CN101723998B - 一种黄芩中黄酮苷的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种黄芩中黄酮苷类化合物的制备方法，该方法适用于包括黄芩苷、汉黄芩苷、白杨素-6-C-α-L-阿拉伯糖苷-8-C-β-D-葡萄糖苷和木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷在内的四种黄酮苷的快速制备。其制备方法是将黄芩药材粉碎后加水提取，先后乙醇醇沉，高速离心，再通过膜分离后，非极性大孔吸附树脂上样，乙醇/水洗脱，收集洗脱液并浓缩干燥后得到黄芩大孔树脂组分，再通过平行制备液相色谱分离，乙腈水作流动相，获得黄芩有效成分。本发明选择性好、所得化合物纯度高，且大大提高了分离纯化效率。制备过程重复性高和可操作性好，易于实现标准化和产业化，对快速获取黄芩中的黄酮类活性成分具有一定的指导意义。

Description

一种黄芩中黄酮苷的制备方法

技术领域

本发明涉及天然药物的分离，具体的说是黄芩中黄酮苷的提取制备方法，包括黄芩苷、汉黄芩苷、白杨素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷和木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备。

背景技术

中药黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根.具有清热燥湿、泻火解毒、凉血止血和除热安胎的功效。主产于河北、山西、内蒙古、山东及河南等地。黄芩中主要包含黄酮、萜、甾醇和有机酸等几大类化合物(刘雄等，甘肃中医学院学报，24(2)：46-51)。其中，以黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素等为代表队黄酮类化合物是黄芩的主要活性成分。药理研究表明，黄芩中的黄酮具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎和镇静等功效，并具有广泛的抗肿瘤活性(李庆林等，中国中药杂志，2007，32(1)：21-24)。同时黄芩中的黄酮类化合物还具有神经保护作用(Kim Y.，Park E.J.，et al.，J.Nat.Prod.，2001，64:75-78)。由于黄酮的多种药理学活性，黄芩中黄酮类化合物的研究一直是人们的研究热点。

目前报道的从天然产物中分离制备黄酮苷类化合物的方法主要有两种：一种是传统的植物化学方法(应龙彬等，中国中医药信息杂志，2007，14(12)：100-102)，另一种为反相制备液相色谱法(刘霞等，中成药，2005，27(12)：1444-1448)。前者是采取传统的溶剂萃取、硅胶柱层析等方法进行化合物的纯化分离，该方法存在重现性差、耗时长、有机残留严重、检测手段落后、自动化程度低等缺点。后者可以采用先进的检测手段，并且具有较好的重复性，可以大大提高自动化程度。但由于通常采用较大粒度固定相，柱效较低，从而限制了多个化合物的同时分离，不利于化合物的高通量制备。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄芩中黄酮苷的制备工艺，主要涉及黄芩苷、汉黄芩苷、白杨素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷和木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷四个化合物。

其利用平行高效制备液相色谱技术快速、高效地从黄芩药材中一次性得到4个高纯度黄芩苷类化合物，包括黄芩苷、汉黄芩苷、白杨素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷和木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种黄芩中黄酮苷的制备方法，

1)样品前处理：称取原药材黄芩，加水煎煮提取2-3次，得到黄芩提取液，将提取液浓缩成浸膏后依次进行醇沉、高速离心和膜分离处理后得到膜分离组分，将膜分离组分上样于非极性大孔树脂柱，分别采用不同体积浓度的乙醇洗脱，洗脱液浓缩，得黄芩大孔树脂分离组分；

2)平行制备液相色谱分离：采用2-6个通道的平行制备液相色谱，以粒径3-10微米的ODS系列中的固定相为色谱填料，以乙腈和水为流动相，梯度洗脱，乙腈的体积浓度从0-100％变化，对黄芩大孔树脂分离组分进行纯化分离，采用DAD实时监控，共收集到四个不同的目标组分，浓缩处理即得黄酮苷类化合物，它们分别为黄芩苷、汉黄芩苷、白杨素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷和木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷。

具体为：

1)提取：称取黄芩原药材，将黄芩加入其重量6-10倍的水煎煮提取1-3小时，过滤得到提取液；煎煮提取和过滤过程重复2-3次，合并提取液，将提取液浓缩至相对密度为0.9-1.10的浸膏，得到黄芩水提组分。

2)醇沉：于浸膏中加入乙醇，使乙醇体积浓度达到50-70％，室温静置12-24小时，过滤，滤渣弃去，取滤液浓缩，滤液浓缩至相对密度1.05-1.10；于所得浓缩物中再加入乙醇使乙醇体积浓度达到75-85％，室温静置12-24小时过滤，滤渣弃去，取滤液浓缩挥发除去乙醇，样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心，得到黄芩醇沉组分；此醇沉组分再通过3000-6000Da的膜分离，得到膜分离组分；

4)非极性大孔树脂分离：将黄芩的膜分离组分上样于非极性大孔树脂柱，上样量与分离材料体积比为1:100-500，分别采用流动相体积浓度5-15％，30-60％和70-95％乙醇洗脱，每次洗脱的体积为3-5个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；循环洗脱，收集采用体积浓度为30-60％的乙醇洗脱时的洗脱液，洗脱液浓缩，即为黄芩大孔树脂分离组分。

5)平行制备液相色谱分离：以粒径3-10微米的ODS系列固定相为色谱填料，以乙腈和水为流动相，梯度洗脱，乙腈的体积浓度从0-100％变化，收集目标化合物，浓缩处理即得黄酮苷。进行高效液相分析确定其纯度。

所述平行制备液相色谱的柱效为50000-150000塔板/米；色谱柱长为100-300毫米，色谱柱内径为5-50毫米。

本发明的优点：

1、化合物纯度高。本发明采用了最先进的高效液相色谱填料和分离制备技术。利用高效液相色谱的高分离能力，可以保证所得化合物的纯度达到95％以上。

2、制备通量高。本发明采用多通道平行制备液相色谱，大大提高了制备效率，可以实现高通量纯化制备。

2.重现性好。本发明利用高效液相色谱系统和ODS系列键合固定相分离材料稳定的性能，可以保证分离制备的重现性和稳定性。

3.周期短。本发明从原药材的粉碎提取到制备得到黄芩中黄酮苷类化合物，只需要10天的时间。

4.能够实现大规模工业生产。本发明所采用工艺非常容易实现标准化，自动化，适于进行产业化大规模生产。

附图说明

图1本发明实施例1平行制备液相色谱制备黄芩有效成分的制备色谱图；

图2本发明中所涉及黄芩有效成分的HPLC色谱图(λ＝280nm)。

具体实施方式

实施例1：黄芩中黄酮苷的制备方法

将黄芩原药材粉碎，定量称取2千克，置于20升提取罐中，加入20升水煎煮1小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入20升水煎煮1小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至500毫升，得到黄芩水提取组分。在浓缩液中加入710毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至300毫升，在浓缩液中加入1600毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(20000转/分钟)离心，得到黄芩醇沉组分300毫升。此醇沉组分再过6000Da膜，得到膜分离组分。

取黄芩膜分离组分，进样到已处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂层析系统(20L)中；首先用3倍柱体积60L15％乙醇洗脱柱体，洗脱液浓缩备其它用，再用3倍柱体积60L50％乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓缩，得到目标的黄芩大孔树脂组分；后用3倍体积60L95％乙醇洗脱，洗脱液浓缩以备其它用。

平行制备液相色谱柱柱长100毫米，内径19毫米，色谱填料为5微米的Xterra固定相，设定紫外检测波长为280nm(可为254-300nm)，流速16.37毫升/分钟/通道，设定洗脱梯度(见表1)，初始流动相(6％乙睛水)平衡色谱柱10分钟，取黄芩大孔树脂组分样品1.2ml(0.3ml×4通道)，进样，按设定梯度洗脱，采用DAD实时监控，根据紫外吸收域值进行收集，共收集到四个不同的目标组分；洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分(见图1)。共进样十次，将十次收集得到的洗脱组分分别合并，浓缩，再通过真空离心干燥得到黄酮苷，经高效液相色谱分析(图2)，各化合物的纯度均大于95％。四个化合物的纯度分别为：黄芩苷96.75％、汉黄芩苷100％，白杨素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷96.99％和木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷95.20％。

分别取10毫克样品进行核磁及质谱分析，对结构进行鉴定；表征数据如下：

化合物1：1H NMR400MHz(DMSO-d6)δ(ppm)：7.03(1H，s，H-3)，13.53(1H，s，OH-5)，9.26(1H，s，OH-7)，8.19(2H，d，J＝7.2Hz，H-2′，6′)，7.57(2H，m，J＝7.2Hz，H-3′，5′)，7.63(2H，m，J＝7.2Hz，H-4′)，3.2～5.1(糖上质子)。13CNMR400MHz(DMSO-d6)δ(ppm)：163.54(C-2)，104.86(C-3)，182.47(C-4)，155.22(C-5)，108.32(C-6)，161.21(C-7)，105.28(C-8)，158.19(C-9)，103.99(C-10)，130.98(C-1′)，126.94(C-2′，C-6′)，129.03(C-3′，C-5′)，132.07(C-4′)，73.23(Glc-C-1)，70.83(Glc-C-2)，78.83(Glc-C-3)，70.51(Glc-C-4)，81.92(Glc-C-5)，61.18(Glc-C-6)，74.13(Ara-C-1)，69.58(Ara-C-2)，73.78(Ara-C-3)，68.39(Ara-C-4)，70.10(Ara-C-5)。飞行时间质谱正离子模式所得准分子离子峰[M+H]⁺：549.1613，元素组成为C₂₆H₂₉O₁₃，负离子模式所得准分子离子峰[M-H]^-：547.1438，元素组成为C₂₆H₂₉O₁₃。结合核磁及质谱数据该化合物鉴定为白杨素-6-C-α-L-阿拉伯糖苷-8-C-β-D-葡萄糖。

化合物2：1H NMR400MHz(DMSO-d6)δ(ppm)：7.02(1H，s，H-3)，12.60(1H，s，OH-5)，8.68(1H，s，OH-6)，7.06(1H，s，H-8)，8.08(2H，d，J＝7.2Hz，H-2′，6′)，7.60(3H，m，H-3′，5′)，3.3～5.5(糖上质子)。13CNMR400MHz(DMSO-d6)δ(ppm)：163.5(C-2)，106.1(C-3)，182.5(C-4)，146.8(C-5)，130.6(C-6)，151.3(C-7)，93.7(C-8)，149.2(C-9)，104.8(C-10)，130.8(C-1′)，126.4(C-2′，C-6′)，129.2(C-3′，C-5′)，132.0(C-4′)，99.9(GlcA-C-1)，72.8(GlcA-C-2)，75.2(GlcA-C-3)，71.3(GlcA-C-4)，75.5(GlcA-C-5)，170.0(GlcA-C-6，-COOH)。飞行时间质谱正离子模式所得准分子离子峰[M+H]⁺：447.0891，元素组成为C₂₁H₁₉O₁₁，负离子模式所得准分子离子峰[M-H]^-：445.0767，元素组成为C21H17O1₁。结合核磁及质谱数据该化合物鉴定为黄芩苷。

化合物3：1H NMR400MHz(DMSO-d6)δ(ppm)：7.07(1H，s，H-3)，13.83(1H，s，OH-5)，7.13(1H，s，H-8)，8.10(2H，d，J＝7.2Hz，H-2′，6′)，7.62(3H，m，H-3′，4′，5′)，4.0～5.4(糖上质子)，3.78(3H，s，OMe-6)。13CNMR400MHz(DMSO-d6)δ(ppm)：163.8(C-2)，105.0(C-3)，182.5(C-4)，152.3(C-5)，132.7(C-6)，152.6(C-7)，94.1(C-8)，156.3(C-9)，106.1(C-10)，130.7(C-1′)，126.5(C-2′，C-6′)，129.2(C-3′，C-5′)，132.2(C-4′)，61.4(6-OMe)，99.4(GlcA-C-1)，72.8(GlcA-C-2)，75.5(GlcA-C-3)，71.2(GlcA-C-4)，75.9(GlcA-C-5)，170.0(GlcA-C-6，-COOH)。飞行时间质谱正离子模式所得准分子离子峰[M+H]⁺：461.1105，元素组成为C₂₂H2₁O₁₁，负离子模式所得准分子离子峰[M-H]^-：459.0954，元素组成为C₂₁H₁₇O₁₁。结合核磁及质谱数据该化合物鉴定为木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷。

化合物4：1H NMR400MHz(DMSO-d6)δ(ppm)：7.02(1H，s，H-3)，13.71(1H，s，OH-5)，6.73(1H，s，H-6)，8.10(2H，d，J＝7.2Hz，H-2′，6′)，7.63(3H，m，H-3′，4′，5′)，4.0～5.6(糖上质子)，3.90(3H，s，OMe-8)。13CNMR400MHz(DMSO-d6)δ(ppm)：163.8(C-2)，105.0(C-3)，182.5(C-4)，152.3(C-5)，132.7(C-6)，152.6(C-7)，94.1(C-8)，156.3(C-9)，106.1(C-10)，130.7(C-1′)，126.5(C-2′，C-6′)，129.2(C-3′，C-5′)，132.2(C-4′)，60.3(8-OMe)，99.4(GlcA-C-1)，72.8(GlcA-C-2)，75.5(GlcA-C-3)，71.2(GlcA-C-4)，75.9(GlcA-C-5)，170.0(GlcA-C-6，-COOH)。飞行时间质谱正离子模式所得准分子离子峰[M+H]⁺：461.1061，元素组成为C₂₂H₂₁O₁₁，负离子模式所得准分子离子峰[M-H]^-：459.0951，元素组成为C₂₁H₁₇O₁₁。结合核磁及质谱数据该化合物鉴定为汉黄芩苷。

白杨素-6-C-α-L-阿拉伯糖苷-8-C-β-D-葡萄糖的结构式：

黄芩苷的结构式：

木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷的结构式：

汉黄芩苷的结构式：

表1实施例1黄芩中黄酮苷的平行制备液相色谱制备梯度设置表

 

序号	时间(min)	流量(ml/min)	A：乙腈(％)	B：甲酸/水(v/v＝0.1/100)(％)
					1	0	16.37	6	94
2	5	16.37	6	94

 

3	10	16.37	12	88
					4	25	16.37	12	88
5	30	16.37	17	83
					6	33	16.37	17	83
7	35	16.37	21	79
					8	51	16.37	26	74
9	53	16.37	95	5

实施例2：

将黄芩原药材粉碎，定量称取4千克，置于100升提取罐中，加入32升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入32升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至800毫升，得到黄芩水提取组分。在浓缩液中加入1370毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至400毫升，在浓缩液中加入2140毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(10000转/分钟)离心，得到黄芩醇沉组分400毫升。此醇沉组分再过6000Da膜，得到膜分离组分。

取黄芩膜分离组分，进样到已处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂层析系统(40L)中，。首先用3倍柱体积15％乙醇洗脱柱体，洗脱液浓缩备其它用，再用3柱体积的50％乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓缩，得到目标的黄芩大孔树脂组分，后用3倍柱体积95％乙醇洗脱柱体，洗脱液浓缩备其它用。

平行制备液相色谱柱柱长100毫米，内径19毫米，色谱填料为5微米的Xterra固定相，设定紫外检测波长为280nm(可为254-300nm)，流速16.37毫升/分钟/通道，设定洗脱梯度(见表1)，初始流动相(6％乙睛水)平衡色谱柱10分钟，取黄芩大孔树脂组分样品1.2ml(0.3ml×4通道)，进样，按设定梯度洗脱，采用DAD实时监控，根据紫外吸收域值进行收集，共收集到四个不同的目标组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分，共进样十次，将十次收集得到的洗脱组分分别合并，浓缩，再通过真空离心干燥得黄酮苷成分，经高效液相色谱分析，各化合物纯度均大于95％。

实施例3：

将黄芩原药材粉碎，定量称取6千克，置于100升提取罐中，加入36升水煎煮3小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入36升水煎煮3小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至1200毫升，得到黄芩水提取组分。在浓缩液中加入2050毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至900毫升，在浓缩液中加入4800毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(25000转/分钟)离心，得到黄芩醇沉组分1080毫升。此醇沉组分再过3000Da膜，得到膜分离组分。

取黄芩膜分离组分，进样到已处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂层析系统中。首先用3倍柱体积15％乙醇洗脱柱体，洗脱液浓缩备其它用，再用3倍柱体积50％乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓缩，得到目标的黄芩大孔树脂组分。后用3倍柱体积95％乙醇洗脱柱体，洗脱液浓缩备其它用。

平行制备液相色谱柱柱长100毫米，内径19毫米，色谱填料为5微米的Xterra固定相，设定紫外检测波长为280nm(可为254-300nm)，流速16.37毫升/分钟/通道，设定洗脱梯度(见表1)，初始流动相(6％乙睛水)平衡色谱柱10分钟，取黄芩大孔树脂组分样品1.2ml(0.3ml×4通道)，进样，按设定梯度洗脱，采用DAD实时监控，根据紫外吸收域值进行收集，共收集到四个不同的目标组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分。共进样十次，将十次收集得到的洗脱组分分别合并，浓缩，再通过真空离心干燥得到黄酮苷成分，经高效液相色谱分析，各化合物纯度均大于96％。

Claims (1)

1.一种黄芩中黄酮苷的制备方法，其特征在于：

1)样品前处理：称取原药材黄芩，加水煎煮提取2-3次，得到黄芩提取液，将提取液浓缩成浸膏后依次进行醇沉、高速离心和膜分离处理后得到膜分离组分，将膜分离组分上样于非极性大孔树脂柱，分别采用不同体积浓度的乙醇洗脱，洗脱液浓缩，得黄芩大孔树脂分离组分；

2)平行制备液相色谱分离：采用2-6个通道的平行制备液相色谱，以粒径3-10微米的ODS系列中的固定相为色谱填料，以乙腈和水为流动相，梯度洗脱，乙腈的体积浓度从0-100％变化，对黄芩大孔树脂分离组分进行纯化分离，采用DAD实时监控，共收集到四个不同的目标组分，浓缩处理即得黄酮苷类化合物，它们分别为黄芩苷、汉黄芩苷、白杨素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷和木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷；

加水煎煮提取2-3次的过程是指，将黄芩加入其重量6-10倍的水煎煮提取1-3小时，过滤得到提取液；煎煮提取和过滤过程重复2-3次，合并提取液，将提取液浓缩至相对密度为0.9-1.10的浸膏，得到黄芩水提组分；

所述浸膏至膜分离组分过程是指于浸膏中加入乙醇，使乙醇体积浓度达到50-70％，室温静置12-24小时，过滤，滤渣弃去，取滤液浓缩，滤液浓缩至相对密度1.05-1.10；于所得浓缩物中再加入乙醇使乙醇体积浓度达到75-85％，室温静置12-24小时过滤，滤渣弃去，取滤液浓缩挥发除去乙醇，样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心，得到黄芩醇沉组分；此醇沉组分再通过3000-6000Da的膜分离，得到膜分离组分；

所述非极性大孔树脂分离过程为，将黄芩的膜分离组分上样于非极性大孔树脂柱，上样量与分离材料体积比为1∶100-500，分别采用流动相体积浓度5-15％和30-60％乙醇洗脱，每次洗脱的体积为3-5个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；循环洗脱，收集采用体积浓度为30-60％的乙醇洗脱时的洗脱液，洗脱液浓缩，即为黄芩大孔树脂分离组分；

所述平行制备液相色谱的柱效为50000-150000塔板/米；色谱柱长为100-300毫米，色谱柱内径为5-50毫米。

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