CN108254471A - 低聚木糖中5-羟甲基糠醛和糠醛含量的检测方法 - Google Patents

低聚木糖中5-羟甲基糠醛和糠醛含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

一种低聚木糖中5‑羟甲基糠醛和糠醛含量的检测方法，所述方法包括以下步骤：以甲醇溶液分别对5‑羟甲基糠醛和糠醛标准品和含5‑羟甲基糠醛和糠醛的低聚木糖供试品进行溶解，制成标准品溶液和供试品溶液；使用C18色谱柱，在0.5～1.0mL/min的流动相流速下进行分离，在波长284nm下通过高效液相色谱对所述供试品溶液进行检测；以及通过将所述供试品溶液的测定结果与对标准工作溶液进行测定而制作的标准工作曲线进行比较，获得检测结果，其中，所述流动相为水‑甲醇、水‑乙腈、0.01M乙酸铵水溶液‑甲醇和0.01M乙酸铵水溶液‑乙腈混合溶液中的至少一种，所述流动相按水相/有机相＝95:5‑40:60(v/v)的比例形成。

Description

低聚木糖中5-羟甲基糠醛和糠醛含量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种对低聚木糖中5-羟甲基糠醛和糠醛的含量进行检测的方法，属于医药技术领域。
背景技术
低聚木糖(xylo-oligosaccharides)又称木寡糖，是由2～7个木糖分子以β-1,4糖苷键结合而得到的以木二糖和木三糖为主要成分的低聚木糖混合物。低聚木糖具有显著的双歧杆菌增殖效果，用量小，且具有耐热、耐酸、难发酵、降低水活性等诸多特点。可广泛应用于食品工业、医药保健品、饲料添加剂等行业中(非专利文献1)。
羟甲基糠醛(5-HMF)和糠醛(2-F)是美拉德反应的中间产物，主要存在于可能发生糖降解反应和美拉德反应的产品中，研究表明，一定量的糠醛或5-羟甲基糠醛被机体吸收后，会对肝脏、肾脏、心脏等器官产生不良影响；5-羟甲基糠醛还对眼黏膜、上呼吸道黏膜等产生刺激作用(非专利文献2-4)。因此，5-HMF和2-F是工业生产的低聚木糖中重要的有害物质。
目前，5-HMF和2-F的检测方法主要有高效液相色谱法(非专利文献5-8)、分光光度法(非专利文献9)、气相色谱法(非专利文献10)和液相色谱-质谱联用(非专利文献11)等，国内外关于蜂产品(非专利文献5，9)、乳制品(非专利文献6)、糖浆(非专利文献7)等食品和香丹注射液(非专利文献8)及葡萄糖注射液(非专利文献10)等医药品中5-HMF和2-F的检测方法均有报道，然而，对于低聚木糖中的5-HMF、2-F的测定，现有技术中鲜有研究报道。丁长河等(微波处理对玉米芯酶法制备低聚木糖的影响，河南工业大学学报，Vol27，No.5，P5-8，2006年10月)记载了可使用分光光度法对低聚木糖中的糠醛进行测定，然而该方法仍存在精度较低(仅0.001mg/mL)、难以同时分别准确测定糠醛和5-羟甲基糠醛含量等缺点。从而，目前对于简便快速、准确率高的对低聚木糖中的5-羟甲基糠醛和糠醛含量同时进行测定的分析检测方法存在实际需求。
现有技术
非专利文献
1许正宏，熊筱晶，陶文沂低聚木糖的生产及应用研究进展[J]食品与发酵工业，2001，28(1)：56-59
2张玉玉，宋弋，李全宏，食品中糠醛和5-羟甲基糠醛的产生机理、含量检测及安全性评价研究进展[J]，食品科学，2012，33(5)：275-279
3谭俊杰，柴建国，张善飞等参麦注射液中5-羟甲基糠醛含量的高效液相色谱测定[J]，时珍国医国药，2010，21(7)：1624-1625
4T,Haugen M,Murkovic M,et al.Dietary exposure to 5-hydroxymethylfurfural from Norwegian food and correlations with urinemetabolites of short-term exposure[J].Food Chem Toxicol,2008,46(12):3697-3702.
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6赵贞，李翠枝，月虹，万鹏，吕海燕，邵建波，HPLC法检测乳制品中5-羟甲基糠醛和糠醛[J]，饮料工业2015，18(1)，48-50
7郭峰，罗建勇，朱晓立，果葡糖浆中5-羟甲基糠醛的检测方法研究进展[J]，现代农业科技，2010，11，20-22
8程巧鸳，郭增喜，陈碧莲，RP-HPLC法同时测定香丹注射液中5-羟甲基糠醛和酚酸类成分的含量[J]医药导报，2015,34(1)，95-98
9周碧青，张素平，张金彪分光光度法和比色卡法快速测定蜂蜜中羟甲基糠醛[J]分析试验室，2016,35(5)，586-589
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11臧清策，何菁菁，白进发等快速筛查中药注射液中有害物质5-羟甲基糠醛的LC-MS/MS方法及其质量评价研究[J]药学学报，2013,48(11)，1705-1709
12化学药物杂质研究的技术指导原则(2005年)[M].1版,北京:中国医药科技出版社，2006：17
发明内容
本发明为了弥补现有技术中的技术空白而进行了深入研究，通过使用高效液相色谱(HPLC)检测，提供了一种快速、准确且重现性好的低聚木糖中5-羟甲基糠醛和糠醛含量的检测方法。
为达到上述目的，本发明所述的低聚木糖中5-羟甲基糠醛和糠醛含量的检测方法包括以下步骤：
以甲醇溶液分别对5-羟甲基糠醛和糠醛标准品和含5-羟甲基糠醛和糠醛的低聚木糖供试品进行溶解，制成标准品溶液和供试品溶液；
使用C18色谱柱，在0.5～1.0mL/min的流动相流速下等度洗脱分离，在波长284nm下通过高效液相色谱对所述供试品溶液进行检测；以及
通过将所述供试品溶液的测定结果与对标准工作溶液进行测定而制作的标准工作曲线进行比较，获得检测结果，
其中，所述流动相为水-甲醇、水-乙腈、0.01M乙酸铵水溶液-甲醇和0.01M乙酸铵水溶液-乙腈混合溶液中的至少一种，所述流动相按水相/有机相＝95:5-40:60(v/v)的比例形成。
在优选的实施方式中，所述流动相为水-甲醇溶液，在一个实施方式中，所述流动相为90:10(v/v)的水-甲醇溶液。
在优选的实施方式中，所述C18色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18柱或Kromasil100-C18(150×4.6mm，色谱柱填料颗粒直径5μm)色谱柱，优选Zorbax Eclipse XDB-C18柱，色谱柱规格为150×4.6mm，色谱柱填料颗粒直径5μm，在25～40℃、优选30℃的柱温下进样5-20μL、优选10μL。
在一个实施方式中，在所述检测前，以流动相溶液对所述供试品进行定容，随后进行膜过滤，获得所述供试品溶液。
在优选的实施方式中，使用0.45μm尼龙膜进行所述膜过滤。
以下，通过附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
附图说明
图1a和图1b分别为5-羟甲基糠醛(5-HMF)和糠醛(2-F)的紫外吸收光谱图。
图2为标准品5-HMF和2-F的HPLC色谱图。
图3为添加标准品的供试品溶液的HPLC色谱图。
图4-图8为使用不同色谱条件对标准品溶液进行检测的HPLC色谱图，其中
图4的色谱条件为：流动相：甲醇-0.1％NH4Ac(10:90v/v)，色谱柱：zorbaxEclipse XDB-C18；
图5的色谱条件为：流动相：甲醇-水(10:90v/v)，色谱柱：zorbax Eclipse XDB-C18；
图6的色谱条件为：流动相：甲醇-水(10:90v/v)，色谱柱：Kromasil 100-5C18(150×4.6mm，5μm)；
图7的色谱条件为：流动相：乙腈-水(10:90v/v)，色谱柱：Kromasil 100-5C18(250×4.6mm，5μm)；
图8的色谱条件为：流动相：乙腈-0.1％NH4Ac(10:90v/v)，色谱柱：Kromasil 100-5C18(250×4.6mm，5μm)。
具体实施方式
在以下具体实施例中，本发明对HPLC色谱条件的检测波长、流动相和色谱柱进行了确定，并验证了5-羟甲基糠醛(5-HMF)和糠醛(2-F)的分离效果；随后，使用5-羟甲基糠醛和糠醛标准品建立工作曲线，对其线性关系进行了验证；并且，对于实际低聚木糖供试品的测定，对测定的精密度和准确度、测定的检出限和定量限、以及供试品溶液的溶液稳定性进行了研究。最后，根据上述测定结果，依据相应标准对低聚木糖中5-羟甲基糠醛和糠醛的含量限度进行了规定。
在以下实施例中，所使用的仪器与具体试剂如下：
Agilent 1100高效液相色谱仪，配有DAD检测器；
UV-3010紫外可见分光光度计(日本日立株式会社)；
分析天平(CP224S，Sartorius，感量0.1mg)。
甲醇(色谱纯，Fisher Scientific)，乙酸铵(AR，国药集团化学试剂有限公司)；标准品5-羟甲基糠醛(99.5％，Dr Ehrenstorfer GmbH，Germany)，糠醛(99.0％，DrEhrenstorfer GmbH，Germany)。
另外，采用山东龙力生物科技股份有限公司日常批量生产且在库房存放的多个批次的低聚木糖作为供试品。供试品批次号分别为20150315、20131115、20131120、20130905、20111104、20101019、20100702、20100413。
在以下实施例中，在进行测定前，使用以下方法分别准备标准品溶液和供试品溶液：
分别准确称取5-羟甲基糠醛和糠醛标准品，用10％甲醇溶解，定容，制得5-羟甲基糠醛和糠醛标准品储备液。在制作标准工作曲线时，将该标准品储备液用10％甲醇稀释成相应标准工作溶液。
精密称定供试品1.000g，置于100ml量瓶中，加10％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，经0.45μm尼龙膜过滤。将滤液作为供试品溶液。
为了进一步减少干扰，优选在加入低浓度乙醇水溶液对样品进行再溶解后对溶液进行过滤，所述过滤使用尺寸为0.22μm的滤膜进行。
对样品检测使用高效液相色谱(HPLC)进行，本发明中，高效液相色谱优选使用如下色谱条件：
色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱(5μm；4.6×150mm)；
流动相：水:甲醇(90:10v/v)；
流速：1.0mL/min；
检测波长：284nm；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
检测器：二极管陈列检测器(DAD)。
为了对低聚木糖中的5-羟甲基糠醛和糠醛含量进行定量，本发明中通过外标法，使用标准曲线对低聚木糖中的5-羟甲基糠醛和糠醛含量进行测定。其中，通过如上所述将5-羟甲基糠醛和糠醛标准品储备液稀释为相应标准工作溶液，建立标准曲线。
实施例
接下来，通过实施例对本发明进行进一步详细地说明，但本发明不仅限于这些实施例。
标准品溶液的配制：准确称量0.0125g的5-羟甲基糠醛，用10％甲醇定容至25ml容量瓶；精密称取0.0165g的糠醛，用10％甲醇定容至50ml容量瓶；分别制得标准品储备液。
分别移取5-羟甲基糠醛储备液5.0ml，糠醛储备液1.0ml用10％甲醇稀释到100ml，即制得5-羟甲基糠醛25.0μg/ml，糠醛3.3μg/ml的标准品混合溶液①。
移取1.0ml标准品混合溶液①用10％甲醇稀释至10ml，即得5-羟甲基糠醛2.5μg/ml，糠醛0.33μg/ml的标准品混合溶液②。
供试品溶液的配制：精密称取供试品1.000g，置100ml量瓶中，加10％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，摇匀，经0.45μm尼龙膜过滤。滤液作为供试品溶液。
试验例1选择检测波长
通过二极管陈列检测器(DAD)对单独的5-羟甲基糠醛和糠醛标准品进行扫描，获得5-羟甲基糠醛和糠醛在紫外光区的最大吸收波长。所获得的紫外吸收光谱图参见图1a和图1b。
由图1a和图1b可知，5-羟甲基糠醛最大吸收波长为284nm，糠醛最大吸收波长为274nm；同一浓度的糠醛在284nm的峰面积为274nm的86％，从而，本申请中确定284nm作为优选的检测波长，在该波长下5-羟甲基糠醛和糠醛皆具有灵敏的吸收值，同时可避开溶剂吸收波长，获得优异的检测效率。
试验例2专属性试验
取上述准备的标准品混合溶液②，并向上述供试品溶液中添加125μg5-羟甲基糠醛和16.5μg糠醛制成添加标准品的供试品溶液。在相同的前述色谱条件下分别对该标准品混合溶液②与添加标准品的供试品溶液进行高效液相色谱分析。具体分析结果分别如图2和图3所示。
将图3与图2的结果进行比较可知，在相同条件下，与标准品混合溶液②的HPLC检测结果相比，添加标准品的供试品溶液的HPLC结果中，5-HMF和2-F同样完全分离，且无杂质干扰峰存在，从而可准确定量检测。
试验例3色谱条件选择
在本试验例中，对色谱条件中流动相和固定相进行了选择。
首先，对于流动相，选取了甲醇-水、甲醇-0.01M乙酸铵水溶液、乙腈-水、乙腈-0.01M乙酸铵水溶液四种流动相(有机相:水相均为10:90(v/v))在其它色谱条件相同的情况下进行比较。比较结果如图4-图5和图7-图8所示。通过比较可知，上述四种流动相均能获得良好分离，但甲醇-水(10:90)作为流动相时，分离效果更好，且操作简便易行。
其次，对于固定相，对两种C18分析柱：zorbax Eclipse XDB-C18(150×4.6mm，5μm)色谱柱和Kromasil 100-C18(150×4.6mm，5μm)色谱柱在其它色谱条件相同的情况下进行比较。比较结果如图5和图6所示。通过比较可知，两种C18分析柱均能达到分离测定要求。
试验例4标准曲线的建立
对于上述标准品混合溶液②，分别进样3μL、5μL、10μL、15μL、20μL、30μL；对于上述标准品混合溶液①，分别进样5μL、10μL，并在上述色谱条件下测定，以浓度C(μg/ml)为横坐标，峰面积Y(mAU*s)为纵坐标进行线性拟合，线性方程和相关系数见表1：
表1标准曲线的回归方程
由表1结果可知，两种物质的相关系数均大于0.999，5-羟甲基糠醛浓度在0.75～25.0μg/ml范围内线性关系良好，糠醛浓度在0.099～3.3μg/ml范围内线性关系良好。
试验例5精密度分析
精密称取供试品，按上述方法进行样品处理获得供试品溶液，对其进行平行测定分析，从而对本发明方法的精密度进行确定。在本试验例中，进行6次平行测定，计算测定结果的相对标准偏差(RSD)值。实验结果如表2所示。
表2精密度试验结果
通过对测定结果进行计算可知，5-羟甲基糠醛、糠醛的RSD值分别为0.28％和0.58％，均小于5％。因此，本发明的测定方法能够获得稳定的测定结果，方法重复性良好，具有优异的精密度。
试验例6准确度分析
人工配制5-羟甲基糠醛与糠醛含量已知的供试品溶液，按表3所述的量添加标准品溶液进行混合，制成待测溶液，对其进行平行测定分析，从而对本发明方法的准确度进行确定。在本试验例中，进行9次平行测定，分别计算5-羟甲基糠醛与糠醛的平均回收率。检测结果及计算获得的回收率如以下表2所示：
表3回收率试验结果
通过上述结果可知，5-羟甲基糠醛、糠醛平均回收率分别为100.5％、99.0％，RSD分别为0.32％、1.8％(n＝9)，因此，本发明的测定方法具有可靠的准确度。
试验例7检测限和定量限
用流动相逐级稀释标准品溶液，至信噪比约为3时，糠醛对应的浓度为0.026μg/ml，5-羟甲基糠醛对应的浓度为0.02μg/ml，将该浓度分别定义为其检出限。信噪比约为10时，糠醛对应的浓度为0.0086μg/ml，5-羟甲基糠醛对应的浓度为0.066μg/ml，将分别定义为其定量限。通过计算得知，供试品中糠醛的检出限、定量限分别为0.0003％、0.0009％；5-羟甲基糠醛的检出限和定量限分别为0.0002％、0.0007％。
试验例8溶液稳定性实验
取如上所述制备的供试品溶液，室温放置，分别于0，1，3，6，8h时进行测定，对5-羟甲基糠醛、糠醛峰面积的RSD值进行分析。分析结果如以下表4所示。
表4溶液稳定性试验
时间(h) 0 1 3 6 8 RSD
5-HMF峰面积 91.408 91.122 91.394 91.176 91.428 0.16％
2-F峰面积 13.73 13.794 13.822 13.728 13.734 0.32％
峰面积计算结果表明，5-羟甲基糠醛、糠醛峰面积RSD分别为0.16％、0.32％，均小于2％，表明该溶液在室温放置条件下，8小时内具有良好的稳定性。
实施例1供试品中5-羟甲基糠醛、糠醛含量的测定
取山东龙力生物科技股份有限公司正常生产的批号分别是20150315、20131115、20131120、20130905、20111104，、20101019、20100702、20100413(其中2015年1批，21013年3批，2011年1批，2010年3批)供试品，按照上述方法制备供试液，依照前述色谱条件使用高效液相色谱进行分析。分析结果参见表5。
表5供试品5-羟甲基糠醛、糠醛分析结果
分析结果表明，上述供试品中5-羟甲基糠醛含量为0.0002％～0.011％，糠醛含量为0.001％～0.022％。
实施例2低聚木糖中5-羟甲基糠醛和糠醛的含量限度的确定
(1)5-羟甲基糠醛的含量限度的确定
参照中国药典2010年版二部附录IV A记载的方法，用水配制5-羟甲基糠醛对照溶液，稀释后配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/ml系列浓度为C的溶液，以纯水作为参比，于284nm下对吸光度A进行测定，得线性方程A＝0.1361C-0.0035，相关系数r＝0.9995。
《2010版中国药典》部分制剂及药用辅料的5-羟甲基糠醛限度参见以下表6所示(以吸光度为限度，则用对照标准品进行限度等量转换，换算为以葡萄糖标示量的百分含量计)。
表6 5-羟甲基糠醛限度(以葡萄糖标示量的百分含量计)
根据《化学药物杂质研究的技术指导原则》(非专利文献12)，低聚木糖糖份最大日剂量不大于2g，杂质鉴定限度为0.05wt％。结合葡萄糖注射液制剂、果糖等5-羟甲基糠醛限值，另参考《2010版中国药典》收载的乳果糖口服液、麦芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、糊精等制剂及药用辅料检查项中没有“5-羟甲基糠醛”，考虑实际样品测定结果，故确定低聚木糖中5-羟甲基糠醛的含量上限为0.024wt％。
(2)糠醛的含量限度的确定
根据《化学药物杂质研究的技术指导原则》(非专利文献12)，低聚木糖糖份最大日剂量不大于2g，杂质鉴定限度为0.05wt％。结合实际样品测定结果，故确定低聚木糖产品中糠醛的含量上限为0.03wt％。
以上实验结果表明，本发明采用C18色谱柱，以水-甲醇溶液为流动相，紫外检测器284nm检测，建立了低聚木糖中5-羟甲基糠醛和糠醛的HPLC检测方法。本发明的检测方法操作方便，样品稳定，精密度高，定量准确，回收率稳定，结果可靠，为监测低聚木糖中5-羟甲基糠醛和糠醛提供了有效的分析方法。并且通过本发明的方法，确定了低聚木糖产品中5-羟甲基糠醛和糠醛的含量限度，为低聚木糖产品的质量监测提供了帮助。
以上较佳实施例仅用于说明本发明的内容，除此之外，本发明还有其他实施方式，但凡本领域技术人员因本发明所涉及之技术启示，而采用等同替代或等效变形方式形成的技术方案均落在本发明保护范围内。

Claims (9)

1.一种低聚木糖中5-羟甲基糠醛和糠醛含量的检测方法，所述方法包括以下步骤：
以甲醇溶液分别对5-羟甲基糠醛和糠醛标准品和含5-羟甲基糠醛和糠醛的低聚木糖供试品进行溶解，制成标准品溶液和供试品溶液；
使用C18色谱柱，在0.5～1.0mL/min的流动相流速下等度洗脱分离，在波长284nm下通过高效液相色谱对所述供试品溶液进行检测；以及
通过将所述供试品溶液的测定结果与对标准工作溶液进行测定而制作的标准工作曲线进行比较，获得检测结果，
其中，所述流动相为水-甲醇、水-乙腈、0.01M乙酸铵水溶液-甲醇和0.01M乙酸铵水溶液-乙腈混合溶液中的至少一种，所述流动相按水相/有机相＝95:5-40:60(v/v)的比例形成。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述流动相为水-甲醇溶液。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述流动相为90:10(v/v)的水-甲醇溶液。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述C18色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18柱或Kromasil 100-C18柱，所述色谱柱的规格为150mm×4.6mm，色谱柱填料颗粒直径5μm。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述C18色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18柱。
6.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述方法在25-40℃的柱温下进样2-20μL。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述方法在30℃的柱温下进样10μL。
8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在所述检测前，以所述流动相对所述供试品进行定容，随后进行膜过滤，获得所述供试品溶液。
9.如权利要求8所述的方法，其中，使用0.45μm尼龙膜进行所述膜过滤。
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