舌草提取物的分离制备方法,分为提取、醇沉、膜分离、非极性大孔树脂分离和工业色谱分离等步骤,具体为:
1)提取:称取白花蛇舌草原药材,加入其重量6-10倍的水煎煮提取2-3次,每次1-3小时,得到提取液,将提取液浓缩至相对密度为0.9-1.10得浸膏;
2)醇沉:将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到50-70%,室温静置12-24小时,过滤,取滤液浓缩至相对密度1.05-1.10;再加入乙醇使乙醇体积浓度达到75-80%,室温静置12-24小时过滤,取滤液浓缩挥发除去乙醇,样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心;
3)膜分离:此醇沉组分再通过3000-6000Da的膜分离,得到膜分离组分;
4)非极性大孔树脂分离:将膜分离组分上样于非极性大孔树脂柱,上样量与分离材料体积比为1∶100-500,分别采用流动相体积浓度10-30%的乙醇和70-95%乙醇洗脱,每次洗脱的体积为3-5个柱体积,流速为1-3个柱体积/小时;循环洗脱,洗脱液浓缩,即为白花蛇舌草大孔树脂分离组分;
5)工业色谱分离:以粒径5-20微米的OEG系列硅胶键合固定相为色谱填料,以甲醇和水为流动相,梯度洗脱,甲醇的体积浓度从2-100%变化,收集目标组分,干燥处理即为白花蛇舌草提取物。
本发明提供的白花蛇舌草提取物的分离制备方法,所述色谱柱效为5000-20000塔板/米。
本发明提供的白花蛇舌草提取物的分离制备方法,所述色谱柱长为200毫-600毫米,色谱柱内径为20毫-300毫米。
本发明的优点:
1.主要成分的含量高。本发明采用了最先进的工业色谱填料和分离制备技术。利用工业色谱的高分离能力,可以保证主要成分的纯度达到70%以上。
2.重现性好。本发明利用工业色谱系统和OEG系列硅胶键合固定相分离材料稳定的性能,可以保证分离制备的重现性和稳定性。
3.周期短。本发明从原药材的粉碎提取到制备得到白花蛇舌草提取物的产品,只需要10天的时间。
4.有机残留低。由于本发明摒弃了传统工艺中溶剂萃取、硅胶柱层析等工艺,采用了有机溶剂使用量较少的工业色谱方法,而且最终产品采用真空离心干燥处理,所以最终产品的有机溶剂残留特别小。
5.能够实现大规模工业生产。本发明所采用工艺非常容易实现标准化,自动化,适于进行产业化大规模生产。
附图说明
图1本发明实施例1工业色谱制备白花蛇舌草提取物的制备色谱图。
图2本发明中白花蛇舌草提取物的HPLC色谱图(λ=254nm)
具体实施方式 白花蛇舌草提取物的制备方法
实施例1:
将白花蛇舌草原药材粉碎,定量称取2千克,置于20升提取罐中,加入20升水煎煮1小时,过滤,滤液保存备用,滤渣中再加入20升水煎煮1小时,过滤,滤液与第一次合并,滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至500毫升,得到白花蛇舌草水提取组分。在浓缩液中加入710毫升95%乙醇,充分搅拌,室温静置24小时,过滤,滤渣弃去,滤液浓缩至300毫升,在浓缩液中加入1600毫升95%乙醇,充分搅拌,室温静置24小时,过滤,滤渣弃去,滤液浓缩至无醇味,浓缩液经过高速离心机(20000转/分钟)离心,得到白花蛇舌草醇沉组分300毫升。此醇沉组分再过6000Da膜,得到膜分离组分。
取白花蛇舌草膜分离组分,进样到已处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂层析系统(20L)中,。首先用5倍柱体积100L 30%乙醇洗脱柱体,洗脱液浓缩备其它用,再用5倍柱体积100L 95%乙醇洗脱,洗脱液保存,并浓缩,得到白花蛇舌草大孔树脂组分。
工业色谱柱柱长400毫米,内径80毫米,色谱填料为10-20微米的OEG-4键合固定相,柱效为15000塔板/米,设定紫外检测波长为254nm(可为230-260nm),流速200分钟/毫升,设定洗脱梯度(见表1),初始流动相(5%甲醇水)平衡色谱柱20分钟,取白花蛇舌草大孔树脂组分样品5ml,进样,按设定梯度洗脱,收集2分钟至8分钟组分。洗脱结束,再次平衡柱子,进样,收集洗脱组分(见图1)。将收集得到的切割组分,合并,浓缩,再通过真空离心干燥得到白花蛇舌草提取物产品2.3克,经高效液相色谱分析(图2),其提取物的总含量>71%。
表1实施例1白花蛇舌草提取物的工业色谱制备梯度设置表
序号 | 时间(min) | 流量(ml/min) | A:甲醇(%) | B:水(%) |
1 | 0 | 200 | 5 | 95 |
2 | 5 | 200 | 5 | 95 |
3 | 10 | 200 | 10 | 90 |
4 | 30 | 200 | 30 | 70 |
5 | 31 | 200 | 100 | 0 |
6 | 35 | 200 | 100 | 0 |
实施例2
将白花蛇舌草原药材粉碎,定量称取5千克,置于100升提取罐中,加入40升水煎煮2小时,过滤,滤液保存备用,滤渣中再加入40升水煎煮2小时,过滤,滤液与第一次合并,滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至1000毫升,得到白花蛇舌草水提取组分。在浓缩液中加入1710毫升95%乙醇,充分搅拌,室温静置24小时,过滤,滤渣弃去,滤液浓缩至500毫升,在浓缩液中加入2670毫升95%乙醇,充分搅拌,室温静置24小时,过滤,滤渣弃去,滤液浓缩至无醇味,浓缩液经过高速离心机(10000转/分钟)离心,得到白花蛇舌草醇沉组分500毫升。此醇沉组分再过6000Da膜,得到膜分离组分。
取白花蛇舌草膜分离组分,进样到已处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂层析系统(60L)中,。首先用3倍柱体积30%乙醇洗脱柱体,洗脱液浓缩备其它用,再用3柱体积的95%乙醇洗脱,洗脱液保存,并浓缩,得到白花蛇舌草大孔树脂组分。
工业色谱柱柱长400毫米,内径80毫米,色谱填料为10-20微米的OEG-4键合固定相,柱效为15000塔板/米,设定紫外检测波长为254nm,流速200分钟/毫升,设定洗脱梯度(见表1),初始流动相(5%甲醇水)平衡色谱柱20分钟,取白花蛇舌草大孔树脂组分样品5ml,进样,按设定梯度洗脱,收集2分钟至8分钟组分。洗脱结束,再次平衡柱子,进样,收集洗脱组分。将收集得到的切割组分,合并,浓缩,再通过真空离心干燥得到白花蛇舌草提取物产品5.8克,经高效液相色谱分析,其提取物的总含量>71%。
实施例3
将白花蛇舌草原药材粉碎,定量称取10千克,置于100升提取罐中,加入60升水煎煮3小时,过滤,滤液保存备用,滤渣中再加入60升水煎煮3小时,过滤,滤液与第一次合并,滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至2000毫升,得到白花蛇舌草水提取组分。在浓缩液中加入3420毫升95%乙醇,充分搅拌,室温静置24小时,过滤,滤渣弃去,滤液浓缩至1500毫升,在浓缩液中加入8000毫升95%乙醇,充分搅拌,室温静置24小时,过滤,滤渣弃去,滤液浓缩至无醇味,浓缩液经过高速离心机(25000转/分钟)离心,得到白花蛇舌草醇沉组分1800毫升。此醇沉组分再过3000Da膜,得到膜分离组分。
取白花蛇舌草膜分离组分,进样到已处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂层析系统中,。首先用3倍柱体积30%乙醇洗脱柱体,洗脱液浓缩备其它用,再用3倍柱体积95%乙醇洗脱,洗脱液保存,并浓缩,得到白花蛇舌草大孔树脂组分。
工业色谱柱柱长400毫米,内径80毫米,色谱填料为10-20微米的OEG-4键合固定相,柱效为15000塔板/米,设定紫外检测波长为254nm(可为230-260nm),流速200分钟/毫升,设定洗脱梯度(见表1),初始流动相(5%甲醇水)平衡色谱柱20分钟,取白花蛇舌草大孔树脂组分样品3ml,进样,按设定梯度洗脱,收集2分钟至8分钟组分。洗脱结束,再次平衡柱子,进样,收集洗脱组分。将收集得到的切割组分,合并,浓缩,再通过真空离心干燥得到白花蛇舌草提取物产品10.8克,经高效液相色谱分析,其提取物的总含量>70%。
Claims (7)
1.一种白花蛇舌草提取物,其中主要成分为鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷,其特征在于:所述的四种主要成分总含量在60%-75%;
其中,所述白花蛇舌草提取物的具体制备步骤:分为提取、醇沉、膜分离、非极性大孔树脂分离和工业色谱分离,具体为:
1)提取:称取白花蛇舌草原药材,加入其重量6-10倍的水煎煮提取2-3次,每次1-3小时,得到提取液,将提取液浓缩至相对密度为0.9-1.10浸膏;
2)醇沉:将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到50-70%,室温静置12-24小时,过滤,取滤液浓缩至相对密度1.05-1.10;再加入乙醇使乙醇体积浓度达到75-80%,室温静置12-24小时过滤,取滤液浓缩挥发除去乙醇,样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心;
3)膜分离:此醇沉组分再通过3000-6000Da的膜分离,得到膜分离组分;
4)非极性大孔树脂分离:将膜分离组分上样于非极性大孔树脂柱,上样量与分离材料体积比为1∶100-500,分别采用流动相体积浓度10-30%的乙醇和70-95%乙醇洗脱,每次洗脱的体积为3-5个柱体积,流速为1-3个柱体积/小时;循环洗脱,洗脱液浓缩,即为白花蛇舌草大孔树脂分离组分;
5)工业色谱分离:以粒径5-20微米的OEG系列硅胶键合固定相为色谱填料,以甲醇和水为流动相,梯度洗脱,甲醇的体积浓度从2-100%变化,收集目标组分,干燥处理即为白花蛇舌草提取物。
2.按照权利要求1所述的白花蛇舌草提取物,其特征在于:鸡矢藤苷甲酯的含量在10%—15%。
3.按照权利要求1所述的白花蛇舌草提取物,其特征在于:去乙酰基车叶草苷酸甲酯含量在10%—20%。
4.按照权利要求1所述的白花蛇舌草提取物,其特征在于:车叶草苷酸含量在20%—25%。
5.按照权利要求1所述的白花蛇舌草提取物,其特征在于:车叶草苷含量在15%-25%。
6.一种如权利要求1所述的白花蛇舌草提取物,其特征在于:所述色谱柱效为5000-20000塔板/米。
7.一种如权利要求1所述的白花蛇舌草提取物,其特征在于:所述色谱柱长为200毫米—600毫米,色谱柱内径为20毫米—300毫米。
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