CN101289429B

CN101289429B - 一种表告依春的分离制备方法

Info

Publication number: CN101289429B
Application number: CN2007100110389A
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 丰加涛; 徐青; 薛兴亚
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: ZHEJIANG ACCHROM TECHNOLOGIES Co Ltd
Priority date: 2007-04-20
Filing date: 2007-04-20
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2027-04-20
Also published as: CN101289429A

Abstract

本发明涉及天然药物的分离，具体地说是一种表告依春的分离制备方法，将板蓝根植物粉碎后，8-12倍量水煎煮得到提取液，再浓缩得到浸膏，加入乙醇醇沉两次，醇沉上清液浓缩，回收乙醇，浓缩液经过高速离心机过滤，滤液经膜分离机分离，透过液通过大孔树脂柱层析分离制备，乙醇水梯度洗脱，得到组分再经高效工业色谱柱分离制备，甲醇水梯度洗脱，收集洗脱液浓缩冷冻干燥即得表告依春。本发明产品纯度高、制备量大，工艺稳定可靠，特别适用于自中药板蓝根中分离制备大量的高纯度的表告依春化合物。

Description

一种表告依春的分离制备方法

技术领域

本发明涉及天然药物的分离，具体地说是一种表告依春的分离制备方法，通过工业色谱技术从传统中药板蓝根中分离表告依春的制备方法。

背景技术

板蓝根为中国传统中药，《中华人民共和国药典》(2000版)规定为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥根，始载于《神农本草经》，有清热解毒、凉血利咽功能，临床上常用于病毒性及细菌性感染疾病。板蓝根对流感毒、肾综合征出血热病毒(HFRSV)、乙型脑炎病毒、腮腺炎病毒、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒以及柯萨奇B4病毒均有不同程度的抑制作用(李玲等.药学学报，1994，29(2)：128-131；张宸豪等.第四军医大学吉林医学院学报，2003，23(3)：125-126；刘思贞等.中草药，1999，30(9)：650-651；孙广莲等.山东中医药大学学报，2001，24(2)：137-138；胡兴昌等.上海师范大学学报(自然科学版)，2003，32(1)：62-65；张大志等.药学研究，2001，10(5)：51-52)。还有研究表明板蓝根具有抗菌作用和对细胞内毒素有作用(郑建玲等.中国微生态学杂志，2003，15(1)：18-19；刘云海等.中草药，2003，34(2)：152-154.刘云海等.中国药科大学学报，2003，34(5)：442-447)。板蓝根作为普遍应用的抗病毒中药，具有十分重要的市场价值，但是其物质基础不清晰，有效成分不明确，严重限制了板蓝根药材的应用，迫切需求能够大规模从板蓝根中分离植被有效成分的技术方法。

表告依春，英文名epigoit rin。文献报道表告依春为板蓝根的主要成分(刘海利等.沈阳药科大学学报，2002，19(2)：93-95；徐丽华等.中国天然药物，2005，3(6)：359-360；Huang QS，et al.Planta Medica，1981，42(3)：308-310)，并且具有明显的抗流感病毒活性(徐丽华等.中国天然药物，2005，3(6)：359-360；黄芳等，中国药科大学学报，2006，379(6)：519-522)。文献有关表告依春的提取分离制备的报道，基本上都是采取传统的己烷、二氯甲烷等溶剂萃取、硅胶柱层析、氧化铝柱层析等方法(刘海利等.沈阳药科大学学报，2002，19(2)：93-95；徐丽华等.中国天然药物，2005，3(6)：359-360；Huang QS，et al.Planta Medica，1981，42(3)：308-310)，这些方法存在产品纯度低、重现性差、耗时长、有机残留严重、检测手段落后、自动化程度低、无法大规模生产等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种产品纯度高、重现性好、周期短，可以大规模生产的表告依春分离制备方法。以满足表告依春化合物标准对照品制备和大规模工业生产的需要。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种表告依春的分离制备方法，

1)提取：称取板蓝根原药材，加入其重量8-12倍的水煎煮提取2-3次，每次1-3小时，得到提取液，将提取液浓缩至相对密度为1.10-1.15的浸膏，得到表告依春提取组分；

2)醇沉：将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到50-70％，0-4℃冷藏静置12-24小时，过滤，滤渣弃去，取滤液浓缩，滤液浓缩至相对密度1.05-1.10；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到75-80％，0-4℃冷藏静置12-24小时过滤，滤渣弃去，取滤液浓缩挥发除去乙醇，样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心，得到表告依春醇沉组分；

3)过膜：将离心液经过截留分子量500-10000Da中空纤维膜分离仪分离，操作压力0.05-0.3MPa，截留液弃去，透过液即为表告依春膜分离组分；

4)非极性大孔树脂分离：将膜分离组分上样于非极性大孔树脂柱，上样量与分离材料体积比为1∶100-500，分别采用流动相体积浓度5-20％的乙醇和40-60％乙醇洗脱，每次洗脱的体积为3-6个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；循环洗脱，洗脱液浓缩，浓缩至浓度为0.1-0.5克/毫升，过0.2-0.4微米滤膜，即为表告依春大孔树脂分离组分；

5)工业色谱分离：以粒径5-20微米的C18硅胶键合固定相为色谱填料，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱，甲醇的体积浓度从0-100％变化，最好从0-50％变化，收集目标组分，冷冻干燥即为表告依春。将样品进行高效液相分析确定产品纯度。

所述色谱柱效为5000-20000塔板/米，色谱柱长为200毫米-600毫米，色谱柱内径为20毫米-300毫米。

本发明具有以下优点：

1.样品纯度高。由于本发明采用了最先进的工业色谱分离制备技术，色谱填料为高分离能力的ODS(C18健合固定相)分离材料，利用工业色谱的高分离能力，可以保证产品的纯度达到98％以上。

2.重现性好。本发明利用工业色谱系统和ODS稳定的性能，可以保证表告依春分离制备的重现性和稳定性。

3.周期短。本发明从原药材的粉碎提取到制备得到表告依春产品，只需要10天的时间。

4.有机残留低。由于本发明摒弃了传统工艺中溶剂萃取、硅胶柱层析等工艺，采用了有机溶剂使用量较少的工业色谱方法，而且最终产品采用冷冻干燥处理，所以最终产品的有机溶剂残留特别小。

5.能够实现大规模工业生产。本发明所采用工艺非常容易实现标准化，自动化，适于进行产业化大规模生产。

附图说明

图1为本发明实施例1工业色谱制备表告依春的制备色谱图；

图2为本发明实施例1表告依春的高效液相分析色谱图。

具体实施方式

实施例1

将板蓝根原药材粉碎，定量称取2千克，置于50升提取罐中，加入20升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入20升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至1000毫升，得到表告依春提取组分。在浸膏中加入1750毫升95％乙醇，充分搅拌，0℃冷藏静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至500毫升，在浓缩液中加入2600毫升95％乙醇，充分搅拌，0℃冷藏静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(20000转/分钟)离心，得到表告依春醇沉组分600毫升。

将表告依春醇沉组分加入到截留分子量6000Da中空纤维膜分离仪的进料罐中，调整操作压力为0.1MPa，截留液弃去，收集透过液即为表告依春膜分离组分。在大孔树脂层析系统中装入处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂5L，将膜分离组分进样至大孔树脂层析柱。首先用4倍柱体积20L5％乙醇洗脱柱体，洗脱液弃去，再用4倍柱体积40％乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓缩至浓度为0.15克/毫升，过0.22微米滤膜，得到表告依春大孔树脂组分50毫升。

工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的C18键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为254nm(可为230-280nm)，流速200分钟/毫升，设定洗脱梯度(见表1)，初始流动相(15％甲醇水)平衡色谱柱20分钟，取表告依春大孔树脂组分样品10ml，进样，按设定梯度洗脱，收集25分钟至30分钟组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分。共进样五次(见图1)，将五次收集得到的洗脱组分，合并，旋转蒸发浓缩至20毫升，再通过冷冻干燥得到表告依春产品2.2克，将样品进行高效液相分析确定产品纯度大于98％(见图2)，取20毫克样品进行核磁分析，对结构进行鉴定(见图3)。旋光测定：[α]_D ²⁵+23°(c 0.90，MeOH)。核磁数据：¹H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：7.42(1H，br，s，3-NH)，5.98(1H，ddd，J＝17.2，10.6，6.4Hz，H-1′)，5.52(1H，d，J＝17.2Hz，H-2′)，5.43(1H，d，J＝10.6Hz，H-2′)，5.31(1H，ddd，J＝8.0，8.8，1.2Hz，H-5)，3.96(1H，dd，J＝9.6，8.8Hz，H-4)，3.65(1H，dd，J＝8.0，9.6Hz，H-4)。¹³C-NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：188.9(C-2)，133.5(C-1′)，120.1(C-2′)，82.8(C-5)，49.5(C-4)。

表告依春的结构式：

表1实施例1表告依春工业色谱制备梯度设置表

序号	时间(min)	流量(ml/min)	A：甲醇(％)	B：水(％)
序号	时间(min)	流量(ml/min)	A：甲醇(％)	B：水(％)	1	0	200	15	85
2	10	200	25	75	1	0	200	15	85
2	10	200	25	75	3	35	200	35	65
4	36	200	100	0	3	35	200	35	65
4	36	200	100	0	5	50	200	100	0

实施例2

将板蓝根原药材粉碎，定量称取0.5千克，置于20升提取罐中，加入5升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入5升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至250毫升，得到表告依春提取组分。在浸膏中加入440毫升95％乙醇，充分搅拌，0℃冷藏静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至150毫升，在浓缩液中加入800毫升95％乙醇，充分搅拌，0℃冷藏静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(20000转/分钟)离心，得到表告依春醇沉组分200毫升。

将表告依春醇沉组分加入到截留分子量3000Da中空纤维膜分离仪的进料罐中，调整操作压力为0.06MPa，截留液弃去，收集透过液即为表告依春膜分离组分。在大孔树脂层析系统中装入处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂2L，将膜分离组分进样至大孔树脂层析柱。首先用3倍柱体积6L5％乙醇洗脱柱体，洗脱液弃去，再用3倍柱体积6L 60％乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓缩至浓度为0.10克/毫升，过0.22微米滤膜，得到表告依春大孔树脂组分20毫升。

工业色谱柱柱长250毫米，内径70毫米，色谱填料为5-10微米的C18键合固定相，柱效为28000塔板/米，设定紫外检测波长为254nm，流速150毫升/分钟，设定洗脱梯度，初始流动相平衡色谱柱15分钟，取表告依春大孔树脂组分样品10ml，进样，按设定梯度洗脱，收集目标组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分。共进样两次，将两次收集得到的洗脱组分，合并，旋转蒸发浓缩至6毫升，再通过冷冻干燥得到表告依春产品0.6克，将样品进行高效液相分析确定产品纯度大于98％。

实施例3

将板蓝根原药材粉碎，定量称取5千克，置于100升提取罐中，加入50升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入50升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至2500毫升，得到表告依春提取组分。在浸膏中加入4400毫升95％乙醇，充分搅拌，0℃冷藏静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至1500毫升，在浓缩液中加入8升95％乙醇，充分搅拌，0℃冷藏静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(20000转/分钟)离心，得到表告依春醇沉组分1.8升。

将表告依春醇沉组分加入到截留分子量6000Da中空纤维膜分离仪的进料罐中，调整操作压力为0.3MPa，截留液弃去，收集透过液即为表告依春膜分离组分。在大孔树脂层析系统中装入处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂20L，将膜分离组分进样至大孔树脂层析柱。首先用5倍柱体积100L15％乙醇洗脱柱体，洗脱液弃去，再用5倍柱体积100L 40％乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓缩至浓度为0.3克/毫升，过0.22微米滤膜，得到表告依春大孔树脂组分60毫升。

工业色谱柱柱长400毫米，内径100毫米，色谱填料为10-20微米的C18键合固定相，柱效为14000塔板/米，设定紫外检测波长为254nm，流速350毫升/分钟，设定洗脱梯度，初始流动相平衡色谱柱20分钟，取表告依春大孔树脂组分样品20ml，进样，按设定梯度洗脱，收集目标组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分。共进样四次，将四次收集得到的洗脱组分，合并，旋转蒸发浓缩至50毫升，再通过冷冻干燥得到表告依春产品5.6克，将样品进行高效液相分析确定产品纯度大于98％。

实施例4

将板蓝根原药材粉碎，定量称取20千克，置于250升提取罐中，加入200升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入200升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至10升，得到表告依春提取组分。在浸膏中加入26.4升95％乙醇，充分搅拌，0℃冷藏静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至6升，在浓缩液中加入32升95％乙醇，充分搅拌，0℃冷藏静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(20000转/分钟)离心，得到表告依春醇沉组分8升。

将表告依春醇沉组分加入到截留分子量6000Da中空纤维膜分离仪的进料罐中，调整操作压力为0.2MPa，截留液弃去，收集透过液即为表告依春膜分离组分。在大孔树脂层析系统中装入处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂50L，将膜分离组分进样至大孔树脂层析柱。首先用3倍柱体积150L10％乙醇洗脱柱体，洗脱液弃去，再用3倍柱体积150L 50％乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓缩至浓度为0.4克/毫升，过0.22微米滤膜，得到表告依春大孔树脂组分120毫升。

工业色谱柱柱长800毫米，内径150毫米，色谱填料为10-20微米的C18键合固定相，柱效为12000塔板/米，设定紫外检测波长为254nm，流速600毫升/分钟，设定洗脱梯度，初始流动相平衡色谱柱30分钟，取表告依春大孔树脂组分样品40ml，进样，按设定梯度洗脱，收集目标组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分。共进样三次，将三次收集得到的洗脱组分，合并，旋转蒸发浓缩至50毫升，再通过冷冻干燥得到表告依春产品23克，将样品进行高效液相分析确定产品纯度大于98％。

Claims

1.一种表告依春的分离制备方法，其特征在于：

1)提取：称取板蓝根原药材，加入其重量8-12倍的水煎煮提取2-3次，每次1-3小时，得到提取液，将提取液浓缩得浸膏；

2)醇沉：将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到50-70％，0-4℃冷藏静置12-24小时，过滤，取滤液浓缩；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到75-80％，0-4℃冷藏静置12-24小时过滤，取滤液浓缩挥发除去乙醇，样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心；

3)过膜：将离心液经过截留分子量500-10000Da的中空纤维膜分离仪分离，操作压力0.05-0.3MPa，截留液弃去，透过液即为膜分离组分；

4)非极性大孔树脂分离：将膜分离组分上样于非极性大孔树脂柱，上样量与分离材料体积比为1∶100-500，分别采用流动相体积浓度5-20％的乙醇和40-60％乙醇洗脱，每次洗脱的体积为3-6个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；循环洗脱，洗脱液浓缩，浓缩至浓度为0.1-0.5克/毫升，过0.2-0.4微米滤膜，即为表告依春大孔树脂分离组分；所述非极性大孔树脂为罗门哈斯XAD-4型大孔树脂；

5)工业色谱分离：以粒径5-20微米的C18硅胶键合固定相为色谱填料，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱，甲醇的体积浓度从0-100％变化，收集目标组分，冷冻干燥即为表告依春。

2.根据权利要求1所述表告依春的分离制备方法，其特征在于：所述色谱柱效为5000-20000塔板/米。

3.根据权利要求1所述表告依春的分离制备方法，其特征在于：所述色谱柱长为200毫米-600毫米，色谱柱内径为20毫米-300毫米。

4.根据权利要求1所述表告依春的分离制备方法，其特征在于：所述梯度洗脱时，甲醇的体积浓度从0-50％变化，收集目标组分。