CN101353363B

CN101353363B - 高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法及产品

Info

Publication number: CN101353363B
Application number: CN2008100737760A
Authority: CN
Inventors: 潘英明; 朱志仁; 王恒山
Original assignee: Guangxi Normal University
Current assignee: Guangxi Normal University
Priority date: 2008-09-09
Filing date: 2008-09-09
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2028-09-09
Also published as: CN101353363A

Abstract

本发明公开了一种高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法及产品，将罗汉果叶加水或其它极性溶剂回流提取，所得的提取物采用体积比为1～4∶4～1∶4～6的乙酸乙酯、正丁醇和水的混合液作为溶剂体系、经制备型高速逆流色谱仪进行分离纯化，即得山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-[β-D-葡萄糖基(1-2)-O-L-鼠李糖甙]和山奈酚-3，7-α-L-二鼠李糖甙。本发明采用高速逆流色谱法对罗汉果叶提取物进行分离纯化，成功分离得到纯度较高的两个黄酮化合物，拓宽了黄酮类产品的原料来源；而且其制备工艺简单，容易操作，纯化效率高，为罗汉果叶中有效成分的提取利用奠定了坚实的基础，可避免大量罗汉果叶资源的浪费和丢弃后对环境造成的污染。

Description

高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法及产品

(一)技术领域：

本发明涉及一种高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法及其产品，属于罗汉果叶中药用活性成分的提纯技术领域。

(二)背景技术：

罗汉果作为广西桂北地区的传统特产，也是我国特有的药用植物，拥有“东方神果”之美誉，在国内及港澳地区、东南亚和欧美国家久负盛名。主要分布在两广、云南、江西、湖南南部等地区，主产于广西永福、临桂和龙胜等县。罗汉果属植物共有7种，其中罗汉果(Siraitia grosvenoriiSwingle)、翅子罗汉果[S.siamensis(Craib)C.Jeffrey]均可入药，其果实的提取物对治疗呼吸系统和消化系统疾病有相近的功效。罗汉果中含有丰富的黄酮甙、甘露醇、维生素E等，在防癌、美容等方面有良好功效。目前，罗汉果产业得到了一定程度的发展，其利用程度也得到了一定的提高。然而，罗汉果的利用大部分集中在果实上，而对于罗汉果叶子的研究很少。罗汉果叶来源充足，仅桂林临桂、永福两县的罗汉果种植面积便已超过10000亩，每亩可产叶200公斤，但大量的罗汉果叶秋后割下后便扔掉或者焚烧，没有加以利用，对环境污染严重。

据文献记载，罗汉果叶除可治疗癬症外，还对致病菌金黄色葡萄糖球菌、白色葡萄糖球菌、卡他双球菌有较强的抑制作用。罗汉果叶晒干后水煎服临床可治疗慢性咽喉炎及慢性支气管炎。陈全斌等曾采用磷钼络合物法研究了罗汉果叶总黄酮提取物的抗氧化能力，测定了罗汉果叶中总黄酮含量并从水提取物中分离得到两个黄酮甙：山奈酚-3，7-a-L-二鼠李糖甙和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-a-L-鼠李糖甙。并经高效液相色谱仪分析检测发现，罗汉果叶所含的黄酮类化合物几乎与银杏叶内所含的黄酮类化合物的成分、质量及含量相当，其中，罗汉果叶中槲皮素、山奈酚的含量更是优于银杏黄酮。

黄酮是一类重要的化合物，可分为：黄酮类(flavones)、黄酮醇(flavonol)、二氢黄酮类(flavonones)、二氢黄酮醇类(flavanonol)、花色素类(anthocyanidins)、黄烷-3，4二醇类(flavan-3，4-diols)、双苯吡酮类(xanthones)、查尔酮(chalcones)和双黄酮类(biflavonoids)等十五种。另外，还有一些黄酮类化合物的结构很复杂，其中包括榕碱及异榕碱等生物碱型黄酮。黄酮类化合物是许多常用中草药的有效成分，除具有抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等方面也有显著效果。因此，充分开发利用罗汉果叶中的黄酮类化合物将具有非常重要的意义。然而目前还没有从罗汉果叶中分离纯化得到大量纯度较高的黄酮类化合物单体的报道。

高速逆流色谱(High-speed countercurrent chromatography，简称HSCCC)是一种基于液-液多级逆流萃取建立的色谱体系。它没有固体载体，避免了待分离样品与固定相载体表面产生化学反应和不可逆吸附。HSCCC是一种理想的制备分离手段，它相对于传统的柱色谱技术，具有适用面广、高效、快速、制备量大、费用低等优点，近年来被广泛应用于生命科学、中医药、海洋药物、现代农业及标准化等领域。国际上HSCCC被大量用于天然产物各类化学成分的分离纯化，如生物碱、黄酮类、萜类、木脂素、香豆素类等。如采用氯仿/甲醇/水(4∶3∶2)体系，可从银杏(Gingkgo biloba)叶粗提物中一次分离得到白果内酯单体；使用三种溶剂系统，经HSCCC分极梯度洗脱，从粗丹参Salvia iltiorrhiza提取物中一次分离纯化得到丹参酮IIA(tonshinone II A)、丹参酮I(tanshinoneI)、隐丹参酮(cryptotanshinone)；从黄连根生物碱粗提物中分离纯化得到巴马亭(palmatine)、小檗碱(epiberberine)及黄连碱(coptisine)等。

(三)发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：将罗汉果叶提取物用高速逆流色谱法进行分离纯化，制得纯度较高的两种黄酮化合物：山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-[β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖甙]和山奈酚-3，7-α-L-二鼠李糖甙。

本发明的技术方案：高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法为：将罗汉果叶加水或其它极性溶剂回流提取，所得到的提取物采用体积比为1～4∶4～1∶4～6的乙酸乙酯、正丁醇和水的混合液作为溶剂体系、经制备型高速逆流色谱仪进行分离纯化，即得山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-[β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖甙]和山奈酚-3，7-α-L-二鼠李糖甙。

优选的高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法为：包括以下步骤：

(1)罗汉果叶提取：取罗汉果叶，加水或其它极性溶剂(如乙醇、甲醇)回流提取，过滤，浓缩，得罗汉果叶粗提物，备用。粗提物中主要含有黄酮类、酚类、有机酸和生物碱等成分。

(2)溶剂的配制：将体积比为1～4∶4～1∶4～6，优选为4∶1∶5的乙酸乙酯、正丁醇和水混合，振荡摇匀，使两相达到平衡，静置分层后分离，下相为流动相，上相为固定相，分别对其进行超声脱气30分钟以上后备用。

(3)样品制备：称取罗汉果叶粗提物，充分溶解于等体积的上相和下相溶剂中，过滤，得样品溶液。

(4)分离纯化：将配制好的固定相溶剂充满聚四氟乙烯柱，然后开启高速逆流色谱仪，调整主机转速为800～900rpm、优选850rpm，以1～ 2ml/min、优选1.5ml/min的流速将流动相溶剂泵入聚四氟乙烯柱内，待柱内溶剂体系建立动态平衡后，取样品溶液由进样阀进样，然后根据紫外检测谱图，分别收集各个峰，其中II号峰为山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-[β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖甙]，V号峰为山奈酚-3，7-α-L-二鼠李糖甙。

上述罗汉果叶加水提取时，煮沸提取3次，每次40～60min，优选50min；加其它极性溶剂提取时，则回流提取3次，每次50～100min；然后过滤，合并滤液并旋干至膏状。

步骤(4)中所收集的II号峰的保留时间为170～195min，得率为0.3～0.4％；V号峰的保留时间为260～300min，得率为1.1～1.5％。

以上所述高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法制得的山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-[β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖甙]和山奈酚-3，7-α-L-二鼠李糖甙。

与现有技术相比，本发明采用高速逆流色谱法对罗汉果叶提取物进行分离纯化，成功分离得到纯度较高的山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-[β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖甙]和山奈酚-3，7-α-L-二鼠李糖甙两个黄酮化合物，拓宽了黄酮类产品的原料来源。而且其制备工艺简单，容易操作，纯化效率高，为罗汉果叶中有效成分的提取利用奠定了坚实的基础，可避免大量罗汉果叶资源的浪费和丢弃后对环境造成的污染。

(四)附图说明：

图1为高速逆流色谱分离罗汉果叶黄酮化合物的色谱图。

(五)具体实施方式：

本发明的实施例1：高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的步骤如下：

(1)罗汉果叶提取：称取无腐烂的干罗汉果叶，加水(水须完全浸没罗汉果叶)煮沸提取3次，每次50min，过滤，合并滤液并旋干至膏状，得罗汉果叶粗提物，备用。

(2)溶剂的配制：将体积比为4∶1∶5的乙酸乙酯、正丁醇和水置于分液漏斗中，剧烈振荡摇匀，使两相达到平衡，静置分层后分离，下相为流动相，上相为固定相，分别对其进行超声脱气30分钟，自然冷却后备用。

(3)样品制备：准确称取90mg罗汉果叶粗提物，溶解于等体积的上相和下相溶剂(各5ml)中，过滤，得样品溶液；

(4)分离纯化：将配制好的固定相(上相)溶剂以15ml/min的流速充满聚四氟乙烯柱，然后开启制备型高速逆流色谱仪，调整主机转速为850rpm，以1.5ml/min的流速将流动相(下相)溶剂泵入聚四氟乙烯柱内，待柱内溶剂体系建立动态平衡后，取样品溶液由进样阀进样，然后根据紫外检测谱图，分别收集各个峰，通过HPLC检验纯度，并用核磁共振氢谱及碳谱进行结构分析。其中保留时间为170～195min的II号峰为山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-[β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖甙]，其纯度为55.6％；保留时间为260～300min的V号峰为山奈酚-3，7-α-L-二鼠李糖甙，其纯度为95.3％。

本发明的实施例2：高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的步骤如下：

(1)罗汉果叶提取：称取罗汉果叶，加入60％的乙醇，80℃回流提取3次，每次60min，过滤，合并滤液并浓缩至膏状，得罗汉果叶粗提物，备用。

(2)溶剂的配制：将体积比为3.6∶1.2∶5.2的乙酸乙酯、正丁醇和水混合，振荡摇匀，使两相达到平衡，静置分层后分离，下相为流动相，上相为固定相，分别对其进行超声脱气40分钟，冷却后备用。

(4)分离纯化：将配制好的固定相(上相)溶剂以15ml/min的流速充满聚四氟乙烯柱，然后开启制备型高速逆流色谱仪，调整主机转速为900rpm，以2ml/min的流速将流动相(下相)溶剂泵入聚四氟乙烯柱内，待柱内溶剂体系建立动态平衡后，取样品溶液由进样阀进样，然后根据紫外检测谱图，分别收集各个峰，通过HPLC检验纯度分析，其中II号峰为山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-[β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖甙]，其纯度为52.5％；V号峰为山奈酚-3，7-α-L-二鼠李糖甙，其纯度为90.2％。

实验例：

1.1材料和仪器

材料：罗汉果叶(由桂林亦元生现代生物技术有限公司提供)

仪器：TBE-300型高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司)；TBP-50A型恒压恒流微量泵(上海同田生化技术有限公司)；8823B型紫外检测仪(北京宾达英创科技有限公司、北京市新技术应用研究所)；HX-1050恒温循环器(北京博医康实验仪器有限公司)；SHB-IIIA循环水式多用真空泵(郑州长城科贸有限公司)；AR1140/C型电子分析天平；岛津高效液相色谱仪(岛津国际贸易(上海)有限公司)；UV-1100紫外可见分光光度计；RE-52AA旋转蒸发仪；DZF-150型数显小型真空干燥箱；SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科贸有限公司)。

1.2高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮

1.2.1罗汉果叶黄酮的制备

同上述实施例1。其中所用的制备型高速逆流色谱仪配有恒流泵、15ml进样阀、聚四氟乙烯柱(柱体积300ml)、UV紫外检测器。

1.2.2结果与讨论

采用乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝4∶1∶5(v/v)溶剂体系分离罗汉果叶黄酮，其分离图如图1所示。

由图1可以看出在溶剂体系乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝4∶1∶5(v/v)条件下，连续洗脱350min，可见5个明显的峰，其中II号峰经HPLC测定，其纯度为55.6％，纯化后得化合物1；V号峰在旋干过程中有白色晶体析出，得化合物2，HPLC分析纯度达到95.3％。

1.2.3结构分析

将步骤1.2.2所得化合物1、2经核磁共振氢谱¹H NMR、碳谱¹³C NMR进行结构分析。

化合物1，淡黄色晶体，M.p.219～221℃，IRv_max ^KBrcm^-1：3430(-OH)，1655(缔合C＝O)，1452，1514，1600(苯环)；盐酸+镁粉呈现深红色，浓硫酸+α-萘酚显阳性。紫外光谱

(nm)265，345显示黄酮类化合物的特征吸收峰。

¹H NMR(CH₃OH，500MHz)δ(ppm)：7.80(2H，d，J＝9.0Hz，2’，6’-H)，6.94(2H，d，J＝9.0Hz，3’，5’-H)，6.74(1H，d，J＝2.0Hz，8-H)，6.48(1H，d，J＝2.0Hz，6-H)，5.96(1H，d，J＝2.0Hz，Rha，1-H)，5.39(1H，d，J＝2.0Hz，Rha’1-H)，4.52(1H，d，J＝8.0Hz，Glc1-H)，3.32～4.22(m，糖中含羟基碳上的氢)，1.25(3H，d，J＝5.5Hz，Rha 6-H)，0.92(3H，d，J＝5.0Hz，Rha 6-CH₃)。

¹³CNMR(CH₃OH，500MHz)δ(ppm)：156.8(C-2)，135.1(C-3)，178.4(C-4)，161.6(C-5)，99.3(C-6)，162.1(C-7)，94.3(C-8)，158.5(C-9)，106.2(C-10)，121.1(C-1’)，130.6(C-2’，6’)，115.2(C-3’，5’)，160.4(C-4’)；Glc：105.5，74.1，76.7，69.8，76.6，60.8；7-Rha：97.8，80.1，70.5，71.8，70.7，16.6；3-Rha：102.1，70.0，70.7，70.8，70.5，16.2。

因此，可确定化合物1为山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-[β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖甙]，其结构式如下：

化合物2，淡黄色针状晶体，M.p.187～189℃，IR v_max ^KBrcm^-1：3430(-OH)，1655(缔合C＝O)，1452，1514，1600(苯环)；盐酸+镁粉呈现深红色，浓硫酸+α-萘酚显阳性。紫外光谱

(nm)265，345显示黄酮类化合物的特征吸收峰。

¹H NMR(CH₃OH，500MHz)δ(ppm)：0.96(3H，d，J＝5.1Hz，(3-O-rha)-CH₃)，1.29(3H，d，J＝6.1Hz，(7-O-rha)-CH₃)，6.46(1H，d，J＝1.9Hz，6-H)，6.80(1H，d，J＝1.9Hz，8-H)，6.94(2H，d，J＝8.4Hz，3’，5’-H)，7.79(2H，d，J＝8.5Hz，2’，6’-H)，5.41(1H，d，J＝1.4Hz，(3-O-rha)-1”)，5.60(1H，d，J＝1.5Hz，(7-O-rha)-1”)。

¹³C NMR(CH₃OH，500MHz)δ(ppm)：158.4(C-4)，135.1(C-3)，178.4(C-4)，161.6(C-5)，98.5(C-6)，162.2(C-7)，94.2(C-8)，156.7(C-9)，106.2(C-10)，121.0(C-1’)，130.6(C-2’，6’)，115.2(C-3’，5’)，160.4(C-4’)；3-Rha：102.1，70.7，70.7，72.2，70.0，16.3；7-Rha：99.2，70.3，70.8，71.8，70.5，16.7。

因此，可确定化合物2为山奈酚-3，7-α-L-二鼠李糖甙，其结构式如下：

Claims

1.高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法，其特征在于：将罗汉果叶加水或其它极性溶剂回流提取，所得到的提取物采用体积比为1～4∶4～1∶4～6的乙酸乙酯、正丁醇和水的混合液作为溶剂体系、经制备型高速逆流色谱仪进行分离纯化，即得山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-[β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖甙]和山奈酚-3，7-α-L-二鼠李糖甙。

2.根据权利要求1所述高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)罗汉果叶提取：取罗汉果叶，加水或其它极性溶剂回流提取，过滤，浓缩，得罗汉果叶粗提物，备用；

(2)溶剂的配制：将体积比为1～4∶4～1∶4～6的乙酸乙酯、正丁醇和水混合，振荡摇匀，静置分层后分离，下相为流动相溶剂，上相为固定相溶剂，分别对其进行超声脱气后备用；

(3)样品制备：称取罗汉果叶粗提物，充分溶解于等体积的上相和下相溶剂中，过滤，得样品溶液；

(4)分离纯化：将配制好的固定相溶剂充满聚四氟乙烯柱，然后开启高速逆流色谱仪，调整主机转速为800～900rpm，以1～2ml/min的流速将流动相溶剂泵入聚四氟乙烯柱内，待柱内溶剂体系建立动态平衡后，取样品溶液由进样阀进样，然后根据紫外检测谱图，分别收集各个峰，其中II号峰为山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-[β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖甙]，V号峰为山奈酚-3，7-α-L-二鼠李糖甙；所述II号峰的保留时间为170～195min，V号峰的保留时间为260～300min。

3.根据权利要求1或2所述高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法，其特征在于：所述其它极性溶剂为乙醇或甲醇。

4.根据权利要求1或2所述高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法，其特征在于：罗汉果叶加水提取时，煮沸提取3次，每次40～60min；加其它极性溶剂提取时，回流提取3次，每次50～100min。

5.根据权利要求1或2所述高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法，其特征在于：乙酸乙酯、正丁醇和水的体积比为4∶1∶5。

6.根据权利要求2所述高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法，其特征在于：步骤(2)中溶剂超声脱气的时间≥30分钟。

7.根据权利要求2所述高速逆流色谱分离纯化罗汉果叶黄酮化合物的方法，其特征在于：步骤(4)中的主机转速为850rpm。