CN111700892B - 五味子乙素抗prrsv的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了五味子乙素抗PRRSV的用途。五味子乙素能够显著抑制PRRSV的复制并直接灭活病毒，抑制PRRSV的吸附和释放，证明五味子乙素在体外具有抗PRRSV作用，有望成为新型的防治猪蓝耳病的药物，在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。

Description

五味子乙素抗PRRSV的用途

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及五味子乙素在制备抗PRRSV的药物中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRSV)，俗称猪蓝耳，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种急性、接触性、高度传染性疾病。PRRSV主要的感染对象是妊娠母猪和仔猪，妊娠母猪表现为繁殖障碍，而仔猪及其各年龄猪除了严重的呼吸道症状和持续性的感染外，还能引起生长发育缓慢和神经症状。该病1987年在美国首次报道，之后在德国、荷兰、加拿大等国相继出现报道，随后迅速蔓延至亚洲及其它地区，给全球养猪业带来了巨大的损失。

当前控制和预防该综合征的主要有效措施还是接种疫苗。目前市面上的PRRSV疫苗主要有灭活苗和弱毒苗，但是这两种疫苗均存在安全性低、效果差等问题。最先用于临床治疗PRRSV的疫苗是灭活苗，使用灭活疫苗后只能产生体液免疫，所以需要二次免疫才能起到一定的保护作用，灭活苗从免疫到产生免疫保护所需要的时间较长，在这期间中和抗体产生的量可能会很少，或者不产生中和抗体，从而发生无效免疫的情况，所以灭活疫苗并不能有效控制PRRSV的发病与传播。相对而言，弱毒苗可快速诱导产生中和抗体，具有免疫时间长、抵抗力强等优点。但是，弱毒苗存在散毒的危险，并且在免疫的过程中可能会出现毒力返强的状况。

五味子[Schisandra chinensis(Yurcz.)Baill.]为木兰科五味子属和南五味子属植物的泛称。五味子中含有挥发油、有机酸、维生素、木脂素、三萜、倍半萜及多糖等多种化学成分。木脂素类化合物为五味子中最主要的药理活性成分，五味子属植物中分离鉴定的200个成分中有150个成分是木脂素。木脂素又分为：五味子素(Sehisandrin)、五味子甲素[去氧五味子素、五味子素A(deoxy schisandrin)]、五味子乙素[7-五味子素、五味子素B(Sehisandrin B)]、五味子丙素(Sehisandrin C)、五味子醇甲、五味子醇乙(schisandrolB)、五味子酯甲(Se-hisantherrin A)、五味子酯乙(Sehisantherfin B)、戈米辛A(gomisinA)等。五味子味酸、甘，性温，有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功能，用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗、盗汗、津伤口渴、短气脉虚、内热消渴、心悸失眠等症。五味子在中医临床中应用广泛，由五味子、灵芝、丹参等中药组成五灵丸，有补肝益脾、改善肝血循环、减轻肝纤维化与脂变、调节免疫功能的作用。主治急性病毒性肝炎、慢性迁延性肝炎及其他原因所致的转氨酶升高，总有效率为84.00％～97.90％，但五味子在抗PRRSV病方面尚未见有报道。

发明内容

针对上述不足之处，发明人经过多方筛查，研究发现，五味子中的五味子乙素对PRRSV有很好的抑制作用，在蓝耳病的防治方面有很好的应用前景。

本发明的目的是提供五味子乙素在制备抗PRRSV的药物中的应用。

本发明的另一目的是提供五味子乙素在制备防治猪蓝耳病药物中的应用。

本发明通过五味子乙素对PRRSV的不同作用方式、不同作用时间分析了五味子乙素对PRRSV的抗病毒作用，并以利巴韦林作为阳性对照药物，利用qRT-PCR、免疫荧光等技术通过各个层面的实验证明了，五味子乙素能够显著抑制PRRSV的复制并直接灭活病毒，抑制PRRSV的吸附和释放，证明五味子乙素在体外具有抗PRRSV作用，有望成为新型的防治猪蓝耳病的药物，在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。

因此，本发明进行五味子乙素抗PRRSV的实验研究，对PRRSV临床用药上提供有价值的理论依据和参考。

附图说明

图1为细胞病变观察图。

图2为五味子乙素抗PRRSV吸附细胞的作用图

图3为五味子乙素抗PRRSV进入细胞的作用图

图4为五味子乙素抗PRRSV释放的作用图

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行进一步解释说明

试验例1

一.实验材料

(1)五味子乙素(Schisandrin)、利巴韦林(Ribavirin)购自于南通飞宇生物科技有限公司。

(2)四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自于北京索莱宝科技有限公司。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

二.五味子乙素和利巴韦林的细胞毒性

用含10％FBS的DMEM将细胞瓶中长至单层的细胞消化后稀释至约2×10⁵/mL，加入96孔板,每孔100μL细胞悬液。待细胞长至单层后，弃去旧培养液，第1～10列依次从高浓度至低浓度加入稀释的药液，每个浓度重复4孔，每孔100μL，11～12列加入细胞培养液作为细胞对照。培养72h后，弃去药液，加入MTT溶液，20μL/孔，继续培养4h后，弃去MTT溶液，加入DMSO完全溶解结晶，测OD_490nm值。计算公式如下：

生长抑制率(％)＝(细胞对照组OD_490nm值-药物组OD_490nm值)/细胞对照组OD_490nm值×100％

当抑制率为0时，则该浓度下药物对细胞没有毒性作用，从而确定药物的最大安全浓度，结果如表1所示。

表1不同质量浓度药物对Marc-145细胞的抑制率/％

注：Schisandrin起始质量浓度为50μg/mL，Ribavirin起始质量浓度为1mg/mL。

由表1可知，当五味子乙素浓度为6.25μg/mL及以下时，利巴韦林浓度为15.63μg/mL及以下时，其对Marc-145细胞没有毒性。故后续试验所采用的五味子乙素的起始质量浓度为6.25μg/mL，利巴韦林的起始质量浓度为15.63μg/mL。

三.五味子乙素抗PRRSV活性

1.五味子乙素对PRRSV的阻断作用

Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，加入以最大安全质量浓度为起始浓度的中药提取物溶液，每孔100μL，2倍比稀释4个浓度梯度，培养4h后，弃去药液，加入100TCID₅₀PRRSV液，每孔100μL，培养2h后，弃去病毒液，加入含2％FBS的DMEM生长维持液。通过公式计算得到药物对病毒的抑制率。

结果如表2所示，可以得到五味子乙素和利巴韦林在最大安全质量浓度时对PRRSV的最大抑制率分别为35.0％、63.3％，五味子乙素对PRRSV的抑制率显著低于利巴韦林(P<0.01)，说明五味子乙素对PRRSV的阻断作用较弱。

表2阻断作用方式下五味子乙素对Marc-145细胞的保护率

注：上述实验结果均经过三次独立实验，每次实验设立四个重复。C1、C2、C3、C4表示从药物的最大安全浓度开始的2倍倍比稀释的4个不同浓度，所有数据均用平均值±标准差(Mean±SD)表示。*，**表示每列的药物组与利巴韦林对照组的差异显著性分别为P<0.05,P<0.01(增强作用)。a，aa表示每列的药物组与利巴韦林对照组的差异显著性分别为P<0.05,P<0.01(增强作用)。

2.五味子乙素对PRRSV的抑制作用

Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，加入100TCID₅₀PRRSV液，每孔100μL，培养2h后，弃去病毒液，加入以最大安全质量浓度为起始浓度的中药提取物溶液，每孔100μL，2倍比稀释4个浓度梯度，培养4h后，弃去药液，加入含2％FBS的DMEM生长维持液。通过公式计算得到药物对病毒的抑制率。

结果如表3所示，五味子乙素和利巴韦林对PRRSV的最大抑制率分别为77.0％、68.9％，五味子乙素对PRRSV的抑制率显著高于利巴韦林(P<0.05)，说明五味子乙素和利巴韦林均具有体外抑制PRRSV的作用，且效果较利巴韦林强。

表3抑制作用方式下五味子乙素对Marc-145细胞的保护率

3.五味子乙素对PRRSV的直接灭活作用

Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，同时加入50μL中药提取物溶液和50μL病毒液(使药液最高浓度为最大安全质量浓度和病毒液终浓度为100TCID₅₀)，培养4h后，弃去药液，加入含2％FBS的DMEM生长维持液。通过公式计算得到药物对病毒的抑制率。

结果如表4所示，五味子乙素和利巴韦林对PRRSV的最大抑制率分别为51.4％、65.5％，五味子乙素对PRRSV的抑制率显著低于利巴韦林(P<0.05)，说明五味子乙素和利巴韦林均具有直接灭活PRRSV的作用，但其作用效果弱于利巴韦林。

表4直接灭活作用方式下五味子乙素对Marc-145细胞的保护率

4.3种作用方式细胞病变观察

从图1可以看到，五味子乙素在对PRRSV的阻断作用下，细胞出现较严重病变，有团聚、圆缩甚至细胞脱落的现象，而在对PRRSV的抑制作用下，细胞出现了轻微病变，在直接灭活作用下细胞基本保持单层完好，只有部分细胞出现圆缩现象。

四.五味子乙素抗PRRSV的作用机制

1.间接免疫荧光检测

37℃、5％CO₂培养72h后，将细胞在室温下用4％多聚甲醛固定30min，用PBS洗涤3次后，将细胞用0.2％Triton X-100透化10min，并用5％BSA封闭30min，然后与抗PRRSV N蛋白单克隆抗体在4℃过夜，用PBS洗涤三次后，加入FITC偶联的二抗，在室温下孵育1h。细胞核用DAPI染色，并通过荧光显微镜检查。

2.五味子乙素抗PRRSV载量的qPCR检测

将收集的细胞培养上清液4℃12000×g离心10min，吸取上清提取RNA，用荧光定量PCR测定病毒载量。

3.五味子乙素抗PRRSV吸附细胞的作用

将Marc-145细胞接种于96孔板，待细胞长至80％左右后，于4℃预冷45min后，弃去旧培养液，每孔加入50μL PRRSV液，同时加入50μL五味子乙素药液，使病毒终浓度和五味子乙素终浓度分别为100TCID₅₀及最大安全浓度，放入冰箱4℃共作用4h后弃去，PBS清洗，加入100μL 2％DMEM，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养72h后，进行MTT和IFA测定，并收获培养液，测定病毒TCID₅₀和病毒载量。同时设立细胞对照组，PRRSV对照组和阳性对照利巴韦林组。

抗病毒吸附试验结果表明(图2)，经对利巴韦林和五味子乙素作用后，五味子乙素药物组的PRRSV N基因拷贝数(图2A)、病毒液TCID₅₀(图2B)显著低于(P<0.05)PRRSV对照组和阳性对照利巴韦林组(P<0.05)，且其对病毒的抑制率(图2C)显著高于阳性对照利巴韦林组(P<0.05)。而阳性对照利巴韦林组的PRRSV N基因拷贝数、病毒液TCID₅₀与PRRSV对照组相比差异不显著。对各处理组细胞进行免疫荧光试验，各组荧光效果差异显著，故五味子乙素具有一定的抗PRRSV吸附效果。

4.五味子乙素抗PRRSV进入细胞的作用

将Marc-145细胞接种于96孔板，待细胞长至80％左右后，弃去旧培养液，每孔加入100μL 100TCID₅₀PRRSV液，置于冰箱，4℃作用4h后，PBS清洗后，再加入100μL最大安全浓度的五味子乙素药液，37℃培养6h后弃去，PBS清洗，加入100μL 2％DMEM继续培养72h后，进行MTT和IFA测定，并收获培养液，测定病毒TCID₅₀和病毒载量。同时设立细胞对照组，PRRSV对照组和阳性对照利巴韦林组。

抗病毒进入试验结果表明(图3)，阳性对照利巴韦林组能够显著抑制PRRSV的进入(P<0.05)，而五味子乙素药物组的PRRSV N基因拷贝数(图3A)、病毒液TCID₅₀(图3B)以及荧光效果图片(图3D)与PRRSV对照组并没有显著差异，且其对PRRSV的抑制率(图3C)显著低于阳性对照利巴韦林组(P<0.05)，故五味子乙素抗PRRSV进入细胞的作用效果不明显。

5.五味子乙素抗PRRSV释放的作用

将Marc-145细胞接种于96孔板，待细胞长至80％左右后，弃去旧培养液，每孔加入100μL 100TCID₅₀PRRSV液，37℃培养24h后弃去，PBS清洗，加入100μL最大安全浓度的五味子乙素药液，37℃培养4h后弃去，PBS清洗，加入100μL 2％DMEM继续培养72h后，进行MTT和IFA测定，并收获培养液，测定病毒TCID₅₀和病毒载量。同时设立细胞对照组，PRRSV对照组和阳性对照利巴韦林组。

抗病毒释放试验结果表明(图4)，相比较五味子乙素抗PRRSV吸附和进入试验结果，各处理的PRRSV N基因拷贝数(图4A)、病毒液TCID₅₀(图4B)以及荧光效果图片(图4D)明显较高，表明在该阶段病毒出现了大量释放现象。而与PRRSV对照组相比，各药物处理组抗PRRSV释放的效果显著(P<0.05)，且五味子乙药物组抗PRRSV释放效果比阳性对照利巴韦林组显著，故五味子乙素具有一定的抗PRRSV释放的作用。

Claims (2)

1.五味子乙素在制备抗PRRSV药物中的应用。

2.五味子乙素在制备防治猪蓝耳病药物中的应用。

Images