CN108309989A - 23-羟基白桦酸在制备防治流感药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了中药白头翁提取物23‑羟基白桦酸在制备防治流感药物中的用途。药理学试验表明，23‑羟基白桦酸有效抑制流感病毒在细胞中的增殖，对感染流感病毒小鼠具有显著保护作用，可作为药效成分配以辅助剂制成注射或口服制剂防治流感。

Description

23-羟基白桦酸在制备防治流感药物中的用途
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及23-羟基白桦酸在制备防治流感药物中的用途。
背景技术
流感是由流感病毒引起的一种严重威胁人类的呼吸道传染病，给人类社会造成巨大的损失。流感病毒由于其宿主广泛，易变异，且可跨种传播，其防控成为医学界的难题。近年来流感频繁爆发，2009年猪源性的新型甲型H1N1流感导致全球上万人死亡；1997年高致病性甲型流感病毒H5N1在香港出现，可直接由禽类传染人，具有很高的致死率；2013年在我国华东地区散发的H7N9高致病性禽流感病毒也已导致逾100人死亡。目前，疫苗接种和抗病毒药物分别是预防和治疗流感的主要方法。但甲型流感病毒表面抗原HA和NA较易发生变异，严重制约了疫苗的应用。临床用于防治流感的化学药物主要包括M2离子通道抑制剂(金刚烷胺和金刚乙胺等)、神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦和扎那米韦等)以及利巴韦林等广谱抗病毒药物。但金刚烷胺在临床上应用多年，已导致普遍的严重耐药性；奥司他韦和扎那米韦耐药性的报道也日益增多。因此，如何防治流感是目前亟待解决的问题。我国的中药资源丰富，运用历史悠久，从中药资源中寻找潜在的抗病毒药物已成为热点。
23-羟基白桦酸(23-hydroxybetulinic acid，23-HBA)是从传统中药白头翁中提取的三萜皂苷元，分子式为C30H48O4，分子量为472.70，分子结构如下所示：
已有文献报道，23-羟基白桦酸对多种肿瘤细胞具有显著抑制作用。中国发明专利CN1491651A公开了23-羟基白桦酸对小鼠黑色素瘤、脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、肺癌、肝癌以及爱滋病的预防和治疗有作用；中国发明专利CN03152904.6公开了23-羟基白桦酸可作为脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、肺癌、肝癌细胞及HIV病毒的抑制剂。中国发明专利CN102108092A公开了23-羟基白桦酸衍生物的制备方法及其可用于抗肿瘤和作为肿瘤耐药逆转剂的用途。
有关23-羟基白桦酸抗流感病毒作用及其在制备防治流感药物中的应用未见报道，也未见相关的专利公开。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供23-羟基白桦酸在制备防治流感药物中的用途。为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种结构如下的23-羟基白桦酸在制备预防和治疗人及动物流感的药物中的用途，所述23-羟基白桦酸的分子式为C30H48O4，分子量为472.70。
一种23-羟基白桦酸在制备防治流感药物中的用途，其实施步骤是：(1)运用MTT法测定23-羟基白桦酸对A549细胞的毒性，确定安全浓度；(2)通过建立流感病毒感染A549细胞模型，评价23-羟基白桦酸对感染病毒的A549细胞的保护效果及对病毒在细胞中增殖的抑制作用。评价手段包括病毒滴度测定、实时荧光定量PCR试验(Real-time PCR)以及蛋白免疫印迹试验(Western blot)等；(3)通过建立流感病毒感染小鼠模型，评价23-羟基白桦酸对感染病毒小鼠的保护作用。
本发明通过体内外试验发现23-羟基白桦酸具有明显抑制流感病毒复制的作用，为其在制备防治流感药物上的应用提供了有力支持。
进一步地，所述用途为以23-羟基白桦酸作为有效成分配以辅助剂制成注射液、片剂、胶囊剂或颗粒剂。
进一步地，所述流感为H1N1亚型、H9N2亚型、H5N1亚型、H3N2甲型或H7N9等甲型流感病毒引起的流感。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)23-羟基白桦酸来源于临床常用的中药白头翁，对人及动物安全。
(2)23-羟基白桦酸在白头翁中含量高达1.0％～1.5％，提取制备工艺成熟，可以为抗流感药物的制备提供充足原料。
附图说明
图1为实施例1中23-羟基白桦酸对细胞内H1N1亚型流感病毒增殖的抑制作用；
图2是实施例2中用MTT法测定23-羟基白桦酸对A549细胞毒性的试验结果；
图3是实施例3中用实时荧光定量PCR测定不同浓度的23-羟基白桦酸在细胞中对流感病毒RNA增殖的抑制作用；
图4是实施例4中Western Blot分析不同浓度的23-羟基白桦酸在细胞中对流感病毒NP蛋白合成的抑制作用；
图5是实施例6中23-羟基白桦酸对感染H1N1亚型流感病毒小鼠的保护作用。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明实施例中所选用的A549细胞和流感病毒H1N1亚型不对发明所包括的范围做任何限定。
本发明23-羟基白桦酸可以通过以下方法制备得到：(1)取干燥的白头翁根25kg，经10倍量70％乙醇冷浸过夜后，加热回流3次，每次3小时，合并三次提取液，200目筛滤过，所得滤液经减压浓缩回收乙醇得流浸膏9.8kg；(2)将提取得到的浸膏用水分散，分别用石油醚和氯仿萃取，萃取液经减压浓缩，得氯仿提取物256g；(3)氯仿萃取物经硅胶和Sephadex LH-20反复柱层析，1∶1的氯仿-甲醇洗脱，得23-羟基白桦酸236mg。
实施例1：23-羟基白桦酸在A549细胞中对H1N1亚型流感病毒增殖的抑制作用
待A549细胞生长至单层后，加入已用基础培养基稀释好的H1N1毒株病毒液(含100TCID50)，100μL/孔，37℃孵育2h，弃去病毒上清，磷酸盐缓冲液(PBS液)清洗一遍，分别加入3.75，7.5及15μg/ml的23-羟基白桦酸，100μL/孔。实验同时设正常对照组(不加受试药物，不加流感病毒液)与流感病毒对照组(不加受试药物)，每个受试浓度设三个平行。细胞继续培养，分别至8h、24h、48h和72h终止培养，观察其病变状况后，于-80℃和4℃反复冻融细胞板三次，使得细胞充分裂解，致使细胞内的病毒全部释放进入细胞上清，然后收集各孔上清液。
根据终点稀释法(Geiler J，Michaelis M，Naczk P，et al.N-acetyl-L-cysteine(NAC)inhibits virus replication and expression of pro-inflammatory moleculesin A549cells infected with highly pathogenic H5N1influenza A virus[J].BiochemPharmacol，2010，79(3)：413-420.)，将所收集的细胞上清用基础培养基10倍倍比稀释，加入生长至单层的MDCK细胞，继续置于培养箱内培养。培养72h后，观察其CPE程度。细胞出现病变程度按以下6级标准记录：“-”为细胞生长正常，无病变出现；“±”为细胞病变少于整个单层细胞的10％；“+”为细胞病变约占整个单层细胞的25％；“++”为细胞病变约占整个单层细胞的50％；“+++”为细胞病变约占整个单层细胞的75％；“++++”为细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。用Reed-Muench法计算出各个时间段内各试验组细胞培养液中的病毒滴度(TCID50)值。实验结果如图1所示，Vehicle代表病毒感染对照组。图中，与病毒感染对照组比较，“*”表示差异显著(P＜0.05)。从图1中可看到，本发明的23-羟基白桦酸对细胞内H1N1亚型流感病毒增殖有显著的抑制作用。
实施例2：23-羟基白桦酸对A549细胞毒性的试验
待A549细胞在96孔细胞培养板生长至单层后，弃去培养基，用PBS(磷酸盐缓冲液)清洗2遍，加入100μL的DMEM细胞维持液稀释好的不同浓度的23-羟基白桦酸，每个浓度做六个复孔。置于37℃，5％CO2环境的培养箱中避光培养48小时。弃20μl上清，每空加20μlMTT溶液，细胞培养箱内继续培养4h。终止培养，小心吸取取孔内培养液，弃去。每孔入150μl二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，摇床低速震荡10min，使甲臜结晶充分溶解。使用酶联免疫检测仪在490nm处测量吸光值。从图2可以看出，23-羟基白桦酸在15μg/mL的浓度下不会对A549细胞的生长产生影响。
实施例3：23-羟基白桦酸在A549细胞中对流感病毒RNA增殖的抑制作用
待A549细胞在6孔细胞培养板生长至单层后，弃去培养基，用PBS(磷酸盐缓冲液)清洗2遍，加入用DMEM细胞维持液稀释好的含100TCID50的H5N1病毒，1ml/孔，37℃孵育2h，弃去病毒上清，PBS清洗2遍，分别加入15，7.5，3.75μg/mL的23-羟基白桦酸，2mL/孔。试验同时设正常对照组(不加受试药物，不加H5N1)与H5N1对照组(不加受试药物)，每个受试浓度设三个平行。细胞继续37℃培养，至感染后48h终止培养。观察其病变状况后，于-80℃和4℃反复冻融细胞板三次，使细胞充分裂解，致使细胞内的病毒全部释放进入细胞上清，然后收集各孔上清液。用总RNA极速抽提试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)推荐的操作方法，将收集到的细胞上清液进行总RNA抽提。提取RNA后立即进行反转录成cDNA，以该cDNA为模板，GAPDH为内参基因，Real Time PCR检测H5N1的NP基因的拷贝数；以正常对照组做参照，评价NP mRNA的变化情况。
H5N1NP基因上下游引物序列：
NP-F：5′-GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3′
NP-R：5’-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3’
GAPDH基因上下游引物序列：
GAPDH-F：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’
GAPDH-R：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’
试验结果如图3所示，与病毒感染对照组比较，“*”表示差异极显著(P＜0.05)，“**”表示差异极显著(P＜0.01)，“***”表示差异极显著(P＜0.001)。本发明的药物23-羟基白桦酸在3.75～15μg/mL的浓度范围内，对A549细胞内流感病毒的RNA增殖有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。
实施例4：Western Blot分析不同浓度23-羟基白桦酸在A549细胞中对流感病毒NP蛋白合成的抑制作用
A549细胞感染流感病毒、加入药物的步骤与实施例2相同，细胞培养至感染后48h终止培养，弃去上清液，用PBS洗2遍。将细胞培养板放置在冰上，加入RIPA裂解液150μL/孔，经吹打后将液体吸出至离心管中，12000转/分钟离心5分钟，将上清吸出至另一干净的管中备用。用BCA法测定各样品蛋白浓度后，采用Western Blot检测流感病毒的NP蛋白和内参蛋白GAPDH的条带。试验结果如图4所示，本发明的药物23-羟基白桦酸在3.75～15μg/mL的浓度范围内，对A549细胞内流感病毒的NP蛋白合成有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。
实施例5：以23-羟基白桦酸为有效成分制备抗流感病毒药物：注射油乳剂
油乳剂注射液的配制：3g本发明的药物23-羟基白桦酸溶解于10mLDMSO中，加40mL橄榄油，充分混匀，加3mL的Tween 80，再次混匀，缓慢加入47mL纯净水，边加边高速搅拌(6000rpm/min)，搅拌同时体系进行冰浴冷却，搅拌10min，乳液分装至5mL的安瓿瓶中，熔封，灭菌，即制得本发明药物的油乳剂注射液。该注射液药物含量为3％，使用前反复摇匀复乳。
实施例6：23-羟基白桦酸对感染H1N1亚型流感病毒小鼠的保护作用
按实施例5的步骤制备23-羟基白桦酸注射油乳剂。18-20g BALB/c雌性小鼠40只分成4组，每组10只，滴鼻感染1.5倍半数致死剂量(MLD50)的H1N1亚型流感病毒。4组的药物剂量分别为正常对照组(不含药物，含相同剂量的DMSO及橄榄油混悬液注射液)，病毒感染对照组、25mg/kg/d 23-羟基白桦酸皮下注射组及50mg/kg/d 23-羟基白桦酸皮下注射组。每天给药1次，感染前4小时给药，连续给药7天，连续观察21天。23-羟基白桦酸对感染H1N1亚型流感病毒小鼠的保护率见图5。从图5可看到，本发明药物23-羟基白桦酸对感染H1N1小鼠有显著的生命保护作用。

Claims (3)

1.一种结构如下的23-羟基白桦酸在制备防治流感药物中的应用：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以23-羟基白桦酸作为有效成分配以辅助剂制成的注射液、片剂、胶囊剂或颗粒剂等剂型在防治流感上的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述流感为H1N1亚型、H9N2亚型、H5N1亚型、H3N2甲型或H7N9等甲型流感病毒引起的流感。
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