CN103951717B

CN103951717B - 一种提取制备苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的方法

Info

Publication number: CN103951717B
Application number: CN201410144187.2A
Authority: CN
Inventors: 楚楚; 李行诺; 颜继忠; 章诗迪; 宋敏
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2014-04-11
Filing date: 2014-04-11
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2034-04-11
Also published as: CN103951717A

Abstract

本发明公开了一种提取制备苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的方法，将含苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的药材粉碎、醇水混合溶剂提取后，经大孔吸附树脂富集、梯度洗脱得到富集物，富集物进行高速逆流色谱分离，以体积比0.5-2:5:1-3:3-5正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，经HPLC检测，合并相同成分的流出液，浓缩、干燥，分别制得苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷。本发明创新性地以高速逆流色谱分离苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的富集物，实现了单体纯化工艺的自动化和可操作性，可一次性获得纯度大于85%的单体成品。

Description

一种提取制备苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的方法

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，涉及一种用大孔树脂结合高速逆流色谱法制备苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的方法。

技术背景

芍药毛茛科芍药属植物，该属植物种类繁多，世界上约有35种，我国有11种及10个变种。芍药有赤、白之分，最早见于《本草经集注》。自古以来，芍药在医家的眼里一直是具有多种功效的中药。2010版中国药典收载白芍为毛茛科植物PaeonialactifloraPall的干燥根。经水煮后晒干而得。赤芍为芍药PaeonialactifloraPall.或川赤芍PaeoniavertchiiLyneh.的干燥根，经直接晒干而得。现代研究表明，学者从芍药属植物中分离获得多种化合物，包括芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药新苷、苯甲酰芍药内酯苷、没食子酸、五没食子酰葡萄糖、苯甲酸等。

现代药理学研究表明，芍药中芍药总苷为其主要的有效成分，同时芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酰芍药内酯苷、氧化芍药苷等单萜苷类成分单体也被证实具有多种药理活性。如芍药苷具有，苯甲酰芍药苷具有抗血栓形成，抑制纤维蛋白溶酶和纤溶酶原等药理作用。随着对芍药研究的深入，其有效成分、有效部位的提取分离纯化越来越受到人们的关注。各种单萜苷类成分的提取分离纯化不仅可为芍药相关质量标准的建立提供物质基础，同时也可为药理活性及机理的进一步探究提供物质保证。

通过长期研究，对芍药中芍药总苷成分的提取工艺已较为成熟，但对单萜苷单体类成分的制备大多集中在芍药苷和芍药内酯苷上，而对其它单萜苷单体的分离纯化尚未见报道。例如：申请号为201110410067.9的发明申请专利公开了“一种芍药苷和白芍苷的制备方法”：以牡丹科植物为原料提取后，以大孔树脂对粗提液进行吸附，以30-75%乙醇水洗脱液浓缩干燥后得精制提取物，再以加压色谱柱对其进行分离纯化，可获得纯度大于90%的芍药苷和白芍苷成品。申请号为201010249421.X的发明专利公开了“一种同时制备芍药内酯苷和芍药苷的方法”，即以芍药药材或提取物为原料，采用柱层析方法进行芍药苷和芍药内酯苷的纯化，优选后的方法制备芍药苷和芍药内酯苷的纯度可达91%-97%。

发明内容

本发明针对传统提取分离工艺中的不足，提供一种从含苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的药材中提取、分离纯化苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的方法，该方法工艺简便，效率高，快速，产品纯度大于85％。苯甲酰芍药苷化学式如式II所示，苯甲酰芍药内酯苷化学式如式I所示。

本发明采用的技术方案是：

一种提取制备苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）选取含苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的植物药材，粉碎后采用醇水混合溶剂进行提取，提取液合并、浓缩、干燥，得粗提物；

（2）步骤（1）所得粗提物加入填充有大孔吸附树脂的色谱柱中，用水和乙醇的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：纯水、30%体积浓度乙醇水溶液、50%体积浓度乙醇水溶液、95%体积浓度乙醇水溶液，收集50%和95%体积浓度乙醇水溶液两部分洗脱部位的洗脱液，浓缩，干燥，得大孔树脂富集物；

（3）由步骤（2）所得大孔树脂富集物，进行高速逆流色谱分离，以体积比0.5-2:5:1-3:3-5正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水为溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速（优选950r/min转速）下，以0.5～5ml/min（优选1.5ml/min）的流速注入流动相，以波长190-380nm（优选210～254nm）的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取大孔树脂富集物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，根据紫外检测器光谱图的峰形，定时收集流出液，经HPLC检测，合并相同成分的流出液，浓缩、干燥，分别制得苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷。

所述步骤（1）中，所述含苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的植物药材通常为毛茛科芍药属植物，优选为白芍或赤芍。

步骤（1）所用醇水混合溶剂可以是醇（如甲醇或乙醇等）、水溶剂，或是这些溶剂按一定比例组成的混合溶液，优选为体积浓度30%-90%乙醇，更优选体积浓度50%乙醇。

所述的提取方式可以是煎煮、回流、超声、冷浸、渗漉、微波或高压提取，优选采用超声提取或回流提取。

提取次数优选为2～3次。

所述步骤（1）的浓缩方式包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓缩等。

所述步骤（1）中的干燥方式包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。

进一步，步骤（1）优选按以下工艺进行提取：白芍或赤芍药材、粉碎成粗粉后加体积浓度30%-90%乙醇（更优选体积浓度50%乙醇），超声提取2-3次，每次0.5-3小时，提取液合并、旋转蒸发至无醇味，冷冻干燥，得粗提物；每次提取所用的体积浓度30%-90%乙醇的体积用量以粗粉的质量计为5～15L/kg。

所述步骤（2）中，所用大孔吸附树脂可以是非极性、弱极性或中极性的大孔吸附树脂，如D101、AB-8、HPD400等，优选弱极性或中等极性的树脂，如D101、AB-8等。所用的洗脱剂为水和含水的乙醇，其中优选0-100%的乙醇，梯度洗脱，优选的梯度为：水-30%乙醇-50%乙醇-95%乙醇。

所述步骤（2）中，所述梯度洗脱时，每次洗脱所用洗脱剂的体积用量一般为2-6倍柱体积，优选5倍柱体积。

梯度洗脱的流速优选为0.1-2ml/min。

进一步，步骤（2）优选按以下工艺进行：步骤（1）所得粗提物加入填充有D101或AB-8树脂的色谱柱中，用水和乙醇的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：先用2-6倍柱体积的纯水洗脱（除杂）、再用2-6倍柱体积的30%体积浓度乙醇水溶液洗脱、再用2-6倍柱体积的50%体积浓度乙醇水溶液洗脱、最后用2-6倍柱体积的95%体积浓度乙醇水溶液洗脱，收集50%和95%体积浓度乙醇水溶液两部分洗脱部位的洗脱液，浓缩，干燥，得大孔树脂富集物；洗脱流速为0.1-2ml/min（更优选为1ml/min）。

所述步骤（3）中，所述正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比优选为0.5:5:2:4或0.5:5:1:5。

所述步骤（3）优选按以下工艺进行：由步骤（2）所得大孔树脂富集物，进行高速逆流色谱分离，以体积比0.5:5:2:4或0.5:5:1:5正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水为溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在950r/min转速下，以1.5ml/min的流速注入流动相，以波长254nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取大孔树脂富集物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，根据紫外检测器光谱图的峰形，定时收集流出液，经HPLC检测，合并相同成分的流出液，浓缩、干燥，分别制得苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷。

本发明通过苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的制备工艺研究，所完成的制备技术路线具有如下优势：

1.应用本发明方法，可以在同一工艺流程中，制备得到苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷，充分利用药材资源。

2.应用本发明方法，可以在同一工艺流程中获得苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的富集物，有效地简化了后续纯化工艺负担。

3.应用本发明方法，创新性地以高速逆流色谱分离苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的富集物，实现了单体纯化工艺的自动化和可操作性，可一次性获得纯度大于85%的单体成品。

4.本发明制备工艺方法简单，精制效率高，耗能低，环保，操作工艺条件易于控制。这种方法较传统的提取分离纯化方法更为快速、简便、高效。同时，其制备工艺简单，可为工业生产放大提供参考依据。

附图说明

图1实施例1所得粗提物液相色谱图。

图2实施例3所得富集物液相色谱图。

图3实施例6的高速逆流色谱图。

图4实施例6所得苯甲酰芍药苷液相色谱图。

图5实施例6所得苯甲酰芍药内酯苷液相色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的方案进行进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的提取

称取200g白芍根粉末，用50v%乙醇3L×2超声提取2次，超声频率40kHz，功率150W，每次提取30分钟，过滤，合并滤液，旋转蒸发至无醇味，冷冻干燥，制得粗提物备用。粗提物的液相色谱图见图1，图1中1代表苯甲酰芍药苷，2代表苯甲酰芍药内酯苷。

实施例2苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的提取

称取50g白芍根粉末，分别用500ml、400ml、300ml50v%乙醇加热至回流提取3次，每次3小时，过滤，合并滤液，旋转蒸发至无醇味，冷冻干燥，制得粗提物备用。

实施例3大孔树脂柱富集

取D101大孔树脂装入玻璃柱中，柱体积为18ml，以实施例1中所获粗提物上样，上样量为15g，吸附后，先用水90ml去除杂质，然后用30v%乙醇90ml洗脱，再用50v%乙醇90ml洗脱，最后用95v%乙醇75ml洗脱，流速为1ml/min，将50%和95%乙醇两部分洗脱所得洗脱液收集合并、浓缩蒸干，得2.192g苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的富集物，液相色谱图如图2，图2中1代表苯甲酰芍药苷，2代表苯甲酰芍药内酯苷。

实施例4大孔树脂柱富集

取AB-8大孔树脂装入玻璃柱中，柱体积为15ml，以实施例1中所获粗提物上样，上样量为12g，吸附后，先用水75ml去除杂质，然后用30v%乙醇75ml洗脱，再用50v%乙醇75ml洗脱，最后用95v%乙醇75ml洗脱，流速为1ml/min，将50%和95%乙醇两部分洗脱所得洗脱液收集合并、浓缩蒸干，得1.819g苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的富集物。

实施例5半制备型高速逆流制备苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷

取实施例3所得苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷富集物234mg，用溶剂体系正丁醇-乙酸乙酯-水（体积比0.5:5:1:5）的上相和下相各取5ml溶解，作为供试品溶液进样。溶剂体系正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比0.5:5:1:5，混合充分后静置，按上下两相分开，上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，分离柱的柱体积为300ml，设定高速逆流色谱仪，流动相流速1.5ml/min，离心分离仪转速950r/min，紫外检测器波长254nm，恒温循环水箱35℃，当明显有流动相流出时，取供试品溶液进样。根据紫外检测器光谱图，出峰190min前为极性较大的成分，190min后将流动相换为溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比0.5:5:2:4）的下相，继续洗脱。自动收集器以5min每管自动收集，用HPLC检测，合并相同成分的流出液，分别获得苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷流份，减压浓缩，冷冻干燥，得到苯甲酰芍药苷3.44mg、苯甲酰芍药内酯苷2.67mg，纯度分别为92.5%、87.1%。

实施例6半制备型高速逆流色谱分离纯化

取实施例3所得苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷富集物200mg，用溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比0.5:5:2:4）的上相和下相各取5ml溶解，作为供试品溶液进样。溶剂体系正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比0.5:5:2:4，混合充分后静置，按上下两相分开，上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，分离柱的柱体积为300ml，设定高速逆流色谱仪，流动相流速1.5ml/min，离心分离仪转速950r/min，紫外检测器波长254nm，恒温循环水箱35℃，当明显有流动相流出时，取供试品溶液进样。根据紫外检测器光谱图，如图3所示，图3中1为芍药苷，2为芍药内酯苷，3为苯甲酰芍药苷、苯甲酰芍药内酯苷，虽然图中不明显，但实际上3的各管流分进行液相检测时，非常明显的分为两个成分相继流出，自动收集器以5min每管自动收集，用HPLC检测，合并相同成分的流出液，分别获得苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷流份，减压浓缩，冷冻干燥，得到苯甲酰芍药苷1.88mg、苯甲酰芍药内酯苷1.30mg，纯度分别为91.0%、86.6%。检测苯甲酰芍药苷、苯甲酰芍药内酯苷纯度，液相色谱图分别如图4、5。

实施例7半制备型高速逆流色谱分离纯化

取实施例3所得苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷富集物180mg，用溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比0.5:5:1:5）的上相和下相各取5ml溶解，作为供试品溶液进样。溶剂体系正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比0.5:5:1:5，混合充分后静置，按上下两相分开，上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，分离柱的柱体积为300ml，设定高速逆流色谱仪，流动相流速1.5ml/min，离心分离仪转速950r/min，紫外检测器波长254nm，恒温循环水箱35℃，当明显有流动相流出时，取供试品溶液进样。自动收集器以5min每管自动收集，用HPLC检测，合并相同成分的流出液，分别获得苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷流份，减压浓缩，冷冻干燥，得到苯甲酰芍药苷1.72mg、苯甲酰芍药内酯苷1.12mg，纯度分别为91.8%、88.0%。

高效液相色谱的检测条件是：乙腈-0.1%磷酸水体系，梯度洗脱（0～5min，8%～12%乙腈；5～20min，12%～20%乙腈；20～30min，20%～35%乙腈；30～35min，35%～100%乙腈），进样量为10μL，流动相流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为230nm。色谱柱为：AgilentExtendC18，250×4.6mm,5μm。

Claims

1.一种提取制备苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（3）由步骤（2）所得大孔树脂富集物，进行高速逆流色谱分离，以体积比0.5-2:5:1-3:3-5正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水为溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速下，以0.5～5ml/min流速注入流动相，以波长190-380nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取大孔树脂富集物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，根据紫外检测器光谱图的峰形，定时收集流出液，经HPLC检测，合并相同成分的流出液，浓缩、干燥，分别制得苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述含苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的植物药材为毛茛科芍药属植物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述含苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷的植物药材为白芍或赤芍。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述醇水混合溶剂为体积浓度30%-90%乙醇；所述的提取方式为煎煮、回流、超声、冷浸、渗漉、微波或高压提取，提取次数为2～3次，每次提取的时间为0.5-3小时。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）按以下工艺进行：白芍或赤芍药材、粉碎成粗粉后加体积浓度30%-90%乙醇，超声提取2-3次，每次0.5-3小时，提取液合并、旋转蒸发至无醇味，冷冻干燥，得粗提物；每次提取所用的体积浓度30%-90%乙醇的体积用量以粗粉的质量计为5～15L/kg。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中，所述大孔吸附树脂为非极性、弱极性或中极性的大孔吸附树脂。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中，所述大孔吸附树脂为D101或AB-8大孔吸附树脂。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（2）按以下工艺进行：步骤（1）所得粗提物加入填充有D101或AB-8树脂的色谱柱中，用水和乙醇的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：先用2-6倍柱体积的纯水洗脱、再用2-6倍柱体积的30%体积浓度乙醇水溶液洗脱、再用2-6倍柱体积的50%体积浓度乙醇水溶液洗脱、最后用2-6倍柱体积的95%体积浓度乙醇水溶液洗脱，收集50%和95%体积浓度乙醇水溶液两部分洗脱部位的洗脱液，浓缩，干燥，得大孔树脂富集物；洗脱流速为0.1-2ml/min。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（3）中，所述正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为0.5:5:2:4或0.5:5:1:5。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（3）按以下工艺进行：由步骤（2）所得大孔树脂富集物，进行高速逆流色谱分离，以体积比0.5:5:2:4或0.5:5:1:5正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水为溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，上相作为固定相，下相作为流动相，将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在950r/min转速下，以1.5ml/min的流速注入流动相，以波长254nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取大孔树脂富集物，用上相、下相体积比1：1的混合溶剂溶解后进样，根据紫外检测器光谱图的峰形，定时收集流出液，经HPLC检测，合并相同成分的流出液，浓缩、干燥，分别制得苯甲酰芍药苷和苯甲酰芍药内酯苷。