CN104030999B - Dl-告依春中表告依春与告依春的分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种DL-告依春中表告依春与告依春的分离方法，该方法是先将DL-告依春制成溶液，再以超临界流体色谱法进行分离；该方法简便、快捷，分离得到的表告依春和告依春单体纯度高。

Description

DL-告依春中表告依春与告依春的分离方法
技术领域
本发明涉及一种将混合物DL-告依春进行拆分的方法，即，将表告依春与告依春自混合物中分离出，得到光学纯单体的方法。
背景技术
DL-告依春(也叫做(R,S)-告依春)为表告依春(R-告依春)和告依春(S-告依春)的混合物，二者互为异构体，该混合物曾被认为是板蓝根的主要有效成分。但后续研究表明，表告依春与告依春的活性具有很大差异，其中的表告依春才是抗流感病毒的活性成分，告依春不但无该活性，更有文献报道其具有一定的毒性。因此，将将DL-告依春进行手性拆分，得到光学纯的表告依春单体，对于研制高效、低毒副作用的抗病毒药物具有十分重要的意义。为此，发明人曾经开发了一种正向手性色谱拆分方法(发明专利申请201010222106.8)，成功将二者分离，但该方法存在纯度偏低、操作繁琐、耗时长、不适于放量制备等不足。
超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography，SFC)是一种以超临界流体做流动相，依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的技术。与常规的HPLC、GC技术相比，SFC具有体系粘度低、扩散和传质速率高等特点，可以有效地弥补HPLC和GC在分离手性物质方面的不足。但由于中药活性成分十分复杂、极性偏大等原因，SFC在中药活性成分手性分离方面的研究鲜见报道。
发明内容
针对现有DL-告依春手性分离方法存在的不足，发明人经过大量的系统实验研究，建立了一种方便高效、重复性好、分离单体纯度更高的手性分离方法。
本发明提供了一种DL-告依春中表告依春与告依春的分离方法，该分离方法为：将DL-告依春制成溶液，以超临界流体色谱法进行分离。
所述的将DL-告依春制成溶液，具体为，将DL-告依春加有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶液溶解，分析时，制成浓度为0.1～10mg/ml(该浓度为混合物的浓度)的溶液，优选制成1mg/ml的溶液，进样量优选为10μL；制备时，制成浓度为10～100mg/ml(该浓度为混合物的浓度)的溶液，进样量优选为50μL；所述的有机溶剂为常用有机溶剂，优选甲醇。该DL-告依春为表告依春与告依春的混合物，该混合物的提取已经有多种方法的报道，本发明所使用的DL-告依春对其提取方法没有要求，也可直接购买得到。
所述的超临界流体色谱法，其固定相是以纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)为填料的手性色谱柱，该色谱柱为键合型或涂敷型，优选用键合型色谱柱。超临界流体色谱法固定相的填料相种类很多，有几十种，如直链淀粉-三(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(4-氯苯基氨基甲酸酯)等。即便是同一种类型的色谱柱不同厂家的填装工艺也不尽相同，填料与填装工艺对固定相的分离效果影响非常大，因此，固定相的选择对于手性分离方法的建立至关重要。发明人通过对DL-告依春结构、性质的分析，结合实验验证，惊喜地发现，以纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)为填料的手性色谱柱可以将表告依春及告依春完全分离，两单体的纯度均在99％以上，分离度均不低于2.5，远高于《中国药典》对分离度的要求。
当所述的固定相为键合型手性色谱柱时，所述分离方法的流动相为体积比83:17到90:10的二氧化碳-乙腈，流速为3～4ml/min，柱温为33～38℃，背压为100～150bar。各参数在该范围内的所述分离方法可以使表告依春与告依春的分离度达到3以上，5分钟以内完成分离。该分离方法十分快捷，且单体纯度非常高，与现有分离方法相比，分离效率、效果均得到显著地提高。
当所述的固定相为键合型手性色谱柱时，本发明的分离方法优选为：流动相为体积比85:15的二氧化碳-乙腈，流速为3.5ml/min，柱温为35℃，背压为100bar。该优选方法可使两成分在4分钟内完成分离，又不被溶剂峰所影响，且两峰的分离度高达3.5。
上述的固定相(键合型手性色谱柱)是指CHIRALPAK IC(5um*4.6mm*150mm)，该手性色谱柱主要用于分析，也可称为分析柱。此外，为了了解该分离方法的耐用性及放量制备的情况，发明人还考察了分析柱的其他规格及半制备柱、制备柱，如CHIRALPAK IC(5um*4.6mm*250mm)、CHIRALPAK IC(5um*20mm*250mm)、CHIRALPAK IC(5um*50mm*150mm)等，均可很好地将表告依春与告依春进行分离。
当固定相为涂覆型手性色谱柱时，所述分离方法的流动相为体积比90:10到95:5的二氧化碳-甲醇，流速为1.5～2.5ml/min，柱温为33～38℃，背压为100～150bar。各参数在该范围内的所述分离方法可以使告依春与表告依春的分离度在2以上，15分钟以内完成分离。该分离方法在保证单体高纯度的同时，相对于现有的液相色谱等分离法也节约了近一倍的时间。
当固定相为涂覆型手性色谱柱时，所述分离方法优选为：流动相为体积比93:7的二氧化碳-甲醇，流速为2.5ml/min，柱温为35℃，背压为100bar。该优选条件下，告依春与表告依春两峰的分离度在2.5以上，9分钟以内完成分离。该方法的有机溶剂消耗量更小，易于回收、更环保。
上述的固定相(涂覆型手性色谱柱)为CHIRALCEL OD(5um*4.6mm*250mm)。该固定相主要用于分析，也可称为分析柱。此外，为了了解该分离方法的耐用性及放量制备的情况，发明人还考察了分析柱的其他规格及半制备柱、制备柱，如CHIRALCEL OD(5um*10mm*250mm)、CHIRALCEL OD(5um*20mm*250mm)，也可很好地将表告依春与告依春进行分离。
本发明所述的分离方法的检测波长为245nm，根据出峰的先后顺序，依次为告依春和表告依春，分别收集两流份，回收溶剂至干，得到光学纯的告依春和表告依春。所述的回收溶剂，可采用本领域任何常用方法完成。精密称取分离得到的表告依春和告依春单体适量，分别加三氯甲烷制成浓度约为3mg/ml的溶液，采用数字式自动旋光仪测定旋光度，测得表告依春和告依春旋光度[α]25 D(c＝3，三氯甲烷)分别为+66.5和-67.3。该结果说明拆分产物的光学纯度很高，该方法手性分离的效果非常好。将分离得到的表告依春和告依春单体分别制成溶液，按照本发明分离方法进样测定，采用峰面积归一化法计算表告依春和告依春化学纯度，分别为99.5％和99.2％。
当需要大量制备光学纯的表告依春和告依春时，本发明所述制备方法可以使用固定相是以纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)为填料的制备或半制备型手性色谱柱，如CHIRALPAK IC5um*20mm*250mm或CHIRALCEL OD5um*20mm*250mm，相应的，提高流速至5ml/min～10ml/min，其他参数不变。
发明人通过以下实验来验证本发明分离方法。
再次重申：以下实验只是本发明方法建立过程中众多实验中的举例性实验，并未涵盖和穷尽了发明人为本发明所做的所有实验，目的仅仅在于用那些数据来阐述本发明分离方法的准确性、稳定性等。
方法学考察试验
1、仪器与试药
Waters Investigator超临界流体色谱仪，配有Waters2998PDA检测器。色谱纯甲醇、乙腈购于Merck公司。DL-告依春来自中国食品药品检定研究院。
2、色谱条件
分离方法A：色谱柱：CHIRALPAK IC(5um*4.6mm*150mm)，流动相：二氧化碳-乙腈85:15(v/v)，流速：3.5ml/min，柱温：35℃，背压：100bar，进样量：10μl，检测波长245nm；
分离方法B：色谱柱：CHIRALCEL OD(5um*4.6mm*250mm)，流动相：二氧化碳-甲醇93:7(v/v)，流速：2.5ml/min，柱温：35℃，背压：100bar，进样量：10μl，检测波长245nm。
3、系统适应性及精密度试验
精密称取DL-告依春，加甲醇溶解制成约1mg/ml的供试液。取该供试液，分别按照上述两种分离方法连续测定5次，记录告依春与表告依春色谱峰的理论塔板数、分离度及峰面积，并计算RSD值。结果表明，两分离方法的精密度都非常好，均可很好地将DL-告依春中的告依春与表告依春分离，具体见表1-2。
表1分离方法A系统适应性试验结果
表2分离方法B系统适应性试验结果
4、检出限与定量限
取DL-告依春供试液，逐级稀释，观察色谱峰与噪音的响应，以信噪比S/N＝3:1计算检测限，以信噪比S/N＝10:1计算定量限。结果，分离方法A的检出限为2.1μg/mL，定量限为6.6μg/mL。分离方法B的测得检出限为2.2μg/mL，定量限为6.8μg/mL。
5、线性关系试验
精密称取DL-告依春适量，加甲醇制得浓度分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0mg/mL的系列溶液，分别采用两种方法测定，记录峰面积，以浓度(X)对峰面积(Y)作线性回归。结果表明，DL-告依春在0.1～10mg/mL浓度范围内两种方法的线性关系良好。详见表3-4。
表3分离方法A线性关系试验
表4分离方法B线性关系试验
6、稳定性试验
取DL-告依春供试液，分别于0、1、2、4、8、16、24小时(h)进样测定，观察并记录峰面积变化情况，计算RSD值。结果表明，DL-告依春供试液在室温下至少24小时内是稳定的。详见表5-6。
表5分离方法A稳定性试验
表6分离方法B稳定性试验
上述结果表明，本发明所述分离方法灵敏、准确且稳定，可以简单、高效地将DL-告依春中的表告依春与告依春完全分离，分离单体纯度高。
除了上述实验外，发明人还对色谱条件调整后的方法进行了方法学验证试验，包括实施例1-9所述方法，结果表明，色谱柱规格、流动相比例、流速、柱温及背压在本发明所述范围内的调整不会影响表告依春及告依春的分离效果。
由于篇幅所限，上述实验的方法、步骤以及相关数据在此不再赘述。
附图说明
图1：当固定相为CHIRALPAK IC(5um*4.6mm*150mm)时本发明分离方法得到的色谱图；
图2：当固定相为CHIRALCEL OD(5um*4.6mm*250mm)时本发明分离方法得到的色谱图。
具体实施方式
仪器与试药
Waters Investigator超临界流体色谱仪，配有Waters2998PDA检测器。色谱纯甲醇、乙腈购于Merck公司。DL-告依春来自中国食品药品检定研究院。
实施例1：
色谱条件：色谱柱：CHIRALPAK IC(5um*4.6mm*150mm)，流动相：二氧化碳-乙腈85:15(v/v)，流速：3.5ml/min，柱温：35℃，背压：100bar，进样量：10μl，检测波长245nm。
方法与结果：精密称取DL-告依春10.05mg，加甲醇溶解，制成1.005mg/ml的溶液，进样，告依春和表告依春可实现手性分离，保留时间分别为3.02min和3.58min，分离度为3.5。
实施例2：
与实施例1的区别在于：流动相：二氧化碳-乙腈83:17(v/v)，流速：3ml/min，柱温：38℃，背压：120bar；告依春和表告依春的保留时间分别为3.11min和3.75min，分离度为3.3。
实施例3：
色谱条件：色谱柱：CHIRALPAK IC(5um*4.6mm*250mm)，流动相：二氧化碳-乙腈90:10(v/v)，流速：4ml/min，柱温：33℃，背压：150bar，进样量：10μl，检测波长245nm。
方法与结果：精密称取DL-告依春10.07mg，加甲醇溶解，制成1.007mg/ml的溶液，进样，告依春和表告依春可实现手性分离，保留时间分别为2.87min和3.31min，分离度为3.1。
实施例4：
色谱条件：色谱柱：CHIRALPAK IC(5um*20mm*250mm)，流动相：二氧化碳-乙腈85:15(v/v)，流速：10ml/min，柱温：35℃，背压：100bar，进样量：50μl，检测波长245nm。
方法与结果：精密称取DL-告依春100.77mg，加甲醇溶解，制成10.08mg/ml的溶液，进样，分别收集告依春和表告依春，减压回收溶剂至干，得到纯度分别为99.36％和99.19％的光学纯告依春与表告依春。
实施例5：
色谱条件：色谱柱：CHIRALCEL OD(5um*4.6mm*250mm)，流动相：二氧化碳-甲醇93:7(v/v)，流速：2.5ml/min，柱温：35℃，背压：100bar，进样量：10μl，检测波长245nm。
方法与结果：精密称取DL-告依春9.92mg，加甲醇溶解，制成0.992mg/ml的溶液，进样，告依春和表告依春可实现手性分离，保留时间分别为7.38min和8.06min，分离度为2.7。
实施例6：
与实施例5的区别在于：流动相：二氧化碳-甲醇90:10(v/v)，流速：2ml/min，柱温：38℃，背压：120bar；告依春和表告依春的保留时间分别为8.13min和8.64min，分离度为2.6。
实施例7：
与实施例5的区别在于：流动相：二氧化碳-甲醇95:5(v/v)，流速：1.5ml/min，柱温：33℃，背压：150bar；告依春和表告依春的保留时间分别为8.39min和8.76min，分离度为2.6。
实施例8：
色谱条件：色谱柱：CHIRALCEL OD(5um*10mm*250mm)，流动相：二氧化碳-甲醇93:7(v/v)，流速：5ml/min，柱温：35℃，背压：150bar，进样量：30μl，检测波长245nm。
方法与结果：精密称取DL-告依春50.03mg，加甲醇溶解，制成5.003mg/ml的溶液，进样，分别收集告依春和表告依春，减压回收溶剂至干，得到纯度分别为99.51％和99.42％的光学纯告依春与表告依春。
实施例9：
色谱条件：色谱柱：CHIRALCEL OD(5um*20mm*250mm)，流动相：二氧化碳-甲醇95:5(v/v)，流速：10ml/min，柱温：35℃，背压：100bar，进样量：70μl，检测波长245nm。
方法与结果：精密称取DL-告依春100.17mg，加甲醇溶解，制成10.02mg/ml的溶液，进样，分别收集告依春和表告依春，氮吹回收溶剂至干，得到纯度分别为99.14％和99.21％的光学纯告依春与表告依春。
本发明不局限于上述实施方式，任何人在本发明的启示下得出的其他任何与本发明相同或相近似的产品，均不排除在本发明的保护范围之外。

Claims (5)

1.DL-告依春中表告依春与告依春的分离方法，其特征在于，该分离方法为：将DL-告依春制成溶液，以超临界流体色谱法进行分离；该分离方法的固定相是以纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)为填料的手性色谱柱，该手性色谱柱为键合型或涂敷型；当固定相为键合型手性色谱柱时，所述分离方法的流动相为体积比83:17到90:10的二氧化碳-乙腈，流速为3～4ml/min，柱温为33～38℃，背压为100～150bar；当固定相为涂覆型手性色谱柱时，所述分离方法的流动相为体积比90:10到95:5的二氧化碳-甲醇，流速为1.5～2.5ml/min，柱温为33～38℃，背压为100～150bar。
2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，当固定相为键合型手性色谱柱时，该分离方法的流动相为体积比85:15的二氧化碳-乙腈，流速为3.5ml/min，柱温为35℃，背压为100bar。
3.如权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述的固定相为CHIRALPAK IC 5μm*4.6mm*150mm。
4.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，当固定相为涂覆型手性色谱柱时，该分离方法的流动相为体积比93:7的二氧化碳-甲醇，流速为2.5ml/min，柱温为35℃，背压为100bar。
5.如权利要求4所述的分离方法，其特征在于，所述的固定相为CHIRALCEL OD 5μm*4.6mm*250mm。
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