FR3018685B1 - Applications cosmetiques et pharmaceutiques de la salicaire - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne les applications cosmétiques et pharmaceutiques d'un extrait de salicaire pour améliorer et/ou renforcer et pour restaurer la fonction barrière de l'épiderme de la peau ou d'une peau âgée ou lésée.
Description
La présente invention concerne l'utilisation d'extraits d'une plante trèsrépandue, notamment en Europe, dans des compositions cosmétiques, ainsi que dansdes compositions pharmaceutiques. Plus précisément, elle se rapporte à de nouvellesapplications de la salicaire pour traiter la peau, les phanères et les muqueuses.
La salicaire commune (Lythrum salicaria L) est une plante herbacée de lafamille des Lythraceae qui prospère à proximité des cours d'eau où elle forme delongues inflorescences rose pourpré semblables à des épis et facilementreconnaissables. Les feuilles sont comestibles crues ou cuites, la tige et sa pulpe lesont après cuisson seulement. La salicaire peut devenir vite envahissante et s'avèreêtre une problématique dans certaines régions où des stratégies d'éradications sontenvisagées.
Très riche en tanin, la salicaire a été utilisée en médecine depuisl'antiquité, notamment pour son action hémostatique et antihémorragique, sousforme de compresses de fleurs. Active dans les entérites banales, surtout chez lenourrisson, elle a aussi servi contre la dysenterie et sa forte teneur en fer la rendefficace contre l'anémie. Son utilisation se fait alors sous forme d'infusion de fleursséchées. La salicaire est reconnue en traitement médicinal de toutes les diarrhées,ainsi que celle du nourrisson et la dysenterie des tuberculeux. Les propriétés de lasalicaire sont idéales dans les inflammations de l'estomac et la leucorrhée, dansl'eczéma et les ulcères. Elle est également utilisée dans les grippes intestinales.
Selon l'article Z. Tunalier et al. (2007) Journal of Ethnopharmacology 110,539-547, on connaît l'utilisation d'extraits de salicaire pour traiter, en applicationlocale, les varices, les hémorroïdes, des saignements gingivaux et l'eczéma. Cetteutilisation repose sur les propriétés anti-inflammatoires de la salicaire.
La présente invention met en évidence de nouvelles applicationscosmétiques et pharmaceutiques de la salicaire, en particulier pour réparer les peauxâgées ou lésées par des dermatoses diverses, comme le psoriasis, la dermatiteatopique.... L'extrait de salicaire améliore significativement la fonction barrière del'épiderme pour lutter contre les agressions externes et joue donc un rôle deprotecteur cutané. Ces extraits de salicaire jouent aussi un rôle favorable dans lescompositions anti-âge.
Les auteurs de l'invention ont découvert que la salicaire permettait destimuler l'expression de différents marqueurs protéiques essentiels dans la formationdu stratum corneum ou couche cornée, dont l'enzyme-clé, la transglutaminase TGK.
Le stratum corneum est la partie la plus superficielle de la peau etreprésente l'aboutissement du processus de différenciation des kératinocytes. Aucours de cette différenciation, les kératinocytes issus de l'assise basale subissent unesérie de remaniements métaboliques et structuraux tout au long de leur migrationvers la surface de la peau. Le dernier stade est leur transformation en cornéocytesdont l'accumulation en une structure cohésive constitue le stratum corneum quiassure la fonction de barrière. Tout au long du processus de différenciation, plusieursprotéines interviennent. L'une d'elles, la TGK, de la famille des glutaminases catalysel'établissement de liaisons peptidiques covalentes du type s(g-glutamyl)-lysine entredivers précurseurs protéiques qui forment le stratum corneum et lui confère cettecapacité à protéger la peau vis-à-vis d'agressions extérieures et à limiter la diffusion del'eau provenant de l'intérieur. La transglutaminase forme des polymères de protéinesgénéralement insolubles. Ces polymères biologiques sont indispensables à l'organismepour créer des barrières et structures stables.
La présente invention vise précisément à offrir de nouvelles compositionspharmaceutiques, dermatologiques ou cosmétiques capables de stimuler les facteursintervenant dans la différenciation, appelés facteurs pro-différenciants comme la TGK,permettant ainsi d'améliorer les conditions de la peau, des phanères, des muqueusessains ou lésés.
Selon l'invention, les compositions ci-dessus comprennent, à titre deprincipe actif, au moins un extrait de salicaire.
On entend par « extrait de salicaire », un extrait ou un mélange d'extraitde plante du genre Salicaria sp de la famille des Lythracées. Il s'agit plus spécialementd'un extrait ou d'un mélange d'extrait de cellules de Salicaria sp. Ce matériel cellulairepeut être obtenu par culture in vitro ou in vivo. Par culture in vitro, on entendl'ensemble des techniques connues de l'homme du métier qui permettent de manièreartificielle l'obtention d'un végétal ou d'une partie d'un végétal. Ainsi, l'extrait peutêtre un extrait ou un mélange d'extraits d'organe (racine, tige, feuille, écorce), voire decellules d'organe, d'au moins une plante du genre Salicaria sp de la famille desLythracées, ou encore un extrait de cellules indifférenciées d'au moins une telle plante.
Les applications selon l'invention s'étendent au traitement des phanèreset des muqueuses. Par phanères selon l'invention, on inclut notamment les ongles etle système pileux, en particulier les cheveux. Par muqueuses, on entend les tissus derevêtement des cavités anatomiques, qui se raccordent à la peau par des orifices naturels, comme la bouche, l'estomac, l'intestin, ainsi que ceux de cavités naturellesexternes comme les narines, les oreilles.
Ainsi, la présente invention a pour objet une utilisation cosmétique oupharmaceutique d'un extrait de salicaire pour protéger la peau, les phanères et lesmuqueuses des agents extérieurs physiques, chimiques ou biologiques, et/ou pouraméliorer et/ou renforcer l'hydratation de la peau et/ou renforcer les phanères,notamment les cheveux, et les muqueuses.
Elle a aussi pour objet un procédé de traitement cosmétique de luttecontre la sécheresse d'une peau ou de traitement cosmétique d'une peau sèche, leditprocédé comprenant une étape selon laquelle on applique au moins un extrait desalicaire sur la peau. L'invention porte aussi sur un procédé de traitement cosmétique anti-âgede la peau ou de traitement cosmétique d'une peau âgée, comprenant une étapeselon laquelle on applique au moins un extrait de salicaire sur la peau. Ce traitementpermet de retarder les phénomènes de vieillissement de la peau, mais aussi deréparer une peau âgée.
Dans toute application cosmétique de l'invention, un extrait de salicairepeut être associé à un autre ou d'autres agents prodifférenciants de la peau, comme lecalcium, la vitamine D et leurs dérivés.
Selon un autre aspect, l'invention concerne les applicationspharmaceutiques d'un extrait de salicaire, telles que présentées ci-après.
Un des objets de l'invention est une composition pharmaceutiquecomprenant un extrait de salicaire, pour restaurer la fonction barrière de l'épidermed'une peau lésée. Cet état peut résulter de l'action d'un agent extérieur physique,chimique ou biologique et/ou d'un trouble ou d'une maladie, comme par exemple dupsoriasis ou une dermatose atopique.
Un autre objet est une composition pharmaceutique comprenant unextrait de salicaire, pour améliorer et/ou renforcer la fonction barrière d'unemuqueuse ou pour restaurer la fonction barrière d'une muqueuse lésée. A titred'exemple, il peut s'agir de la muqueuse intestinale. La lésion de la muqueuse peutrésulter d'un trouble ou d'une maladie; dans le cas de la muqueuse intestinale, lalésion peut être provoquée par le syndrome du colon irritable.
Dans la visée thérapeutique de l'invention, l'extrait de salicaire peut êtreadministré par voie topique, il peut aussi être administré par voie orale.
Selon un aspect de l'invention, l'extrait est administré après que leprocessus inflammatoire est terminé, notamment en traitement réparateur parreconstruction du stratum corneum.
Dans une composition de l'invention, l'extrait de salicaire peut aussi êtreassocié à un ou plusieurs agents anti-inflammatoires et/ou immunosuppresseursutilisés dans le traitement de l'inflammation cutanée, tels que les cyclosporines etleurs dérivés, les biothérapies anti-cytokines et les corticoïdes.
Un extrait de salicaire selon l'invention peut être obtenu par touteméthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier. On peut enparticulier citer les procédés d'extraction solide-liquide en milieux alcooliques(notamment méthanoliques, éthanoliques), aqueux, ainsi qu'en milieux utilisant dessolvants tels que les cétones, les esters, les éthers, les polyols, les solvants chlorés etles mélanges d'au moins deux des solvants précités, comme les milieuxhydroalcooliques.
Avantageusement, un extrait est obtenu par extraction de salicaire enmilieu hydroalcoolique, notamment une solution aqueuse d'éthanol. Selon cettevariante, la concentration de l'éthanol varie de préférence d'environ 20 à environ 40%(v/v), mieux encore elle est d'environ 30% (v/v).
Les méthodes alternatives aux solvants peuvent aussi être envisagéescomme le CO2 supercritique, les micro-ondes...
Ces modes de préparation font partie intégrante de l'invention.
Ces extraits peuvent être utilisés tels quels sous forme liquide ou enpoudre, non purifiés ou purifiés.
Si l'extrait est en poudre, son séchage peut être conduit par toutetechnique bien connue de l'homme du métier. L'extrait peut être séché paratomisation, évaporation ou lyophilisation. La poudre ainsi obtenue peut êtreencapsulée dans des liposomes ou autres vecteurs et supports pour une meilleurehomogénéité de la composition et une meilleure diffusion du principe actifnotamment sur la peau. L'extrait est de préférence obtenu à partir des parties aériennes desalicaire.
Les auteurs ont observé que les extraits obtenus par macérationhydroalcoolique des parties aériennes de salicaire présentent une forte activitébiologique. Ceci quel que soit le pourcentage d'éthanol dans le solvant d'extraction.Des résultats similaires sont observés dans l'eau ou de l'éthanol.
Les extraits de salicaire selon l'invention peuvent être associés dans lescompositions de l'invention avec des substances augmentant la protection cutanée. Atitre d'exemple mais de manière non limitative, on peut citer les associations avec desmucopolysaccharides, des vitamines, des céramides, des substances antiradicalaires,des filtres U.V.
De même, l'activité réparatrice des extraits selon l'invention estparticulièrement intéressante quand ils sont associés avec des substances ayant uneffet cicatrisant comme des protéines, l'acide hyaluronique, des acides aminés, et/ouavec des substances anti-inflammatoires, anti-âge, après-solaire ou avec des actifsanti-acné, anti-dermatoses... L'activité protectrice des extraits de l'invention vis-à-vis des radicauxlibres et des UV est également très intéressante dans le domaine capillaire,notamment dans le cas d'association avec des substances facilitant le bon état du cuirchevelu et de celui du cheveu, comme des minéraux, des vitamines, des céramides,des extraits protéiques, des mucopolysaccharides, des acides de fleurs ou de fruits.
Les compositions de l'invention sont tout particulièrement adaptées àune application topique pour prévenir et/ou traiter de nombreuses altérationscutanées. L'invention a donc aussi pour objet l'utilisation dermo-cosmétique d'unextrait de salicaire, comme agent réparateur et/ou protecteur de la peau et dusystème pileux comme les cheveux, notamment pour lutter contre les agressionsexternes, telles que celles liées à la pollution, au soleil, au stress oxydatif, auvieillissement et aux pathologies cutanées entraînant un dysfonctionnement del'homéostasie de l'épiderme ou des cheveux. C'est pourquoi, une application directe des compositions de l'inventionconcerne la lutte contre le vieillissement et la mort cellulaire induits par les UV.L'invention se rapporte aussi à l'une utilisation de ces compositions en tant queprolongateur de bronzage.
Pour une utilisation cosmétique, les compositions de l'invention peuventse présenter sous la forme de crèmes, gels, lotions, laits, émulsions H/E et E/H,solutions, onguents, pulvérisateurs, huiles corporelles, lotions capillaires,shampooings, lotions après-rasage, savons, bâtons protecteur des lèvres, bâtons etcrayons pour maquillage. Les compositions peuvent comprendre tous excipientsnécessaires à leur formulation. Ainsi, lorsqu'elles sontsous la forme de gel, ellescomprennent des excipients appropriés tels que les esters de cellulose ou d'autresagents gélifiants, tels que le carbopol, la gomme guar, etc...
Ces compositions cosmétiques peuvent aussi prendre la forme de lotionou solution dans laquelle les extraits et/ou molécules sont sous forme encapsulée, parexemple dans des microsphères. Ces microsphères peuvent par exemple êtreconstituées de corps gras, d'agar et d'eau. Les agents actifs peuvent être aussiincorporés dans des vecteurs de type liposomes, glycosphères, dans des chylomicrons,des macro-, micro-, nano-particules ainsi que les macro-, micro- et nanocapsules etaussi être adsorbés sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites etautres supports minéraux. Ces émulsions jouissent d'une bonne stabilité et peuventêtre conservées pendant le temps nécessaire pour l'utilisation à des températurescomprises entre 0 et 50 °C sans qu'il y ait sédimentation des constituants ouséparation des phases.
Les compositions cosmétiques de l'invention comprennent de l'ordre de0,01 à 5%, préférentiellement entre 0,1 et 2,5% d'extrait de salicaire lorsqu'elles sontsous forme de poudre et de l'ordre de 0,01 à 25%, préférentiellement entre 0,5 et 10%lorsqu'elles sont sous forme encapsulée. Les pourcentages sont exprimés en poidsd'extrait sec de salicaire par rapport au poids de la composition finale.
Pour la préparation de ces compositions, les extraits de salicaire sontmélangés aux excipients généralement employés en cosmétique.
Les compositions cosmétiques de l'invention peuvent aussi contenir desadditifs ou des adjuvants usuels en cosmétologie, comme par exemple des agentsantibactériens ou des parfums mais aussi des lipides d'extraction et/ou de synthèse,polymères gélifiants et viscosants, tensio-actifs et émulsifiants, principes actifs hydroou liposolubles, extraits de plantes, extraits tissulaires, extraits marins, actifs desynthèse. L'utilisation cosmétique ou dermocosmétique d'extraits comprend tousles soins du corps et de la peau y compris les produits solaires, protecteurs etbronzants, les produits anti-âge, anti-seborrhéïques, toniques, les produits assurantl'amélioration de l'aspect de la peau y compris le traitement acnéique, les rougeurscutanées, le traitement du cuir chevelu et celui de la chute des cheveux.
Les compositions cosmétiques de la présente invention peuvent aussicomprendre d'autres principes actifs complémentaires choisis pour leur action, parexemple pour la protection solaire, l'effet anti-rides, l'activité antiradicalaire etantioxydante, l'activité anti-irritante, la nutrition cellulaire, la respiration cellulaire,l'hydratation et la régénération cellulaire, les traitements anti-séborrhéiques, ainsi qued'autres principes actifs ayant une action sur la tonicité cutanée, la protection ducheveu.
Les compositions cosmétiques de la présente invention sont depréférence à utiliser quotidiennement en les appliquant une ou plusieurs fois par jour.
Les compositions cosmétiques de la présente invention sont très bientolérées, elles ne présentent aucune phototoxicité et leur application sur la peau, pourdes périodes de temps prolongées, n'implique aucun effet systémique. L'invention concerne aussi l'utilisation d'extraits de salicaire pour lapréparation de compositions dermocosmétiques présentant une activité anti-inflammatoire et dermoprotectrice. Ces compositions sont utiles pour prévenir et/outraiter notamment des maladies dermatologiques liées à des activités séborrhéiques,acnéiques et/ou inflammatoires.
Ces compositions dermocosmétiques se présentent sous forme liquide,de poudre, de pâte ou d'émulsion, seule ou en combinaison avec d'autres substances.Elles comprennent de l'ordre de 0,01 à 25% en poids d'extrait de salicaire. Lespourcentages sont exprimés en poids d'extrait sec de salicaire par rapport au poids dela composition finale.
Pour les préparations de ces compositions dermocosmétiques, les extraitsde salicaire sont mélangés à des excipients.
En conséquence, de manière générale, l'invention se rapporte àl'utilisation d'un extrait de salicaire, pour la préparation d'une compositionpharmaceutique, nutraceutique, dermatologique ou cosmétique destiné à préveniret/ou traiter les pathologies et désordres résultant : du vieillissement naturel ou prématuré de la peau ou des cheveux, de dermatoses, comme le psoriasis, la dermatite atopique..., d'états inflammatoires des systèmes cutanés ou pileux, induisant desdémangeaisons, irritations, rougeurs chroniques, irritations et démangeaisonspersistantes et des troubles fonctionnels de la fragilité capillaire, d'un problème de coagulation du sang.
Une composition pharmaceutique selon l'invention comprend outre aumoins un agent actif comme défini précédemment, un vecteur, ou un excipientpharmaceutiquement acceptable.
La présente invention est maintenant illustrée, de manière non limitative,par les exemples 1 à 5 suivants. L'exemple 1 illustre des procédés de préparation d'extraits de salicaireselon l'invention.
Les exemples 2 à 4 suivants illustrent les propriétés des extraits ci-dessusde l'invention qui ont été évaluées par la capacité de ces extraits à stimuler l'expression de marqueurs-clé de la différenciation épidermique. Les marqueurschoisis, tous impliqués dans l'arrangement des filaments de kératine et dans laformation de l'enveloppe de la couche cornée, sont la transglutaminase K (TGK), lafilaggrine et la cytokératine 10 (KRT10). La TGK catalyse l'établissement de liaisonspeptidiques du type s(g-glutamyl)-lysine entre divers précurseurs protéiques. Lafilaggrine et la KRT10 sont peu exprimées dans les monocouches de kératinocytesprimaires et sont considérés comme des marqueurs de différenciation terminale del'épiderme. L'exemple 5 met en évidence les propriétés d'un extrait de l'inventionévaluées par sa capacité à stimuler l'expression de kératines, composants majeurs dela tige pilaire.
Les exemples font référence aux figures 1 à 7, selon lesquelles :
Figure 1 représente l'influence de l'extrait EX10MF1046, sur l'expressionde différents marqueurs de la différenciation épidermique, par les cultures dekératinocytes à l'état basal, évaluée par RT-qPCR.
Figure 2 présente les images numériques de coupe d'épidermesreconstruits (RHE) traités par un témoin, une référence et l'extrait de l'inventionEX10MF1046 à 20pg/ml, et leurs effets sur l'expression de marqueurs de ladifférenciation épidermique.
Figure 3 représente l'influence de l'extrait EX10MF1046, sur l'expressionde différents marqueurs de la différenciation épidermique, par les cultures dekératinocytes stimulées ou non par un mélange de cytokines IL-17, OSM et TNFa (mix-PSO), évaluée par RT-qPCR.
Figure 4 présente les images numériques de coupes d'épidermesreconstruits stimulés par un mélange de cytokines IL-17, OSM, TNFa traités par untémoin, une référence (JAK inhibitor 1) et l'extrait de l'invention EX10MF1046 à20pg/ml, et leurs effets sur l'expression du marqueur de différenciation épidermiqueKRT10.
Figure 5 représente l'influence de l'extrait EX10MF1046, sur l'expressionde différentes chimiokines induites par l'inflammation, par les cultures dekératinocytes stimulées ou non par un mélange de cytokines IL-17, OSM et TNFa (mix-PSO), évaluée par RT-qPCR.
Figure 6 représente l'influence de l'extrait EX10MF1046, sur la libérationde l'IL-8 par des épidermes reconstruits (RHE à J13) stimulés par le mélange decytokines IL-17, OSM et TNFa (mix-PSO) pendant 48h, observés à la figure 4.
Figure 7 présente un schéma d'une boucle inflammatoire chronique de lapeau (par exemple, psoriasis) illustrant le stade d'intervention de l'extrait EX10MF1046dans cette boucle.
Exemple 1 : Obtention des extraits de salicaire
Différents extraits de salicaire (EX3MF1046, EX4MF1046, EX1MF1046 etEX2MF1046) ont été obtenus dans le présent exemple, selon un protocole généraldécrit ci-après et dont les conditions spécifiques à chaque extrait sont spécifiées dansle tableau 1.
Protocole général :
Une masse de parties aériennes de salicaire, préalablement séchées, estbroyée et mise à macérer pendant 24 heures dans un solvant de macération. Pendanttoute la durée de la macération, le mélange a été maintenu sous agitation, à 20°C.Après macération, le résidu de plante est séparé de l'extrait par clarification etfiltration. L'extrait est ensuite directement concentré par évaporation sous vide,puis séché par atomisation et obtenu sous forme d'une poudre, à l'exception desextraits EX10MF1046 et EX13MF1046 qui, avant concentration, sont mis au contact decharbon actif (O,5kg), laissés sous agitation pendant une heure puis séparés ducharbon actif par filtration.
Tableau 1
Exemple 2 : Evaluation dans des primocultures de kératinocytesépidermiques humains normaux (NHEK) 1) Matériels et méthodes
Cellules Kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK) ; référenceBlOalternatives K341, utilisés au troisième passage.
Conditions de culture : 37°C, 5% CO2
Milieu de culture : KeratinocyteSFM complémenté avec facteur decroissance épidermique (EGF) 0,25ng/ml, extrait pituitaire (EP) 25pg/ml etgentamycine 25pg/ml.
Milieu d'essai KeratinocyteSFM complémenté avec gentamycine25pg/ml.
Extraits testés
Dans l'étape initiale de sélection d'un extrait pour la poursuite des essais,et après évaluation de cytotoxicité préalable, les extraits EX1MF1046, EX2MF1046,EX3MF1046, EX4MF1046 et EX13MF1046 sont testés aux concentrations suivantes : EX1MF1046, 0,005 mg/ml EX2MF1046, 0,003 mg/ml EX3MF1046, 0,005 mg/ml EX4MF1046, 0,005 mg/ml EX13MF1046, 0,005 mg/ml L'étape ci-dessus a conduit à retenir les extraits EX3MF1046 etEX10MF1046 qui correspond à l'extrait EX3MF1046 filtré, pour les essais suivants. Ilssont évalués aux concentrations suivantes : EX3MF1046, entre 0,0016 mg/ml et 0,02 mg/ml ; concentration noncytotoxique. EX10MF1046, 0,02 mg/ml
Immunomarquages in situ
Les kératinocytes ont été ensemencés et cultivés à confluence en plaques96 puits puis le milieu a été remplacé par du milieu d'essai contenant ou non (témoin)l'extrait testé ou la référence (CaCI2 à 1,5 mM) et les cellules ont été incubées pendant72 heures. Toutes les conditions expérimentales ont été réalisées en n=3, pour chaquemarqueur.
Après incubation, le milieu d'essai est éliminé et les cellules sont rincées,fixées et perméabilisées. Les cellules sont marquées avec les anticorps primairesdirigés contre les protéines d'intérêt (TGK, filaggrine et KRT10) \ Ces anticorps ont étérévélés par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (GAMAIexa 488). Enparallèle, les noyaux des cellules sont colorés par le Hoechst 33258 (bisbenzimide).L'acquisition des images est réalisée avec un système d'imagerie à haute résolution,INCell Analyzer™1000 (GE Healthcare). Pour chaque puits, 5 saisies d'imagesnumérisées sont effectuées. Les marquages sont quantifiés par mesure de l'intensitéde fluorescence des protéines rapportée au nombre de noyaux identifiés par leHoechst (intégration des données numériques par le logiciel Developer Toolbox 1.5,GE Healthcare).
Le screening des extraits n'a été réalisé que sur le paramètre TGK (tableau2).
Analyse des transcrit, RT-qPCR
Les kératinocytes ont été ensemencés et cultivés à confluence en plaques24 puits puis le milieu a été remplacé par du milieu d'essai contenant ou non (témoin)le composé à l'essai ou la référence (CaCI2 à 1,5 mM) et les cellules ont été incubéespendant 48 heures. Toutes les conditions expérimentales ont été réalisées en n=3,pour chaque marqueur.
Après incubation, le milieu d'essai a été éliminé et les cellules ont étérincées et congelées à -80 °C. L'expression des marqueurs a été évaluée par RT-qPCR sur les ARNmessagers (ARNm) extraits des tapis cellulaires de chaque traitement (les réplicats ontété poolés avant l'extraction de l'ARN). Les étapes d'extraction d'ARN, réversetranscription, amorces et conditions de PCR ont été décrites précédemment1_3. 2) Résultats
Screening
Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous qui illustre leniveau d'expression de la TGK via le marquage fluorescent des NHEK, l'intensité defluorescence des NHEK étant proportionnelle à l'expression de TGK.
Tableau 2
L'extrait EX3MF1046 se révèle le plus actif dans ces conditions.
Influence de l'extrait EX3MF1046 à différentes concentrations, surl'expression de TGK
Le tableau 3 illustre le niveau d'expression de la TGK via le marquagefluorescent des NHEK pour différentes concentration de l'extrait EX3MF1046.
Tableau 3
a) L'expression de TGK est donnée en Intensité de fluorescence/Nombrede cellules (UA)
Ces résultats montrent que l'extrait EX3MF1046 induit de façon dose-dépendante l'expression de TGK dans les cultures de NHEK. L'activité est supérieure àcelle de la référence chlorure de calcium, dès la concentration de 5 pg/ml ; l'effetmaximum qui est 4 fois supérieur à celui du CaCI2 est observé à la concentration noncytotoxique de 20 pg/ml.
Influence de l'extrait EX10MF1046, sur l'expression de la TKG, lafilaggrine et la KRT10
La même méthodologie que celle employée pour évaluer l'effet d'unextrait sur l'expression de TGK a été appliquée pour les marqueurs filaggrine et KRT10.
Le tableau 4 présente une évaluation du niveau d'expression des troismarqueurs ci-dessus via le marquage fluorescent des NHEK.
Tableau 4
On observe que la filtration de l'extrait EX3MF1046 maintient l'effet pro-différenciant de l'extrait.
Dans cette expérience, on retrouve l'effet inducteur de TGK et on observeune très forte surexpression de protéine KRT10. Contrairement au calcium qui focalisel'effet sur quelques cellules en les transformant en très grosses cellules différenciées(cornéocytes), EX10MF1046 induit une très forte surexpression de KRT10 dans denombreuses cellules mais n'augmente pas significativement la taille des cellules. Lemécanisme d'action du calcium et de EX10MF1046 sont donc différents et pourraientêtre additionnels ou synergiques. Ceci est confirmé par l'analyse de la filaggrine, quiaugmente (plus modérément) suite au traitement par EX10MF1046, mais sans induirela production caractéristique de granules de filaggrine dans les cellules répondant aucalcium.
Influence de l'extrait EX 10MF1046, sur l'expression d'autres marqueursde la différenciation épidermique L'analyse a été élargie à d'autres marqueurs protéiques de ladifférenciation épidermique, à savoir, la loricine, l'involucrine et la kératine 1 (KRT1). L'influence de EX10MF1046 à 20 pg/ml est étudiée sur l'expression destranscrits des différents marqueurs ci-dessus par les cultures de kératinocytes à l'état
basal. Les traitements sont de 48 h, l'analyse est réalisée par RT-qPCR. Les résultatssont donnés en % des témoins non traités après randomisation des expressionsrelatives par rapport au gène de ménage GAPDH. Ils sont représentés sur la figure 1.
Les analyses en RT-qPCR montrent une surexpression très nette de tousles marqueurs de différenciation en présence de l'extrait ; les stimulations étaientfortes (stimulation d'un facteur 4 à plusieurs dizaines de fois selon les marqueurs) ettoutes supérieurs à celles obtenues avec le calcium, à l'exception du marqueurinvolucrine.
Exemple 3 : Evaluation dans des épidermes reconstruits (RHE) 1) Matériels et méthodes
Epidermes reconstruits RHE produits à partir de kératinocytes de prépuce humain et largementdécrits dans les publications de B\Oalternatives1_4.
Les RHE sont cultivés à 37°C, 5% CO2, à l'interface air-liquide, en milieuEpilife + calcium 1,5 mM et compléments, sans vitamine C. La référence pour lesétudes d'effets pro-différenciants est la vitamine C (50 pg/ml).
Extraits testés
Extrait EX10MF1046, testé à 20 pg/ml, dans le milieu de culture des RHE.
Immunomarquages in situ
Les RHE sont placés à l'interface air-liquide (JO) et cultivés pendant 7 joursen présence ou absence (témoin) de l'extrait EX10MF1046 ou de la vitamine C(référence). A la fin de l'incubation, les épidermes sont rincés puis fixés dans unesolution de formaldéhyde. Les tissus fixés sont déshydratés par des bains d'éthanolsuccessifs et croissants puis inclus en paraffine « Paraplast ». Des coupes transversalessont réalisées au microtome (épaisseur 5 pm) puis maintenues à températureambiante jusqu'à la réalisation des marquages.
Les coupes sont déparaffinées puis les sites antigéniques sont démasquésdans une solution de tampon citrate pH6 (DAKO, S1700). Après lavage en PBS-T, lescoupes sont incubées avec une solution de peroxyde d'hydrogène 3% durant5 minutes. Après lavage, les coupes sont ensuite incubées à température ambiantependant 1 heure avec l'anticorps primaire (anti-TGK, SC-25786 ; anti-KRTIO, SC-23877 ;anti-filaggrine, SC-66192 ; tous de chez Santa-Cruz Biotech). Après lavage, lemarquage est révélé avec un kit de détection streptavidine-peroxydase (DAKO, réf. K0690) couplé au chromogène AEC (DAKO, K346111). Après contre-coloration àl'hématoxyline et lavage en eau ultrapure, les coupes sont montées entre lame etlamelle en milieu aqueux Glycergel (DAKO, C056330). Les coupes sont observées àl'aide d'un microscope NIKON E400. Les images numériques sont enregistrées avecune caméra NIKON DS-Ril et le logiciel NIS-Elements 3.10. 2) Résultats
Le passage à l'interface air-liquide conduit, dans les conditions optimalesde reconstruction épidermique, à une très forte différenciation qu'il est très difficile desur-stimuler. Aussi il convient de se mettre en conditions non-optimales ou légèrementcarencées pour voir l'effet de produits stimulant la différenciation.
Les images numériques obtenues sont présentées à la figure 2.
Dans ces conditions expérimentales présentant une carence (vitamine C),l'extrait EX10MF1046 montre une nette compensation et une forte stimulation del'expression de KRT10, filaggrine et TGK.
Exemple 4 : Effets protecteur des lésions cutanées induites parl'inflammation (psoriasis, dermatites) de l'épiderme ; évaluation dans des épidermesreconstruits (RHE) 1) Matériels et méthodes
Cellules et épidermes reconstruits
Les NHEK sont préparés comme dans l'exemple 2.
Les RHE sont préparés comme dans l'exemple 3 (milieu complet incluantvitamine C). Mélange inflammatoire, référence
Le mélange inflammatoire (mix cytokines, M3) est constituéd'interleukine-17 (IL-17), oncostatine M (OSM) et tumor-necrosis factor alpha (TNFa),toutes provenant de chez R&D Systems, à la concentration finale de 3 ng/ml chaque.
La référence est le « JAK inhibitor 1 » (Calbiochem CAS 457081-03-7) à10 μΜ final.
Extrait testé
Extrait EX10MF1046, testé à 20 pg/ml, dans le milieu de culture des RHE.Analyse des transcrit, RT-qPCR
Les NHEK sont pré-cultivés comme dans l'exemple 2 puis traités pendant24 h avec l'extrait EX10MF1046 (20 pg/ml) ou le JAK inhibitor (10 pM). Le mélange de cytokines est ensuite ajouté aux milieux contenant ou non l'extrait et les cultures sontpoursuivies pendant 24 h. A la fin de l'incubation, les tapis cellulaires sont rincés puis extraits entampon de lyse ; les protocoles et analyses suivants sont les mêmes que ceux del'exemple 2.
Les résultats sont donnés en % des témoins non traités, ils sontreprésentés à la figure 3.
Immunomarquages in situ
Les RHE sont placés à l'interface air-liquide (JO) et cultivés jusqu'à Jll.Puis les RHE sont traités en systémique avec l'extrait EX10MF1046 (20 pg/ml) ou le JAKinhibitor (10 μΜ) pendant 7h. Le mélange de cytokines est ajouté aux milieuxcontenant ou non les produits et les cultures sont poursuivies pendant 48 h.
Le traitement des tissus, les marquages et l'analyse sont réalisés commedans l'exemple 3. Des images numériques des coupes observées sont enregistrées.
Les NHEK ou les RHE sont traités par l'extrait EX10MF1046 ou laréférence, puis par un mélange cytokinique constitué par au moins une cytokineactivant la voie Jak/Stat, soit OSM ou IL-22 (activateurs de STAT-3/1) ; un activateur devoie NF-kB, soit IL-1 ou TNF-α et une troisième cytokine pouvant être l'IL-17(activateur de CREBP) orientant vers une réponse de type psoriasis ou l'IL-4/IL-13(activateur de STAT-6), orientant vers la dermatite atopique 5‘7. A noter que toutes cescytokines sont aussi plus ou moins activatrices des voies MAKPkinases (mitogen-activated protein kinases) chez le kératinocyte. Dans ces mélanges, les cytokinesinductrices de STAT-3/1 (OSM, IL-22) 2‘3’ 7 sont cruciales dans la physiopathologiecutanée, elles sont responsables de l'effet sur la différenciation cutanée et desmodifications morphologiques observées dans ces pathologies. Les autres cytokines,notamment IL-17, TNF-a et IL-1 5‘7 sont plus impliquées et de façon hautementsynergique dans l'induction de l'immunité innée (peptides antimicrobiens) et laproduction de chimiokines responsables du maintien et de l'amplification de la boucleinflammatoire responsable de ces pathologies chroniques 5‘7.
Ce mélange choisi contient l'OSM comme inducteur de STAT-3/1, associéau TNF-a (NF-kB, MAPkinases) et à l'IL-17 (pour donner l'orientation « psoriasis »,Thl7. Ce mélange a un effet inflammatoire hautement synergique qui mime donc lapathologie inflammatoire cutanée au niveau de l'épiderme et en particulier lepsoriasis. Le remplacement de L'IL-17 (cytokine Thl7) par une ou plusieurs cytokinesTh2 (IL-4/IL-13) conduirait à un phénotype cutané plus proche de la dermatiteatopique6. Dans les deux cas, la différenciation anormale de l'épiderme est remarquable, avec perte des marqueurs de différenciation terminale, hyperplasie(etc).
La référence est le « JAK inhibitor 1 », inhibiteur large de voie Jak-Stat ettesté à forte concentration.
Dosages ELISA
Les milieux de culture des RHE à 48h sont prélevés et congelés à -80°C. Lecontenu en IL-8 a été dosé à l'aide d'un kit ELISA spécifique (R&D Systems DY208),selon le protocole préconisé par le fournisseur. 2) Résultats L'influence de l'extrait EX10MF1046 à 20 pg/ml est étudiée surl'expression des transcrits des marqueurs KRT1, KRT10, filaggrine et loricrine, par lescultures de kératinocytes stimulées (ou non (Ctrl-) par un mélange de cytokines (IL-17,OSM, TNFa à 3 ng/ml, mix PSO). Les traitements sont de 48 h au total, l'analyse estréalisée par RT-qPCR.
Les résultats sont représentés sur la figure 3.
Ils montrent que l'extrait EX10MF1046 protège l'épiderme des effets del'inflammation en restaurant l'expression des marqueurs de différenciation tardive,filaggrine et loricrine, et que cet extrait induit une forte surexpression des kératinesKRT1 et KRT10 dans ces conditions. L'extrait EX10MF1046 protège doncpotentiellement des défauts de différenciation de l'épiderme induits parl'inflammation. L'expression de KRT10 par des épidermes reconstruits (RHE analyse à J13)stimulés par le mélange de cytokines IL-17, OSM, TNFa est observée sur les imagesnumériques représentées à la figure 4.
Cette figure montre une restauration partielle mais nette de l'expressionde la protéine KRT10 par le traitement avec l'extrait EX10MF1046 dans les RHE traitéspar le mélange pro-inflammatoire.
La figure 5 montre l'effet inhibiteur de l'extrait EX10MF1046 (à 20pg/ml)de l'expression de chimiokines induite par l'inflammation des kératinocytes. Cet effetrésulte de l'interruption de la boucle inflammatoire en empêchant le recrutement deleucocytes au niveau de la peau lésionnelle. Cet effet s'ajoute aux effets sur ladifférenciation (figure 3) pour contribuer au retour à une homéostasie normale de lapeau (résolution de l'inflammation). D'autre part, comme cela a été vu au niveau des transcrits (figure 5),EX10MF1046 inhibe très fortement l'expression/libération de chimiokines etnotamment l'IL-8 au niveau de la protéine (figure 6), confirmant son effet inhibiteurpotentiel du recrutement de leucocytes (polynucléaires dans le cas de l'IL-8) au niveaudes lésions cutanées (en plus de l'effet positif sur ces mêmes lésions). Ces effets 1)protecteurs des lésions cutanées et 2) limitant l'infiltration leucocytaire dans la peausont résumés dans la figure 7 qui représente schématiquement une boucled'inflammation chronique de la peau (psoriasis...). EX10MF1046 protège donc des effets délétères (lésions cutanées) descytokines produites par les leucocytes (1), tout en bloquant le recrutement desinfiltrats leucocytaires et cassant ainsi le cercle vicieux de l'inflammation chronique(2).
Exemple 5 : Effets sur le renforcement du cheveu 1) Matériels et méthodes
Cultures de follicules de cheveu humain in vitro
Les bulbes de cheveux sont microdisséqués à partir d'un lifting et placésdès l'isolement en milieu de culture (Milieu E de William complémenté; Invitrogen)contenant ou non (témoin), l'extrait à l'essai puis incubés pendant 72 heures. Pourchaque condition, un excès de bulbes est préparé afin d'atteindre la valeur cible de 6cheveux/condition sélectionnés en final.
En fin d'incubation, les cheveux sont congelés à sec en azote liquide etstockés à -80°C jusqu'à l'extraction d'ARN.
Extrait testé
Extrait EX10MF1046, testé à 20 pg/ml, dans le milieu de culture des RHE.
Analyse des transcrit, RT-qPCR L'isolement et le contrôle qualité des ARN sont réalisés comme dansl'exemple 2. L'amplification des ARN et la synthèse des analogues d'ARN biotinylés(ARNa) sont réalisés à l'aide du kit « GeneChip 3'IVT Express » (Affymetrix®).L'hybridation et le marquage sont réalisés à l'aide du kit « GeneAtlas™ hybridization,wash and stain kit for 3'IVT arrays » (Affymetrix"9). L'hybridation des ARNa fragmentéssur la puce Affymetrix® HG-U219 est réalisée sur la station d'hybridation « GeneAtlas™fluidics station » (Affymetrix"9) pendant 20 heures à 45°C. Toutes les procéduresexpérimentales et de normalisation sont réalisées selon les directives du fournisseur. L'analyse est effectuée par microarray full transcriptome sur puceAffymetrix"9 HG-U219. 2) Résultats
Les kératines sont des composants majeurs de la tige pilaire. Uneaugmentation de ces kératines aura potentiellement un impact positif sur ledéveloppement/renforcement capillaire. L'effet de l'extrait EX10MF1046 par rapport au témoin est illustré dans letableau 5 suivant qui donne l'expression de transcrits de marqueurs de différenciationdans des follicules de cheveu humain maintenus en survie in vitro.
Tableau 5
Cette expérience montre que les transcrits de certaines kératines etprotéines associées ont une tendance nette à l'augmentation d'expression, comme laKRT1, la KRT10 et la loricrine. On retrouve en cela les effets sur les kératinocytes. Leseffets sont moins visibles que dans les exemples précédents du fait 1) que le folliculeest moins sensible aux traitements car « protégé » par les feuillets internes et externes(les kératinocytes ne sont pas en contact direct avec le milieu) et par son proprevolume (accessibilité aux kératinocytes internes au follicule) et 2) que la méthodeutilisée par microarrays est moins sensible que la qPCR.
BIBLIOGRAPHIQUES 1) Mcheik JN, Barrault C, Pedretti N, Garnier J, Juchaux F, Levard G, Morel F,Lecron JC, Bernard FX. Foreskin-isolated kératinocytes provide successfulextemporaneous autologous paediatric skin grafts. J Tissue Eng Regen Med.2013 Mar 14. doi: 10.1002/term.l690. [Epub ahead of print] 2) Boniface K, Bernard FX, Garcia M, Gurney AL, Lecron JC, Morel F. IL-22 inhibitsepidermal différentiation and induces proinflammatory gene expression andmigration of human kératinocytes. J Immunol.
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Claims (7)
- REVENDICATIONS
- 1. Utilisation cosmétique d'un extrait de salicaire (Lythrum salicaria L.)pour améliorer et/ou renforcer la fonction barrière de l'épiderme. 2. Utilisation cosmétique d'un extrait de salicaire (Lythrum salicaria L.)pour améliorer et/ou renforcer l'hydratation de la peau ou pour renforcer le cheveu.
- 3. Utilisation cosmétique d'un extrait de salicaire (Lythrum salicaria L.)pour lutter contre la sécheresse de la peau ou pour traiter une peau sèche.
- 4. Utilisation cosmétique d'un extrait de salicaire (Lythrum salicaria L.)pour traiter une peau âgée.
- 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4,caractérisée en ce que l'extrait est obtenu par extraction solide-liquide de salicaire enmilieu hydroalcoolique, par exemple dans une solution aqueuse d'éthanol en uneconcentration variant de 20 à 40% (v/v).
- 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,caractérisée en ce que l'extrait est obtenu à partir des parties aériennes de salicaire.
- 7. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que l'extraitest associé avec un autre agent prodifférenciant de la peau tel que le calcium, lavitamine D et leurs dérivés.
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