WO2005011717A1 - Utilisation de l’acide betulinique ou d’un extrait vegetal titre en acide betulinique seul ou en association pour des applications cosmetiques, nutraceutiques, veterinaires et pharmaceutiques - Google Patents

Utilisation de l’acide betulinique ou d’un extrait vegetal titre en acide betulinique seul ou en association pour des applications cosmetiques, nutraceutiques, veterinaires et pharmaceutiques Download PDF

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triterpenes
cosmetic
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Philippe Bernard
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Definitions

  • betulinic acid or a plant extract titrated in betulinic acid alone or in combination for cosmetic, nutraceutical, veterinary and pharmaceutical applications.
  • Psophocarpus tetragonolobus (L.) is a protein-rich plant, cultivated in tropical regions (India, Vietnam 7) for its nutritive properties; making it a plant devoid of any toxicity, since it is food. This plant is native to Papua New Guinea and the Indonesian islands. We observed the significant presence of saponosides and triterpenes in Psophocarpus tetragonolobus. Indeed, we record not less than 5% of triterpenes compared to the dry matter of a total ethanolic extract of Psophocarpus tetragonolobus.
  • the present invention relates to a composition of total or enriched extracts, from Fabaceae, in particular of the genus Psophocarpus, such as Psophocarpus tetragonolobus, for dermo-cosmetic, nutraceutical, veterinary and pharmaceutical preparations and having anti-inflammatory, anti-viral properties. and anti-carcinogens.
  • These compositions according to the invention are particularly suitable for sensitive skin (redness, irritation) thanks to the anti-inflammatory properties which provide a soothing and protective role in the skin.
  • the anti-carcinogenic properties of certain triterpenes allow these extracts to be used as protective agents for the body. Let us cite for example the skin in the event of solar burns.
  • the present invention also relates to the use of total extract or enriched in triterpenes of Psophocarpus sp, as anti-inflammatory, anti-viral and anti-carcinogenic agents, as well as 'a cosmetic, dermatological or pharmaceutical composition comprising one of the said agents and their use as protective agents, as well as for hair and joint problems.
  • Another object of the invention is also to provide a process for obtaining extracts of Psophocarpus sp, enriched in variable proportions according to the type of extract, in active principle of triterpene type for the properties mentioned above.
  • the term “in vitro culture” means all of the techniques known to those skilled in the art which artificially make it possible to obtain a plant or part of a plant.
  • the term “in vivo culture” means all of the culture techniques which make it possible to obtain a plant or part of a plant.
  • the extract can be an organ extract (root, stem, leaf, bark), or even organ cells, of at least one plant of the genus Psophocarpus sp of the family Fabaceae, or an extract of undifferentiated cells of at least one such plant.
  • Any extraction or purification method known to a person skilled in the art can be used according to the invention such as maceration techniques or by other methods such as, for example, simple decoction, leaching, extraction under reflux, extraction by means of ultrasound or microwaves or finally against the current techniques, with the use of various solvents. Mention may in particular be made of alcoholic extracts, in particular ethanolic extracts, propylene glycol, etc. and hydroalcoholic extracts, but also beautiful, ketones, esters, ethers, polyols, chlorinated solvents and mixtures of at least two of the above solvents.
  • the process for obtaining extracts of Psophocarpus sp are characterized in that the following successive operations are carried out: Total extract: In a first step, the fresh plant material (root for example) is ground , frozen or dry in an aqueous solution, in a second step, the aqueous solution is filtered which is finally sterilized. This aqueous solution corresponds to the extract. This extract can then be dried (evaporation, lyophilization). In a variant of this process, an alcoholic solution is used in the first step (methanob ethanob ..) or hydroalcoholic. The extract thus obtained can be evaporated to dryness, the residue being used as it is or after purification.
  • aqueous, alcoholic or hydroalcoholic solutions can also be subjected to acid hydrolysis in order to cleave the saponosides and recover only the corresponding aglycones.
  • the subject of the invention is therefore the use alone or in combination of an extract of Psophocarpus sp from the Fabaceae family as an anti-inflammatory, anti-viral and anti-carcinogenic agent in dermocosmetic and pharmaceutical compositions.
  • This agent is to protect tissues and organs against inflammatory, infectious and tumor problems, since such extracts contain phosphohpase A2 inhibitors, belonging to the phytochemical family of saponosides and more specifically triterpenes.
  • Selective extract variably enriched in triterpenes corresponds to the industrial extraction of betulinic acid from 500 kg of Psophocarpus tetragonolobus root. The procedure and conditions are as follows: - Grind the asparagus pea root (Psophocarpus tetragonolobus) until a particle size of less than 1 mm is obtained.
  • the quantity of triterpene extract obtained represents approximately 20 kilograms, ie a production yield of the order of 4%.
  • Pure molecules The extracts, total or enriched in triterpenes, can be fractionated by chromatography in order to separate the different triterpenes, such as betulinic acid. These fractions make it possible to extract pure compounds from plant material. These compounds can also be used in dermocosmetic and pharmaceutical preparations for the properties claimed previously. Synthetic and / or hemi-synthetic derivatives can also be claimed for these same properties. Such synthetic derivatives and semi-synthetic find all their interest in the case of diseases where the molecule must be optimized in order to overcome certain natural barriers. These three methods of preparation, from biological material, are an integral part of the invention.
  • the invention can be used as it is in liquid or powder form after drying by atomization, evaporation or lyophilization, or encapsulated in liposomes or other vectors and supports for better homogeneity of the cosmetic preparation and better diffusion of the active product on the skin.
  • These extracts and molecules are particularly interesting for anti-inflammatory and anti-carcinogenic problems.
  • extracts and / or pure molecules act, in a dose-dependent manner, as phosphohpase A2 inhibitors and also inhibit the production of interleukins and the activity of macrophages.
  • extracts and / or molecules is meant extracts and / or triterpenes from the genus Psophocarpus.
  • extracts and / or molecules according to the present invention can be formulated in galenical form: creams, gels, lotions, milks, O / W and W / O emulsions, solutions, ointments, sprays, body oils, lotions capillaries, shampoos, aftershave lotions, soaps, lip protector sticks, makeup sticks and pencils at levels of 0.01 and 5% by weight, preferably between 0.1 and 2.5% in powder form and at levels between 0.01 and 25%, preferably between 0.5 and 10% in encapsulated form.
  • the extracts and / or molecules are mixed with.
  • excipients generally used in the cosmetic technique.
  • the form of the cosmetic composition of the present invention could be a cream in which the extracts and / or molecules are associated with the excipients commonly used in cosmetology.
  • the cosmetic compositions may also be presented in the form of a gel in appropriate excipients such as cellulose esters or other gelling agents, such as carbopol, guar gum, etc.
  • the cosmetic compositions according to the invention can also take the form of a lotion or solution in which the extracts and / or molecules are in encapsulated form.
  • the microspheres according to the invention can for example consist of fatty substances, agar and water.
  • the extracts and / or molecules can be incorporated into vectors such as liposomes, glycospheres, in chylomicrons, macro-, micro-, nano-particles as well as macro-, micro- and nanocapsules and also be adsorbed on organic polymers. powdery, talcs, bentonites and other mineral supports. These emulsions have good stability and can be stored for the time necessary for use at temperatures between 0 and 50 ° C. without sedimentation of the constituents or separation of the phases.
  • the cosmetic compositions of the invention may also contain additives or adjuvants customary in cosmetology, such as for example antibacterial agents or perfumes but also extraction and / or synthetic lipids, gelling and viscosifying polymers, surfactants and emulsifiers, hydro or liposoluble active ingredients, plant extracts, tissue extracts, marine extracts, synthetic active ingredients.
  • additives or adjuvants customary in cosmetology such as for example antibacterial agents or perfumes but also extraction and / or synthetic lipids, gelling and viscosifying polymers, surfactants and emulsifiers, hydro or liposoluble active ingredients, plant extracts, tissue extracts, marine extracts, synthetic active ingredients.
  • the cosmetic or dermocosmetic use of extracts and / or molecules includes all body and skin care including sun, protective and bronzing products, anti-aging, anti-seborrheic, tonic products, products providing improvement of the appearance of the skin including acne treatment, redness of the skin, treatment of the scalp and that of hair loss.
  • the cosmetic compositions of the present invention may also comprise other complementary active principles chosen for their action, for example for sun protection, the anti-wrinkle effect, the anti-radical and antioxidant activity, the anti-irritant activity, the cellular nutrition, cellular respiration, hydration and cellular regeneration, anti-seborrheic treatments, as well as other active ingredients having an action on skin tone, protection of the hair.
  • complementary active principles these are generally present in the composition at a concentration high enough for them to be able to exercise their activity.
  • the cosmetic compositions of the present invention are preferably to be used daily by applying them one or more times a day.
  • the cosmetic compositions of the present invention are very well tolerated, they exhibit no phototoxicity and their application to the skin, for prolonged periods of time, does not imply any systemic effect.
  • Extracts and / or triterpenes from the genus Psophocarpus can also be used in dermocosmetic products for their anti-inflammatory, anti-viral and anti-carcinogenic (protective) activity, in liquid, powder, paste or emulsion form, alone or in combination with other substances.
  • the extracts and / or triterpenes from the genus Psophocarpus according to the present invention can be formulated in galenical form: paste, emulsion, sprayer in an amount between 0.01 and 25% by weight.
  • the extracts and / or triterpenes from the genus Psophocarpus are mixed with excipients.
  • the extracts and / or triterpenes from the genus Psophocarpus according to the present invention can be used for the manufacture of medicaments intended for the treatment of certain inflammations, itching, irritations, chronic redness, persistent irritations and itching, such as psoriasis , as well as conditions related to inflammation of the skin, cartilage tissue and Crohn's disease. They can also be used, in the form of a cream, ... in order to combat inflammatory joint disturbances caused by polyarthritis and other inflammatory conditions of the cartilage. These extracts can also be applied as a protector against carcinogenic pathologies, affecting cellular deregulations such as melanoma and other cancers as well as the treatment of various viral attacks.
  • the dermopharmaceutical compositions using the present invention may contain complementary active principles, present in a sufficiently large amount in the preparation so that they can exercise their activity.
  • the synthesis and hemisynthesis of these triterpene derivatives can increase the biophysico-chemical qualities of such compounds in order to make them more permeable to. different biological barriers of the organism. This is the case for example with the passage of the blood-brain barrier in the case of claims for protective properties of the central nervous system. All cosmetic formulations incorporating. such substances are claimed for the same properties.
  • the use of such extracts can also extend to nutraceuticals since it is originally a food plant, which good would use for its anti-inflammatory properties.
  • the following examples illustrate the invention without, however, limiting its scope.
  • the results obtained are as follows: Volume of extract added Inhibition of PLA 2 (%) in the enzymatic solution Total extract of extract enriched with final Psophocarpus Psophocarpus tetragonolobus tetragonolobus 400 ⁇ l 100 100 200 ⁇ l 80 100 50 ⁇ l 40 90
  • the extract was produced by maceration, in boiling alcohol for 1 hour, of 10 g of ground plant in 200 ml of ethanol. A concentration to 20 ml was then carried out. The dry matter yield is 1.5%. Nature of the cells used The secretion of cytokines was assayed in incubation supernatants of mononuclear peripheral venous blood cells (PBMCs) from healthy human donors. All blood samples were taken at the Hepato-Gastroenterology and Nutritional Assistance Service of France University Hospitals (Hautepierre Hospital), after approval of the study protocol concerning the effects of celastrol by the CCPPRB n ° l d 'Alsace.
  • PBMCs peripheral venous blood cells
  • the mononuclear cells are then separated by centrifugation on Ficoll-Histopaque with density 1.076 (Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, France) (30 min at 400 g) according to the B0yum technique [1], then, after two successive washes, resuspended in RPMI medium 1640 (Gibco BRL) supplemented with 10% (volume / volume) of heat-inactivated fetal calf serum (SVF) (56 ° c, 30 min, Gibco BRL), and antibiotics (penicillin / streptomycin 100 IU / ml ).
  • RPMI medium 1640 Gibco BRL
  • SVF heat-inactivated fetal calf serum
  • the cells are incubated, at the rate of 2 ⁇ 10 5 cells / well of the 24-well plates (Corning Inc., New York, USA), at 37 ° C. in a humidified incubator (air 95% - CO2 5%), in the presence or in the absence of the compounds studied diluted in DMSO (dimethyl sulfoxide, Sigma; maximum: 1% (v / v) per well), with or without activation by lipopolysaccharide (LPS Salmonella abortus equi, 5 ⁇ g / ml) (Sigma). After 24 hours of incubation, the plates are centrifuged (15 min at 200 g), and the supernatants removed and then frozen at -80 ° C until the Elisa assay.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Sigma maximum: 1% (v / v) per well
  • lipopolysaccharide LPS Salmonella abortus equi, 5 ⁇ g / ml
  • TNF- ⁇ concentrations in culture media are determined by specific Elisa enzyme immunoassays. Briefly, 96-well plates (Corning Inc.) are treated with 50 ml / well of a solution of the first monoclonal capture antibody (Antibody Solutions, Flalf Moon Bay, CA, USA) (5 ⁇ g / ml) diluted in PBS / thimerosal 0.05% (weight / volume) (Sigma). After overnight incubation, hermetically sealed and at 4 ° C., the plates are washed three times and the non-specific binding sites saturated by incubation for 1 hour at room temperature in the presence of PBS / 5% milk (weight / volume). .
  • the first monoclonal capture antibody Antibody Solutions, Flalf Moon Bay, CA, USA
  • O-phenylenediamine dichlorate O-phenylenediamine dichlorate
  • the reading is carried out by measuring the optical density (OD) at 450 nm with an absorption spectrophotometer (reference filter: 620 nm).
  • the concentration of cytokines is determined by interpolation from the standard range, and the results normalized with respect to the control.
  • the ethanolic extract of Psophocarpus has shown in a dose-dependent manner an inhibitory action on the secretion of TNF- ⁇ by the human monocytic line THP-1 in response to activation by bacterial LPS after 24 hours of in vitro incubation.
  • a CI 5 o could be evaluated at 13 ⁇ g / ml. No cellular toxicity was observed even at the highest concentrations.
  • the inflammation itself is induced by the injection of carrageenan, subcutaneously, into the rat's paw, one hour after administration, if necessary, of the drug of interest to be studied. (IP injection, 10 mg / kg).
  • IP injection 10 mg / kg.
  • an edema develops and the inflammation induced by carrageenan is then followed by a simple measurement of the diameter of the paw. It is thus possible to determine, in less than 24 hours, whether one of the compounds reduces inflammation, and therefore its activity in vivo.
  • This work also made it possible to evaluate, for each of the molecules studied, a possible toxic activity in animals, information which is impossible to obtain in vitro.
  • Psoriasis is a complex disease that combines a significant inflammatory component with a proliferative component of skin cells. The idea is therefore to combine with psophocarpus extract or pure betulinic acid, colchicine or a titrated plant extract, in colchicine and a phosphodiesterase 4 inhibitor, such as papaverine, e-viniferine or else plant extracts known to inhibit phosphodiesterases, such as Ginko biloba, hypericum ...
  • a phosphodiesterase 4 inhibitor such as papaverine, e-viniferine or else plant extracts known to inhibit phosphodiesterases, such as Ginko biloba, hypericum ...
  • Betulinic acid alone and the extract of psophocarpus have demonstrated a significant action against psoriasis.
  • betulinic acid with colchicine and a natural or synthetic phosphodiesterase 4 inhibitor, the effects are advantageously demonstrated. This amounts to reinforcing the anti-inflammatory and anti-proliferative action linked to the combination of these molecules which act by different but complementary biochemical mechanisms.

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'extrait total, ou enrichi en triterpènes, de Léguminosées, comme Psophocarpus tetragonolobus et espèces apparentées, comme agents antiviraux, antiinflammatoires et anticarcinogènes ainsi qu'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique comprenant au moins l'un desdits agents.

Description

Utilisation de l'acide bétulinique ou d'un extrait végétal titré en acide bétulinique seul ou en association pour des applications cosmétiques, nutraceutiques, vétérinaires et pharmaceutiques.
Psophocarpus tetragonolobus (L.) est une plante riche en protéine, cultivée dans les régions tropicales (Inde, Vietnam...) pour ses vertus nutritives ; ce qui en fait une plante dénuée de toute toxicité, puisqu'elle est alimentaire. Cette plante serait originaire de Papouasie-Nouvelle Guinée et des îles indonésiennes. Nous avons observé la présence significative de saponosides et de triterpènes dans Psophocarpus tetragonolobus. En effet, nous enregistrons pas moins de 5% de triterpènes par rapport à la matière sèche d'un extrait éthanolique total de Psophocarpus tetragonolobus.
Par ailleurs, nous avons récemment montré que certains triterpènes sont de bons inhibiteurs d'une enzyme, la phospholipase A2 (Bernard P. et al, 2001, Phytochemistry, 58, 865). Cette enzyme est largement connue comme étant impliquée dans la dégradation des lipides membranaires, notamment l'arachidonate, précurseur de molécules impliquées dans la cascade de l'inflammation (Dennis E. A., Phospholipases. In : Boyer P. D. (ed), The Enzymes (troisième édition), Académie press, 1983). La présente invention concerne une composition d'extraits total ou enrichi, à partir de Fabacées, notamment du genre Psophocarpus, comme Psophocarpus tetragonolobus, pour des préparations dermo-cosmétiques, nutraceutiques, vétérinaires et pharmaceutiques et ayant des propriétés anti-inflammatoires, anti-virales et anti- carcinogènes. Ces compositions selon l'invention sont particulièrement appropriées pour les peaux sensibles (rougeurs, irritations) grâce aux propriétés anti-inflammatoires qui procurent un rôle apaisant et protecteur au niveau de la peau. Les propriétés anti- carcinogènes de certains triterpènes permettent d'utiliser ces extraits comme agents protecteurs de l'organisme. Citons par exemple la peau en cas de brûlures solaires.... La présente invention concerne également l'utilisation d'extrait total ou enrichi en triterpènes de Psophocarpus sp, comme agents anti-inflammatoires, anti-viraux et anti- carcinogènes, ainsi qu'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique comprenant l'un des dits agents et leur utilisation comme agents protecteurs, ainsi que pour les problèmes capillaires et liés aux articulations. Un autre but de l'invention est également de fournir un procédé d'obtention d'extraits de Psophocarpus sp, enrichis dans des proportions variables selon le type d'extrait, en principe actif de type triterpènes pour les propriétés mentionnées précédemment. Ainsi, trois formules d'extraction/purification peuvent être retenues : (i) un extrait total de la plante, (ii) un extrait visant à concentrer les triperpènes et enfin, (iii) l'obtention de triterpènes pures. Chacun de ces trois produits revendique les mêmes applications biologiques, puisque quelque soit la formule, la phospholipase A2 sera inhibée. Par la suite, le terme « extrait de Psophocarpus sp », doit s'entendre comme « extrait de cellules de Psophocarpus sp » et plus précisément comme « extrait de cellules d'au moins un végétal du genre Psophocarpus sp de la famille des Fabacées ». Ledit matériel peut être obtenu par culture in vitro ou in vivo. Par culture in vitro, on entend l'ensemble des techniques connues de l'homme du métier qui permettent de manière artificielle l'obtention d'un végétal ou d'une partie d'un végétal. Par culture in vivo, on entend l'ensemble des techniques de cultures qui permettent d'obtenir un végétal ou une partie d'un végétal. Ainsi, l'extrait peut être un extrait d'organe (racine, tige, feuille, écorce), voire de cellules d'organe, d'au moins une plante du genre Psophocarpus sp de la famille des Fabacées, ou encore un extrait de cellules indifférenciées d'au moins une telle plante. Toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier peut être utilisée selon l'invention telles que des techniques de macération ou par d'autres procédés comme, par exemple, la simple décoction, la lixiviation, l'extraction sous reflux, l'extraction au moyen d'ultrasons ou de micro-ondes ou enfin des techniques à contre-courant, avec l'utilisation de divers solvants. On peut, en particulier, citer les extraits alcooliques, notamment éthanoliques, propylène glycol... et les extraits hydroalcooliques, mais aussi beau, les cétones, les esters, les éthers, les polyols, les solvants chlorés et les mélanges d'au moins deux des solvants précités. Conformément à la présente invention, le procédé d'obtention d'extraits de Psophocarpus sp sont caractérisés en ce que l'on effectue les opérations successives suivantes : Extrait total : Dans une première étape, on broie le matériel végétal (racine par exemple) frais, congelé ou sec dans une solution aqueuse, dans une seconde étape, on filtre la solution aqueuse qui est finalement stérilisée. Cette solution aqueuse correspond à l'extrait. Cet extrait peut ensuite être séché (évaporation, lyophilisation). Dans une variante de ce procédé, on utilise dans la première étape une solution alcoolique (méthanob éthanob ..) ou hydroalcoolique. L'extrait ainsi obtenu peut être évaporé à sec, le résidu étant utilisé tel quel ou après purification. Ces solutions, aqueuses, alcooliques ou hydroalcooliques, peuvent également être soumises à hydrolyse acide afin de cliver les saponosides et ne récupérer que les aglycones correspondants. L'invention a donc pour objet l'utilisation seule ou en association d'un extrait de Psophocarpus sp de la famille des Fabacées comme agent anti-inflammatoire, anti-viral et anti-carcinogène dans des compositions dermocosmétiques et pharmaceutiques. Cet agent a pour objet la protection des tissus et organes contre les problèmes inflammatoires, infectieux et tumoraux, puisque de tels extraits contiennent des inhibiteurs de phosphohpase A2, appartenant à la famille phytochimique des saponosides et plus précisément des triterpènes. Il est à noter que d'autres familles phytochimiques interviennent dans l'effet anti-inflammatoire via l'inhibition d'autres cibles biologiques de l'inflammation comme les cyclooxygénases, les lypoxygénases.... Cela explique que l'extrait total pourra être préféré pour exprimer toute l'activité anti- - inflammatoire de la plante. Extrait sélectif enrichi de façon variable en triterpènes : Cet exemple correspond à l'extraction industrielle de l'acide bétulinique à partir de 500 kg de racine de Psophocarpus tetragonolobus. Le mode opératoire et les conditions sont les suivantes : - Broyer la racine de pois asperge (Psophocarpus tetragonolobus) jusqu'à obtenir une granulométrie inférieure à 1 mm. - Placer le broyât dans le réacteur imprégner de toluène de manière à ce que le toluène recouvre la totalité de la masse. - Laisser macérer 12 heures à température ambiante. - Après macération et filtration, placer le broyât dans l'extracteur en présence de 3 à 5 volumes de toluène. - Porter à ébullition (température ébullition : 111°C) pendant 8 heures. - Filtrer grossièrement puis réaliser une filtration plus fine. - Chasser le toluène. - Procéder à une seconde extraction dans les mêmes conditions que la première. - Mélanger les 2 extraits et sécher dans une étuve à plateaux. - Broyer l'extrait. - Remettre en solution l'extrait (terpénoïdes) dans 10 volumes d'alcool 99°. - Filtrer sous vide pour supprimer les autres composés non solubles. - Evaporer puis sécher.
- Broyer l'extrait triterpénique.
La quantité d'extrait triterpénique obtenue représente environ 20 kilogrammes, soit un rendement de production de l'ordre de 4%. Molécules pures : Les extraits, total ou enrichi en triterpènes, peuvent être fractionnés par chromatographie afin de séparer les différents triterpènes, comme l'acide bétulinique. Ces fractions permettent d'extraire des composés purs à partir de matériel végétal. Ces composés peuvent aussi être utilisés dans les préparations dermocosmétiques et pharmaceutiques pour les propriétés revendiquées précédemment. Des dérivés synthétiques et/ou hémisynthétiques peuvent également être revendiqués pour ces mêmes propriétés. De tels dérivés synthétiques et hémi synthétiques retrouvent tout leur intérêt dans le cas de maladies où la molécule doit être optimisée afin de franchir certaines barrières naturelles. Ces trois modes de préparation, à partir du matériel biologique, font partie intégrante de • ' l'invention. L'invention peut être utilisée telle quelle sous forme liquide ou en poudre après séchage par atomisation, évaporation ou lyophilisation, ou encapsulée dans des liposomes ou autres vecteurs et supports pour une meilleure homogénéité de la préparation cosmétique et une meilleure diffusion du produit actif sur la peau. Ces extraits et molécules sont particulièrement intéressant pour les problèmes anti- inflammatoires et anti-carcinogènes.
De manière surprenante, il a été observé que ces divers extraits et/ou molécules pures agissaient, de manière dose dépendante, comme inhibiteurs de phosphohpase A2 et inhibaient également la production d'interleukines et l'activité des macrophages. On entend par extraits et/ou molécules, les extraits et/ou triterpènes issus du genre Psophocarpus.
Il a été observé que l'activité anti-inflammatoire des extraits et/ou molécules est notable lors d'une association à des substances augmentant la protection cutanée. A titre d'exemple mais de manière non limitative, on peut citer les associations de ces extraits et/ou molécules pures aux mucopolysaccharides, vitamines, céramides, substances antiradicalaires, filtres UN.
L'activité réparatrice des extraits et/ou molécules apparaît particulièrement intéressante quand ils sont associés à des substances ayant un effet cicatrisant (protéines, acide hyaluronique, acides aminés) ou anti-inflammatoire. Pour l'utilisation cosmétique, les extraits et/ou molécules selon la présente invention peuvent être formulés sous forme galénique : crèmes, gels, lotions, laits, émulsions H/E et E/H, solutions, onguents, pulvérisateurs, huiles corporelles, lotions capillaires, shampooings, lotions après-rasage, savons, bâtons protecteur des lèvres, bâtons et crayons pour maquillage à des teneurs de 0.01 et 5% en poids, préférentiellement entre 0,1 et 2,5% sous forme de poudre et à des teneurs comprises entre 0,01 et 25%, préférentiellement entre 0,5 et 10% sous forme encapsulée.
Pour la préparation de ces compositions, les extraits et/ou molécules sont mélangés aux. excipients généralement employés dans la technique cosmétique. La forme de la composition cosmétique de la présente invention pourrait être une crème dans laquelle les extraits et/ou molécules sont associés aux excipients couramment utilisés dans la cosmétologie.
Les compositions cosmétiques peuvent être également présentées sous forme de gel dans ' les excipients appropriés tels que les esters de cellulose ou d'autres agents gélifiants, tels .. que le carbopol, la gomme guar, etc..
Les compositions cosmétiques suivant l'invention peuvent aussi prendre la forme de ι lotion ou solution dans laquelle les extraits et/ou molécules sont sous forme encapsulée. Les microsphères suivant l'invention peuvent par exemple être constituées de corps gras, d'agar et d'eau. Les extraits et/ou molécules peuvent être incorporés dans des vecteurs de type liposomes, glycospheres, dans des chylomicrons, des macro-, micro-, nano- particules ainsi que les macro-, micro- et nanocapsules et aussi être adsorbés sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites et autres supports minéraux. Ces émulsions jouissent d'une bonne stabilité et peuvent être conservées pendant le temps nécessaire pour l'utilisation à des températures comprises entre 0 et 50 °C sans qu'il y ait sédimentation des constituants ou séparation des phases.
Les compositions cosmétiques de l'invention peuvent aussi contenir des additifs ou des adjuvants usuels en cosmétologie, comme par exemple des agents antibactériens ou des parfums mais aussi des lipides d'extraction et/ou de synthèse, polymères gélifiants et viscosants, tensio-actifs et émulsifiants, principes actifs hydro ou liposolubles, extraits de plantes, extraits tissulaires, extraits marins, actifs de synthèse.
L'utilisation cosmétique ou dermocosmétique d'extraits et/ou molécules comprend tous les soins du corps et de la peau y compris les produits solaires, protecteurs et bronzants, les produits anti-âge, anti-seborrhéïques, toniques, les produits assurant l'amélioration de l'aspect de la peau y compris le traitement acnéique, les rougeurs cutanées, le traitement du cuir chevelu et celui de la chute des cheveux.
Les compositions cosmétiques de la présente invention peuvent aussi comprendre d'autres principes actifs complémentaires choisis pour leur action, par exemple pour la protection solaire, l'effet anti-rides, l'activité antiradicalaire et antioxydante, l'activité anti-irritante, la nutrition cellulaire, la respiration cellulaire, l'hydratation et la régénération cellulaire, les traitements anti-séborrhéiques, ainsi que d'autres principes actifs ayant une action sur la tonicité cutanée, la protection du cheveu. Lorsque les compositions cosmétiques de la présente invention contiennent des principes actifs complémentaires, ceux-ci sont généralement présents dans la composition à une concentration suffisamment élevée pour qu'ils puissent exercer leur activité. Les compositions cosmétiques de la présente invention sont de préférence à utiliser quotidiennement en les appliquant une ou plusieurs fois par jour. Les compositions cosmétiques de la présente invention sont très bien tolérées, elles ne présentent aucune phototoxicité et leur application sur la peau, pour des périodes de • temps prolongées, n'implique aucun effet systémique.
Les extraits et/ou triterpènes issus du genre Psophocarpus peuvent aussi être utilisés dans des produits dermocosmétiques pour leur activité anti-inflammatoire, anti-virale et anti-carcinogène (protectrice), sous forme liquide, de poudre, de pâte ou d'émulsion, seule ou en combinaison avec d'autres substances.
Pour l'utilisation dermo-pharmaceutique, les extraits et/ou triterpènes issus du genre Psophocarpus selon la présente invention peuvent être formulés sous forme galénique : pâte, émulsion, pulvérisateur en quantité comprise entre 0,01 et 25% en poids. Pour les préparations de ces compositions, les extraits et/ou triterpènes issus du genre Psophocarpus sont mélangés à des excipients.
Pour l'utilisation pharmaceutique, les extraits et/ou triterpènes issus du genre Psophocarpus selon la présente invention peuvent être employés pour la fabrication de médicaments destinés au traitement de certaines inflammations, démangeaisons, irritations, rougeurs chroniques, irritations et démangeaisons persistantes, comme le psoriasis, ainsi que des affections liées à l'inflammation de la peau, du tissu cartilogineux et de la maladie de Crohn. Ils peuvent également être employés, sous forme de crème,... afin de lutter contre les perturbations inflammatoires articulaires causées par la polyarthrite et autres affections inflammatoires du cartilage. Ces extraits peuvent également être appliqués comme protecteur contre les pathologies carcinogènes, affectant les dérégulations cellulaires type mélanome et autres cancers ainsi que le traitement des différentes agressions virales. Les compositions dermopharmaceutiques utilisant la présente invention peuvent contenir des principes actifs complémentaires, présents en quantité suffisamment importante dans la préparation pour qu'ils puissent exercer leur activité. La synthèse et l'hémisynthèse de ces dérivés triterpéniques peuvent permettent d'augmenter les qualités biophysico-chimiques de tels composés afin de les rendre plus perméables aux . différentes barrières biologiques de l'organisme. C'est le cas par , exemple du passage, de la barrière hémato-encéphalique dans le cas de, revendications des propriétés de protection du système nerveux central. Toutes formulations cosmétiques intégrant de. telles substances sont revendiquées pour les mêmes propriétés. L'utilisation de tels extraits peut s'étendre également à la nutraceutique puisqu'à l'origine il s'agit d'une plante alimentaire, que bon utiliserait pour ses propriétés anti- inflammatoires. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.
EXEMPLES
Exl : Réalisation des tests anti-inflammatoires : Evaluation de l'activité de la phospholipase A2 en présence d'un extrait total de Psophocarpus tetragonolobus. La phospholipase A2 pancréatique bovine a été utilisée. L'activité phospholipase A2 a été évaluée par méthode titrimétrique selon la procédure Sigma. En bref, 10 ml d'une solution de lécithine 2% est maintenue à pH = 8 par addition d'une solution 10 mM NaOH jusqu'à stabilisation du pH (variation maximale de 0,01 unité de pH/mn). A cette solution est ajouté 200 μl de phospholipase A2 (2,5 unités/ml) et 400 μl d'une solution contenant soit le blanc (solvant de l'extrait), soit l'extrait total ou enrichi. L'extrait total a été réalisé comme suit : Les racines séchées de Psophocarpus tetragonolobus ont été broyées puis un extrait 10% méthanol a été réalisé. L'extrait enrichi a été réalisé dans les conditions citées précédemment. L'effet inhibiteur est évalué en mesurant la quantité de NaOH ajoutée à la solution et nécessaire pour maintenir le pH à 8. Le pourcentage d'inhibition est calculé de la manière suivante : % INHIBITION = [(A - B)/A] x 100 où A = [NaOH] ajoutée dans l'échantillon « blanc » et B = [NaOH] ajoutée dans l'échantillon contenant l'extrait. Les résultats obtenus sont les suivants : Volume d'extrait ajouté Inhibition de la PLA2 (%) dans la solution enzymatique Extrait total de Extrait enrichi de finale Psophocarpus Psophocarpus tetragonolobus tetragonolobus 400 μl 100 100 200 μl 80 100 50 μl 40 90
Ex2 : Réalisation des tests anti-inflammatoires : Evaluation de l'activité immunosuppressive.
L'extrait a été réalisé par macération, dans l'alcool bouillant pendant 1 heure, de 10 g de plante broyée dans 200 ml d'éthanol. Une concentration à 20 ml a ensuite été réalisée. Le rendement en matière sèche est de 1,5%. Nature des cellules utilisées La sécrétion des cytokines a été dosée dans des surnageants d'incubation de cellules mononucléées du sang veineux périphérique (PBMCs) de donneurs sains humains. Tous les prélèvements de sang ont été réalisés au Service d'Hépato-Gastroentérologie et d'Assistance Nutritive des Hôpitaux Universitaires de Strasbourg (Hôpital de Hautepierre), après approbation du protocole d'étude concernant les effets du célastrol par le CCPPRB n°l d'Alsace.
Isolement et incubation des cellules mononuclées et du sang total : Chez des volontaires sains, 20 ml de sang veineux périphérique sont prélevés le matin à jeun sur héparine. Le sang est ensuite dilué au demi dans une solution saline équilibrée de Hank's dépourvue en Ca2+ et en Mg2+ (HBSS-CMF, Gibco BRL, Cergy, France) additionnée de pénicilline-streptomycine 100 Ul/ml (Biochrom KG, Berlin, Allemagne). Les cellules mononucléées (lymphocytes et monocytes) sont alors séparées par centrifugation sur Ficoll-Histopaque de densité 1,076 (Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, France) (30 min à 400 g) selon la technique de B0yum[l], puis, après deux lavages successifs, resuspendues dans du milieu RPMI 1640 (Gibco BRL) additionné de 10 % (volume/volume) de sérum de veau foetal (SVF) inactivé à la chaleur (56°c, 30 min, Gibco BRL), et d'antibiotiques (pénicilline/streptomycine 100 Ul/ml). Les cellules sont incubées, à raison de 2 x 105 cellules/puits des plaques de 24 puits (Corning Inc., New York, USA), à 37°C dans un incubateur humidifié (air 95 % - CO2 5 %), en présence ou en absence des composés étudiés dilués dans du DMSO (diméthyl sulfoxyde, Sigma ; maximum : 1 % (v/v) par puits), avec ou sans activation par lipopolysaccharide (LPS Salmonella abortus equi, 5 μg/ml) (Sigma). Après 24 heures d'incubation, les plaques sont centrifugées (15 min à 200 g), et les surnageants prélevés puis congelés à -80°C jusqu'au dosage Elisa. Le célastrol nous a été gracieusement fourni par le Professeur AC Allison (DAWA Inc, Belmont, CA, USA). Test de viabilité cellulaire : Les culots cellulaires (PBMCs et sang total) contenus dans les plaques de culture sont resuspendus dans du RPMI 1640 additionné de XTT (1 mg/mb Sigma), et de phénazine méthosulfate (1,25 mM, Sigma). Les plaques sont incubées 4 heures, puis lues en absorbance à 450 nm (filtre de référence : 620 nm). La viabilité cellulaire est estimée par rapport aux puits de référence (maximum de viabilité) après soustraction de l'absorption propre du milieu (milieu sans cellules). Test Elisa :
Les concentrations de TNF-a dans les milieux de culture sont déterminées par des tests immunoenzymatiques Elisa spécifiques. Brièvement, des plaques 96 puits (Corning Inc.) sont traitées par 50 ml/puits d'une solution du premier anticorps monoclonal de capture (Antibody Solutions, Flalf Moon Bay, CA, USA) (5 μg/ml) dilué dans du PBS/thimérosal 0,05 % (poids/volume) (Sigma). Après une nuit d'incubation, scellées hermétiquement et à 4°C, les plaques sont lavées trois fois et les sites de fixation non spécifique saturés par incubation durant 1 heure à température ambiante en présence de PBS/lait 5 % (poids/volume). Après trois lavages supplémentaires, 25 ml d'échantillon, ou de cytokine recombinantes humaines servant à l'établissement de la gamme étalon (R&D Systems Europe, Abingdon, UK pour l'h-TNF-a) additionnés de 25 ml d'une solution d'anticorps biotinylé (Antibody Solutions, Half Moon Bay, CA, USA) (2 μg/ml) sont déposés en duplicate dans chaque puits, et les plaques incubées 2 heures à température ambiante. Après lavages, 50 ml d'une solution de streptavidine-HR- peroxydase (Zymed, San Francisco, CA, USA) diluée au 1/3000 dans du PBS sont déposés dans chaque puits. Après 1 heure d'incubation à température ambiante, la réaction enzymatique est révélée par du dichlorate d'O-phénylènediamine (OPD SigmaFast, Sigma) déposé après 4 lavages supplémentaires. La lecture s'effectue par mesure de la densité optique (DO) à 450 nm au spectrophotomètre d'absorption (filtre de référence : 620 nm). La concentration en cytokines est déterminée par interpolation à partir de la gamme étalon, et les résultats normalisés par rapport au contrôle. Statistiques :
Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à la valeur de référence (production de la cytokine étudiée en présence de LPS). Compte tenu du faible nombre d'échantillons, les résultats ont été analysés par des tests non paramétriques (Kruskal- Wallis). La significativité statistique est définie à p £ 0,05. Courbes dose-réponses :
Les courbes dose-réponses ont été ajustées à l'aide du logiciel « Prism » (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA). Résultats :
Figure imgf000011_0001
Concentration extrait éthanolique (μg/ml)
L'extrait éthanolique de Psophocarpus a montré de manière dose dépendante une action inhibitrice sur la sécrétion de TNF-α par la lignée monocytaire humaine THP-1 en réponse à l'activation par le LPS bactérien après 24H d'incubation in vitro. Une IC5o a pu être évaluée à 13 μg/ml. Aucune toxicité cellulaire n'a été observée même aux concentrations les plus élevées.
Ex3 : Réalisation des tests anti-inflammatoires : Evaluation de l'activité in vivo.
Il s'agit du modèle d'inflammation dans la patte de souris induit par la carraghénine- Modèle animal d'inflammation aiguë. L'inflammation en elle-même est induite par l'injection de carraghénine, par voie sous-cutanée, au niveau de la patte du rat, une heure après administration, s'il y a lieu, de la drogue d'intérêt à étudier (injection IP, 10 mg/kg). En très peu de temps se développe un œdème et l'inflammation induite par la carraghénine est ensuite suivie par une simple mesure du diamètre de la patte. Il est ainsi possible de déterminer, en moins de 24h, si l'un des composés réduit l'inflammation, et donc son activité in vivo. Ce travail a également permis d'évaluer, pour chacune des molécules étudiées, une éventuelle activité toxique chez l'animal, information qu'il est impossible d'obtenir in vitro.
t éthanolique
Figure imgf000012_0001
Time (hr)
L'évaluation de l'action de l'extrait éthanolique de Psophocarpus in vivo sur un test d'inflammation aiguë obtenue par injection de carraghénine dans la paume de la souris met en évidence une forte action inhibitrice du gonflement de la patte. Aucune toxicité n'a été enregistrée aux doses administrées ainsi qu'à des doses 10 fois plus élevées. L'ensemble de ces tests démontrent que l'extrait éthanolique ou propylène glycol-eau de racines de Psophocarpus présente une double activité anti-inflammatoire en agissant à la fois sur la voie de l'inhibition des phospholipases et cyclooxygénases, mais aussi sur la voie de l'inhibition du relargage des cytokines inflammatoires, comme le TNF-alpha.
Ex4 : Association de l'extrait titré ou triterpénique avec d'autres actifs. Le psoriasis est une maladie complexe qui combine une composante inflammatoire significative avec une composante proliférative des cellules de la peau. L'idée est donc d'associer à l'extrait de psophocarpus ou à l'acide bétulinique pur, la colchicine ou un extrait de plante titré, en colchicine et un inhibiteur de phosphodiestérase 4, comme la papavérine, la e-viniferine ou encore des extraits de plantes connus pour inhiber les phosphodiestérases, comme le Ginko biloba, hypericum...
L'acide bétulinique seul ainsi que l'extrait de psophocarpus ont démontré une action significative contre le psoriasis. Toutefois, en associant l'acide bétulinique avec la colchicine et un inhibiteur de phosphodiestérase 4 naturel ou synthétique, les effets sorit avantageusement mis en évidence. Cela revient à renforcer l'action anti-inflammatoire et anti-proliférative liée à la combinaison de ces molécules qui agissent par des mécanismes biochimiques différents mais complémentaires. " '

Claims

REVENDICATIONS
1. Extrait de racine, ou tout autre organe, de Psophocarpus tetragonolobus et espèces apparentées pour une utilisation comme cosmétique, nutraceutique et médicament.
2. Procédé d'obtention selon la revendication 1 d'un extrait de racine, ou tout autre organe de Psophocarpus tetragonolobus et espèces apparentées, total par extraction à beau, les alcools, les cétones, les esters, les éthers, les polyols, les solvants chlorés et les mélanges d'au moins deux des solvants précités permettant d'obtenir un extrait total ou sélectif tel qu'un extrait enrichi en triterpènes ou un extrait de composés purs, notamment l'acide bétulinique.
3. Procédé d'obtention selon les revendications 1 et 2 d'un extrait total, caractérisé en ce que l'on effectue les opérations successives suivantes telles que broyage de l'organe dans une solution aqueuse ou alcoolique ou hydroalcoolique suivi ou non d'une évaporation à sec avec ou non au préalable une hydrolyse acide permettant d'obtenir soit les saponosides, soit les aglycones correspondants. -* i .
4. Procédé d'obtention selon les revendications 1 et 2 d'un extrait sélectif concentré en triterpènes ou constitué de molécules pures, caractérisé en ce que la racine du pois asperge (Psophocarpus tetragonolobus) est broyée jusqu'à obtenir une granulométrie fine, puis ce broyât est recouvert de toluène, laissé à macération durant 12 heures pour être ensuite réextrait dans 3 à 5 volume de toluène durant 8 heures 'à 111 °C, puis séché et repris par 10 volumes d'alcool à 99°C, filtré et séché et enfin cet extrait sélectif concentré en triterpènes pouvant être fractionné ou non afin d'en purifier les molécules pures telles que les différents triterpènes notamment l'acide bétulinique.
5. Procédé d'obtention des compositions dermo-cosmétiques, nutraceutique, vétérinaires et pharmaceutiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisées en ce que l'extraction réalisée à partir de Psophocarpus peut être remplacée par des techniques de macérations ou par d'autres procédés comme, par exemple, la simple décoction, la lixiviation, l'extraction sous reflux, l'extraction au moyen d'ultrasons ou de micro-ondes ou enfin des techniques à contre courant.
6. Utilisation de tels extraits des revendications 2 à 4 pour la fabrication de préparations dermo-cosmétiques, nutraceutique, vétérinaire et pharmaceutiques destinées au traitement et/ou à la prévention des pathologies inflammatoires, virales et carcinogènes.
7. Utilisation selon les revendications 2 à 6 comme agent dermoprotecteur contre diverses agressions physiques, chimiques et biologiques externes, et pour apaiser et protéger les peaux sensibles aux rougeurs et aux irritations ainsi que le psoriasis.
8. Utilisation selon les revendications 2 à 6 pour le traitement des irritations, des démangeaisons persistantes ainsi que des affections liées à l'inflammation de la peau, du tissu cartilagineux, du psoriasis et de la maladie de Crohn.
9. Utilisation selon les revendications 2 à 6 pour le traitement des pathologies affectant les dérégulations cellulaires, type mélanome et autres cancers ainsi que le traitement des différentes agressions virales.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 9 caractérisées en ce que lesdits extraits sont présents sous forme sèche obtenus par évaporation, atomisation ou lyophilisation sous forme liquide ou sous forme encapsulée dans des glycospheres ou des vecteurs sélectionnés dans le groupe constitué de liposomes, de chylomicrons, de macro-, micro- et nanoparticules, de macro-, micro- et nanocapsules, ou adsorbés sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites et autres supports minéraux.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 9 caractérisées en ce que la teneur en triterpènes est présente en une quantité comprise entre 0,01 et 5%, préférentiellement entre 0,1 et 2,5% sous forme de poudre, et présent entre 0,01 et 25%, préférentiellement entre 0,5 et 10% sous forme encapsulée.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 9 caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est combinée à un ou plusieurs additifs sélectionnés parmi le groupe constitué de lipides d'extraction et/ou de synthèse, de polymères gélifiants et viscosants, de tensioactifs et émulsifiants, de principes actifs hydro- ou liposolubles, d'extraits de plantes, d'extraits tissulaires, d'extraits marins, de principes actifs d'origine synthétique.
13. Utilisation de l'acide bétulinique pur ou d'un extrait végétal titré en acide bétulinique, seul ou en association avec la colchicine ou un extrait végétal titré en colchicine et/ou un inhibiteur de phosphodiestérase naturel ou synthétique pour lutter contre le psoriasis.
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