CN109419804B - 一种畜禽用抗病毒感染的植物源制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种畜禽用抗病毒感染的植物源制剂，特别涉及HHT作为广谱抗病毒制剂的应用。本发明首次发现高三尖杉酯碱(HHT)具备广谱高效的抗病毒活性，可高效抑制7科类9种病毒(VSV、NDV、PEDV、TGEV、AIV、HSV‑1、PRV、PRRSV、FMDV)感染宿主细胞及动物(鸡、鸡胚、猪等)，显著减少动物体内病毒量，且减轻感染症状，为养殖业提供安全可靠的新型生物制剂。本发明为开发广谱高效抗病毒新药提供依据和可能，为保障农牧业可持续性发展与人类健康提供一种新的安全可靠的技术手段。对于开发传统医药资源，弘扬我国中医药事业具有深远的现实意义。

Description

一种畜禽用抗病毒感染的植物源制剂

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及一种畜禽用抗病毒感染的植物源制剂。

背景技术

目前针对病毒感染，尤其当病原体属于突发或未知时，没有大量类似于抗生素一样广谱、高效、安全的药物治疗手段，加之病毒生化武器日益成为全人类的巨大潜在威胁，这些事实都强调新型广谱抗病毒制剂研制的必要性与紧迫性。疫苗是一种公认可行的治疗手段，曾为人类健康做出积极贡献，但是也面临一些棘手问题与缺憾，比如窄谱——疫苗只针对特定血清型的病毒有效；同时由于无法预测病毒的变异，以至于只有在传染病发作之后才能开展疫苗的研制；此外，还有一些病毒性传染病(如艾滋病)的疫苗研制还属于空窗期。广谱抗病毒制剂的研制，可以与疫苗的使用互为补充，事实上广谱抗病毒制剂研究已获得令人瞩目的进展，相信也终将为人类在与各类病毒性传染病的对抗中占据优势地位做出难以替代的贡献。

近年来广谱抗病毒制剂相关研究获得长足进展，突破了抗病毒制剂单一宿主的瓶颈与限制，以及广谱类制剂活性相对较弱的原有思维，部分成果已面临应用。抗病毒制剂研究基于两方面设计，一是从病毒侵染层面，二是从宿主细胞防御层面。从宿主细胞防御层面研究抗病毒制剂，即通过改变或者消除为病毒复制所需但是对细胞本身生长并不重要的蛋白或分子，以影响病毒的生命周期，从而达到抗病毒效果。针对宿主细胞的抗病毒制剂，可以在真正意义上达到广谱抗病毒的目的，且可最小化耐药性产生的可能性，因此成为病毒学领域的重要研究方向。

1972年Powerll R.G.小组首次从三尖杉属植物日本粗榧中分离得到了高三尖杉酯碱(简称HHT，分子结构示意图见图1)，并发现了其具有显著的抗白血病活性(L-1210白血病小鼠相对生存期延长42％，P388小鼠相对生存期延长238％)，但是受资源短缺限制当时并未进行深入研究，三尖杉属植物为我国特产树种，在我国有8种，4变种，主要分布在南方，20世纪70年代，中国科学院上海药物研究所马广恩等从三尖杉(CephalotaxusfortuneiHook)中分离了多种生物碱成分，包括三尖杉碱、三尖杉酯等，陈瑞婷等(陈瑞婷,花泽,胥彬.三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱的药理研究[J].科学通报,1980,25(18):859-861.)对这些化合物进行了抗癌活性实验，实验结果表明，HHT具有较强的抗白血病活性，它能够使染色质固缩、核破裂、抑制蛋白合成。临床试用证实其对急性粒细胞白血病、单核细胞白血病等有显著的疗效，1990年HHT被纳入《中国药典》，逐渐成为临床上治疗白血病的常用药物。近十多年来，人们热衷于靶向治疗，大力研发靶向抗肿瘤制剂已是时代潮流，imantinib是一款2001年在美国上市的靶向特定酪氨酸激酶的抗白血病药物，它的上市阻碍了HHT在美国的推广，但后来的研究发现imantinib在约三分之一的患者中在短期内即产生耐药性，解决它的耐药性问题变得迫在眉睫，新的临床研究证明HHT对imantinib、Dasatinib等靶向药物耐药患者的疗效突出，使HHT又重新引起国外的重视，因此，经过临床试验，2012年FDA批准HHT用于治疗急性粒细胞白血病、单核细胞白血病。

一些蛋白合成抑制剂早有报道，如阻止翻译起始因子复合物eIF4E-eIF4G形成的抑制物4E2Rcat；如放线菌酮CHX通过干扰易位步骤而阻碍翻译过程；Lactimidomycin(LTM)靶向翻译延长而抑制蛋白合成。这些抑制物的体外抗病毒效果也比较明显，比如近期LTM被证明显著抑制登革热病毒等RNA病毒，问题在于，4E2Rcat、CHX影响了宿主细胞合成系统，但是细胞毒性很大，且均没有进行体内试验验证。本课题组基于功能学筛选，发现高三尖杉酯碱HHT可高效且选择性抑制多种病毒复制，且不影响宿主细胞蛋白翻译。早些年曾有报道表明，HHT可在一定程度上抑制乙肝病毒与小鼠肝炎病毒感染，作用机理与体内抗病毒效果尚不清楚。

美国食品药物管理局(FDA)批准的止痛药吲哚美辛与抗抑郁药物氟西汀具有高效的抗病毒效果，据报道这两种药物可以靶向抑制某种细胞蛋白(酶)的合成，而后者同时也是病毒的作用靶位。这些FDA批准药物的药理与安全性已证实，据此开发抗病毒药物的时间与耗费将大幅度缩减，因此为新药研制开拓了新方向。2012年FDA批准HHT，因此开发抗病毒新药的前景乐观而明确。

发明内容

本发明的目的是提供一种畜禽用抗病毒感染的植物源制剂。

本发明的另一目的是提供HHT作为畜禽用广谱抗病毒制剂的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供源自三尖杉属植物的生物碱成分在制备畜禽用广谱抗病毒药物中的应用。

本发明所述所述生物碱成分包括但不限于HHT(高三尖杉酯碱)、三尖杉碱、三尖杉酯等。优选HHT。

本发明所述病毒包括但不限于副粘病毒科、正粘病毒科、冠状病毒科、弹状病毒科、疱疹病毒科、小RNA病毒科和动脉炎病毒科的病毒。

在本发明的具体实施方式中，所述病毒包括NDV(新城疫病毒)、VSV(水疱性口炎病毒)、PEDV(猪流行性腹泻病毒)、TGEV(猪传染性胃肠炎病毒)、AIV(禽流感病毒)、HSV-1(人单纯疱疹病毒)、PRV(猪伪狂犬病毒)、PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)、FMDV(口蹄疫病毒)等。

本发明还提供一种畜禽用抗病毒感染的植物源制剂，其活性成分为从三尖杉属植物中分离的生物碱成分，优选HHT。

本发明还提供一种畜禽用抗病毒药物组合物，其包含从三尖杉属植物中分离的生物碱成分(优选HHT)，以及至少一种药用赋形剂。

本发明所述的制剂或药物组合物可以是肌注、皮下、或口服等剂型。

当HHT的使用浓度为20-300nM时，可高效抑制7科类9种病毒(VSV、NDV、PEDV、TGEV、AIV、HSV-1、PRV、PRRSV、FMDV)感染宿主细胞(HeLa、Vero、Marc145、PK15细胞等)，按0.01-1mg/kg体重给药量可高效抑制病毒感染宿主动物(鸡、鸡胚、猪等)，显著减轻甚至消除感染动物症状。

本发明具有以下优点：

本发明首次发现高三尖杉酯碱(HHT)具备广谱高效的抗病毒活性，可高效抑制7科类9种病毒(VSV、NDV、PEDV、TGEV、AIV、HSV-1、PRV、PRRSV、FMDV)感染宿主细胞及动物(鸡、鸡胚、猪等)，显著减轻甚至清除感染动物体内病毒，为养殖业提供安全可靠的新型生物制剂。本发明为开发广谱高效抗病毒新药提供依据及可能，为保障农牧业可持续性发展与人类健康提供一种新的安全可靠的技术手段。对于开发传统医药资源，弘扬我国中医药事业具有深远的现实意义，也是现代医药研究的主要关注方向。

附图说明

图1为高三尖杉酯碱(HHT)分子结构示意图。

图2为本发明实施例1中HHT对VSV病毒毒力的影响。其中，A表示HeLa细胞感染VSV，0.5MOI，1.5h后换2％DMEM培养基，同时向细胞培养液中分别加入0、0.005、0.01、0.05、0.1、10、100、1000μM的HHT与公认的广谱抗病毒药—利巴韦林(Ribavirin)，继续培养24h，冻融三次，采用细胞病变法测定病毒毒力的结果；可见，相较于利巴韦林，HHT有效抗病毒浓度少1000倍。B表示一部分为HeLa细胞感染VSV，1MOI，1.5h后换2％DMEM培养基，同时向细胞培养液中加入10、50、100nM的HHT，继续培养36h后收集细胞，进行免疫印迹分析，另一部分为HeLa细胞感染VSV，0.5MOI，1.5h后换2％DMEM培养基，同时向细胞培养液中加50nM HHT，分别在感染后8h、24h、36h收集细胞样品，进行免疫印迹分析，所用病毒蛋白抗体为VSV-G，可见，HHT显著抑制G蛋白表达且呈剂量依赖性及时间依赖性。C表示HeLa细胞感染VSV，0.5MOI，从左到右分别在病毒感染前2h、同时、感染后2h、6h、8h分别加入50nM HHT，继续培养48h后收集细胞，进行免疫印迹法分析(所用病毒蛋白抗体为VSV-G)，或者冻融三次采用细胞病变法测定病毒毒力，可见，病毒感染前2h加HHT不影响病毒蛋白表达及病毒滴度，感染同时及感染后2h、6h、8h加50nM HHT显著抑制病毒蛋白表达及病毒滴度，且感染同时加HHT抑制病毒滴度效果最显著。

图3为本发明实施例2中HHT对NDV病毒毒力的影响。其中，A表示HeLa细胞感染GFP-NDV，0.1MOI,1.5h后，向细胞培养液中加作用浓度由低到高依次为5、10、25、50、100nM的HHT。继续培养24h后，在荧光显微镜Olympus IX73观察，用CellSens软件成像的结果；可见，HHT显著抑制GFP-NDV感染且呈剂量依赖性。B表示HeLa细胞感染GFP-NDV 0.1MOI，1.5h后向细胞培养液中加入10、100、500nM的HHT，继续培养36h后收集细胞，进行免疫印迹法分析，所用病毒蛋白抗体为NDV-NP，可见，100nM的HHT可完全抑制NP蛋白表达。C表示24孔板铺满HeLa细胞，参照图3A的做法，在荧光显微镜Olympus IX73观察，统计HHT对GFP-NDV感染的抑制率，结果表明HHT对GFP-NDV的半数抑制率为18nM。D表示用50PFU的GFP-NDV接种11日龄SPF鸡胚，实验组注射浓度分别为0.07、0.1、0.2mg/kg的HHT，36h、48h收获鸡胚，4℃放置6h后，收集尿囊液，测定血凝效价，统计病毒滴度，结果显示，相较于实验组，0.2mg/kg实验组显著抑制NDV血凝效价，E表示10000PFU的NDV接种40日龄SPF鸡，实验组肌肉注射0.2mg/kg的HHT，连续注射3天，接种病毒后第7天取鸡全血、肝、肺，RT-PCR法检测全血中病毒蛋白N的mRNA水平，统计数据，结果显示，HHT显著抑制NDV在鸡体内的增殖。

图4为本发明实施例3中HHT对PEDV病毒毒力的影响。其中，A表示Vero细胞感染PEDV，0.1MOI，1.5h后向细胞培养液中加入10、100、300、500nM的HHT，48h后收获细胞，进行免疫印迹法分析，所用病毒蛋白抗体为PEDV-N，结果表明，100nM HHT的抑制率为80％。B表示Vero细胞感染PEDV，0.1MOI，分别于PEDV感染前2h、同时、感染后2h、感染后6h，向细胞培养液中加50nM的HHT，感染48h后，用PBS洗3遍后，4％多聚甲醛固定15min，PBS洗2遍；0.1％Triton100作用15min，PBS洗2遍；5％FBS封闭液37度封闭1h，病毒蛋白N的单克隆抗体37度孵育1h，PBST洗5遍；二抗FITC 37℃孵育1h，PBST洗5遍，在荧光显微镜Olympus IX73观察并统计间接免疫荧光方法检测病毒蛋白N的荧光信号，可见，感染前2h加入HHT未显著抑制病毒复制，而感染同时、感染后2h及感染后6h加HHT显著抑制病毒复制。C表示Vero细胞感染PEDV，0.1MOI，感染同时加100、200、500nM的HHT，感染48h后，细胞病变法测定病毒滴度，结果表明，500nM HHT完全抑制病毒复制。D表示3日龄仔猪感染PEDV，实验组与对照组各三组，实验组HHT用药浓度为0.05mg/kg，连续注射2天，5天后采全血进行RT-PCR检测，测定血清内病毒蛋白NP的mRNA水平，结果显示，HHT显著抑制PEDV在仔猪体内的增殖。

图5为本发明实施例4中HHT对HSV-1病毒毒力的影响。

图6为本发明实施例5中HHT对AIV病毒毒力的影响。

图7为本发明实施例6中HHT对PRRSV病毒毒力的影响。

图8为本发明实施例7中HHT对TGEV病毒毒力的影响。

图9为本发明实施例8中HHT对FMDV病毒毒力的影响。

图10为本发明实施例9中HHT对PRV病毒毒力的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中涉及的常规试验：

1、细胞的制备

进行HeLa、Vero、PK15、Marc145细胞传代时使用含有10％胎牛血清和100U青链霉素的DMEM培养液，维持液用含有2％胎牛血清和100U青链霉素的DMEM培养液。

NDV感染HeLa细胞，VSV、HSV-1、PEDV、PRV感染vero细胞，TGEV、FMDV感染PK15细胞，PRRSV感染Marc145细胞。

2、病毒的增殖

HSV-1、NDV、VSV、PRV细胞毒的增殖：按照细胞瓶培养液1/10的量接种病毒原液，待细胞病变(如NDV形成大合胞体)达75％(一般为48小时)采用反复冻融法收获病毒，即将细胞瓶放入-80℃冻存后放置室温至部分融化，此时平摇细胞瓶使贴壁细胞脱壁，再次放入-80℃冻存，如此反复3次，使病毒从细胞中释放出来，于-80℃冻存。

NDV鸡胚毒的增殖：9-10日龄鸡胚经尿囊腔接种NDV病毒原液，鸡胚死亡后收集尿囊液测定血凝效价及TCID₅₀，分装后于液氮冻存。

3、病毒效价滴度的测定方法

细胞病变(cytopathic effect，CPE)为致细胞病变作用，指病毒对组织培养细胞侵染后产生的细胞变性，利用此种病变效应可进行病毒定量。病毒感染形成细胞病变常见合胞体(即多个细胞聚集一起形成多核的大细胞)与噬斑(细胞脱落形成空斑)两种。病变融合率为病变细胞占所有细胞的比率。

毒力测定：将细胞毒(VSV、PEDV、PRV)倍比稀释得到细胞毒悬液，用96孔板培养HeLa、Vero细胞至单层，向各孔中加入细胞毒悬液10μL/孔，做12个稀释度及8个重复，于37℃二氧化碳培养箱中放置48小时后观察细胞病变，或记录病变融合率(病变融合率即病变细胞占所有细胞的比率)，重复3次。

空斑形成单位(Plaque-forming unit,PFU)测定是一种测定病毒感染性比较准确的方法。将适当浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的玻璃平皿或扁瓶中，当病毒吸附于细胞上后，再在其上复盖一层溶化的半固体营养琼脂层，待凝固后，孵育培养。当病毒在细胞内复制增殖后，每一个感染性病毒颗粒在单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用中性红等活性染料着色，在红色的背景中显示出没有着色的“空斑”，清楚可见。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴度可以用每毫升空斑形成单位(PFU)来表示。用12孔板培养Vero细胞至单层，向各孔中加入加入900ul无血清培养基第一孔加入100ul细胞毒悬液，做10个稀释度，于37℃二氧化碳培养箱中放置48小时后观察细胞病变，每块板留一孔阴性对照，即不加入病毒液。37℃培养1.5h，加入混合好的含1％琼脂糖DMEM 1ml/孔，37℃培养72h。每孔用4％甲醛溶液250ul固定4-6h，将琼脂甩出，自来水冲洗干净(动作轻柔，防止细胞脱落)；每孔加入0.5％结晶紫乙醇溶液200ul，染色15min，自来水洗净。挑选出现20-100个空斑的细胞孔进行计数，PFU/ml＝空斑数×病毒稀释倍数÷接种体积(ml)。

TCID₅₀计算方法：制备96孔板单层细胞，将病毒做10倍系列稀释，横向接种单层细胞板，每稀释度重复3孔，每日观察细胞病变，记录高于50％和低于50％病变孔的病毒稀释度，计算比距，获得TCID₅₀结果。计算公式为：(高于50％的病变率-50％)/(高于50％病变率-小于50％病变率)＝比距；比距与接近50％病变率的病毒的稀释度的指数相加，即得指数。

血凝(HA)试验：NDV与AIV病毒或病毒的血凝素，能够选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验(HA)。在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加25ul生理盐水，于左侧第1孔加25ul病毒液尿囊液，混合均匀后，吸25ul至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃25ul；第12孔为红细胞对照。自右至左依次向各孔加入1％鸡红细胞悬液25ul，在振荡器上振荡，室温下静置后10min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100％凝集，不凝集的红细胞沉于孔底呈点状。以100％凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。

实施例1 HHT对VSV病毒毒力的影响

用0.5MOI的VSV感染HeLa细胞，1.5h后分别向细胞培养液中加入不同浓度的HHT和利巴韦林(Ribavirin)，感染24h后冻融三次，测定病毒毒力，结果表明，相较于利巴韦林，HHT有效抗病毒浓度少1000倍(图2A)。

用1MOI的VSV感染HeLa细胞，1.5h后向细胞培养液中加入不同浓度的HHT，病毒感染36h后收集细胞。采用免疫印迹法检测病毒蛋白G蛋白的表达，结果表明，HHT显著抑制G蛋白表达且呈剂量依赖性。用0.5MOI的VSV感染HeLa细胞，1.5h后加浓度为50nM HHT，分别在8h、24h、36h收集细胞样品进行免疫印迹检测病毒蛋白G蛋白的表达，结果表明，HHT显著抑制病毒G蛋白的表达(图2B)。

用0.5MOI的VSV感染HeLa细胞，分别在病毒感染前2h，感染同时，感染后2h、6h、8h分别向细胞培养液中加入50nM HHT，感染后48h收集细胞，采用免疫印迹法检测病毒蛋白G蛋白的表达，或者冻融三次测定病毒毒力，结果表明，病毒感染前2h加HHT不影响病毒蛋白表达及病毒滴度，感染同时及感染后2h、6h、8h加50nM HHT显著抑制病毒蛋白表达及病毒滴度，感染同时加HHT抑制病毒滴度效果最显著(图2C)。

实施例2 HHT对NDV病毒毒力的影响

用0.1MOI的GFP-NDV(绿色荧光蛋白标记的NDV)感染HeLa细胞，1.5h后向细胞培养液中加入不同浓度的HHT，HHT的作用浓度由低到高依次为5、10、25、50、100nM。病毒感染24h后，在荧光显微镜Olympus IX73观察，用CellSens软件成像，结果表明，HHT显著抑制GFP-NDV感染且呈剂量依赖性(图3A)。

用0.1MOI的GFP-NDV感染HeLa细胞，1.5h后向细胞培养液中加入不同浓度的HHT，病毒感染36h后收集细胞，免疫印迹法检测病毒蛋白NP表达，结果表明，HHT显著抑制NDV蛋白表达且呈剂量依赖性(图3B)。

用0.1MOI的GFP-NDV感染HeLa细胞，1.5h后向细胞培养液中加入不同浓度的HHT，病毒感染24h后，在荧光显微镜Olympus IX73观察，统计HHT对GFP-NDV感染的抑制率，结果表明HHT对GFP-NDV的半数抑制率为18nM(图3C)。

用50PFU的GFP-NDV接种11日龄SPF鸡胚，实验组注射0.07、0.1、0.2mg/kg的HHT，36h、48h收获鸡胚，4度放置6h后，收集尿囊液，测定血凝效价，统计病毒滴度，结果显示，相较于实验组，0.2mg/kg实验组显著抑制NDV血凝效价(图3D)。

用10000PFU的NDV接种40日龄SPF鸡，实验组肌肉注射0.2mg/kg的HHT，连续注射3天，接种病毒后第7天取鸡全血、肝、肺，RT-PCR法检测全血中病毒蛋白N的mRNA水平，统计数据，结果显示，HHT显著抑制NDV在鸡体内的增殖(图3E)。

实施例3 HHT对PEDV病毒毒力的影响

Vero细胞感染0.1MOI的PEDV，1.5h后向细胞培养液中加入不同浓度的HHT，48h后收获细胞，免疫印迹法对病毒蛋白表达分析，结果表明，100nM HHT的抑制率为80％(图4A)。

Vero细胞感染0.1MOI的PEDV，分别于PEDV感染前2h、感染同时、感染后2h、感染后6h加50nM的HHT，感染48h后，间接免疫荧光方法检测病毒蛋白N蛋白荧光信号，结果表明，感染前2h加入HHT未显著抑制病毒复制，而感染同时、感染后2h及感染后6h加HHT显著抑制病毒复制(图4B)。

Vero细胞感染0.1MOI的PEDV，感染同时加不同剂量的HHT，感染48h后，测定病毒滴度，结果表明，500nM HHT完全抑制病毒复制(图4C)。

3日龄仔猪感染PEDV，实验组与对照组各三组，实验组感染同时给药HHT，浓度为0.05mg/kg，连续注射2天，5天后采全血进行RT-PCR检测，测定血清内病毒蛋白NP的mRNA水平，结果显示，HHT显著抑制PEDV在仔猪体内的增殖(图4D)。

实施例4 HHT对HSV-1病毒毒力的影响

用0.1MOI的HSV-1感染Vero细胞，1.5h后向细胞培养液中加入不同浓度的HHT，病毒感染48h后收集细胞，免疫印迹法检测病毒蛋白ICP8蛋白的表达，以及细胞病变，结果表明，HHT显著抑制HSV-1病毒蛋白表达与病毒粒子产生，且呈剂量依赖性(图5)。

实施例5 HHT对AIV病毒毒力的影响

用50PFU的AIV接种11日龄SPF鸡胚，实验组注射0.1mg/kg的HHT，48h、72h收获鸡胚，4度放置6h后，收集尿囊液，测定血凝效价，统计病毒滴度，结果表明，HHT可减少AIV血凝效价10倍(图6)。

实施例6 HHT对PRRSV病毒毒力的影响

用0.1MOI的PRRSV感染Marc145细胞，1.5h后向细胞培养液中加入不同浓度的HHT，病毒感染36h后收集细胞，免疫印迹法检测病毒蛋白M蛋白的表达，结果表明，HHT显著抑制PRRSV病毒蛋白表达且呈剂量依赖性(图7)。

实施例7 HHT对TGEV病毒毒力的影响

用0.1MOI的TGEV感染PK15细胞，1.5h后向细胞培养液中加入不同浓度的HHT，病毒感染48h后收集细胞，免疫印迹法检测病毒蛋白N蛋白的表达，结果表明，HHT显著抑制TGEV病毒蛋白表达且呈剂量依赖性(图8)。

实施例8 HHT对FMDV病毒毒力的影响

用0.1MOI的FMDV感染PK-15细胞，1.5h后向细胞培养液中加入不同浓度的HHT，病毒感染6h后收集细胞，免疫印迹法检测病毒蛋白VP0、VP1、VP2、VP3蛋白的表达，结果表明，HHT显著抑制FMDV病毒蛋白表达且呈剂量依赖性(图9)。

实施例9 HHT对PRV病毒毒力的影响

0.1MOI的PRV感染Vero细胞，1.5h后向细胞培养液中加入不同浓度的HHT，病毒感染36h后收集细胞，免疫印迹法检测病毒蛋白gC蛋白的表达；感染后48h冻融三次，采用细胞病变法测定病毒毒力，结果表明，HHT显著抑制PRV病毒蛋白表达与病毒粒子产生，且呈剂量依赖性(图10)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.高三尖杉酯碱在制备畜禽用广谱抗病毒制剂中的应用，所述病毒选自水疱性口炎病毒、新城疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、禽流感病毒、人单纯疱疹病毒1型、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒。

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