CN110123636B - 一种利用高速逆流色谱精制注射液的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用高速逆流色谱精制注射液的方法，属于药品技术领域。其包括如下步骤：分离的两相溶剂体系由乙酸乙酯、正丁醇、水和乙酸混匀后，静置分层得到；将上相作为固定相，下相作为流动相；将固定相注入高速逆流色谱柱内，待固定相充满后，再将流动相注入；待整个体系建立动态平衡后，将健骨注射液进样；当紫外检测器的吸收信号达到1500mV‑2500mV时，收集色素杂质，当吸收信号降为200mV‑300mV时，将高速逆流色谱柱中剩余的健骨注射液全部推出，收集，浓缩，得到健骨注射液精制液。本发明的方法，色素去除率为58.65％‑59.38％，有效成分回收率达到99.02％‑99.85％，产品更加安全有效。

Description

一种利用高速逆流色谱精制注射液的方法
技术领域
本发明涉及一种利用高速逆流色谱精制注射液的方法，属于药品技术领域。
背景技术
中药注射剂是我国一种创新型的药物，不仅保留了中医药的传统优势，还具备了西药作用迅速、生物利用率高的特点，在临床应用十分广泛。壮药健骨注射液是上世纪70年代以战骨(Premna fulva Craib)为原料精制而成的单方注射剂，收载于卫生部药品标准，主治脊椎骨质增生症，对风湿性关节痛亦有疗效。健骨注射液在临床疗效上取得了一定的疗效，但由于注射液用于肌肉注射，人们存在个体差异，容易导致过敏，局部疼痛等不良反应。为全面提高中药注射剂的安全性、有效性和质量可控性，国家食品药品监督管理局相继颁布了《中药注射剂安全性再评价工作方案》、《中药注射剂安全性再评价技术评价指导原则》、《中药注射剂安全性再评价技术要求》等文件。因此，对健骨注射液进行疗效和安全性再评价研究是非常必要和紧迫的。
中国发明专利申请号为94101711.7的《健骨注射液》和中国发明专利申请号为201310697328.9的《一种健骨注射液生产工艺的改进方法》，均公开了健骨注射液的生产方法。第二个专利是在第一个专利的基础上的改进。第二个专利公开了如下内容：以战骨茎粉碎，超声提取，上D101大孔树脂柱，水洗脱色后用40％的乙醇洗脱，回收得到健骨浓缩液，加入注射用水和活性炭，静置过滤得健骨，加注射用水，调酸灌封得到健骨注射液成品。较之第一个专利，第二个专利对原料进行粉碎，运用超声提取确实加强了对有效成分的提取，但同时也增加了其它杂质的提取率，在后续的工艺中，采用大孔树脂脱色提取，最后运用活性炭再次脱色除杂。
健骨注射液自上市以来，在临床上取得了一定的疗效。但是，由于注射液直接用于肌肉注射，在临床案例中还是存在一定比例的过敏、局部疼痛等不良反应，损害人体健康。虽然上述第二个专利对健骨注射液进行了工艺的改正，但是成品仍然存在较深的颜色，可能此产品还是存在较多色素或其它不明杂质。因此，利用现代科学技术方法对健骨注射液进行二次精制开发研究，除去对人体不利的杂质，提高有效成分的含量，使其发挥更好的临床效果是很有必要的。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种利用高速逆流色谱精制注射液的方法。本发明采用高速逆流色谱，对现有技术的健骨注射液进行精制，得到健骨注射液精制液。该健骨注射液精制液的色素去除率为58.65％-59.38％，有效成分回收率达到99.02％-99.85％，产品更加安全有效。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种利用高速逆流色谱精制注射液的方法，包括如下步骤：
分离的两相溶剂体系由乙酸乙酯、正丁醇、水和乙酸按体积比为(0.5-4):(6-9.5):10:(0-0.5)混匀后，静置分层得到；
将两相溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相；
先将固定相注入高速逆流色谱柱内，待固定相充满高速逆流色谱柱后，调节转速为750r/min-950r/min，再将流动相注入高速逆流色谱柱；
待整个体系建立动态平衡后，将健骨注射液由进样阀进样，进样流速为0.5mL/min-3mL/min，进样体积为1.0mL-20.0mL；
当紫外检测器的吸收信号达到1500mV-2500mV时，标志为色素杂质流出，收集色素杂质，当吸收信号降为200mV-300mV时，停止收集，得到色素杂质；而后采用流速为5.0mL/min-20.0mL/min，将高速逆流色谱柱中剩余的健骨注射液全部推出，收集，浓缩，得到健骨注射液精制液。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用高速逆流色谱，对现有技术的健骨注射液进行精制，得到健骨注射液精制液。该健骨注射液精制液的色素去除率为58.65％-59.38％，有效成分回收率达到99.02％-99.85％，产品更加安全有效。
(2)本发明的方法简单，操作容易，市场前景广阔，适合规模化生产。
本发明的原理：
本发明中，健骨注射液来自市售购买，购自广西南宁百会药业集团有限公司，药品的通用名称为健骨注射液，成份为战骨(茎)经加工制成的注射液，批准文号为国药准字Z45021593。
本发明所采用的高速逆流色谱具有如下优点：(1)无不可逆吸附。固定相为无需载体液-液色谱系统，故而消除了气-液和固-液色谱中因使用载体而带来的吸附现象；(2)高回收率。由于流动相和固定相均为液体，样品可全部回收；(3)操作简便。因固定相为液体，体系更换与平衡方便、快捷。虽然高速逆流色谱有如上的独特优势特点，但是，目前仅有部分文献支持一些天然产物分离制备研究，更未见提出利用高速逆流色谱进行色素除杂技术工艺的研究，原因如下：高速逆流色谱良好的分离效果主要来自溶剂体系的选择。目前在溶剂体系的选择上还没有非常系统、成熟的理论来指导，虽然已有学者建立了几种经验性的溶剂系统筛选方法，但这些方法均为经验性的规律总结。如何选择一种具有良好分离效果的溶剂体系还依赖于操作者的经验。本申请的发明人克服了溶剂体系选择复杂的困难，经过长期大量的试验，摸索出针对健骨注射液精制的高速逆流的相关参数。
本发明采用高速逆流色谱，对现有技术的健骨注射液进行“敲除”色素杂质和“捕获”健骨注射液精制液。与现有技术采用固相柱色谱法相比，本发明得到更为安全有效的精制液。与健骨注射液相比，健骨注射液精制液的色素去除率为50％-60％，有效成分回收率达到98％-99％。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述乙酸乙酯、正丁醇、水和乙酸的体积比为0.5:9.5:10:0.1。
采用上述进一步的有益效果是：以上为最佳参数。采用上述参数，分离的效果最佳。
进一步，所述乙酸乙酯、正丁醇、水和乙酸的体积比为1:9:10:0。
采用上述进一步的有益效果是：以上为最佳参数。采用上述参数，分离的效果最佳。
进一步，所述乙酸乙酯、正丁醇、水和乙酸的体积比为4:6:10:0.5。
采用上述进一步的有益效果是：以上为最佳参数。采用上述参数，分离的效果最佳。
进一步，所述固定相注入高速逆流色谱柱的流速为10mL/min-40mL/min，所述流动相注入高速逆流色谱柱的流速为1.0mL/min-5.0mL/min。
进一步，所述动态平衡时的固定相保留率Sf≥73％。
采用上述进一步的有益效果是：一般而言，固定相保留率Sf在40％以上才能实现样品较好的分离。固定相保留率是衡量一台高速逆流色谱仪综合性能的重要指标，直接决定样品纯化过程中的分离度。本发明选用固定相保留率Sf≥73％，色素杂质能更好地富集收集，达到分离效果。
更进一步，所述固定相保留率Sf的计算公式为：
Sf＝(Vc-VS)/Vc×100％,式中，Sf代表固定相保留率，VS代表流动相推出的固定相体积(mL)，Vc代表柱体积(mL)。
进一步，所述高速逆流色谱仪的温度为20℃-30℃。
进一步，所述紫外检测器的检测波长为200nm-350nm。
进一步，所述转速为900r/min。
采用上述进一步的有益效果是：以上为最佳转速。采用上述参数，分离的效果最佳。
附图说明
图1为本发明的实验例1中，色素杂质去除的实验结果图。从左到右，分别为本发明的健骨注射液精制液、色素杂质和现有技术的健骨注射液。
图2为本发明的实施例2利用高速逆流色谱精制注射液的初步分离效果图。图中，1为色素杂质峰；2、3、4和5为健骨注射液的有效成分在高速逆流色谱中的分离效果峰。
图3为实施例2购买的市售健骨注射液的HPLC色谱图。图中，1为芹菜素6，8-二-碳-β-D-葡萄糖苷(维采宁2)，2为芹菜素-6-碳-β-D-木糖-8-碳-β-D-葡萄糖苷(维采宁1)，3为芹菜素-6-碳-β-D-木糖-8-碳-β-D-半乳糖苷，4为芹菜素-6-碳-β-D-葡萄糖苷-8-碳-β-D-木糖苷(维采宁3)，5为芹菜素6-碳-β-D-半乳糖-8-碳-β-D-木糖苷，6、7和8未知。
图4为本发明的实验例2中，高速逆流色谱分离图2中的分离效果峰1的HPLC图。图中，1为色素杂质。
图5为本发明的实验例2中，高速逆流色谱分离图2中的分离效果峰2的HPLC图。图中，1为芹菜素6，8-二-碳-β-D-葡萄糖苷(维采宁2)。
图6为本发明的实验例2中，高速逆流色谱分离图2中的分离效果峰3的HPLC图。图中，2为芹菜素-6-碳-β-D-木糖-8-碳-β-D-葡萄糖苷(维采宁1)，3为芹菜素-6-碳-β-D-木糖-8-碳-β-D-半乳糖苷，4为芹菜素-6-碳-β-D-葡萄糖苷-8-碳-β-D-木糖苷(维采宁3)，5为芹菜素6-碳-β-D-半乳糖-8-碳-β-D-木糖苷。
图7为本发明的实验例2中，高速逆流色谱分离图2中的分离效果峰4的HPLC图。图中，6、7和8未知。
图8为本发明的实验例2中，高速逆流色谱分离图2中的分离效果峰5的HPLC图。图中，8未知。
图9为实施例2制备得到的的健骨注射液精制液的HPLC色谱图。图中，1为芹菜素6，8-二-碳-β-D-葡萄糖苷(维采宁2)，2为芹菜素-6-碳-β-D-木糖-8-碳-β-D-葡萄糖苷(维采宁1)，3为芹菜素-6-碳-β-D-木糖-8-碳-β-D-半乳糖苷，4为芹菜素-6-碳-β-D-葡萄糖苷-8-碳-β-D-木糖苷(维采宁3)，5为芹菜素6-碳-β-D-半乳糖-8-碳-β-D-木糖苷，6、7和8未知。
图10为本发明的实验例3中，NO活性测试的结果图。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本实施例的利用高速逆流色谱精制注射液的方法，包括如下步骤：
分离的两相溶剂体系由乙酸乙酯、正丁醇、水和乙酸按体积比为0.5:9.5:10:0.1混匀后，静置分层得到。
将两相溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相。
先将固定相以流速为10mL/min注入温度为20℃的高速逆流色谱柱内，待固定相充满高速逆流色谱柱(320mL)后，调节转速为750r/min，再将流动相以流速为1.0mL/min注入高速逆流色谱柱。
待整个体系建立动态平衡后，此时固定相流出84mL,固定相保留率Sf的计算公式为：
Sf＝(Vc-VS)/Vc×100％＝(320mL-84mL)/320mL×100％＝73.75％。
将136.94mg市售购买的广西南宁百会药业集团有限公司生产的健骨注射液由进样阀进样，进样流速为0.5mL/min，进样体积为1.0mL。
当检测波长为200nm-350nm的紫外检测器的吸收信号达到1500mV时，标志为色素杂质流出，收集色素杂质，当吸收信号降为200mV时，停止收集，得到81.31mg色素杂质；而后采用流速为5.0mL/min将高速逆流色谱柱中剩余的健骨注射液全部推出，收集，浓缩，得到55.42mg健骨注射液精制液。
本实施例的色素去除率和回收率分别计算如下：
色素去除率＝81.31mg/136.94mg×100％＝59.38％。
回收率率＝(81.31mg+55.42mg)/136.94mg×100％＝99.85％。
实施例2
本实施例的利用高速逆流色谱精制注射液的方法，包括如下步骤：
分离的两相溶剂体系由乙酸乙酯、正丁醇、水和乙酸按体积比为1:9:10:0混匀后，静置分层得到。
将两相溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相。
先将固定相以流速为25mL/min注入温度为25℃的高速逆流色谱柱内，待固定相充满高速逆流色谱柱(320mL)后，调节转速为900r/min，再将流动相以流速为3.0mL/min注入高速逆流色谱柱。
待整个体系建立动态平衡后，此时固定相流出81.3mL,固定相保留率Sf的计算公式为：
Sf＝(Vc-VS)/Vc×100％＝(320mL-81.3mL)/320mL×100％＝74.59％。
将135.77mg市售购买的广西南宁百会药业集团有限公司生产的健骨注射液由进样阀进样，进样流速为1.5mL/min，进样体积为10.0mL。
当检测波长为200nm-350nm的紫外检测器的吸收信号达到2000mV时，标志为色素杂质流出，收集色素杂质，当吸收信号降为250mV时，停止收集，得到80.15mg色素杂质；而后采用流速为12.0mL/min将高速逆流色谱柱中剩余的健骨注射液全部推出，收集，浓缩，得到54.29mg健骨注射液精制液。
本实施例的色素去除率和回收率分别计算如下：
色素去除率＝80.15mg/135.77mg×100％＝59.03％。
回收率率＝(80.15mg+54.29mg)/135.77mg×100％＝99.02％。
实施例3
本实施例的利用高速逆流色谱精制注射液的方法，包括如下步骤：
分离的两相溶剂体系由乙酸乙酯、正丁醇、水和乙酸按体积比为4:6:10:0.5混匀后，静置分层得到。
将两相溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相。
先将固定相以流速为40mL/min注入温度为30℃的高速逆流色谱柱内，待固定相充满高速逆流色谱柱(320mL)后，调节转速为950r/min，再将流动相以流速为5.0mL/min注入高速逆流色谱柱。
待整个体系建立动态平衡后，此时固定相流出82.5mL,固定相保留率Sf的计算公式为：
Sf＝(Vc-VS)/Vc×100％＝(320mL-82.5mL)/320mL×100％＝74.22％。
将135.51mg市售购买的广西南宁百会药业集团有限公司生产的健骨注射液由进样阀进样，进样流速为3mL/min，进样体积为20.0mL。
当检测波长为200nm-350nm的紫外检测器的吸收信号达到2500mV时，标志为色素杂质流出，收集色素杂质，当吸收信号降为300mV时，停止收集，得到79.48mg色素杂质；而后采用流速为20.0mL/min将高速逆流色谱柱中剩余的健骨注射液全部推出，收集，浓缩，得到55.12mg健骨注射液精制液。
本实施例的色素去除率和回收率分别计算如下：
色素去除率＝79.48mg/135.51mg×100％＝58.65％。
回收率率＝(79.48mg+55.12mg)/135.51mg×100％＝99.33％。
实验例1：色素杂质的去除实验
采用紫外分光光度法测定同等浓度的实施例2制备得到的健骨注射液精制液、色素杂质和实施例2购买的市售健骨注射液(现有注射液稀释5倍)，在425nm波长下吸光度读数分别为1.521±0.003、1.670±0.007、2.906±0.005。
同时，也采用直接目视法对比(见图1)。实施例2制备得到的健骨注射液精制液的颜色为透亮的浅黄色，色素杂质为浅黄棕色，实施例2购买的市售健骨注射液为深黄棕色或棕红色液体。
实验例2：HPLC对高速逆流色谱分离效果各部位、健骨注射液精制液和健骨注射液的成分分析
实施例2利用高速逆流色谱精制注射液的初步分离效果图，见图2。
首先，采用HPLC方法对实施例2购买的市售健骨注射液进行成分分析，见图3。
其次，对图2中的分离效果峰1进行HPLC分析，结果见图4。对图2中的分离效果峰2进行HPLC分析，结果见图5。对图2中的分离效果峰3进行HPLC分析，结果见图6。对图2中的分离效果峰4进行HPLC分析，结果见图7。对图2中的分离效果峰4进行HPLC分析，结果见图8。
最后，对实施例2制备得到的健骨注射液精制液进行成分分析，结果见图9。
上述HPLC分离条件为：Agilent Zorbax SB-C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为0.1％甲酸水溶液(A)和甲醇(B)；梯度洗脱程序为：0-15min，5-20％A；15-50min，20-40％A；50-60min，40-5％A；60-65min，5％A；自动进样器进样量为20μL；检测波长：190-400nm；流速为1.0mL/min，柱温为35℃。
结果表明，本发明的健骨注射液精制液的主要物质基础与现有市售健骨注射液基本一致，故健骨注射液精制液在去除色素杂质的同时很好地保留了健骨注射液的有效成分。
实验例3：药理实验
(1)抗炎实验--二甲苯耳肿胀实验
选取45只小鼠，按随机数字表分成3组：分别为实施例2制备得到的健骨注射液精制液组、实施例2购买的市售健骨注射液组、空白对照组(生理盐水)。各组分别肌肉注射给药连续7天，每天1次，末次给药1h后，7组小鼠于每只小鼠右耳两面涂抹二甲苯0.1mL致肿，左耳不涂为正常耳。后脱颈椎处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳，于同一部位用打孔器冲下耳片，直径8mm，于分析天平上称重。以两耳片质量差为耳肿胀度，计算小鼠耳肿胀度及耳肿胀抑制率，计算公式如下：
耳肿胀度(mg)＝右耳廓重(mg)－左耳廓重(mg)。
耳肿胀抑制率(％)＝(空白对照组平均耳肿胀度－给药组平均耳肿胀度)/空白对照组平均耳肿胀度×100％。
结果如表1所示。
表1二甲苯耳肿胀实验结果
组别 耳肿胀度(mg) 耳肿胀抑制率(％)
空白对照组(生理盐水) 18.85±0.86
健骨注射液组 16.22±0.98* 13.95％
健骨注射液精制液组 15.87±1.03* 15.81％
备注：健骨注射液精制液组的样品浓度换算为健骨注射液组的浓度相等。
*为给药组与空白对照组相比，P<0.05.
(2)NO活性测试
取对数生长期细胞消化成单细胞悬液接种于96孔细胞培养板(每孔1×105个细胞)，37℃、5％CO2预培养12h，更换DMEM培养液，分为模型组(RAW264.7与LPS共培养)、药物组(不同浓度的药物、LPS和细胞共培养)。每组加细胞100μL，药物50μL，LPS(终浓度1μg/mL)50μL共培养24h后，以Griess法测定细胞培养液中NO含量。取不同处理组的培养上清液100μL加入等体积的Griess试剂混合，室温静置10min，于540nm测定其吸收度。根据回归方程求出相应的浓度。每次实验设3个平行，重复实验3次。实验结果如图10。
综上，本发明采用无损、无污染、高效的高速逆流色谱，对现有技术的健骨注射液进行精制，得到健骨注射液精制液。该健骨注射液精制液的色素去除率为58.65％-59.38％，有效成分回收率达到99.02％-99.85％，产品更加安全有效。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种利用高速逆流色谱精制注射液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
分离的两相溶剂体系由乙酸乙酯、正丁醇、水和乙酸按体积比为0.5:9.5:10:0.1混匀后，静置分层得到；
将两相溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相；
先将固定相注入高速逆流色谱柱内，待固定相充满高速逆流色谱柱后，调节转速为750r/min-950r/min，再将流动相注入高速逆流色谱柱；其中，所述固定相注入高速逆流色谱柱的流速为10mL/min-40mL/min，所述流动相注入高速逆流色谱柱的流速为1.0mL/min-5.0mL/min；
待整个体系建立动态平衡后，将健骨注射液由进样阀进样，进样流速为0.5mL/min-3mL/min，进样体积为1.0mL-20.0mL；所述动态平衡时的固定相保留率Sf≥73%；
当紫外检测器的吸收信号达到1500mV-2500mV时，标志为色素杂质流出，收集色素杂质，当吸收信号降为200mV-300mV时，停止收集，得到色素杂质；而后采用流速为5.0mL/min-20.0mL/min，将高速逆流色谱柱中剩余的健骨注射液全部推出，收集，浓缩，得到健骨注射液精制液，其中，所述紫外检测器的检测波长为200nm-350nm。
2.根据权利要求1所述的利用高速逆流色谱精制注射液的方法，其特征在于，所述固定相保留率Sf的计算公式为：
Sf=（Vc-VS）/Vc×100%，式中，Sf代表固定相保留率，VS代表流动相推出的固定相体积，单位为mL，Vc代表柱体积，单位为mL。
3.根据权利要求1-2任一项所述的利用高速逆流色谱精制注射液的方法，其特征在于，所述高速逆流色谱柱的温度为20℃-30℃。
4.根据权利要求1-2任一项所述的利用高速逆流色谱精制注射液的方法，其特征在于，所述转速为900r/min。
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