CN101709059A - 五味子单体成分的分离制备方法 - Google Patents
五味子单体成分的分离制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种五味子单体成分的分离制备方法；将五味子乙醇提取物用石油醚萃取，将石油醚萃取物采用硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯洗脱，HPLC监测，收集洗脱流分粗提物A，粗提物B；洗脱剂石油醚-乙酸乙酯体积比为3～5∶1；粗提物A和粗提物B分别应用高速逆流色谱进行分离，得到五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯乙单体，纯度均高于98％。
Description
技术领域：
本发明涉及逆流色谱制备分离方法，具体地说是关于应用高速逆流色谱法从五味子70～95％乙醇粗提物中分离制备五味子木脂素类单体成分的方法。
背景技术：
北五味子为木兰科植物五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.)的干燥成熟果实，本草中将其列为上品，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效。现代药理研究表明五味子有增加中枢神经兴奋，增强人体精神、体力和心血管系统张力及心脏收缩力，降低病毒性肝炎患者血清谷丙氨酶等活性。主要化学成分为木脂素、三萜、倍半萜有机酸、挥发油和多糖等。联苯环辛烯类木脂素是五味子中主要活性成分，具有保肝护肝的作用，是评价五味子药材及其产品质量的主要指标。五味子木脂素类单体成分的制备对于北五味子系列药物的开发、质量控制具有重要的意义。
目前，联苯环辛烯类木脂素类化合物的分离多采用柱层析法，但操作起来十分繁琐，且分离效率不高，很难得到高纯度的样品。高速逆流色谱(HSCCC)是一种液液分配分离技术，它的分离原理是利用单向流体动力学平衡原理，使两个互不相溶的溶剂相在高速旋转的螺旋管中单向分布，其中一相作固定相，由恒流泵输送载有样品的流动相穿过固定相，利用样品在两相中分配系数(K)的不同实现分离。它完全排除了支撑体对样品的不可逆吸附、玷染、变性、失活等影响。另外，它的上样量较大，最多可达几克，是高效液相色谱的104～105倍；与常压和低压色谱相比，上样量虽少，但分离能力要好得多，有的样品经过一次分离就能得到一个甚至多个单体，且分离时间较短，一般几个小时即可完成一次分离。它与一般色谱的分离方式不同，特别适用于制备级的分离，已成为中药与天然产物的分离纯化过程中迄今为止最有效的方法之一。
发明内容：
本发明针对现有技术的不足提出了一种从五味子提取物中快速分离纯化木脂素类单体成分的方法，该方法工艺简便，效率高，制备量大，产品纯度大于98％。
本方案是通过如下技术措施来实现的：
(1)将五味子药材粉碎用质量浓度70～95％乙醇回流提取3次，每次1.5小时，减压浓缩，得提取物浓缩液；
(2)用石油醚萃取提取物浓缩液，将石油醚萃取物采用硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯洗脱，HPLC监测，共收集洗脱流分40瓶，每瓶1000毫升，前9瓶合并为粗提物A，后31瓶合并为粗提物B；洗脱剂石油醚-乙酸乙酯体积比为3～5∶1。
(3)将两部分样品粗提物A和粗提物B分别应用高速逆流色谱进行分离，将由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水组成的溶剂系统配置于分液漏斗中充分振摇后静置12小时，分层，上相作为固定相，下相作为流动相；
分离粗提物A所用溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为(10-20∶1∶10-20∶1.2)；
分离粗提物B所用溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为(1-2∶1.6∶1-2∶1.6)；
首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满半制备型逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使半制备型逆流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800r/min时，称取一定量样品放入固定相溶解，用注射器注入逆流色谱仪进样阀的储液管中，旋转进样阀为接柱状态，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相；
根据检测器紫外光谱图，对分离的每个色谱峰的对应物都进行收集，高效液相色谱检测，合并相同成分，得到纯度大于98％的五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯乙7种单体。
利用高效液相色谱(HPLC)分析提取物及HSCCC分离物。HPLC条件：Waters C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，检测波长：220nm，柱温：25℃，流动相：甲醇/水＝3/1(V/V)；流动相流速：1.0mL/min，进样量：10uL。
化合物的鉴定：应用Agilent 5973质谱仪和Varian 600MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，1H-NMR和13C-NMR谱的测定。
本方案的有益效果可根据对上述方案的叙述得知，由于采用高速逆流色谱分离制备五味子木脂素类单体成分，具有制备量大、分离时间短、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂、产品纯度高等特点。因此本发明与现有技术相比，实现了技术创新和提升目的。
附图说明
图1实施例1中五味子提取物A的高速逆流色谱分离色谱图；
图2实施例1五味子提取物B的高速逆流色谱分离的色谱图；
图3实施例2中五味子提取物A的高速逆流色谱分离色谱图；
图4实施例2五味子提取物B的高速逆流色谱分离的色谱图；
具体实施方式：
实施例1：
将五味子药材1.3Kg粉碎，80％乙醇回流提取，提取物减压浓缩，得浓缩液。浓缩液用石油醚萃取，得萃取物89g。石油醚萃取物采用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯＝3∶1(V/V)等度洗脱，HPLC监测，合并相同部分，回收溶剂，得到9.2g粗提物A和74.6g粗提物B。
将粗提物A应用高速逆流色谱进行分离，选择溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，首先以18∶1∶20∶1.2的体积比将上述溶剂体系配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，平衡12小时后将上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相。
采用北京新技术应用研究所生产的GS10A2型半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(多层缠绕聚四氟乙烯的柱，容量为230mL)等组成。首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵一定流速灌满色谱分离柱，开启速度控制器，使高速逆流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800r/min时，取200mg五味子提取物A溶解于10ml固定相中，用注射器注入逆流色谱仪进样阀的储液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。设置流动相流速为2mL/min，开始泵流动相，然后根据检测器紫外光谱图(见图1)接收目标成分，得五味子酚(峰a)10.6mg，五味子甲素(峰b)30.8mg，五味子乙素(峰c)42.6mg，五味子丙素(峰d)22.5mg。
将粗提物B应用高速逆流色谱进行分离，选择溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水＝(1∶0.8∶0.9∶0.8，V∶V)，取上相为固定相，下相为流动相。取200mg五味子提取物B采用北京新技术应用研究所生产的GS10A2型半制备型高速逆流色谱仪进行分离，根据检测器紫外光谱图(见图2)接收目标成分，得五味子醇甲(峰e)47.0mg，五味子醇乙(峰f)15.8mg，五味子酯乙(峰g)16.7mg。
利用HPLC分析分离物。HPLC条件：Waters C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：25℃，流动相：甲醇/0.5％醋酸水溶液＝3/1(V/V)；流速：1.0mL/min，进样量：10uL，检测波长：220nm。经HPLC检测，五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙的纯度分别为98.1％、98.2％、98.0％、98.2％、98.3％、98.5％、98.1％。
图1实施例1中五味子提取物A的高速逆流色谱分离色谱图；溶剂系统：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(18∶1∶20∶1.2)，上样量200mg；a：五味子酚，b：五味子甲素，c：五味子乙素，d：五味子丙素。
图2实施例1五味子提取物B的高速逆流色谱分离的色谱图；溶剂系统：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶0.8∶0.9∶0.8)，上样量200mg；e：五味子醇甲，f：五味子醇乙，j：五味子酯乙。
实施例2：
将五味子药材1.3Kg粉碎，95％乙醇回流提取，提取物减压浓缩，得浓缩液。浓缩液用石油醚萃取，得萃取物96g。石油醚萃取物采用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯＝5∶1(V/V)等度洗脱，HPLC监测，合并相同部分，回收溶剂，得到8.0g粗提物A和85.1g粗提物B。
将粗提物A应用高速逆流色谱进行分离，选择溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，首先以20∶1∶20∶1的体积比将上述溶剂体系配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，平衡12小时后将上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相。
采用北京新技术应用研究所生产的GS10A2型半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(多层缠绕聚四氟乙烯的柱，容量为230mL)等组成。首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵一定流速灌满色谱分离柱，开启速度控制器，使高速逆流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800r/min时，取200mg五味子提取物A溶解于10ml固定相中，用注射器注入逆流色谱仪进样阀的储液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。设置流动相流速为2mL/min，开始泵流动相，然后根据检测器紫外光谱图(见图3)接收目标成分，得五味子酚(峰1)11.8mg，五味子甲素(峰2)28.5mg，五味子乙素(峰3)36.7mg，五味子丙素(峰4)18.0mg。经HPLC检测，纯度分别为98.2％、98.5％、98.1％和98.2％。HPLC检测条件同实施例1。
将粗提物B应用高速逆流色谱进行分离，选择溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水＝(0.9∶0.8∶1∶0.8，V∶V)，取上相为固定相，下相为流动相。取200mg五味子提取物B采用北京新技术应用研究所生产的GS10A2型半制备型高速逆流色谱仪进行分离，根据检测器紫外光谱图(见图4)接收目标成分，得五味子醇甲(峰5)40.1mg，五味子醇乙(峰6)19.8mg，五味子酯乙(峰7)15.8mg。经HPLC检测，纯度分别为98.0％、98.2％、98.1％。
图3实施例2中五味子提取物A的高速逆流色谱分离色谱图；溶剂系统：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(20∶1∶20∶1)，上样量200mg；1：五味子酚，2：五味子甲素，3：五味子乙素，4：五味子丙素。
图4实施例2五味子提取物B的高速逆流色谱分离的色谱图；溶剂系统：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(0.9∶0.8∶1∶0.8)，上样量200mg；5：五味子醇甲，6：五味子醇乙，7：五味子酯乙。
虽然本发明已经通过选用的实施例及其附图进行描述并完全公开，但是对本领域技术人员来说，在不超出本发明实质的情况下，任何改变和变化都属于本发明的范围。
Claims (1)
1.一种五味子单体成分的分离制备方法，其特征是：
(1)将五味子药材粉碎用质量浓度70～95％乙醇回流提取3次，每次1.5小时，减压浓缩，得提取物浓缩液；
(2)用石油醚萃取提取物浓缩液，将石油醚萃取物采用硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯洗脱，HPLC监测，共收集洗脱流分40瓶，每瓶1000毫升，前9瓶合并为粗提物A，后31瓶合并为粗提物B；洗脱剂石油醚-乙酸乙酯体积比为3～5∶1。
(3)将两部分样品粗提物A和粗提物B分别应用高速逆流色谱进行分离，将由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水组成的溶剂系统配置于分液漏斗中充分振摇后静置12小时，分层，上相作为固定相，下相作为流动相；
分离粗提物A所用溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为(10-20∶1∶10-20∶1.2)；
分离粗提物B所用溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为(1-2∶1.6∶1-2∶1.6)；
首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满半制备型逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使半制备型逆流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800r/min时，称取一定量样品放入固定相溶解，用注射器注入逆流色谱仪进样阀的储液管中，旋转进样阀为接柱状态，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相；
根据检测器紫外光谱图，对分离的每个色谱峰的对应物都进行收集，高效液相色谱检测，合并相同成分，得到纯度大于98％的五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯乙单体。
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