CN103467438A

CN103467438A - 五味子中木脂素单体的提取分离制备方法

Info

Publication number: CN103467438A
Application number: CN2013104318540A
Authority: CN
Inventors: 楚楚; 颜继忠; 章诗迪; 童胜强; 李行诺
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-09-18
Also published as: CN103467438B

Abstract

本发明公开了一种五味子中木脂素单体的提取分离制备方法：五味子药材粉末经CO₂超临界提取，得粗提物进行第一次高速逆流色谱分离，以体积比2-10:0-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成溶剂体系A，上相A为固定相A，下相A为流动相A，制得五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯乙；将分离后的固定相A回收，作为待测样品进行第二次高速逆流色谱分离，以体积比1-10:0-4:0-9:1的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成溶剂体系B，上相B为固定相B，下相B为流动相B，制得五味子甲素和五味子乙素。本发明采用超临界流体提取结合高速逆流色谱分离的方法，提取后无需复杂的样品处理即可直接用于后续单体的分离纯化，提取分离步骤简单高效。

Description

五味子中木脂素单体的提取分离制备方法

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，涉及一种快速高效的联合制备方法从五味子中提取、分离纯化木脂素单体成分。具体涉及用超临界提取法结合高速逆流色谱法提取分离制备五味子中的单体成分。

背景技术

五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill或华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的成熟果实。前者习称“北五味子”，后者习称“南五味子”。始载于《神农本草经》，列为上品。五味子性温，味甘、酸，归肺、心、肾经。具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心的功效。可用于治疗久咳虚喘、自汗盗汗、久泻不止、津伤口渴、心悸、失眠多梦等。现代药理学研究表明五味子具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保肝、神经保护等多种药理作用。

五味子中含有木脂素、挥发油、有机酸、多糖、三萜及倍半萜等多种化学成分，其中木脂素为主要有效成分。木脂素类成分中含量较高的包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素等。随着研究的深入，以上几种主要的木脂素类成分均被证实具有良好的药理活性，如五味子醇甲具有抗氧化、抗衰老、保肝等药理作用，五味子甲素具有保肝等药理活性，五味子乙素具有护肝、抗癌、抗病毒、抗溃疡、抗氧化、神经保护等作用，因此，开发一种快速、高效、低成本的制备方法对该类成分的进一步研究开发来说至关重要。

通过长期研究，对五味子中总木脂素类成分的提取工艺已较为成熟，但对木脂素单体类成分的制备大多集中在五味子醇甲、五味子醇乙的分离纯化上，而对五味子甲素、五味子乙素、五味子酯乙等单体的分离纯化报道较少。文献中有以溶剂提取法、超声提取法、微波提取法、超临界流体萃取法、酶解法辅助超声波提取法、超高压提取法等方法对五味子中木脂素类成分进行提取，以硅胶柱色谱法、大孔树脂柱色谱法、高速逆流色谱法对木脂素单体进行分离的。大多提取分离的流程是以回流法提取，采用一定的方法对木脂素进行富集除杂，进而再以柱色谱对其进行分离纯化。如申请号为201210144871.1的发明专利公开了“一种纯化五味子醇甲的新方法”。采用微波逆流提取、大孔树脂分离纯化和柱层析进一步纯化，最终得到了五味子醇甲单体（含量98％以上）。如申请号为200910010631.0的发明专利中公开了“一种制备五味子醇甲和五味子醇乙的新工艺”，提取工艺为将含有五味子醇甲和五味子醇乙的提取液用有机溶剂萃取，萃取物经过反复柱层析分离后，收集含有五味子醇甲和五味子醇乙的流份，得到纯度均大于98%五味子醇甲和五味子醇乙。再如申请号为201010510828.3的发明专利中公开了“一种从五味子中提取五味子甲素的工艺”，使用超声辅助石油醚提取和碱醇反萃取的方法制备木脂素总提物，再两次通过硅胶氧化铝混合柱层析，洗脱，回收溶剂，石油醚-丙酮或环己烷-乙醇重结晶，干燥，最终获得五味子甲素单体。

不难看出，五味子中木脂素单体的提取分离纯化工艺存在步骤繁琐，制备周期长，操作复杂，耗时耗力，得率低等各种弊端。专利号为ZL200910242188.X的发明专利中公开了一种“五味子单体成分的分离制备方法”，该专利较之前方法，纯化步骤采用高速逆流色谱，使得纯化周期得到了缩短，可同时制备多个木脂素单体。但样品前处理繁琐，需通过提取、萃取、硅胶柱层析等多步，使得整个制备过程仍较复杂。

超临界流体萃取作为一种环保、快速、且可工业化的提取手段，目前正广泛用于各种天然产物的提取中。五味子中的木脂素类成分极性较小，用该方法对其进行提取具有其他方法不可比拟的优势。如专利号为ZL200610041566.4、ZL201010119871.7的发明专利中均采用了超临界流体萃取法提取五味子中的总木脂素类成分。但至今未有将超临界提取与高速逆流色谱分离纯化五味子中木脂素单体的报道。

发明内容

本发明针对现有工艺中的不足，提供一种从五味子药材中联合使用超临界萃取和高速逆流色谱提取、分离纯化木脂素单体五味子甲素、五味子乙素、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙的方法，该方法工艺简便，效率高，快速，产品纯度大于92％。

本发明公开了一种以超临界流体萃取五味子药材粉末，所得超临界萃取物以高速逆流色谱进行分离纯化，最终可同时获得纯度高于92%的五味子甲素、五味子乙素、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙单体木脂素成分。这种方法较传统的提取分离纯化方法更为快速、简便、高效。

本发明采用的技术方案是：

一种五味子中木脂素单体的提取分离制备方法，所述方法为：10～65目的五味子药材粉末经CO₂超临界提取，制得五味子粗提物，五味子粗提物先进行第一次高速逆流色谱分离，以体积比为2-10:0-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系A，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相A为固定相A，下相A为流动相A，取五味子粗提物，用上相A、下相A体积比1：1的混合溶剂溶解，作为供试品溶液进样，设定高速逆流色谱仪，转速500～1000r/min，流动相的流速0.1～10ml/min，紫外检测器波长180～400nm，分别收集紫外检测光谱图上各色谱峰的流出液、浓缩、干燥，分别制得五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯乙；将第一次高速逆流色谱分离后的固定相A取出回收，除去溶剂、干燥后，作为待测样品进行第二次高速逆流色谱分离，以体积比为1-10:0-5:0-10:1的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系B，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相B为固定相B，下相B为流动相B，将待测样品用上相B、下相B体积比1：1的混合溶剂溶解，作为待测样品溶液进样，设定高速逆流色谱仪，转速500～1000r/min，流动相的流速0.1～10ml/min，紫外检测器波长180～400nm，分别收集紫外检测光谱图上各色谱峰的流出液、浓缩、干燥，分别制得五味子甲素和五味子乙素。

进一步，优选本发明所述方法包括以下步骤：

（1）称取五味子果实粉碎后过10～65目筛，得五味子药材粉末，进行CO₂超临界提取，提取温度35～60℃，提取压力14～30MPa，提取时间0.5～6h，制得五味子粗提物；

（2）步骤（1）所得五味子粗提物进行第一次高速逆流色谱分离，首先以体积比为2-10:0-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系A，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相A为固定相A，下相A为流动相A，取五味子粗提物，用上相A、下相A体积比1:1的混合溶剂溶解，作为供试品溶液，将固定相A充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速下，以0.1～10ml/min的流速注入流动相A，以波长180～400nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取供试品溶液进样，根据紫外检测器光谱图，对分离的各个色谱峰的对应流出液进行收集，经HPLC检测，合并相同成分的流出液，浓缩、干燥，分别制得五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯乙；

（3）将步骤（2）第一次高速逆流色谱分离后的固定相A取出回收，除去溶剂、干燥后，作为待测样品进行第二次高速逆流色谱分离，以体积比为1-10:0-5:0-10:1的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系B，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相B为固定相B，下相B为流动相B，将待测样品用上相B、下相B体积比1:1的混合溶剂溶解，作为待测样品溶液，将固定相B充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速下，以0.1～10ml/min的流速注入流动相B，以波长180～400nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取待测样品溶液进样，根据紫外检测器光谱图，对分离的各个色谱峰的对应流出液进行收集，经HPLC检测，合并相同成分的流出液，浓缩、干燥，分别制得五味子甲素和五味子乙素。

所述步骤（1）中，提取温度优选35～55℃。提取时间优选1～4h。

所述的供试品溶液中含有的五味子粗提物的质量与高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱的体积比为0.1～0.5:300g/ml。

所述的待测样品溶液中含有的待测样品的质量与高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱的体积比通常为0.1～0.5:300g/ml。

所述步骤（2）中，所述流动相A的流速优选为1～3mL/min，更优选1.8mL/min。

所述步骤（3）中，所述流动相B的流速优选为1～3mL/min，更优选1.8mL/min。

所述步骤（2）或步骤（3）中，所述转速优选800r/min。

所述步骤（2）或步骤（3）中，所述紫外检测器的检测波长优选210-280nm，更优选254nm。

所述步骤（2）或步骤（3）中，高速逆流色谱分离通常在常温下进行，优选恒温25℃。

本发明所述体积比为2-10:0-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系A，其中乙酸乙酯、甲醇的组分比例中的0代表可以为0，即溶剂体系中可以不含有乙酸乙酯或甲醇。即所述高速逆流溶剂体系A可以为以下四种体系之一：

（a）体积比为2-10:5的正己烷和水；

（b）体积比为2-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、水，其中的0代表无限接近于0但不为0；

（c）体积比为2-10:0-10:5的正己烷、甲醇、水，其中的0代表无限接近于0但不为0；

（d）体积比为2-10:0-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水，其中的0代表无限接近于0但不为0.

同样的，所述体积比为1-10:0-5:0-10:1的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系B，其中乙酸乙酯、甲醇的组分比例中的0代表可以为0，即溶剂体系中可以不含有乙酸乙酯或甲醇。即所述高速逆流溶剂体系B可以为以下四种体系之一：

（i）体积比为1-10:1的正己烷和水；

（ii）体积比为1-10:0-5:1的正己烷、乙酸乙酯、水，其中的0代表无限接近于0但不为0；

（iii）体积比为1-10:0-10:1的正己烷、甲醇、水，其中的0代表无限接近于0但不为0；

（iv）体积比为1-10:0-5:0-10:1的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水，其中的0代表无限接近于0但不为0；

较为优选的，所述高速逆流溶剂体系A中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为5～8：2～5：4～5：5，更优选为6:4:5:5、7:3:5:5、10:9:9:10或8:2:5:5。

较为优选的，所述高速逆流溶剂体系B中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为2～4：1～2：2～4：1，更优选为7:3:7:3、6:4:7:3、7:3:8:2或6:4:8:2.

所述将第一次高速逆流色谱分离后的固定相A取出回收，通常使用氮气或空气将分离柱中的固定相吹出收集即可。本领域技术人员公知此技术。

本发明的有益效果在于：

1、首次采用超临界流体技术结合高速逆流色谱法对五味子中的五种主要木脂素类成分（包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素）进行提取、分离及纯化。

2、采用的超临界流体萃取技术不仅环保、快速，同时，对五味子中木脂素选择性提取效果，有利于木脂素单体后续的分离纯化。仅需一次提取即可直接用于后续单体的分离纯化，提取步骤简单高效，比现有技术简化了前处理的提取步骤。

3、采用高速逆流色谱法进行分离纯化，操作简单，产品纯度较高。

4、该方法快速、高效、简便、低成本、环保，与现有技术相比，提取步骤简单，周期短，分离纯化效率高，实现了技术创新和提升，对五味子中木脂素类成分的开发研究起到了重要的借鉴作用。

附图说明

图1为本发明方法的工艺流程示意图。

图2为实施例6的高速逆流色谱图，图中峰1为五味子醇甲，峰2为五味子醇乙，峰3为五味子酯乙。

图3为实施例6制得的五味子醇甲的HPLC色谱图。

图4为实施例6制得的五味子醇乙的HPLC色谱图。

图5为实施例6制得的五味子酯乙的HPLC色谱图。

图6为实施例9的高速逆流色谱图，图中峰4为五味子甲素，峰5为五味子乙素。

图7为实施例9制得的五味子甲素的HPLC色谱图。

图8为实施例9制得的五味子乙素的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：超临界流体提取

取北五味子果实，粉碎，得五味子药材粉末，粒径为50～65目，取五味子药材粉末2g，放入超临界流体萃取罐，提取温度40℃，提取压力25MPa，CO₂流量为2L/min，提取时间为1h，得五味子粗提物。以五味子醇甲为代表，计算其提取率为0.5294%。

实施例2：超临界流体提取

取北五味子果实，粉碎，得五味子药材粉末，粒径为10～20目，取五味子药材粉末3g，放入超临界流体萃取罐，提取温度35℃，提取压力14MPa，CO₂流量为2L/min，提取时间为2h，得五味子粗提物。以五味子醇甲为代表，计算其提取率为0.3926%。

实施例3：超临界流体提取

取北五味子果实，粉碎，得五味子药材粉末，粒径为50～65目，取五味子药材粉末3g，放入超临界流体萃取罐，提取温度35℃，提取压力30MPa，CO₂流量为2L/min，提取时间为2h，得五味子粗提物。以五味子醇甲为代表，计算其提取率为0.6001%。

实施例4：超临界流体提取

取北五味子果实，粉碎，得五味子药材粉末，粒径为50～65目，取五味子药材粉末3g，放入超临界流体萃取罐，提取温度55℃，提取压力25MPa，CO₂流量为2L/min，提取时间为2h，得五味子粗提物。以五味子醇甲为代表，计算其提取率为0.5650%。

实施例5：超临界流体提取工艺

取北五味子果实，粉碎，得五味子药材粉末，粒径为20～40目，取五味子药材粉末3kg，放入超临界流体萃取罐，提取温度36℃，提取压力15MPa，CO₂流量为40±5kg/h，提取时间为4h，得五味子粗提物。以五味子醇甲为代表，计算其提取率为0.2806%。

实施例6：第一次高速逆流色谱分离纯化

取五味子粗提物（以实施例5中提取工艺制备所得提取物）300mg，溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为6:4:5:5，混合充分后静置，按上下两相分开，五味子粗提物300mg用上下相各7mL溶解，作为供试品溶液。以溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相。将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，分离柱的柱体积为300ml，设定高速逆流色谱仪，流动相流速1.8mL/min，离心分离仪转速800rpm，紫外检测波长254nm，恒温循环水箱25℃。当明显有流动相流出时，取供试品溶液进样，根据紫外检测器光谱图，如图2所示，峰1为五味子醇甲，峰2为五味子醇乙，峰3为五味子酯乙。对分离的各个色谱峰的对应流出液进行收集，用HPLC检测，合并相同成分的流出液，减压浓缩，冷冻干燥，分别得到五味子醇甲23.2mg，五味子醇乙2.3mg，五味子酯乙1.4mg，用高效液相色谱对三种分离产物进行检测，纯度分别为98.61%、99.03%、94.30%，HPLC色谱图分别如图3-5所示。高效液相色谱的检测条件是：乙腈-水体系，梯度洗脱（0～10min，45%～58%乙腈；10～15min，58%～60%乙腈；15～25min，60%～70%乙腈；25～35min，70%～75%乙腈；35～45min，75%～95%乙腈；45～50min，95%～100%乙腈），进样量为10μL，流动相流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为225nm，洗脱时间为68min。色谱柱为：phenomenex Gemini C18，250×4.6mm,5μm。

实施例7：第一次高速逆流色谱分离纯化

取五味子粗提物（以实施例5中提取工艺制备所得提取物）300mg，用溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（8:2:5:5，v/v）上下相各7mL溶解。其他操作条件同实施例6。所获得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙组分，减压浓缩，冷冻干燥，得到五味子醇甲19.1mg，五味子醇乙1.9mg，五味子酯乙1.0mg，纯度分别为95.36%、95.24%、92.87%。

实施例8：第一次高速逆流色谱分离纯化

取五味子粗提物（以实施例5中提取工艺制备所得提取物）250mg，用溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（10:9:9:10，v/v）上下相各7mL溶解。其他操作条件同实施例6。所获得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙组分，减压浓缩，冷冻干燥，得到五味子醇甲13.1mg，五味子醇乙3.3mg，五味子酯乙0.9mg，纯度分别为98.50%、94.89%、93.44%。

实施例9：第二次高速逆流色谱分离纯化

按照实施例6方法分离两次，用空气吹出固定相，合并两次实例6分离后所得固定相，除去溶剂，干燥作为待测样品，备用。溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体积比7:3:7:3，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相。待测样品113mg用上下相各7mL溶解，得待测样品溶液。其他色谱的操作条件同实施例6。当明显有流动相流出时，取待测样品溶液进样，根据紫外检测器光谱图，如图6所示，峰4为五味子甲素，峰5为五味子乙素。对分离的各个色谱峰的对应流出液进行收集，经HPLC检测，合并相同成分的流出液，经减压浓缩，冷冻干燥，得到五味子甲素2.5mg，五味子乙素3.1mg，用高效液相色谱对两种分离产物进行检测，纯度分别为97.22%、95.28%，HPLC色谱图分别如图7-8所示。

实施例10：第二次高速逆流色谱分离纯化

按照实施例6方法分离两次，用空气吹出固定相，合并两次实例6分离后所得固定相，除去溶剂，干燥作为待测样品，备用。待测样品119mg用溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6:4:7:3，v/v）上下相各7mL溶解。其他色谱操作条件同实施例9。所获得五味子甲素、五味子乙素组分，减压浓缩，冷冻干燥，得到五味子甲素2.1mg，五味子乙素3.3mg，纯度分别为95.59%、95.97%。

实施例11：第二次高速逆流色谱分离纯化

按照实施例6方法分离两次，用氮气吹出固定相，合并两次实例6分离后所得固定相，除去溶剂，干燥作为待测样品，备用。待测样品109mg用溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（7:3:8:2，v/v）上下相各7mL溶解。其他色谱操作条件同实施例8。所获得五味子甲素、五味子乙素组分，减压浓缩，冷冻干燥，得到五味子甲素1.9mg，五味子乙素2.9mg，纯度分别为93.59%、92.07%。

Claims

1.一种五味子中木脂素单体的提取分离制备方法，其特征在于所述方法为：10～65目的五味子药材粉末经CO₂超临界提取，制得五味子粗提物，五味子粗提物先进行第一次高速逆流色谱分离，以体积比为2-10:0-10:0-10:5的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系A，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相A为固定相A，下相A为流动相A，取五味子粗提物，用上相A、下相A体积比1:1的混合溶剂溶解，作为供试品溶液进样，设定高速逆流色谱仪，转速500～1000r/min，流动相的流速0.1～10ml/min，紫外检测器波长180～400nm，分别收集紫外检测光谱图上各色谱峰的流出液、浓缩、干燥，分别制得五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯乙；将第一次高速逆流色谱分离后的固定相A取出回收，除去溶剂、干燥后，作为待测样品进行第二次高速逆流色谱分离，以体积比为1-10:0-5:0-10:1的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系B，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相B为固定相B，下相B为流动相B，将待测样品用上相B、下相B体积比1:1的混合溶剂溶解，作为待测样品溶液进样，设定高速逆流色谱仪，转速500～1000r/min，流动相的流速0.1～10ml/min，紫外检测器波长180～400nm，分别收集紫外检测光谱图上各色谱峰的流出液、浓缩、干燥，分别制得五味子甲素和五味子乙素。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于本发明所述方法包括以下步骤：

（3）将步骤（2）第一次高速逆流色谱分离后的固定相A取出回收，除去溶剂、干燥后，作为待测样品进行第二次高速逆流色谱分离，以体积比为1-10:0-5:0-10:1的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系B，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相B为固定相B，下相B为流动相B，将待测样品用上相B、下相B体积比1：1的混合溶剂溶解，作为待测样品溶液，将固定相B充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在500～1000r/min转速下，以0.1～10ml/min的流速注入流动相B，以波长180～400nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取待测样品溶液进样，根据紫外检测器光谱图，对分离的各个色谱峰的对应流出液进行收集，经HPLC检测，合并相同成分的流出液，浓缩、干燥，分别制得五味子甲素和五味子乙素。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，提取温度35～55℃，提取时间1～4h。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的供试品溶液中含有的五味子粗提物的质量与高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱的体积比为0.1～0.5:300g/ml。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的待测样品溶液中含有的待测样品的质量与高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱的体积比为0.1～0.5:300g/ml。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述紫外检测器的检测波长为210-280nm。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述高速逆流溶剂体系A中，所述正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为5～8:2～5:4～5:5。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述高速逆流溶剂体系B中，所述正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为2～4:1～2:2～4:1。