WO2018096039A1 - Extraits de plantes du genre tagetes et leurs utilisations - Google Patents

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WO2018096039A1
WO2018096039A1 PCT/EP2017/080224 EP2017080224W WO2018096039A1 WO 2018096039 A1 WO2018096039 A1 WO 2018096039A1 EP 2017080224 W EP2017080224 W EP 2017080224W WO 2018096039 A1 WO2018096039 A1 WO 2018096039A1
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extract
skin
tagetes
acid
roots
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PCT/EP2017/080224
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Jean-François GINGLINGER
Simon DESLIS
Léna EMILE
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Plant Advanced Technologies Pat
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    • C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
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Definitions

  • the present invention is in the field of plant extracts and relates to an extract of plants of the genus Tagetes enriched in leontopodic acid B, a process for preparing such an extract and a cosmetic composition and a pharmaceutical or nutraceutical composition, said compositions comprising as active agent at least one plant extract of the genus Tagetes according to the invention.
  • the subject of the invention is also the use of such an extract of plants of the genus Tagetes, especially as a medicament for the prevention and / or treatment of a neurodegenerative disease, in particular Alzheimer's disease.
  • the application CN101856347 describes a pharmaceutical composition containing leontopodic acid extracted from a plant of the genus Edelweiss, used in the preparation of medicaments for treating hepatitis.
  • Tagetes is a genus of herbaceous plants of the family Asteraceae according to the classical classification, native to Mexico, Central America and western South America. This genus is composed of about thirty species, some of which are cultivated as ornamental (Tagetes erecta) or medicinal (Tagetes patula) and are used in traditional medicine for their antibacterial, antifungal and soothing properties.
  • the aerial parts of plants of the genus Tagetes are known for their medical or cosmetic virtues, in particular via the presence of numerous phenolic compounds.
  • none of the published studies reported the presence of leopatric acid in plants of the genus Tagetes.
  • the inventors have now developed a method for preparing a plant extract of Tagetes enriched in léontopodique acid B (ALB).
  • the inventors have indeed shown that the cultivation of plants of the genus Tagetes, in particular Tagetes patula and Tagetes erecta, under particular conditions, provides an extract of said plants unexpectedly comprising a very high content of leontopodic acid B (ALB), detected for the first time in the genus Tagetes.
  • ALB leontopodic acid B
  • Such a method allows the realization of successive extractions without destroying or altering the survival of the plants.
  • a plant extract according to the invention not only has cosmetic benefits, in particular the treatment or prevention of cutaneous aging and inflammation of the skin, but also a neuroprotective activity of interest for prevention. or the treatment of neurodegenerative diseases, especially Alzheimer's disease.
  • Figure 1 shows a chromatogram of the root extract of Tagetes erecta obtained according to Example 1.
  • Figure 2 shows a chromatogram of the root extract of Tagetes patula obtained according to Example 2.
  • Figure 3 shows the survival, as a percentage of live neurons compared to the control, of primary cortical neurons poisoned for 24 hours by the peptide ⁇ 1-42 added to a final concentration of 20 ⁇ , in the presence of a root extract of Tagetes erecta to concentrations ranging from 10 ng / mL to 10 ⁇ g / mL, according to Example 5.
  • the bars of the histogram represent: control control (1); + peptide ⁇ 1-42 (2); peptide ⁇ 1-42 + root extract of Tagetes erecta 10 nM (3); peptide ⁇ 1-42 + root extract of Tagetes erecta 100 nM (4); peptide ⁇ 1-42 + root extract of Tagetes erecta 1 ⁇ (5); peptide ⁇ 1-42 + root extract of Tagetes erecta 10 ⁇ (6).
  • FIG. 4 shows the growth of the latent neurite network for 24 hours by the peptide of ⁇ 1-42 added to a final concentration of 20 ⁇ , in the presence in the presence of a root extract of Tagetes erecta at concentrations varying from 10 ng / mL at 10 ⁇ g / ml, according to Example 5.
  • control control (1) + peptide ⁇ 1-42 (2), peptide ⁇ 1-42 + root extract of Tagetes erecta 10 nM (3 ), peptide ⁇ 1-42 + root extract of Tagetes erecta 100 nM (4), peptide ⁇ - 42 + root extract of Tagetes erecta 1 ⁇ (5), peptide ⁇ 1-42 + root extract of Tagetes erecta 10 ⁇ (6).
  • the present invention firstly relates to an extract of plants of the genus Tagetes characterized in that it is enriched in leprosy acid B and that it comprises at least 2.5%, in particular at least 5.5%, more particularly at less than 8% by weight of léontopodique acid B, expressed relative to the total weight of the dry extract.
  • the subject of the present invention is an extract of plants of the genus Tagetes enriched in leontopodic acid B and comprising at least 2.5%, at least 3%, at least 3.5%, at least 4%, at least 4%. , 5%, at least 5%, at least 5,5%, at least 6%, at least 6,5%, at least 7%, at least 7,5%, at least 8%, at least 8,5% %, at least 9%, at least 9.5%, or at least 10% by weight of léontopodique B acid, expressed relative to the total weight of the dry extract.
  • Tagetes plant extract is meant the product obtained by the extraction of plants, or a plant, of the genus Tagetes, or “Tagettes”.
  • enriched in leontopodic acid B is meant a plant extract comprising a greater amount of leontopodic acid B, relative to a corresponding plant extract which can be found in nature.
  • leontopodic acid is meant a compound corresponding to the following general formula (I):
  • any three of the radicals Q 1, Q 2, Q 3 and Q 4 represent a caffeoyl group and the fourth radical represents a hydrogen atom or a 3-hydroxybutanoyl group of the formula CH 3 -CH (OH) -CH 2 -CO.
  • léontopodique acid B or “ALB” means a compound having the general formula (I) wherein any three of Qi radicals, Q2, Q3 and Q4 represent an caféoyle group and the fourth radical represents a hydrogen atom 'hydrogen.
  • Acid léontopodique Bl or “ALB1” denotes a compound of formula (I) wherein Q 2, Q 3 and Q 4 represent a group caféoyle and Qi represents a hydrogen atom.
  • léontopodique B2 acid or "ALB2” denotes a compound of formula (I) wherein any three of the radicals Qi, Q2, Q3 and Q4 represent an caféoyle group and the fourth radical represents a hydrogen atom, said compound being characterized in that the mass m / z of the ionized product (otherwise called molecular ion) in negative mode mass spectrometry is 695 and that its chromatographic retention time is greater than that of the léontopodique B1 under the conditions described in Example 1.1.
  • léontopodique B3 acid or "ALB3” denotes a compound of formula (I) wherein any three of the radicals Qi, Q2, Q3 and Q4 represent an caféoyle group and the fourth radical represents a hydrogen atom, said compound being characterized in that the mass m / z of the ionized product (otherwise known as molecular ion) in negative mode mass spectrometry is 695 and that its chromatographic retention time is greater than that of the léontopodique acid B2 under the conditions described in Example 1.1.
  • ALA a compound corresponding to the general formula (I) in which any three of the radicals Qi, Q2, Q3 and Q 4 represents a caffeoyl group and the fourth radical represents a 3-hydroxybutanoyl group of formula CH 3 -CH (OH) -CH 2 -CO-.
  • leontopodic acid A is understood to mean a compound of formula (I) in which Q 2 , Q 3 and Q 4 represent a caffeoyl group and Q 1 represents a CH 3 -CH (OH) -CH 2 CO- group.
  • ALB1, ALB2 and ALB3, and of ALA are therefore acids of general formula (I) substituted with 3 caffeine groups and with an R radical, with R chosen from: a group 3-hydroxybutanoyl and a hydrogen atom, as shown in Table 1 below:
  • Dry extract one understands the extract obtained by the implementation of the method followed by a stage of desiccation of the extract, drying being implemented according to any well known method of l one skilled in the art, in particular to place the extract in a hot and dry atmosphere.
  • Dry root biomass means the dry root biomass determined before proceeding to the root extraction stage. For solid / liquid extraction from fresh root, dry root biomass was measured at 5 ⁇ 1.5% of fresh root biomass.
  • an extract according to the present invention can also be defined in that it comprises at least 0.75% by weight of léontopodique acid B, expressed with respect to the total weight of dry biomass, more preferably at least 1 , 5%, at least 2%, at least 2,5%, or at least 3% by weight of B leontopodic acid.
  • an extract according to the invention is characterized in that said leotopodic acid B comprises the position isomers ALB1, ALB2 and ALB3, said ALB2 isomer being present in a proportion of at least 50%, preferably from less than 80% of the total weight of the léontopodique acid B present in said extract.
  • an extract according to the invention is characterized in that it does not comprise a detectable detectable amount of leontopodic acid A, or that it comprises a small or very small amount of lontopodic acid A, and preferably less than 2%, preferably less than 1.5%, more preferably less than 1% and even more preferably less than 0.5% of lontopodic acid A, as a percentage of the total weight of the leontopodic acid present in said extract .
  • an extract according to the present invention comprises at least 2.5% by weight of léontopodique B acid, expressed relative to the total weight of the dry extract, more preferably at least 5.5%, at least At least 7.5%, at least 7%, at least 7.5%, at least 8% and at least 8.5% by weight of léontopodique B acid expressed relative to the total weight of the dry extract, and includes less of 1.5%, preferably less than 1%, more preferably less than 0.5% of lontopodic acid A, as a percentage of the total weight of the leontopodic acid present in said extract.
  • a plant extract of the genus Tagetes according to the invention is an extract of a species of Tagetes selected from Tagetes erecta and Tagetes patula.
  • an extract of plants of the genus Tagetes is an extract of a part of the plant, that is to say a constituent part of a plant such as the roots, the stem, leaves, flower or seed.
  • the subject of the invention is a root extract of a plant of the genus Tagetes.
  • the subject of the invention is an extract of plants of the genus Tagetes, in particular a root extract, more particularly chosen from:
  • the subject of the invention is a process for preparing a plant extract of the genus Tagetes according to the invention comprising:
  • step b) a step of solid / liquid extraction of the plants optionally stimulated during step b), and
  • the subject of the invention is a process for the preparation of a plant extract of the genus Tagetes according to the invention comprising:
  • step b) optionally a step of stimulating the roots of the plants, c) a step of solid / liquid extraction of the roots optionally stimulated in step b), and
  • the term "cultivation of plants under soil conditions” means any method of cultivation in which the roots of the plant are not in the soil. More specifically, above-ground cultivation is a crop in which the roots of plants rest in a reconstituted environment, detached from the soil. This culture medium is irrigated regularly by nutrient solutions appropriate to the crop plant.
  • Substrate systems include the infra-structure in which the nutrient solution enters the substrate at the bottom and the percolation into which the nutrient solution is distributed by discontinuous irrigation to the upper surface of the system and then drowns downwards.
  • substrate mineral or organic, is neutral and inert like sand, clay or rockwool for example. This substrate can also be of industrial origin.
  • cultivation of plants in aeroponics means an aboveground culture mode for which the roots of the plants are not in contact with a solid medium or even with a liquid medium.
  • the plants are fed with a nutritive mist obtained by misting, via a mist, the nutrient solution in a closed medium.
  • plants can be arranged on trays with the aerial part of the plant above the tray and the root part below, the trays are arranged on tables forming a retention zone for collect the excess of a diffused liquid towards the plants, and one transfers the trays on the tables to different stations.
  • step a) the plants cultivated in aeroponics are fed by root spraying with a nutritive solution of essential mineral salts (N - nitrogen, Phosphorus - P, Potassium - K), in order to obtain maximum root development and a maximum concentration of molecules of interest, without altering the survival of the plant.
  • essential mineral salts N - nitrogen, Phosphorus - P, Potassium - K
  • the skilled person knows how to adapt the proportions and concentrations of different mineral salts to optimize the root development and concentration of the molecules of interest.
  • the mineral salt concentrations of the nutritive solutions are in this case included in a range of low electroconductivity advantageously ranging between 0.4 to 1.6 mS / cm, preferably between 0.6 to 0.8 mS, in order to to promote a greater diversity of molecules in the extracts.
  • step c) of a process according to the invention the term "solid / liquid extraction” is understood to mean any solvent extraction technique which consists in extracting a chemical species present in a solid and being soluble in said solvent.
  • extraction techniques include maceration, exudation, infusion, decoction, extraction with Soxhlet and Kumagawa extractors, microwave assisted extraction, ultrasound-assisted extraction. , enzymatic extraction, supercritical fluid extraction (CO2 + DPG). Extraction leads to the recovery of the contained metabolites in one or the other part of the plants, and in particular the roots, by means of a leaching liquid, or solvent, brought into contact with the cut roots and / or still attached to the plant, in a particular solvent and for a suitable duration.
  • step c) of solid / liquid extraction of the plants or of part of the plants is carried out by means of a process chosen from: exudation and maceration .
  • step c) of solid / liquid extraction of the plants or part of the plants, advantageously the roots potentially stimulated during step b) is carried out by a method selected from: root exudation and root maceration.
  • This step consists in particular of a "soaking" step, during which the roots of the plants are placed in a dipping tank containing a liquid for a predetermined duration.
  • the plants are arranged on a tray with the aerial part of the plant above the tray and the root part below, the tray is raised after soaking, then the liquid contained in the soaking tray is collected.
  • the soaking step is followed by a cutting step in which the aerial part or the root portion of the plants is partially cut to harvest the cut portion. It is possible to extract the substances from the cut parts, in addition to extracting the substances during soaking.
  • the root exudation is carried out on roots still attached to the plant.
  • the root maceration is carried out on freshly cut roots, that is to say, cut for less than 24 hours, and preferably as soon as possible after cutting, ideally just after cutting, said roots being optionally dried after their section and before maceration.
  • the drying of the roots can be achieved by the implementation of any suitable drying process, known to those skilled in the art, and in particular by placing the roots at a temperature of between 40 ° C. and 60 ° C. for 4 hours, preferably in a dry environment.
  • the drying of the roots can in particular be carried out in a ventilated oven.
  • step c) of a method according to the invention comprises bringing the roots into contact with a solvent chosen from: alcohols, glycols and eutectic solvents.
  • a solvent chosen from: alcohols, glycols and eutectic solvents.
  • Said alcohol is preferably chosen from ethanol and methanol, used pure or in the form of an aqueous solution of alcohol, the latter comprising from 10% to 99.9% of alcohol, more particularly between 40% and 90%, and even more particularly between 50% and 85%.
  • Said glycol is a diol in which the two hydroxyl groups are borne by different carbons, and is chosen from: dipropylene glycol, propane 1,3 diol, propane 1,2 diol and butylene glycol, and is used pure or in the form of an aqueous solution of glycol, the latter comprising from 10% to 99.9% of glycol, more particularly between 40% and 90%, and even more particularly between 50% and 85%.
  • Said eutectic solvent is composed of two or more components, which may be solid or liquid and which, in a particular composition, exhibit a sharp decrease in their melting temperature, thereby rendering the mixture liquid. Natural eutectic solvents are mainly composed of amino acids, organic acids, sugars and choline derivatives.
  • choline-glucose chloride (ratio 1: 1), choline chloride-citric acid (ratio 1: 1), chloride of choline - citric acid (2: 1 ratio), choline - sucrose chloride (4: 1 ratio), choline - sucrose chloride (1: 1 ratio), choline chloride - tartaric acid (2: 1 ratio) , choline - xylose chloride (ratio 2: 1), choline - xylose chloride (ratio 3: 1), citric acid - sucrose (ratio 1: 1), citric acid - glucose (ratio 1: 1), glucose - tartaric acid (1: 1 ratio), choline - urea chloride (1: 2 ratio), choline chloride - xylitol
  • the solvent is characterized by an acidic pH, in particular when it is used during the solid / liquid extraction step.
  • said alcohol or said glycol used during a solid / liquid extraction step is characterized by a pH of between 2 and 5, preferably between 2 and 4, more preferably between 2.5 and 3.5.
  • a plant extract according to the invention is characterized by a pH of between 2.5 and 5, preferably between 2.5 and 4 and more advantageously between 3 and 4.
  • the acids used for adjusting the pH of the solvent or extract are preferably phosphoric acid, citric acid or hydrochloric acid. More particularly, said glycol is selected from the following group: dipropylene glycol, propane 1,3 diol, propane 1,2 diol and butylene glycol.
  • Propane 1,3 diol, or trimethylene glycol can be prepared by chemical synthesis according to techniques known to those skilled in the art and described in the literature, it is also commercially available. Said propane 1,3 diol may also be produced by the implementation of a fermentation process under suitable conditions of a living organism, in particular a genetically modified strain of Escherichia coli. The propane 1,3 diol thus obtained is designated by the term "propane 1,3 diol biosourced", such a product is produced and then purified as described in particular in the international application WO 2004/101479 and marketed under the trademark Zemea®.
  • step c) of solid / liquid extraction comprises bringing the roots into contact with propane 1,2 diol or with propane 1,3 diol, and in particular propane 1,3 diol biosourced.
  • step c) of a method according to the invention comprises bringing the roots into contact with a solvent for a period of between 15 minutes and 30 minutes for root exudation and for a period of time between 1 hour and 96 hours, especially between 24 hours and 72 hours, especially between 36 hours and 48 hours for root maceration.
  • a method according to the invention comprises a step of sectioning the roots and then drying the severed roots, prior to the step of macerating said roots, the maceration being carried out by placing the roots in contact with a solvent .
  • the method according to the invention may therefore comprise a first root exudation step carried out by immersion in a solvent of the roots still attached to the plant for a period of between 15 minutes to 30 minutes, followed by a stage of root maceration of the roots. cut from the plant and then dried.
  • the durations of root exudation and / or root maceration are chosen so as to favor the extraction of a large quantity of compounds of interest while not affecting the survival of the plant and without leading to the exhaustion of the plants. resources.
  • the plants, after the root exudation step are aeropically cultured according to steps a) and optionally b) in order to restart their root development and promote the production by the roots of secondary metabolites.
  • a process according to the invention is a process for preparing a root extract of plants of the genus Tagetes.
  • a process according to the invention is a process for preparing a root extract of plants of the genus Tagetes erecta or Tagetes Patula.
  • the subject of the invention is also a method for preparing a plant extract of the genus Tagetes according to the invention comprising:
  • step b) of stimulating plant roots comprises:
  • An elicitation step in which the roots are placed in the presence of a solution comprising at least one agent chosen from: a salt, a surfactant, a solvent, an elicitor of fungal or bacterial origin, a derivative of the acid jasmonic, in particular methyl jasmonate, salicylic acid, an ethylene generator, a chitin, chitosans and / or their mixture, and / or
  • a solution comprising at least one agent chosen from: a salt, a surfactant, a solvent, an elicitor of fungal or bacterial origin, a derivative of the acid jasmonic, in particular methyl jasmonate, salicylic acid, an ethylene generator, a chitin, chitosans and / or their mixture, and / or
  • a step of placing the roots in contact with a solution deficient in nitrogen that is to say a solution comprising a proportion of nitrogen less than the proportion of nitrogen usually considered optimal for the development of the plant and particularly the roots, preferably less than 15% nitrogen, and advantageously not including nitrogen, said steps being sequential or simultaneous.
  • the roots can also be stimulated by placing the plants in contact with a nutrient solution deficient in nitrogen. Placing the plants with a nutrient solution deficient in nitrogen causes a "nitrogen stress" responsible for the stimulation.
  • a solution deficient in nitrogen according to the present invention is a solution comprising less than 15% nitrogen, preferably less than 10% nitrogen, advantageously less than 8%, more preferably less than 6%, less than 5%, less than 4%, less than 3%, less than 2% %, less than 1% nitrogen and still more preferably 0% nitrogen.
  • the stimulation step b) makes it possible to significantly increase the content of secondary metabolites in the roots and thus promote the flow of the metabolites leaving the roots to the solvent chosen for the extraction, without a total loss of viability of the roots. the plant so that it can be put back in culture then reused.
  • the stimulation step of the plant makes it possible to promote the production and secretion of the molecules of interest.
  • step b) of stimulating the roots is carried out by spraying or macerating the plant with a solution of elicitors chosen from jasmonic acid derivatives such as, for example, methyl jasmonate, salicylic acid and chitosans, or by feeding the plant with a nutrient solution N / P / K deficient nitrogen vaporized on the roots.
  • step b) is carried out by spraying or macerating the plant with a solution chosen from:
  • a nutrient solution N / P / K comprising less than 6% nitrogen, said solution being preferably sprayed on the roots.
  • step b) of stimulating the roots with a solution of elicitors is advantageously carried out for a period of between 1 day and 21 days, preferably between 1 and 7 days.
  • step b) of stimulating the roots by feeding the plant with a nutrient solution N / P / K deficient nitrogen vaporized on the roots is advantageously carried out for a period of between 10 days and 8 weeks preferably 3 weeks.
  • the mineral salt concentrations of the nutrient solutions are in a range of low electroconductivity advantageously ranging between 0.4 to 1.6 mS / cm, preferably between 0.6 to 0, 8mS, to promote a greater diversity of molecules in the extracts.
  • step b) is carried out after step a).
  • step b) and step a) are carried out simultaneously, the stimulation solution is then incorporated into the nutrient solution or administered by any other mode of administration. administration known to those skilled in the art.
  • the "soaking" step is preceded by a washing step in which the liquid diffused towards the plants is clear water. This limits the intake of the elements contained in the nutrient solution or in the possible stimulation solution during the soaking step.
  • the subject of the invention is a method comprising the following steps:
  • step b) a step of solid / liquid extraction of the roots stimulated in step b), comprising:
  • said solvent which is identical or different in the first and second phases, is chosen from alcohols, glycols and eutectic solvents, and being used in the pure form or in the form of an aqueous solution of alcohol, glycol or eutectic solvent , and
  • a method according to the invention advantageously comprises an additional step of readjusting the solvent content of the extract, to obtain an advantageous content of at least 50%, and / or an adjustment of the pH of the extract, to obtain a pH advantageously between 3 and 5, preferably approximately 3.5, for the preservation of the extract.
  • a method according to the invention advantageously comprises at least one additional step of purification and / or treatment of the plant extract, such a step is in particular chosen from:
  • At least one filtration in particular nanofiltration and / or sterilizing filtration and / or clarifying filtration,
  • This step makes it possible to obtain the final extract of Tagetes, preferably of Tagetes patula and Tagetes erecta and in particular of Tagetes erecta rich in polyphenols, in particular in léontopodique B (ALB) and its isomers of position.
  • ALB léontopodique B
  • the process according to the invention makes it possible to obtain an extract of plants of the genus Tagetes, preferably Tagetes patula and Tagetes erecta, which is particularly rich in polyphenols, in particular in leontopodic acid B and its isomers.
  • the plant extract obtained by the process described above is rich in a mixture of the different isomers of ALB, such as for example ALB1, ALB2 and ALB3.
  • a chromatogram (FIG. 1) of the analysis of a root extract of Tagetes erecta obtained according to the invention shows that leontopodic acid B is present in this extract in the form of at least three isomers: ALB1, ALB2 and ALB3.
  • ALB2 is the predominantly present isomer.
  • At least 50%, even more preferably at least 80% by weight of said ALBs are in the form of the isomer ALB2, relative to the total weight of leontopodic acid B.
  • the subject of the present invention is also an extract capable of to be obtained by a process according to the invention.
  • the third subject of the present invention is a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising, as active agent, at least one extract according to the invention or an extract obtained by a process according to the invention, and at least one excipient.
  • said extract is an extract of plants of the genus Tagetes, preferably Tagetes patula and Tagetes erecta and in particular a root extract of plants of the genus Tagetes, in particular a root extract of Tagetes patula or Tagetes erecta according to the invention.
  • the modes of administration, the dosages and the optimal dosage forms of a cosmetic composition according to the invention can be determined according to the criteria generally taken into account in the establishment of a cosmetic treatment adapted to a subject such as, for example, the type of skin.
  • the cosmetic composition according to the invention is advantageously intended for topical application. It may especially be in the form of a cream, a milk, a lotion, a gel, a serum, a spray, a mousse, a solution, an ointment, an emulsion, a patch or a mask.
  • a cosmetic composition according to the invention comprises at least one cosmetically acceptable excipient chosen according to the type of administration desired.
  • a cosmetic composition according to the present invention may further comprise at least one adjuvant known to a person skilled in the art, selected among thickeners, preservatives, perfumes, dyes, chemical or mineral filters, moisturizers, thermal waters, etc.
  • a cosmetically acceptable excipient may be chosen from polymers, silicone compounds, surfactants, rheology agents, humectants, penetration agents, oily components, waxes, emulsifiers, film-forming agents, perfumes, electrolytes, pH adjusters, antioxidants, preservatives, dyes, nacres, pigments and mixtures thereof.
  • a cosmetic composition according to the invention may further comprise at least one other cosmetically active agent, such as another anti-aging agent, a moisturizing agent, an agent having a calming, soothing or relaxing activity, a skin microcirculation stimulating agent. a sebum-regulating agent for the care of oily skin, a cleaning or purifying agent, an anti-radical agent, an anti-inflammatory agent, a chemical or mineral sunscreen, etc.
  • another cosmetically active agent such as another anti-aging agent, a moisturizing agent, an agent having a calming, soothing or relaxing activity, a skin microcirculation stimulating agent.
  • a sebum-regulating agent for the care of oily skin such as a cleaning or purifying agent, an anti-radical agent, an anti-inflammatory agent, a chemical or mineral sunscreen, etc.
  • a cosmetic composition according to the invention comprises at least one Tagetes extract according to the invention, and in particular a root extract of Tagetes patula or Tagetes erecta according to the invention, in an amount of between 0.01 and 10%. in particular between 0.05 and 5%, more particularly between 0.1 and 2%, by weight relative to the total weight of the composition.
  • the fourth subject of the present invention is an extract according to the invention, an extract obtained by a process according to the invention, or a cosmetic composition according to the invention, for preventing or slowing skin aging, and / or having a soothing effect or calming of the skin following the sensation of irritation, and / or stimulating the renewal of the epidermis as well as the barrier function of the epidermis and the hydration of the skin, and / or to protect the epidermis from environmental stresses .
  • a cosmetic composition according to the invention may in particular be intended to prevent or slow skin aging.
  • a cosmetic composition according to the invention may also be intended to have a soothing or calming effect on the skin following the sensation of irritation that may develop after shaving, friction, or contact with allergens.
  • a cosmetic composition according to the invention may especially be intended to promote the integrity and effectiveness of the barrier function of the epidermis.
  • a cosmetic composition according to the invention may especially be intended to stimulate the hydration of the skin.
  • the subject of the present invention is a pharmaceutical composition comprising, as active agent, at least one extract according to the invention or an extract obtained by a process according to the invention, and at least one pharmaceutically acceptable excipient, and a composition nutraceutical composition comprising, as active agent, at least one extract according to the invention or an extract obtained by a process according to the invention, and at least one nutraceutically acceptable excipient.
  • the term "pharmaceutically or nutraceutically acceptable” means any ingredient which is useful in the preparation of a pharmaceutical or nutraceutical composition, which is generally safe, non-toxic and neither biologically nor otherwise undesirable and which is acceptable to a pharmaceutical or nutraceutical composition. veterinary use or in humans.
  • salts which are pharmaceutically or nutraceutically acceptable, as defined above, and which possess the desired pharmacological activity of the parent compound.
  • Such salts include:
  • compositions formed when an acidic proton present in the parent compound is either replaced by a metal ion, for example an alkali metal ion, an alkaline earth metal ion or a aluminum ion; is coordinated with a pharmaceutically or nutraceutically acceptable organic or inorganic base.
  • Acceptable organic bases include diethanolamine, ethanolamine, N-methylglucamine, triethanolamine, tromethamine and the like.
  • Acceptable inorganic bases include aluminum hydroxide, calcium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate and sodium hydroxide.
  • the modes of administration, the dosages and the optimal dosage forms of a pharmaceutical composition according to the invention can be determined according to the criteria generally taken into account in the establishment of a pharmaceutical treatment adapted to a subject such as, for example, age or body weight of the patient, severity of his general condition, tolerance to treatment, side effects noted, skin type.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may further comprise at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further comprise at least one adjuvant pharmaceutically known to those skilled in the art, chosen from the thickeners, preservatives, perfumes, dyes, chemical or mineral filters, moisturizers, thermal waters, etc.
  • said pharmaceutical composition comprises at least one extract according to the invention in an amount of between 0.01 and 10%, in particular between 0.05 and 5%, more particularly between 0.1 and 2%, by weight relative to to the total weight of the composition.
  • a pharmaceutical composition is particularly suitable for oral, nasal, transdermal, parenteral, topical, rectal and mucosal administration. It may be in dry form, such as for example: soft capsule, capsule, tablet, lyophilisate, powder, granule, or patch, or in liquid form, such as: solution, suspension, spray, cream or gel.
  • the pharmaceutically acceptable excipient is known to those skilled in the art and is chosen according to the method of administration of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutically acceptable excipient may be chosen from the group consisting of diluents, binders, disintegrants, dyes, lubricants, solubilizing agents, absorption promoters, film-forming agents and gelling agents. , and their mixtures.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may further comprise at least one compound chosen from the group consisting of emollients, moisturizing active agents, activators of keratin synthesis, kératorégulateurs, keratolymila, agents restructuring the cutaneous barrier ( skin lipid synthesis activators, PPAR agonists or Peroxysome Proliferator Activated Receptor), activators of keratinocyte differentiation (retinoids, calcidone®, calcium), antibiotics, anti-bacterial agents, antifungal compounds, anti-cancer agents agents, immunomodulators, such as tacrolimus, pimecrolimus, oxazolines, preservatives, anti-irritants, soothing agents, filters and sunscreens, anti-oxidants, growth, healing agents or eutrophic molecules, drugs and anti-inflammatory agents, drugs and anti-Alzheimer agents.
  • emollients moisturizing active agents
  • activators of keratin synthesis kératorégulateurs, keratolytiques
  • the subject of the present invention is an extract according to the invention or a pharmaceutical composition according to the invention for its use as a medicament.
  • the subject of the present invention is also an extract according to the invention, an extract obtained by a process according to the invention, or a pharmaceutical composition according to the invention or a nutraceutical composition according to the invention, for its use as as a medicament for stimulating antimicrobial defense and / or for ameliorating or treating inflammation of the skin and / or for promoting skin healing, particularly in the case of wound closure.
  • the subject of the present invention is also an extract according to the invention, an extract obtained by a process according to the invention, or a pharmaceutical composition according to the invention, for its use as a medicament for preventing or slowing down aging.
  • cutaneous to have a soothing or calming effect of the skin following the sensation of irritation, to stimulate the barrier function of the epidermis as well as the hydration of the skin.
  • said extract will advantageously be associated with a pharmaceutically acceptable excipient and suitable for cutaneous application
  • said pharmaceutical composition will advantageously contain a pharmaceutically acceptable excipient suitable for cutaneous application.
  • the subject of the present invention is also an extract according to the invention, an extract obtained by a process according to the invention, or a pharmaceutical composition according to the invention or a nutraceutical composition according to the invention, for its use as a medicament for preventing or treating a neurodegenerative disease.
  • neurodegenerative disease means a disease mainly involving deterioration. the functioning, and possibly death, of nerve cells, and in particular neurons. These diseases induce cognitive-behavioral, sensory and motor disorders.
  • said neurodegenerative disease is selected from: Alzheimer's disease, spinocerebellar ataxia, multisystem atrophy, Alexander's disease, Alpers disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Alzheimer's disease. Huntington, Parkinson's disease, Pick's disease, macrophage myofasciitis, progressive supranuclear palsy, multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis.
  • a neurodegenerative disease may be a neurodegenerative disease due to oxidative stress. This is particularly the case of Alzheimer's disease.
  • Alzheimer's disease is defined as a disease that primarily affects persons over 65 years of age, who have various clinical symptoms, such as progressive decline in memory, thinking, language, and ability to learning.
  • the toxic role of ⁇ -amyloid peptide ( ⁇ ) has now shifted from insoluble ⁇ -fibrils to smaller soluble aggregates of ⁇ -oligomers.
  • Soluble de ⁇ soluble oligomers isolated from the cortex of patients with Alzheimer's disease have been shown to directly induce hyperphosphorylation of Tau protein (T) and neurite degeneration (Jin M, et al., Soluble amyloid).
  • beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration Proc Natl Acad Sci US 2011 Apr 5; 108 (14): 5819-24).
  • all substances having a reducing property of ⁇ -peptide neurotoxicity may be useful as a novel therapeutic agent for the treatment or prevention of Alzheimer's disease.
  • the subject of the present invention is therefore an extract according to the invention, an extract obtained by a process according to the invention, or a pharmaceutical composition according to the invention, for its use as a medicament for preventing or treating Alzheimer's disease.
  • the present invention also relates to a method of cosmetic skin care to prevent or delay the appearance of the effects of aging skin, and / or have a soothing or calming effect of the skin following the feeling of irritation and / or stimulate the renewal of the epidermis as well as the barrier function of the epidermis and the hydration of the skin, and / or to protect the epidermis from environmental stresses, said method being characterized in that it comprises application, on at least a portion of the skin of the body or face, of a cosmetic composition according to the invention.
  • the cosmetic composition is applied to a subject in need thereof, in particular in anticipation of or following a single or repeated exposure of the skin to oxidative stress.
  • the latter can generate an excess of free radicals that can accelerate the signs of skin aging.
  • the invention finally relates to a method for preventing and / or treating a neurodegenerative disease, in particular one of the diseases mentioned above, and particularly Alzheimer's disease, comprising the administration of a therapeutically therapeutic amount. effective of at least one compound of an extract according to the invention, an extract prepared by a process according to the invention, a nutraceutical composition according to the invention or a pharmaceutical composition according to the invention to a patient in need.
  • the invention relates to a method for preventing or slowing skin aging, for reducing skin inflammation, for having a soothing or calming effect on the skin following the sensation of irritation, to stimulate the barrier function of the skin.
  • the present invention also relates to a nutraceutical composition comprising an extract according to the invention, or an extract obtained by a process according to the invention, and a nutraceutically acceptable excipient, for improving cognitive functions in a patient suffering from a neurodegenerative disease, and especially Alzheimer's disease.
  • the nutraceutically acceptable excipient is known to those skilled in the art and is chosen from excipients compliant with international regulations applicable to food additives.
  • other botanical extracts known to those skilled in the art may also be added to a nutraceutical composition according to the invention for improving cognitive functions in a patient suffering from a neurodegenerative disease, and particularly the disease of Alzheimer.
  • These botanical extracts can be chosen from extracts of plants or a part of plants (for example root, stem, leaf, flower, seed, bud, fruit) such as citrus (orange, lemon, grapefruit), the genus Rosa ( rosehip, rosebush), Panax ginseng, Bacopa monnieri, blackcurrant, Ginkgo biloba, vine, savory, rosemary, alder, walnut, olive tree. Examples 1 to 4 below and Figures 1 to 4 are intended to illustrate the present invention without limiting the scope thereof.
  • Tagetes erecta extracts are prepared from plants originating from Reunion Island.
  • the supplier is the Horticultural Company of Basin Flat, EARL Bassin Flat 31, Way of the Cross of Jubile 97410 Saint Pierre, Reunion Island.
  • a polyphenolic root extract of Tagetes erecta, rich in ALB is obtained according to the following process: • Culture of Tagetes erecta in aeroponia with a defined nutrient solution, composition N / P / K corresponding to 15/10/30 and electroconductivity between 0.4 and 1.6 mS / cm,
  • the extract is purified (removal of salts by nanofiltration), concentrated by nanofiltration and clarified by clarifying filtration, and
  • ALBs The quantification of ALBs is done through a standard range prepared from a standard of commercial ALBl provided by Extrasyntician (Genay, France) solubilized in the extraction solvent and acidified to pH 3.5 with phosphoric acid. The concentrations of all isomers of ALB are thus expressed in ALB1 equivalents in each extract.
  • Figure 1 a chromatogram of the root extract of Tagetes erecta obtained according to Example 1.
  • the apparatus used to analyze the extract is a UPLC Shimadzu Nexera X2 (LC-30AD pumps, sample changer SIL- 30AC, CTO-20A furnace, SPD-M20A diode array detectors, Kyoto, Japan) operating in reverse phase with a Kinetex biphenyl column (00F-4622-AN, Phenomenex, Torrance, CA, USA) of dimensions 150 mm x 2.1 mm, 2.6 pm.
  • a Kinetex biphenyl column (00F-4622-AN, Phenomenex, Torrance, CA, USA) of dimensions 150 mm x 2.1 mm, 2.6 pm.
  • the mobile phase consists of a solvent A (Mili-Q ultrapure water, Merck Millipore + 0.1% formic acid, Carlo Erba, Val-de-Reuil, France) and a solvent B (Acetonitrile, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany) whose gradient was programmed as follows: 5-20% B (0-3.5 min), 20-27.5% B (3.5-8 min), 27.5-90% B (8- 8.1 min), 90% B (8.1-10 min), 90-5% B (10-10.1 min), 5% B (10.1-12 min).
  • the analysis rate is 0.5 mL / min with an oven temperature of 40 ° C.
  • a diode array detector records the UV spectra between 220 and 370 nm.
  • the device is coupled to a mass spectrometer (Shimadzu LCMS-2020) operating with electrospray ionization (4.5 kV) in positive and negative mode in a range of m / z between 100 and 1000.
  • the software LabSolutions (version 5.60 SP2) is used to operate the system.
  • the extract to be analyzed is filtered on a 0.2 ⁇ m filter before injection.
  • Tagetes erecta are cultivated in aeroponia with a 15/10/30 (nitrogen / phosphorus / potassium) culture medium having an electroconductivity of 0.4 to 1.6 mS / cm, then the roots are stimulated for a period of 2 to 4 weeks by nitrogen stress by the use of a nutrient solution N / P / K comprising: less than 6% of nitrogen, 15% of phosphorus and 40% of potassium, and an electroconductivity of 0.6 to 0.8 mS / cm.
  • the roots are cut and then dried for 48 hours in a ventilated oven at a temperature between 40 and 50 ° C.
  • the quantification of the ALBs is performed according to the material and methods described above in Example 1.1.
  • Root or leaf extracts are prepared from roots and dried leaves of Tagetes patula, native to Reunion Island.
  • the supplier is the Horticultural Company of Basin Flat, EARL Bassin Flat 31, Way of the Cross of Jubile 97410 Saint Pierre, Reunion Island.
  • the plants at the 2-leaf stage are cultured in aeroponia with a 6/10/36 (nitrogen / phosphorus / potassium) culture medium having an electroconductivity of 0.7 mS / cm. After 2.5 weeks of aeroponic culture, fresh roots and leaves are cut and then dried for 48 hours in a ventilated oven at a temperature between 40 and 50 ° C.
  • the root extract of Tagetes patulae according to the chromatogram presented in FIG. 2 has the following characteristics:
  • Figure 2 is presented a chromatogram of the root extract of Tagetes patula obtained according to Example 2, the material and methods used to perform the chromatography are identical to the materials and methods of the chromatography of Example 1.1.
  • the study consists in measuring the effects of Tagetes erecta extract by qRT-PCR on microfluidic TaqMan maps, on the one hand, on the expression of 94 genes involved in the dermal biology, the remodeling of connective tissues and the aging ("Dermal Benefits" card defined by StratiCELL) and, on the other hand, on the expression of 94 genes involved in the key functions of the epidermis, such as the barrier function directly related to hydration, the response antioxidant, or pigmentation by melanocytes ("Epidermal Benefits" card defined by StratiCELL).
  • the protocol consisted in adding Tagetes erecta extract in the monolayer human fibroblasts NHDFs (Normal Human Dermal Fibroblasts) culture medium and reconstituted melanized human epidermis. (RHE / MEL / 001), and, after 24 h, to analyze the different populations of RNA to identify genes differentially expressed by qRT-PCR.
  • NHDFs Normal Human Dermal Fibroblasts
  • a preliminary cytotoxicity study defined the working concentration of Tagetes erecta extract for the gene expression study.
  • TGF- ⁇ Transforming Growth Factor-beta-1
  • vitamin D3 1 ⁇ , 25-dihydroxyvitamin D3
  • the Tagetes erecta plants are cultivated in aeroponics according to Example 1.
  • the fresh roots are cut and then macerated at room temperature for 24 hours in a 70/30 aqueous ethanolic solution (ethanol / water - v / v).
  • the extract is filtered.
  • the solvent is removed using a rotary evaporator and the powder dried in a desiccator.
  • An analysis by liquid chromatography coupled with mass spectrometry made it possible to verify the presence of léontopodique acid B in the extract.
  • the first part of the study was performed on NHDFs human dermal fibroblasts (ATCC, CRL-2522, origin: foreskin) grown in a monolayer in DMEM medium (Invitrogen, 31885-049) containing antibiotics (Penicillin / Streptomycin, Invitrogen , 15140-122) but not containing serum. These cells were maintained in a humid atmosphere at 37 ° C containing 5% CO 2.
  • the second part of the study was performed on reconstituted epidermis (StratiCELL®, RHE / MEL / 001) with or without primary human NHEMs melanocytes (Normal Human Epidermal Melanocytes) from a dark phototype donor (phototype IV to V) (Invitrogen, C2025C, Lot No. 439684).
  • the tissues were cultured at the air-liquid interface for 14 days in a suitable culture medium, and a humid atmosphere at 37 ° C containing 5% CO 2. Determination of the range of study concentrations of Tagetes erecta extract by a preliminary cytotoxicity study
  • NHDFs fibroblasts performed 30.1 and 30.7 population doublings and NHEM melanocytes were seeded in 24-well plates 24 h prior to application of the actives.
  • Reconstituted epidermis (RHE / 001, lot CB0314 / 2) was transferred to a 12-well plate before being treated with the extract.
  • the extract was diluted in the culture medium and then added, without prior filtration, to the culture medium of human fibroblasts NHDFs containing no serum, in the medium of human primary melanocytes NHEMs, or in the culture medium of differentiated epidermis.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • NHDFs fibroblasts and melanocytes NHEMs: 0.16 ⁇ g / ml, 0.8 ⁇ g / ml, 4 ⁇ g / ml, 20 ⁇ g / ml, 100 ⁇ g / ml;
  • Reconstituted Epiderms 4 ⁇ g / ml and 20 ⁇ g / ml.
  • the extract was added, at a selected concentration, in the culture medium of the human fibroblasts NHDFs (having carried out 30.5 and 30.8 doublings of population) in the absence of serum or in the culture medium of the differentiated melanized epidermis ( RHE / MEL / 001, lots CB0314 / 3 and CB0314 / 4), without filtration prior to contacting the cells / epidermis.
  • RNAs were then stored at -80 ° C.
  • RNA concentration was determined by spectrophotometric measurement. The quality and integrity of the RNAs were then verified by capillary electrophoresis (Agilent Bioanalyzer 2100 Platform - Agilent RNA 6000Nano Kit, 5067-1511).
  • RNAs by Spectrophotometric Measurement: an aliquot of each RNA was diluted in RNase-free water and its concentration was determined using an Ultrospec 1100 Pro spectrophotometer (Amersham).
  • RNA Integrity by Agilent Bioanalyzer Capillary Electrophoresis Integrity of total RNA was assessed by visualization of electrophoresis peaks corresponding to ribosomal RNAs.
  • ribosomal band size should be 1.9 kb for 18S-RNA and 4.7 kb for 28S-RNA.
  • the intensity of the band corresponding to the 28S-RNA must be greater than the intensity of the band corresponding to the 18S-RNA.
  • Small diffuse bands representing RNAs of lower molecular weight (tRNA and 5S ribosomal RNA) may be present. When the RNA is degraded, banding of the ribosomal RNA and a background of the higher molecular weight RNAs are observed.
  • RNA-to-cDNA Kit Applied Biosystems, 4387406
  • cDNA synthesis a mix was prepared according to the supplier's instructions, with 2 ⁇ g of total RNA, the ad hoc buffer provided in the kit and the reverse transcriptase enzyme. This reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour, then 5 minutes at 95 ° C and finally the cDNA samples were set on ice and stored at -20 ° C.
  • the real-time qPCR method was used to quantify the expression of different specific targets in the NHDF fibroblast populations treated with TGF- ⁇ (20 ng / ml) as well as melanized epidermides treated with vitamin D3. ( ⁇ ) and ethanol solvent (0.1% EtOH), used to solubilize VD3.
  • the target sequences of the genes of interest were amplified by PCR using "TaqMan Gene Expression Assays" (Applied Biosystems). These kits include a TaqMan probe and 2 specific primers, which were premixed at a concentration of 18 ⁇ for each primer and 5 ⁇ M for the probe. This mixture is concentrated 20 times.
  • the TaqMan probes were grafted with a fluorophore (FAM) at the 5 'end of the sequence and with a 3' fluorescence quencher.
  • FAM fluorophore
  • PCRs were performed using the 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). The reactions were carried out in a volume of 20 ⁇ l. The reaction mixture contains 10 ⁇ L of TaqMan Fast Universal Master Mix (Applied Biosystems), 1 ⁇ L of TaqMan Gene Expression Assay and 5 ⁇ L of RNase-free water. In each well of a 96-well microplate, 16 ⁇ l of the mixture and 4 ⁇ l of cDNA (4 ng) were added.
  • reaction mixtures with probes and primers corresponding to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) for fibroblasts and ⁇ 2-microglobulin (B2M) for melanized epidermis were also prepared with the same samples.
  • cDNA A control without cDNA served as a negative control of amplification.
  • the thermal cycles were programmed with an incubation step at 50 ° C for 2 min, followed by a first denaturation step at 95 ° C for 10 min.
  • the PCR amplification protocol was continued with 40 cycles of 15 sec at 95 ° C followed by a min at 60 ° C.
  • the relative quantitation of the transcripts was carried out by the use of a calculation method which consists in comparing the average of the control values (Ct) obtained for the TGF- ⁇ (20 ng / ml) and VD3 ( ⁇ ) conditions with the respective control conditions (untreated CTL and 0.1% CTL ethanol). These Ct represent the detection threshold at which the amount of DNA is such that the signal differs significantly from the background noise.
  • This average Ct value was normalized to a household gene, namely Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) for NHDF fibroblasts and ⁇ 2-microglobulin (B2M) for reconstituted melanized epidermis.
  • GPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • B2M ⁇ 2-microglobulin
  • the results were exported from the real-time qPCR device using the SDS RQ Manager software (v1.2.1, Applied Biosystems) and the analysis of the expression modifications was performed using the Data Assist software ( V3.0., Applied Biosystems) designed to perform the relative quantification of gene expression using the Ct ( ⁇ :) comparison method (Pfaffl, 2001 and Livak and Shmittgen, 2001) described in the paragraph above and a combination of statistical analyzes.
  • the calculation method of ⁇ : consists of comparing the Ct values obtained for the conditions treated by the extract with the reference condition (DMSO control).
  • RNA populations demonstrate the presence of narrow peaks, corresponding to the 18S and 28S ribosomal RNAs, and a balanced ratio between the two peaks.
  • NGF-Hs00171458_m l Beta-nerve growth factor
  • Table 2 List of genes that vary significantly 24 hours after the application of the root extract of Tagetes erecta (at 100 ⁇ g ES / ml) on human dermis fibroblasts NHDFs.
  • the gene symbol and the test number, the name of the genes, the relative expression (RQ) with respect to the 1% DMSO vehicle (RQ> 1: increase - RQ ⁇ 1: decrease) and the p value (p -value) are presented.
  • the Tagetes erecta extract remarkably induces the expression of the superoxide dismutase 2 (SOD2) gene (X 13.6).
  • SOD2 superoxide dismutase 2
  • This regulation is coupled with the overexpression of other genes involved in the response to oxidative stress, such as HMOX1 (heme oxygenase 1 (X2, 1)), TXRND1 (thioredoxin reductase 1 (XI, 6)), NQO1 (NAD (H) dehydrogenase, quinone 1 (XI, 6)), MT2A (metallothionein 2A (XI, 5)) and G6PD (Glucose-6-phosphate dehydrogenase (X1.2)).
  • HMOX1 heme oxygenase 1 (X2, 1)
  • TXRND1 thioredoxin reductase 1 (XI, 6)
  • NQO1 NAD (H) dehydrogenase, quinone 1 (XI,
  • the superoxide dismutase 2 encoded by the SOD2 gene is a mitochondrial protein involved in the first line of defense against reactive oxygen species. In fact, it converts the superoxide anion into hydroperoxide, which itself is converted into oxygen and water by catalase and peroxyredoxins.
  • NAD (H) dehydrogenase, quinone 1 (NQO1) is another detoxifying enzyme that promotes, by reduction, the formation of hydroquinones from quinones, preventing the production of radical species.
  • the NQO1 gene is overexpressed in response to pro-oxidants, heavy metals, UV or ionizing radiation to protect the cell from its harmful effects.
  • Glucose-6-phosphate dehydrogenase encoded by the G6PD gene is the first enzyme in the pentose phosphate pathway. It catalyzes the oxidation of glucose-6-phosphate to 6-phosphoglucono-5-lactone. This reaction is coupled with the reduction of a NADP + molecule to NADPH, necessary for the reduction of glutathione GSSG (oxidized form) to glutathione GSH (reduced form), a powerful antioxidant.
  • Metallothioneins including metallothionein 2A (MT2A), are low molecular weight proteins capable of binding metals. They are involved in various biological functions such as the neutralization of free radicals, the storage of zinc or in the protection against the toxicity of cadmium.
  • MMT2A metallothionein 2A
  • the HMOX1 gene encoding the HO-1 protein or heme oxygenase is often overexpressed in response to stress, and plays a crucial role in protecting and maintaining cellular homeostasis.
  • the HO-1 protein is involved in the degradation of Theme (having prooxidant properties) in carbon monoxide, ferrous iron and biliverdin. These last 2 components are the precursors of the antioxidants bilirubin and ferritin. HMOX1 is therefore known for its protective role against oxidative stress.
  • the thioredoxin system is one of the major antioxidant defense systems.
  • thioredoxin reductase catalyzes the transfer of electrons from NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) to thioredoxin, which itself has a reducing effect on various target proteins.
  • NADPH Natural Acidamide Adenine Dinucleotide Phosphate
  • the isoform 1 encoded by the TXRND1 gene is the most studied. It is known to be in particular under the transcriptional control of the Nrf-2 transcription factor playing a major role in the antioxidant defense.
  • the overexpression of 6 genes involved in the antioxidant defense demonstrates the ability of the extract to reduce the effects of pro-oxidant stress generating an excess of free radicals, such as UV accelerating the signs of aging at the level of skin, or to fight against various pathologies or pro-inflammatory conditions, also generating reactive oxygen species.
  • the extract is clearly positioned with respect to a cosmetic claim related to the control of the production of free radicals, in an anti-aging or anti-inflammatory way.
  • ECM extracellular matrix
  • DCN Decorin
  • the collagens III (COL3A1) and XVI (COL16A1) play a role in maintaining the homeostasis of the ECM and are therefore important for the strength and elasticity of the dermis.
  • Heparanase encoded by the HPSE gene plays a role in the degradation of heparan sulfate (HS), basement membrane components present at cell membranes where they are associated with other proteins to form proteoglycans (including the perlecan, syndecans and glypicans).
  • Fibulin-5 (FBLN5) plays a major role in the assembly of elastic fibers in the dermis.
  • NTRK2 X0.6
  • NGFR X0.06
  • the latter code for neurotrophin receptors, responsible for the sensation of pain. Under-expression of these genes could promote a soothing or calming effect on the skin due to an inflammatory condition or irritation that develops after shaving, friction, or contact with allergens.
  • Neurotrophins are part of a family of growth factors controlling the development, maintenance and apoptosis of neuronal cells. Neurotrophins also exert multiple non-neuronal functions: they regulate proliferation and cell differentiation, apoptosis and tissue remodeling, especially in the skin.
  • Dermal fibroblasts and myofibroblasts synthesize and secrete neurotrophins such as Nerve Growth Factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or neurotrophin-3 (NT-3).
  • NGF Nerve Growth Factor
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • NT-3 neurotrophin-3
  • the effects of neurotrophins are mediated by their receptors also expressed by fibroblasts.
  • P75 NTR is able to bind all neurotrophins.
  • NGF neurotrophic factor
  • a neurotrophic factor initially described as a survival factor for neurons in the central nervous system, but also at the level of sensory neurons or nociceptors of the skin. NGF also plays a role in inflammation. In fact, the neutralization of NGF inhibits the sensitization of sensory neurons (nociceptors), with the effect of reducing the perception of pain associated with an inflammatory state.
  • the extract induces a decrease in the expression of genes coding for neurotrophin receptors, including in particular the TrkB (NTRK2) (X 0.06) and p75 NTR (NGFR) (X 0.06) receptors and NGF. It may therefore promote a soothing or soothing effect on the skin due to an inflammatory condition or irritation that develops after shaving, friction, or contact with allergens.
  • NTRK2 TrkB
  • NGFR p75 NTR
  • the extract promotes a soothing or soothing effect on the skin due to an inflammatory condition or irritation that develops after shaving, friction, or contact with allergens.
  • vitamin D3 100 nM was studied as a validation control. Since vitamin D3 was solubilized in ethanol, a "solvent ethanol" condition was used as a control condition. After 24 h of culture, the total RNA populations were extracted, their integrity was analyzed by capillary electrophoresis, and the gene expression differences were analyzed by q RT-PCR using Taq Man 96- well, targeting the key functions of the epidermis.
  • Table 3 List of genes that vary significantly 24 hours after the application of the root extract of Tagetes erecta (at 20 ⁇ g ES / ml) on reconstructed epidermis.
  • the gene symbol and the test number, the name of the genes, the relative expression (RQ) with respect to the DMSO vehicle at 0.2% (RQ> 1: increase - RQ ⁇ 1: decrease) and the p value (p-value) are presented.
  • the extract increases the expression of the genes HRNR and AQP5.
  • the extract acts as an inducer of the expression of the gene encoding hornin (HRNR), with an amplitude of 3.6.
  • Hornerin is a protein present in the stratum corneum and the granular layer of the epidermis. Recent work shows that this protein is structurally quite close to pro-filaggrin (precursor of filaggrin).
  • Hornerin is an essential protein for the mechanical resistance of the stratum corneum. It is indeed a major constituent of the horny envelope, a substrate of transglutaminase-3 and located at the periphery of corneocytes. An antimicrobial defense role has also been demonstrated for certain peptides derived from hornerin. It has also been shown that HRNR is under-expressed in vivo in many cases of atopic dermatitis. The fact that hornerin is induced by a UV skin treatment or after "tape stripping" suggests a role of this protein in the integrity of the barrier function of the skin after restoration of the latter following stress caused by exposure to the sun or mechanical friction related for example to shaving.
  • the extract also induces the overexpression of AQP5 (X1,9) encoding aquaporin-5, a membrane protein acting as a water transporter across the plasma membrane and thus playing an important role in the hydration of the plasma. 'epidermis.
  • the extract Because of its positive effect on the expression of a protein (hornerine) essential for the stratum corneum and the granular layer of the epidermis, the extract demonstrates a positive role in the integrity and effectiveness of the function barrier of the epidermis.
  • hornerine essential for the stratum corneum and the granular layer of the epidermis
  • the extract plays a positive role in the hydration of the skin.
  • MMPs are metalloproteinases capable of cleaving most of the components of the ECM and modifying, by proteolysis, many molecules important for skin healing.
  • MMP1 plays a major role in the reepithelialization of keratinocytes, which is essential in the healing process of skin wounds.
  • MMPl facilitates assembly of ECM, cell elongation and migration, actin cytoskeleton reorganization, and induces ERK kinase activation (extracellular signal-regulated kinase) required for motility and ability to invasion of epithelial cells.
  • ERK kinase activation extracellular signal-regulated kinase
  • a transcriptomic study on a DNA chip was carried out from human fibroblasts (NHDFs) and human keratinocytes (NHEKs) treated during 24 hours. hours by a root extract of Tagetes erecta. Variations in gene expression have been contextualized and interpreted biologically through the proprietary StratiCELL Skin Knowledge database.
  • NHDFs human fibroblasts
  • NHEKs human keratinocytes
  • a root extract of Tagetes erecta was prepared according to Example 1.1.
  • NHDFs dermal fibroblasts Normal Human Dermal Fibroblasts
  • ATCC / LGC promoChem, CRL-2522, origin: foreskin were cultured in a monolayer in DMEM medium (Invitrogen, 31885-049) without serum and containing antibiotics (penicillin / streptomycin, Invitrogen, 15140-122).
  • the cells were maintained in a humid atmosphere at 37 ° C containing 5% CO 2.
  • NHDFs fibroblasts and the NHEK keratinocytes were inoculated in 24-well plates 24 hours before the application of the extract, in DMEM medium (INVITROGEN, 31885) containing antibiotics (penicillin / streptomycin, INVITROGEN, 15140) in the presence of 10%. serum for NHDFs or in Epilife medium (INVITROGEN, M-EPI-500 A) containing the HKGS supplement (INVITROGEN, S-001-K) and gentamycin (INVITROGEN, 15710-049) for NHEKs.
  • the extract was solubilized in the appropriate culture medium and then placed in contact with NHDFs fibroblasts or NHEK keratinocytes for 24 hours.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Fibroblasts NHDFs and keratinocytes NHEKs 3%, 1%, 0.33% 0.11%, 0.037% Cell treatment
  • RNA populations were extracted. The extraction was carried out using the RNeasy kit (Qiagen). After 24 hours of treatment, the cells were rinsed with PBS and lysed in ad hoc buffer. The extraction and purification of the RNAs were carried out according to supplier's instructions. Total RNAs were then stored at -80 ° C for transcriptomic analysis.
  • RNA concentration was determined by spectrophotometric measurement. The quality and integrity of the RNAs were then verified by capillary electrophoresis (Agilent Bioanalyzer 2100 Platform - Agilent RNA 6000Nano Kit, 5067-1511).
  • RNA quantification by spectrophotometric measurement an aliquot of each RNA was diluted in RNAse-free water and its concentration was determined using an Ultrospec 1100 Pro spectrophotometer (Amersham).
  • RNA Integrity by Agilent Bioanalyzer Capillary Electrophoresis Integrity of total RNA was assessed by visualization of electrophoresis peaks corresponding to ribosomal RNAs. For total RNAs of higher eukaryotes, ribosomal band size should be 1.9 kb for 18S-RNA and 4.7 kb for 28S-RNA. The intensity of the band corresponding to the 28S-RNA must be greater than the intensity of the band corresponding to the 18S-RNA.
  • RNA and 5S ribosomal RNA Small diffuse bands representing lower molecular weight RNAs (tRNA and 5S ribosomal RNA) may be present. When RNA is degraded, banding of ribosomal RNA and background noise of the higher molecular weight RNAs are observed.
  • the fourth replica serves as a back-up.
  • RNA samples (50ng) were amplified using Ribo-SPIA technology, according to 3 steps (Ovation Pico WTA System V2, NuGEN, 3302-12) and purified with the Agencourt RNA Clean up XP Beads Kit ( Agencourt - Beckam Coulter Genomics, A29168). For each sample, 5 ⁇ g was fragmented and labeled with biotin, using the NuGEN Encore Biotin Module (NuGEN, 4200-12). Hybridization was performed on DNA chips of GeneChip Model Human Gene 2.0 ST (Affymetrix, 902112). The hybridization steps on chip, washing and fixation, were carried out according to the protocol defined by Affymetrix.
  • the hybridization solution was prepared using the Affymetrix Genechip Expression 3 'Amplification Reagent Hybridization Controls kits (Affymetrix, 900454) and Hybridization Module for GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit (Affymetrix, 900720), and blended with complementary DNA (CDNA) amplified in the previous steps.
  • Hybridization was carried out for 18 h in the GeneChip Hybridization Oven 640 (Affymetrix, 800139). The washing and revelation were performed using the GeneChip Fluidics Station 450 fluidic station (Affymetrix, 00-0079) and the intensity measurements were scanned with the GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).
  • Raw data processing was performed with the R (v3.2.3) software and the oligo package (vl .34.2) of the BioConductor project (v3.2, Gentleman R. et al., Genome Biology 2004, 5, R80 ).
  • the over-representation analysis was performed using the hypergeometric test method in order to characterize the dermo-cosmetic themes / groups of interest factors based on the proportion of their detected and differentially expressed targets.
  • the analysis was conducted at the beginning of the list of genes detected with a p-value of 0.05 and a difference of the level of expression (rate of change or fold-change or FC) greater than 1.5 (b). lateral). 4.2. Results
  • the optimal concentrations (in% v / v) selected for the extract and its solvent are as follows: Extract and solvent (propane 1,2 diol) for 3% NHDFs fibroblasts and for 1% NHEKs keratinocytes.
  • the ratio of absorbance at 260nm and 280nm is used to assess the purity of the RNA. A ratio close to 2 makes it possible to consider the sample as pure and devoid of contamination by proteins.
  • the 260/230 ratio is used as a secondary measure of purity of the sample.
  • the 260/230 value is generally higher than the 260/280 ratio and is expected to be around 2.2.
  • the ratios obtained for all the samples of the present study are therefore satisfactory (data not shown) and were subsequently qualified by capillary electrophoresis.
  • RNA populations demonstrate the presence of narrow peaks, corresponding to 18S and 28S ribosomal RNAs, and a balanced ratio between the two peaks.
  • RNAs As the quality and integrity of the extracted RNAs have been demonstrated, they have been used for the continuation of the protocol and involved in the reactions. amplification, purification, biotin labeling and hybridization on microarrays.
  • the human epidermis is a stratified epithelium constituting a barrier whose layers are defined by the stage of differentiation of the cells that compose them. As they are differentiated, the keratinocytes are loaded into keratin filaments and contain a matrix retaining the water, all surrounded by the horny envelope. Terminal differentiating keratinocytes are isolated by intercorneocyte lipids and are attached to each other by corneodesmosomes.
  • Basal keratinocytes progress through the four layers of the epidermis: basal, thorny, granular and horny.
  • the basal layer is formed by a single layer of cubic or prismatic keratinocytes linked together by desmosomes. In this layer the cells divide, one of the two cells remains in the basal layer while the other migrates to the upper layers.
  • Basal keratinocytes are attached by hemi-desmosomes to a basement membrane that separates the epidermis from the dermis and forms the dermal-epidermal junction.
  • the spinous layer is formed by 5 to 15 layers of polygonal keratinocytes linked together by desmosomes. These cells contain tonofilaments, the precursor filaments of keratin.
  • the granular layer is formed by 3 layers of keratinocytes which contain keratohyaline grains and lamellar granules.
  • the stratum corneum is formed from 5 to 15 layers of corneocytes, i.e. differentiated keratinocytes which no longer have nuclei and organelles, but are surrounded by a horny envelope. They are loaded with keratin filaments.
  • keratin filaments (called tonofilaments) become more numerous and begin to aggregate in the cells of the spinous layer to form the tonofibrils. At the level of the granular layer, they associate with keratohyaline granules.
  • the epidermis requires the maintenance of a water gradient between the deep layers (water content ⁇ 70%) and the surface layers (water content ⁇ 20%). This gradient is maintained by several systems, mainly intercorneocyte lipids, natural hydration factor (NMF) and intercellular junctions.
  • NMF natural hydration factor
  • the intercorneocyte lipids form a hydrophobic barrier predominantly composed of long-chain ceramides.
  • GRHL3 is involved in the pathway controlling the polarity of keratinocytes within the epidermis, an essential way to ensure organized tissue morphology and repair.
  • keratinocytes and fibroblasts The skin is a barrier against environmental stress. To cope with these stresses, which are pollutants and xenobiotics, keratinocytes and fibroblasts overexpress a set of genes capable of neutralizing them and maintaining the cellular equilibrium.
  • Aldehyde dehydrogenase 3A1 catalyzes the conversion of aldehydes to acids. For keratinocytes, the expression of the gene is increased (ALDH3A1
  • This dehydrogenase is involved in the detoxification of alcohol-derived acetaldehyde, in the metabolism of corticosteroids and in the lipid peroxidation.
  • HSP heat shock proteins
  • Glutathione detoxifies the body of heavy metals but also eliminates ROS since glutathione peroxidase whose expression of GPX2 gene is increased for keratinocytes (GPX2 - 1.8
  • keratinocytes can produce anti-microbial peptides, responsible for the attraction and activation of immune cells.
  • Anti-microbial peptides have broad spectrum activity and destroy organisms by disrupting their membrane integrity. Some of them are constitutively expressed but most are inducible.
  • Calprotectin has been shown to exert its antibacterial activity against Escherichia coli, Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Capnocytophaga spumblea and Borrelia burgdorferi (Lyme disease).
  • This chemokine is constantly produced in the epidermis and dermis in healthy conditions.
  • it has recognized bactericidal activity against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Finegoldia magna, Streptococcus pyogenes.
  • SLPI secretory leukocyte peptidase inhibitor
  • the root extract of Tagetes erecta could potentially stimulate the renewal of the epidermis.
  • the extract could also strengthen the cohesion of the epidermis and its barrier properties, limit the loss of water and thus promote the hydration of the tissue.
  • Tagetes erecta extract on cell cultures of keratinocytes and fibroblasts also suggests a potentially protective activity against environmental stresses following the induction of the expression of genes coding for metallothioneins, for the enzymes involved in the metabolism of xenobiotics and for the proteins and enzymes responsible for antioxidant defense.
  • Example 5 Effect of a Tagetes Erecta Root Extract on the Survival of Primary Cortical Neurons Wounded by the ⁇ Peptide (20 ⁇ g, 24 Hours) and on a Neural Network of Primary Cortical Neurons Wounded by the ⁇ Peptide (20 ⁇ g, 24 hours).
  • the aim of this study is to evaluate the effects of the root extract on primary cortical neurons of rats, intoxicated by the ⁇ -peptide according to the in vitro model of Alzheimer's disease described in Callizot et al., 2013 (Callizot N. et al., Operational dissection of ⁇ -amyloid cytopathic effects on cultured neurons, J Neurosci Res 2013, 91: 706-16). The survival of the neurons as well as the integrity of the neurite network are evaluated. 5.1. Materials and methods
  • the root extract is prepared from dried roots of Tagetes erecta.
  • the plants are grown in aeroponics according to Example 1.
  • the fresh roots are cut and dried.
  • 70 g of dried roots are ground to dry and macerated for 65 hours in 1 liter of methanol.
  • the extract is filtered.
  • the solvent is removed using a rotary evaporator and the dried powder in a desiccator to finally obtain 4.15 g of powder.
  • Chromatographic analysis performed according to Example 1.1 showed the presence of léontopodique acid B in the extract.
  • Four concentrations are tested: 10 ng / mL, 100 ng / mL, 1 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL dry extract diluted in water with 0.1% DMSO.
  • the vehicle used is the culture medium (see section below) containing 0.1% DMSO (Pan Biotech, Batch: H 130813).
  • Rat cortical neurons are cultured as described in Singer et al., 1999 (Singer C, et al., Mitogen-activated protein kinase pathway mediates estrogen neuroprotection after glutamate toxicity in primary cortical neurons.) Neurosci 1999, 19: 2455- 2463) and Callizot et al., (2013).
  • pregnant female rats are killed by cervical dislocation after 15 days of gestation.
  • the fetuses are collected and immediately placed in an ice-cold L15 Leibovitz medium (Pan Biotech, Batch: 8810315) supplemented with 2% penicillin (10,000 U / ml) and a solution of streptomycin (10 mg / ml) (PS, Pan Biotech).
  • bovine serum albumin BSA; Pan Biotech, batch: K180713
  • the cortex is treated for 20 min at 37 ° C with a trypsin-EDTA solution (Pan Biotech, Batch: 3330914) at a final concentration of 0.05% trypsin and 0.02% EDTA.
  • the dissociation is stopped by the addition of DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's medium) with 4.5 g / L of glucose (Pan Biotech, Batch: 8530315), containing DNase I grade II (final concentration 0.5 mg / ml).
  • Pan Biotech, Batch: H140508 10% fetal calf serum
  • FCS fetal calf serum
  • the cells are mechanically dissociated by three forced passages through 10 mL pipette tips. The cells are then centrifuged at 515 g for 10 min at 4 ° C. The supernatant is discarded, and the pellet is suspended in a defined culture medium consisting of a Neurobasal medium (Invitrogen, batch: 1715722) with a 2% solution of supplement B27 (Invitrogen, lot: 1709534), 2 mmol / L of L-glutamine (Pan Biotech, lot: 6620314), 2% PS solution, and 10 ng / ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF, Pan Biotech, Batch: H140108).
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • Viable cells are counted with a Neubauer cytometer, using the trypan blue exclusion test.
  • Cells are seeded at a density of 30,000 per well of a 96-well pre-coated plate of poly-L-lysine (Biocoat, Batch: 21614030) and cultured at 37 ° C in an incubator containing 95% air and 5 ml. % C02. The middle is changed every day. After 11 days of culture, the cortical neurons are intoxicated by a solution of peptides ⁇ 1-42 (see below). Preparation of the peptide ⁇ 1-42 and exposure of the root extract to said peptide
  • ⁇ 1-42 peptide The preparation of the ⁇ 1-42 peptide is carried out according to the procedure described in Callizot et al., (2013).
  • the peptide ⁇ 1-42 (Bachem, Batch: 1014012) is dissolved in the above-described, serum-free, defined culture medium at an initial concentration of 40 pmol / L. This solution is gently stirred for 3 days at 37 ° C. in the dark and immediately used after having been diluted in the culture medium at the concentration tested (20 ⁇ l).
  • the root extract tested at the different concentrations is dissolved in the culture medium and is then preincubated with the primary cortical neurons for 1 hour before application of the ⁇ 1-42 peptide.
  • the peptide solution ⁇ 1-42 is added to a final concentration of 20 ⁇ diluted in the culture medium in the presence of the extract to be tested and the whole is left for 24 hours.
  • the extract is tested for a crop. For each extract concentration and controls, 6 wells are evaluated, 30 photos per plate are taken using ImageXpress (Molecular Devices) at x20 magnification, to evaluate the neurite network and the number of neurons. Photo analysis is performed using Custom Module Editor (Molecular Devices). The results are presented in terms of number of positive cells or MAP-2 labeled neurite network.
  • the statistical analyzes performed for the different conditions are ANOVA or variance analyzes followed by the Fischer PLSD test or the Dunnett test using the GraphPad Prism software.
  • Figure 3 shows the effect of the root extract of Tagetes erecta on the survival of the primary cortical neurons poisoned for 24 hours by the peptide ⁇ 1-42 added to a final concentration of 20 ⁇ .
  • Figure 4 shows the effect of the root extract of Tagetes erecta on the growth of the neurite network intoxicated for 24 hours by the peptide ⁇ 1-42 added to a final concentration of 20 ⁇ .
  • the control control was not treated with the ⁇ 1-42 peptide. Only the vehicle used for the root extract (the culture medium containing 0.1% DMSO) was added to the cell culture of cortical neurons. 100% survival of neurons is observed in this condition.
  • the vehicle used for the root extract the culture medium containing 0.1% DMSO
  • the root pre-incubated with neuronal cells in culture 1 hour before the addition of peptide ⁇ 1-42 provides an effect on the survival of neurons increasingly important with increasing concentrations of extract.
  • the root extract at the highest concentration (10 ⁇ g / mL) shows a significant effect on neuron survival (by 30%).
  • the protective effect seems to depend on the dose applied: the effect increases with the dose applied (Figure 3).
  • the root extract of Tagetes erecta makes it possible to reduce the neurotoxicity caused by the ⁇ -peptide.
  • This extract according to the invention is a good candidate for the protection of cortical neurons and the maintenance of their connections, that is to say the maintenance of the integrity of the neurite network.
  • the extract according to the invention is of interest as a new therapeutic agent for the prevention and / or treatment of Alzheimer's disease.

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Abstract

La présente invention concerne un extrait de plantes du genre Tagetes enrichi en acide léontopodique B, un procédé de préparation d'un tel extrait ainsi qu'une composition cosmétique et une composition nutraceutique et une composition pharmaceutique, lesdites compositions comprenant en tant qu'agent actif au moins un extrait de plantes du genre Tagetes selon l'invention. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait selon l'invention, notamment en tant que médicament pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie neurodégénérative, en particulier la maladie d'Alzheimer; mais également une composition cosmétique comprenant un extrait selon l'invention.

Description

EXTRAITS DE PLANTES DU GENRE TAGETES ET LEURS UTILISATIONS
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se situe dans le domaine des extraits végétaux et concerne un extrait de plantes du genre Tagetes enrichi en acide léontopodique B, un procédé de préparation d'un tel extrait ainsi qu'une composition cosmétique et une composition pharmaceutique ou nutraceutique, lesdites compositions comprenant en tant qu'agent actif au moins un extrait de plantes du genre Tagetes selon l'invention. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel extrait de plantes du genre Tagetes, notamment en tant que médicament pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie neurodégénérative, en particulier la maladie d'Alzheimer.
ART ANTERIEUR
La grande majorité des propriétés bénéfiques de l'Edelweiss {Leontopodium alpinum Cass., famille des Astéracées) a été attribuée aux métabolites secondaires polyphénoliques, et notamment à l'acide léontopodique identifié comme l'un des principaux composés des parties aériennes de l'Edelweiss (S. Schwaiger, et al., Leontopodic acid—a novel highly substituted glucaric acid derivative from Edelweiss (Leontopodium alpinum Cass.) and its antioxidative and DNA protecting properties, Tetrahedron, Volume 61, Issue 19, 2005, 4621-4630). L'acide léontopodique B a été retrouve en moindre quantité que l'acide léontopodique A dans les parties aériennes de l'Edelweiss (S. Schwaiger, et al. Development of an HPLC-PAD-MS assay for the identification and quantification of major phenolic edelweiss (Leontopodium alpium Cass.) constituents, Phytochemical Analysis, volume 17, no. 5, 2006, 291-298). Cette classe de métabolites secondaire dérivés de l'acide glucarique a rarement été trouvé en dehors du genre Leontopodium (S. Schwaiger et al., 2005).
La demande CN101856347 décrit une composition pharmaceutique contenant de l'acide léontopodique extrait d'une plante du genre Edelweiss, utilisée dans la préparation de médicaments destinés à traiter l'hépatite.
Costa et al. (2010) enseigne que le prétraitement de cellules avec de l'acide léontopodique isolé d'une plante du genre Edelweiss entraîne la diminution de la production d'espèces réactives de l'oxygène (Reactive Oxygen Species, ou ROS) mais n'induit aucune amélioration de la survie cellulaire (S. Costa et al.; Free radicals and antioxidants in two oxidative-stress cell models exposed to ochratoxin A and amyloid β : unexpected results, World Mycotoxin journal , August 2010, 3(3) : 257-261). L'effet anti-inflammatoire d'extraits éthanoliques d'Edelweiss comprenant de l'acide léontopodique a également été décrit (Lulli D. et al., Anti-inflammatory effects of concentrated ethanol extracts of Edelweiss (Leontopodim alpinum cass.) callus structures towards human keratinocytes and endothelial cells, Mediators of Inflammation, vol. 2012, article ID 498373).
L'effet anti-oxydant exercé par des dérivés d'acide hexarique sur des neutrophiles est également connu (Dudek et al., Caffeic acid derivatives isolated from the aerial parts of Galinsoga parviflora and their effect on inhibiting oxidative burst in human neutrophils, Phytochemistry Letters 16 (2016), 303-310). L'Edelweiss est une plante clairsemée dans les hautes montagnes de l'Europe et de l'Asie à 1 800-3 000 mètres d'altitude, dans des zones inaccessibles, et elle est protégée dans de nombreux pays. Il est donc fortement souhaitable de disposer de nouvelles sources de ce puissant antioxydant.
Tagetes est un genre de plantes herbacées de la famille des Asteraceae selon la classification classique, originaire du Mexique, d'Amérique centrale et de l'ouest de l'Amérique du Sud . Ce genre est composé d'une trentaine d'espèces dont certaines sont cultivées comme ornementales (Tagetes erecta) ou médicinales (Tagetes patula) et sont utilisées en médecine traditionnelle pour leurs propriétés antibactériennes, antifongiques et apaisantes. Les parties aériennes de plantes du genre Tagetes sont connues pour leurs vertus médicales ou cosmétiques, notamment via la présence de nombreux composés phénoliques. Cependant aucune des études publiées n'a reporté la présence d'acide léontopodique dans les plantes du genre Tagetes.
Les inventeurs ont maintenant développé un procédé permettant de préparer un extrait végétal de Tagetes enrichi en acide léontopodique B (ALB). Les inventeurs ont en effet montré que la culture de plantes du genre Tagetes, en particulier Tagetes patula et Tagetes erecta, dans des conditions particulières, permet d'obtenir un extrait desdites plantes comprenant de manière inattendue une très forte teneur en acide léontopodique B (ALB), détecté pour la première fois dans le genre Tagetes. Un tel procédé permet la réalisation d'extractions successives sans détruire ni altérer la survie des plantes. Les inventeurs ont également montré qu'un extrait végétal selon l'invention présente non seulement des bénéfices cosmétiques, notamment le traitement ou la prévention du vieillissement cutané et de l'inflammation de la peau, mais également une activité neuro-protectrice intéressante pour la prévention ou le traitement de maladies neurodégénératives, et tout particulièrement la maladie d'Alzheimer.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 montre un chromatogramme de l'extrait racinaire de Tagetes erecta obtenu selon l'exemple 1.
La Figure 2 montre un chromatogramme de l'extrait racinaire de Tagetes patula obtenu selon l'exemple 2.
La Figure 3 montre la survie, en pourcentage de neurones vivants par rapport au contrôle, de neurones corticaux primaires intoxiqués pendant 24h par le peptide Αβ1-42 ajouté à une concentration finale de 20 μΜ, en présence d'un extrait racinaire de Tagetes erecta à des concentrations variant de 10 ng/mL à 10 pg/ml, conformément à l'exemple 5.
Les barres de l'histogramme représentent : témoin contrôle (1) ; + peptide Αβ1-42 (2) ; peptide Αβ1-42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 10 nM (3) ; peptide Αβ1-42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 100 nM (4) ; peptide Αβ1-42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 1 μΜ (5) ; peptide Αβ1-42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 10 μΜ (6).
La Figure 4 montre la croissance du réseau de neurites intoxiqués pendant 24h par le peptide de Αβ1-42 ajouté à une concentration finale de 20 μΜ, en présence en présence d'un extrait racinaire de Tagetes erecta à des concentrations variant de 10 ng/mL à 10 pg/ml, conformément à l'exemple 5. Les barres de l'histogramme représentent : témoin contrôle (1), + peptide Αβ1-42 (2), peptide Αβ1-42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 10 nM (3), peptide Αβ1-42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 100 nM (4), peptide Αβΐ- 42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 1 μΜ (5), peptide Αβ1-42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 10 μΜ (6).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention a pour premier objet un extrait de plantes du genre Tagetes caractérisé en ce qu'il est enrichi en acide léontopodique B et qu'il comprend au moins 2,5%, en particulier au moins 5,5%, plus particulièrement au moins 8% en poids d'acide léontopodique B, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec.
Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un extrait de plantes du genre Tagetes enrichi en acide léontopodique B et comprenant au moins 2,5%, au moins 3%, au moins 3,5%, au moins 4%, au moins 4,5%, au moins 5%, au moins 5,5%, au moins 6%, au moins 6,5%, au moins 7%, au moins 7,5%, au moins 8%, au moins 8,5%, au moins 9%, au moins 9,5%, ou au moins 10% en poids d'acide léontopodique B, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec.
Par « extrait de plantes du genre Tagetes » on entend le produit obtenu par l'extraction de plantes, ou d'une plante, du genre Tagetes, ou « Tagettes ».
Par « enrichi en acide léontopodique B » on entend un extrait végétal comprenant une quantité supérieure d'acide léontopodique B, par rapport à un extrait végétal correspondant pouvant être trouvé dans la nature.
Par « acide léontopodique » on entend un composé répondant à la formule générale (I) suivante :
HO
Figure imgf000005_0001
(I), dans laquelle trois quelconques des radicaux Qi, Q2, Q3 et Q4 représentent un groupe caféoyle et le quatrième radical représente un atome d'hydrogène ou un groupe 3-hydroxybutanoyl de formule CH3-CH(OH)-CH2-CO. Par « acide léontopodique B », ou « ALB », on entend un composé répondant à la formule générale (I) dans laquelle trois quelconques des radicaux Qi, Q2, Q3 et Q4 représentent un groupe caféoyle et le quatrième radical représente un atome d'hydrogène. Par « acide léontopodique Bl » ou « ALB1 », on désigne un composé de formule (I) dans laquelle Q2, Q3 et Q4 représentent un groupe caféoyle et Qi représente un atome d'hydrogène.
Par « acide léontopodique B2 » ou « ALB2 », on désigne un composé de formule (I) dans laquelle trois quelconques des radicaux Qi, Q2, Q3 et Q4 représentent un groupe caféoyle et le quatrième radical représente un atome d'hydrogène, ledit composé étant caractérisé en ce que la masse m/z du produit ionisé (autrement appelé ion moléculaire) en spectrométrie de masse en mode négatif est de 695 et que son temps de rétention chromatographique est supérieur à celui de l'acide léontopodique Bl dans les conditions expérimentales décrites dans l'exemple 1.1.
Par « acide léontopodique B3 » ou « ALB3 », on désigne un composé de formule (I) dans laquelle trois quelconques des radicaux Qi, Q2, Q3 et Q4 représentent un groupe caféoyle et le quatrième radical représente un atome d'hydrogène, ledit composé étant caractérisé en ce que la masse m/z du produit ionisé (autrement appelé ion moléculaire) en spectrométrie de masse en mode négatif est de 695 et que son temps de rétention chromatographique est supérieur à celui de l'acide léontopodique B2 dans les conditions expérimentales décrites dans l'exemple 1.1.
Par « acide léontopodique A », ou « ALA », on entend un composé répondant à la formule générale (I) dans laquelle trois quelconques des radicaux Qi, Q2, Q3 et Q4 représentent un groupe caféoyle et le quatrième radical représente un groupe 3-hydroxybutanoyl de formule CH3-CH(OH)-CH2-CO- .
Plus particulièrement, on entend par « acide léontopodique A » un composé de formule (I) dans lequel Q2, Q3 et Q4 représentent un groupe caféoyle et Qi représente un groupe CH3-CH(OH)-CH2CO-.
Les différents isomères de position de l'ALB, notamment ALB1, ALB2 et ALB3, et de l'ALA sont donc des acides de formule générale (I) substitués par 3 groupements caféoyles et par un radical R, avec R choisi parmi : un groupe 3- hydroxybutanoyl et un atome d'hydrogène, tels que représentés dans le Tableau 1 ci-dessous :
Figure imgf000007_0001
Tableau 1. Structure des acides léontopodiques Par « extrait sec » on entend l'extrait obtenu par la mise en œuvre du procédé suivie d'une étape de dessication de l'extrait, la dessication étant mise en œuvre selon toute méthode bien connue de l'homme du métier, notamment de placer l'extrait en atmosphère chaude et sèche. Par « biomasse racinaire sèche » on entend la biomasse racinaire sèche déterminée avant de procéder à l'étape d'extraction racinaire. Pour l'extraction solide / liquide à partir de racine fraîche, la biomasse racinaire sèche a été mesurée à 5 ± 1,5% de la biomasse racinaire fraîche.
Selon un aspect avantageux, un extrait selon la présente invention peut être également défini en ce qu'il comprend au moins 0,75% en poids d'acide léontopodique B, exprimé par rapport au poids total de biomasse sèche, plus préférentiellement au moins 1,5%, au moins 2%, au moins 2,5%, ou au moins 3% en poids d'acide léontopodique B. Selon un aspect particulier, un extrait selon l'invention est caractérisé en ce que ledit acide léontopodique B comprend les isomères de position ALB1, ALB2 et ALB3, ledit isomère ALB2 étant présent dans une proportion d'au moins 50%, préférentiellement d'au moins 80% du poids total de l'acide léontopodique B présent dans ledit extrait.
Selon un autre aspect particulier, un extrait selon l'invention est caractérisé en qu'il ne comprend pas d'acide léontopodique A en quantité détectable, ou qu'il comprend une quantité faible ou très faible d'acide léontopodique A, et de préférence moins de 2%, de préférence moins de 1,5%, plus préférentiellement moins de 1% et encore plus préférentiellement moins de 0,5% d'acide léontopodique A, en pourcentage du poids total de l'acide léontopodique présent dans ledit extrait.
Selon un autre aspect avantageux, un extrait selon la présente invention comprend au moins 2,5% en poids d'acide léontopodique B, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec, plus préférentiellement au moins 5,5%, au moins 6,5%, au moins 7%, au moins 7,5%, au moins 8% et au moins 8,5% en poids d'acide léontopodique B exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec, et comprend moins de 1,5%, de préférence moins de 1%, plus préférentiellement moins de 0,5% d'acide léontopodique A, en pourcentage du poids total de l'acide léontopodique présent dans ledit extrait. Selon un autre aspect particulier, un extrait de plantes du genre Tagetes selon l'invention est un extrait d'une espèce de Tagetes choisie parmi Tagetes erecta et Tagetes patula.
Selon un autre aspect particulier, un extrait de plantes du genre Tagetes selon l'invention est un extrait d'une partie de la plante, c'est-à-dire une partie constitutive d'une plante telle que les racines, la tige, les feuilles, la fleur ou la graine. Avantageusement, l'invention a pour objet un extrait racinaire d'une plante du genre Tagetes. Pour l'obtention d'un extrait des différentes parties aériennes, quand celles-ci sont jugées suffisamment développées, elles sont mises en contact avec un liquide de lessivage ou solvant par percolation, aspersion, immersion ou macération et ensuite ledit liquide de lessivage est récupéré et traité pour en extraire les molécules d'intérêt qui ont été libérées par les parties aériennes desdites plantes. Pour l'obtention d'un extrait racinaire, quand les racines sont jugées suffisamment développées, celles-ci sont mises en contact avec un solvant par immersion ou macération, et ensuite ledit solvant est récupéré et traité pour en extraire les molécules d'intérêts qui ont été libérées par les racines desdites plantes. Ce type de procédé correspond en partie au procédé développé par la société Plant Advanced Technologies (PAT) sous le nom de « PAT Plantes à Traire® » et décrit dans la demande internationale WO 01/33942. Le contenu de la demande internationale WO 01/33942 est incorporé par référence à la présente description.
Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un extrait de plantes du genre Tagetes, notamment un extrait racinaire, plus particulièrement choisi parmi :
Un extrait obtenu par exsudation racinaire dans un solvant,
- Un extrait obtenu par macération racinaire dans un solvant, et
Un mélange d'au moins un extrait obtenu par exsudation racinaire dans un premier solvant et d'au moins un extrait obtenu par macération racinaire dans un deuxième solvant ; Dans un deuxième aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un extrait de plantes du genre Tagetes selon l'invention comprenant :
a) une étape de culture de Tagetes en conditions hors-sol, et particulièrement en aéroponie,
b) optionnellement une étape de stimulation des plantes,
c) une étape d'extraction solide / liquide des plantes optionnellement stimulées lors de l'étape b), et
d) la récupération de l'extrait obtenu lors de l'étape c). Selon un mode de réalisation particulier de ce deuxième aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un extrait de plantes du genre Tagetes selon l'invention comprenant :
a) une étape de culture de Tagetes en conditions hors-sol, et particulièrement en aéroponie,
b) optionnellement une étape de stimulation des racines des plantes, c) une étape d'extraction solide / liquide des racines optionnellement stimulées lors de l'étape b), et
d) la récupération de l'extrait obtenu lors de l'étape c).
Dans le cadre de l'invention, on entend par « culture des plantes en conditions hors sol », tout mode de culture dans lequel les racines de la plante ne sont pas dans de la terre. Plus précisément, la culture hors sol est une culture dans laquelle les racines des plantes reposent dans un milieu reconstitué, détaché du sol. Ce milieu de culture est irrigué de façon régulière par des solutions nutritives appropriées à la plante cultivée.
Il existe différentes techniques de culture hors sol tels que les systèmes sans substrat qui nécessitent une solution nutritive enrichie en oxygène, et les systèmes avec substrat. Parmi les systèmes sans substrat, on peut citer l'aquiculture pour laquelle la solution nutritive est non circulante et est contenue dans un bac de culture, la Nutrient Film Technique (N. F.T.) pour laquelle la solution nutritive s'enrichit en oxygène dissous au cours de son déplacement par échange avec l'air, et l'aéroponie pour laquelle les racines des plantes ne sont en contact ni avec un milieu solide, ni même avec un milieu liquide : elles sont alimentées par un brouillard nutritif obtenu par brumisation (via un brumisateur) de la solution nutritive dans un milieu fermé. Parmi les systèmes avec substrat, on retrouve la subirrigation dans laquelle la solution nutritive pénètre dans le substrat au niveau de sa partie inférieure et la percolation dans laquelle la solution nutritive est distribuée par irrigation discontinue à la surface supérieure du système puis percole vers le bas du substrat. Le substrat, minéral ou organique, est neutre et inerte comme du sable, de l'argile ou de la laine de roche par exemple. Ce substrat peut être également d'origine industrielle. On entend par « culture des plantes en aéroponie » un mode de culture hors sol pour lequel les racines des plantes ne sont en contact ni avec un milieu solide, ni même avec un milieu liquide. Selon un mode de réalisation particulier, les plantes sont alimentées par un brouillard nutritif obtenu par brumisation, via un brumisateur, de la solution nutritive dans un milieu fermé.
Typiquement, dans un procédé selon l'invention, on peut disposer des plantes sur des plateaux avec la partie aérienne de la plante au-dessus du plateau et la partie racinaire en-dessous, on dispose les plateaux sur des tables formant zone de rétention pour collecter l'excédent d'un liquide diffusé vers les plantes, et on transfère les plateaux sur les tables à différents postes.
Lors de l'étape a), les plantes cultivées en aéroponie sont alimentées par pulvérisation racinaire d'une solution nutritive de sels minéraux essentiels (Azote - N, Phosphore - P, Potassium - K), afin d'obtenir un développement racinaire maximum et une concentration maximum en molécules d'intérêt, sans altérer la survie de la plante. L'homme du métier, à l'aide de ses connaissances générales, sait comment adapter les proportions et concentrations des différents sels minéraux pour optimiser le développement racinaire et la concentration des molécules d'intérêt. Les concentrations en sels minéraux des solutions nutritives sont dans ce cas comprises dans une gamme d'électroconductivité faible s'étendant avantageusement entre 0,4 à 1,6 mS/cm, de préférence entre 0,6 à 0,8 mS, afin de favoriser une plus grande diversité de molécules dans les extraits.
Dans l'étape c) d'un procédé selon l'invention, on entend par « extraction solide/liquide » toute technique d'extraction par solvant qui consiste à extraire une espèce chimique se trouvant dans un solide et étant soluble dans ledit solvant. Parmi ces techniques d'extraction, on peut citer la macération, l'exsudation, l'infusion, la décoction, l'extraction par extracteurs de Soxhlet et de Kumagawa, l'extraction assistée par micro-onde, l'extraction assistée par ultrason, l'extraction par voie enzymatique, l'extraction par fluide supercritique (C02 +DPG). L'extraction conduit à la récupération des métabolites contenus dans l'une ou l'autre partie des plantes, et notamment les racines, au moyen d'un liquide de lessivage, ou solvant, mis en contact avec les racines coupées et/ou encore accrochées à la plante, dans un solvant particulier et pendant une durée appropriée.
Selon un aspect particulier, dans un procédé selon l'invention, l'étape c) d'extraction solide/liquide des plantes ou d'une partie des plantes, est réalisée au moyen d'un procédé choisi parmi : une exsudation et une macération. Selon un aspect plus particulier, dans un procédé selon l'invention, l'étape c) d'extraction solide/liquide des plantes ou d'une partie des plantes, avantageusement les racines potentiellement stimulées lors de l'étape b), est réalisée au moyen d'un procédé choisi parmi : une exsudation racinaire et une macération racinaire. Cette étape consiste notamment en une étape de « trempage », pendant laquelle on met les racines des plantes dans un bac de trempage contenant un liquide pendant une durée prédéterminée. Typiquement, les plantes sont disposées sur un plateau avec la partie aérienne de la plante au-dessus du plateau et la partie racinaire au-dessous, le plateau est remonté après le trempage, puis le liquide contenu dans le bac de trempage est collecté. Selon un aspect particulier, l'étape de trempage est suivie d'une étape de coupe dans laquelle la partie aérienne ou la partie racinaire des plantes est partiellement coupée pour récolter la partie coupée. Il est possible d'extraire les substances des parties coupées, outre l'extraction des substances lors du trempage.
De préférence, dans un procédé selon l'invention, l'exsudation racinaire est réalisée sur des racines encore attachées à la plante. Selon un autre aspect préféré, la macération racinaire est réalisée sur des racines fraîchement coupées, c'est-à-dire coupées depuis moins de 24 heures, et de préférence le plus tôt possible après coupage, idéalement juste après coupage, lesdites racines étant éventuellement séchées après leur section et avant macération. Le séchage des racines peut être réalisé par la mise en œuvre de tout procédé de séchage adapté, connu de l'homme du métier, et notamment en plaçant les racines à une température comprise entre 40°C et 60°C pendant 4 heures, de préférence dans un environnement sec. Le séchage des racines peut notamment être réalisé dans une étuve ventilée.
Plus particulièrement, l'étape c) d'un procédé selon l'invention comprend la mise en présence des racines avec un solvant choisi parmi : les alcools, les glycols et les solvants eutectiques. Ledit alcool est choisi de préférence parmi l'éthanol et le méthanol, utilisés purs ou sous la forme d'une solution aqueuse d'alcool, celle-ci comprenant de 10% à 99,9% d'alcool, plus particulièrement entre 40% et 90%, et encore plus particulièrement entre 50% et 85%. Ledit glycol est un diol dans lequel les deux groupes hydroxyl sont portés par des carbones différents, et est choisi parmi : le dipropylène glycol, le propane 1,3 diol, le propane 1,2 diol et le butylène glycol, et est utilisé pur ou sous la forme d'une solution aqueuse de glycol, celle-ci comprenant de 10% à 99,9% de glycol, plus particulièrement entre 40% et 90%, et encore plus particulièrement entre 50% et 85%. Ledit solvant eutectique est constitué de deux composants ou plus, qui peuvent être solides ou liquides et qui, dans une composition particulière, présentent une forte diminution de leur température de fusion, rendant ainsi le mélange liquide. Les solvants eutectiques naturels sont principalement constitués d'acides aminés, d'acides organiques, de sucres et de dérivés de la choline. L'eau peut faire partie du solvant, mais est dans ce cas fortement retenu dans le liquide et ne peut être évaporée. Les combinaisons particulières des composants constituant ledit solvant eutectique sont choisies parmi notamment, et de manière non exhaustive, le chlorure de choline - glucose (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - acide citrique (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - acide citrique (ratio 2 : 1), le chlorure de choline - saccharose (ratio 4: 1), le chlorure de choline - saccharose (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - acide tartrique (ratio 2 : 1), le chlorure de choline - xylose (ratio 2 : 1), le chlorure de choline - xylose (ratio 3 : 1), l'acide citrique - saccharose (ratio 1 : 1), l'acide citrique - glucose (ratio 1 : 1), le glucose - acide tartrique (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - urée (ratio 1 : 2), le chlorure de choline - xylitol - eau (2 : 1 : 3) et l'acide lactique - glucose - eau (5 : 1 : 3). Ces solvants permettent de favoriser l'extraction d'une forte teneur en acide léontopodique B (ALB) et ses isomères. Dans le cas d'un mélange d'extraits racinaires, lesdits premier et deuxième solvants peuvent être identiques ou différents.
Selon un aspect particulier de l'invention, le solvant est caractérisé par un pH acide, notamment lorsqu'il est utilisé lors de l'étape d'extraction solide/liquide. Selon un aspect particulier, ledit alcool ou ledit glycol utilisé lors d'une étape d'extraction solide/liquide est caractérisé par un pH compris entre 2 et 5, de préférence entre 2 et 4, plus préférentiellement entre 2,5 et 3,5. Selon un autre aspect particulier, un extrait végétal selon l'invention est caractérisé par un pH compris entre 2,5 et 5, de préférence entre 2,5 et 4 et plus avantageusement entre 3 et 4. L'utilisation d'un solvant à pH acide favorise la solubilisation des composés d'intérêt dans ledit solvant et limite la dégradation chimique ou enzymatique des métabolites secondaires dont ALB lors de l'extraction. Les acides utilisés pour l'ajustement du pH du solvant ou de l'extrait sont de préférence l'acide phosphorique, l'acide citrique ou l'acide chlorhydrique. Plus particulièrement, ledit glycol est choisi dans le groupe suivant : le dipropylène glycol, le propane 1,3 diol, le propane 1, 2 diol et le butylène glycol.
Le propane 1,3 diol, ou triméthylène glycol, peut être préparé par synthèse chimique selon des techniques connues de l'homme du métier et décrites dans la littérature, il est aussi disponible commercialement. Ledit propane 1,3 diol peut également être produit par la mise en œuvre d'un procédé de fermentation en conditions adaptées d'un organisme vivant, notamment une souche génétiquement modifiée d'Escherichia coli. Le propane 1,3 diol ainsi obtenu est désigné par le terme de « propane 1,3 diol biosourcé », un tel produit est produit puis purifié comme décrit notamment dans la demande internationale WO 2004/101479 et commercialisé sous la marque Zéméa®. Par « butylène glycol » on entend le butane 1,2 diol, le butane 1,3 diol, le butane 2,3 diol et le butane 1,4 diol. De façon encore plus particulière, dans un procédé selon l'invention, l'étape c) d'extraction solide/liquide comprend la mise en présence des racines avec du propane 1,2 diol ou avec du propane 1,3 diol, et notamment du propane 1,3 diol biosourcé.
Selon un aspect particulier, l'étape c) d'un procédé selon l'invention comprend la mise en présence des racines avec un solvant pendant une durée comprise entre 15 minutes et 30 minutes pour l'exsudation racinaire et pendant une durée comprise entre 1 heure et 96 heures, notamment entre 24 heures et 72 heures, plus particulièrement entre 36 heures et 48 heures pour la macération racinaire.
Selon un autre aspect particulier, un procédé selon l'invention comprend une étape de section des racines puis de séchage des racines sectionnées, préalablement à l'étape de macération desdites racines, la macération étant réalisée par la mise en présence des racines avec un solvant.
Le procédé selon l'invention peut donc comprendre une première étape d'exsudation racinaire effectuée par immersion dans un solvant des racines encore accrochées à la plante pendant une durée comprise entre 15 minutes à 30 minutes, suivie d'une étape de macération racinaire des racines coupées de la plante, puis éventuellement séchées.
Les durées d'exsudation racinaire et/ou de macération racinaire sont choisies de manière à favoriser l'extraction d'une forte quantité en composés d'intérêt tout en n'altérant pas la survie de la plante et sans mener à l'épuisement des ressources. Ainsi les plantes, après l'étape d'exsudation racinaire, sont remises en culture en aéroponie selon les étapes a) et optionnellement b) afin de recommencer leur développement racinaire et favoriser la production par les racines de métabolites secondaires.
Selon un aspect particulier, un procédé selon l'invention est un procédé de préparation d'un extrait racinaire de plantes du genre Tagetes. Selon un aspect préféré, un procédé selon l'invention est un procédé de préparation d'un extrait racinaire de plantes du genre Tagetes erecta ou Tagetes Patula. Selon un mode de réalisation préféré, l'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un extrait de plantes du genre Tagetes selon l'invention comprenant :
a) une étape de culture de Tagetes en conditions hors-sol, et particulièrement en aéroponie,
b) une étape de stimulation des racines des plantes,
c) une étape d'extraction solide/liquide des racines stimulées lors de l'étape b), et
d) la récupération de l'extrait obtenu lors de l'étape c).
Selon un autre aspect particulier, dans un procédé selon l'invention, l'étape b) de stimulation des racines des plantes comprend :
• une étape d'élicitation dans laquelle les racines sont mises en présence d'une solution comprenant au moins un agent choisi parmi : un sel, un tensioactif, un solvant, un éliciteur d'origine fongique ou bactérienne, un dérivé de l'acide jasmonique, en particulier le méthyl jasmonate, l'acide salicylique, un générateur d'éthylène, une chitine, des chitosans et/ou leur mélange, et/ou
• une étape de mise en présence des racines avec une solution carencée en azote, c'est-à-dire une solution comprenant une proportion d'azote inférieure à la proportion d'azote habituellement considérée comme optimale pour le développement de la plante et en particulier des racines, avantageusement moins de 15% d'azote, et avantageusement ne comprenant pas d'azote, lesdites étapes étant séquentielles ou simultanées. Les racines peuvent également être stimulées par la mise en présence des plantes avec une solution nutritive carencée en azote. La mise en présence des plantes avec une solution nutritive carencée en azote provoque un « stress azoté » responsable de la stimulation. Selon un aspect particulier, une solution carencée en azote selon la présente invention est une solution comprenant moins de 15% d'azote, de préférence moins de 10% d'azote, avantageusement moins de 8%, plus avantageusement moins de 6%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1% d'azote et encore plus avantageusement 0% d'azote.
L'étape b) de stimulation permet d'augmenter de manière significative la teneur en métabolites secondaires dans les racines et favoriser ainsi le flux des métabolites sortant des racines vers le solvant choisi pour l'extraction et ce, sans perte totale de la viabilité de la plante afin qu'elle puisse être remise en culture puis réutilisée. En d'autres termes, l'étape de stimulation de la plante permet de favoriser la production et la sécrétion des molécules d'intérêt.
Avantageusement, l'étape b) de stimulation des racines est réalisée par pulvérisation ou macération de la plante avec une solution d'éliciteurs choisie parmi les dérivés d'acide jasmonique comme par exemple le méthyl jasmonate, l'acide salicylique et les chitosans ou par l'alimentation de la plante avec une solution nutritive N/P/K carencée en azote vaporisée sur les racines. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'étape b) est mise en œuvre par pulvérisation ou macération de la plante avec une solution choisie parmi :
• une solution de méthyl jasmonate à une concentration comprise entre 0,01 et 200 μΜ, avantageusement entre 0,1 et 20 μΜ,
· une solution d'acide salicylique à une concentration comprise entre 1 et 500 μΜ, avantageusement entre 10 et 50 μΜ,
• une solution de chitosans à une concentration de 0,002 à 1 g/L, avantageusement de 0,05 à 0,1 g/L, et
• une solution nutritive N/P/K comprenant moins de 6% d'azote, ladite solution étant de préférence vaporisée sur les racines.
En outre, l'étape b) de stimulation des racines avec une solution d'éliciteurs est avantageusement effectuée pendant une durée comprise entre 1 jour et 21 jours, de préférence entre 1 et 7 jours. Selon un aspect particulier, l'étape b) de stimulation des racines par l'alimentation de la plante avec une solution nutritive N/P/K carencée en azote vaporisée sur les racines est avantageusement effectuée pendant une durée comprise entre 10 jours et 8 semaines, de préférence 3 semaines.
Lors de l'étape b), les concentrations en sels minéraux des solutions nutritives sont comprises dans une gamme d'électroconductivité faible s'étendant avantageusement entre 0,4 à 1,6 mS/cm, de préférence entre 0,6 à 0,8mS, afin de favoriser une plus grande diversité de molécules dans les extraits.
Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, l'étape b) est réalisée après l'étape a). Selon un autre aspect particulier d'un procédé selon l'invention, l'étape b) et l'étape a) sont effectuées de manière simultanée, la solution de stimulation est alors incorporée à la solution nutritive ou administrée par tout autre mode d'administration connu de l'homme du métier.
Selon un perfectionnement, l'étape de « trempage » est précédée d'une étape de lavage dans laquelle le liquide diffusé vers les plantes est de l'eau claire. On limite ainsi l'apport des éléments contenus dans la solution nutritive ou dans l'éventuelle solution de stimulation lors de l'étape de trempage.
Avantageusement, l'invention a pour objet un procédé comprenant les étapes suivantes :
a) une étape de culture de Tagetes en conditions hors-sol, et particulièrement en aéroponie,
b) une étape de stimulation des racines des plantes,
c) une étape d'extraction solide/liquide des racines stimulées lors de l'étape b), comprenant :
- une première phase de mise en présence des racines encore liées à la plante avec un solvant, en particulier pendant une durée comprise entre 15 minutes à 30 minutes, - suivie d'une seconde phase comprenant la section desdites racines et la macération des racines sectionnées dans un solvant,
ledit solvant, identique ou différent dans la première et la deuxième phase, est choisi parmi les alcools, les glycols et les solvants eutectiques, et étant utilisé pur ou sous la forme d'une solution aqueuse d'alcool, de glycol ou de solvant eutectique, et
d) la récupération des extraits obtenus lors de l'étape c). Un procédé selon l'invention comprend avantageusement une étape supplémentaire de réajustement de la teneur en solvant de l'extrait, pour obtenir une teneur avantageuse d'au moins 50%, et/ou un ajustement du pH de l'extrait, pour obtenir un pH avantageusement compris entre 3 et 5, de préférence d'approximativement 3,5, en vue de la conservation de l'extrait.
Un procédé selon l'invention comprend avantageusement au moins une étape supplémentaire de purification et/ou de traitement de l'extrait végétal, une telle étape est notamment choisie parmi :
au moins une filtration, en particulier une nanofiltration et/ou une filtration stérilisante et/ou une filtration clarifiante,
une extraction liquide/solide,
une purification,
une concentration et
une décoloration de l'extrait racinaire,
de telles méthodes de purification et/ou de traitement sont bien connues de l'homme du métier. Cette étape permet d'obtenir l'extrait final de Tagetes, de préférence de Tagetes patula et Tagetes erecta et en particulier de Tagetes erecta riche en polyphénols, notamment en léontopodique B (ALB) et ses isomères de position.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir un extrait de plantes du genre Tagetes de préférence Tagetes patula et Tagetes erecta, particulièrement riche en polyphénols, notamment en acide léontopodique B et ses isomères. En particulier, l'extrait de plantes obtenu par le procédé décrit ci-dessus, est riche en un mélange des différents isomères de l'ALB, comme par exemple ALB1, ALB2 et ALB3. Un chromatogramme (Figure 1) de l'analyse d'un extrait racinaire de Tagetes erecta obtenu selon l'invention, montre que l'acide léontopodique B est présent dans cet extrait sous la forme d'au moins trois isomères : ALB1, ALB2 et ALB3. ALB2 est l'isomère majoritairement présent. De préférence, au moins 50%, encore plus préférentiellement au moins 80% en poids desdits ALB sont sous la forme de l'isomère ALB2, par rapport au poids total d'acide léontopodique B. La présente invention a également pour objet un extrait susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention.
La présente invention a pour troisième objet une composition cosmétique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon l'invention ou un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, et au moins un excipient. Avantageusement, ledit extrait est un extrait de plantes du genre Tagetes, de préférence Tagetes patula et Tagetes erecta et notamment un extrait racinaire de plantes du genre Tagetes, en particulier un extrait racinaire de Tagetes patula ou de Tagetes erecta selon l'invention.
Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques optimales d'une composition cosmétique selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement cosmétique adapté à un sujet comme par exemple le type de peau.
La composition cosmétique selon l'invention est avantageusement destinée à une application topique. Elle peut notamment se présenter sous la forme d'une crème, d'un lait, d'une lotion, d'un gel, d'un sérum, d'un spray, d'une mousse, d'une solution, d'une pommade, d'une émulsion, d'un patch ou d'un masque. Une composition cosmétique selon l'invention comprend au moins un excipient cosmétiquement acceptable choisi en fonction du type d'administration souhaitée. Une composition cosmétique selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un adjuvant connu de l'homme du métier, choisi parmi les épaississants, les conservateurs, les parfums, les colorants, des filtres chimiques ou minéraux, les agents hydratants, les eaux thermales, etc.
Un excipient cosmétiquement acceptable peut être choisi parmi les polymères, les composés siliconés, les agents tensioactifs, les agents de rhéologie, les agents humectants, les agents de pénétration, les composants huileux, les cires, les émulsifiants, les agents filmogènes, les parfums, les électrolytes, les ajusteurs de pH, les agents antioxydants, les conservateurs, les colorants, les nacres, les pigments et leurs mélanges.
Une composition cosmétique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un autre agent cosmétiquement actif, tels qu'un autre agent anti-âge, un agent hydratant, un agent ayant une activité calmante, apaisante ou relaxante, un agent stimulant la microcirculation cutanée, un agent sébo- régulateur pour le soin des peaux grasses, un agent nettoyant ou purifiant, un agent anti-radicalaire, un agent anti-inflammatoire, un filtre solaire chimique ou minéral, etc.
Avantageusement, une composition cosmétique selon l'invention comprend au moins un extrait de Tagetes selon l'invention, et en particulier un extrait racinaire de Tagetes patula ou de Tagetes erecta selon l'invention, en une quantité comprise entre 0,01 et 10%, en particulier entre 0,05 et 5%, plus particulièrement entre 0,1 et 2%, en poids par rapport au poids total de la composition.
La présente invention a pour quatrième objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition cosmétique selon l'invention, pour prévenir ou ralentir le vieillissement cutané, et/ou avoir un effet apaisant ou calmant de la peau suite à la sensation d'irritation, et/ou stimuler le renouvellement de l'épiderme ainsi que la fonction barrière de l'épiderme et l'hydratation de la peau, et/ou pour protéger l'épiderme des stress environnementaux. Une composition cosmétique selon l'invention peut notamment être destinée à prévenir ou ralentir le vieillissement cutané. Une composition cosmétique selon l'invention peut aussi notamment être destinée à avoir un effet apaisant ou calmant de la peau suite à la sensation d'irritation qui peut se développer après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes. Une composition cosmétique selon l'invention peut notamment être destinée à favoriser l'intégrité et l'efficacité de la fonction barrière de l'épiderme. Une composition cosmétique selon l'invention peut notamment être destinée à stimuler l'hydratation de la peau.
La présente invention a pour cinquième objet une composition pharmaceutique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon l'invention ou un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable, et une composition nutraceutique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon l'invention ou un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, et au moins un excipient nutraceutiquement acceptable.
Dans la présente invention, on désigne par « pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptable » tout ingrédient qui est utile dans la préparation d'une composition pharmaceutique ou nutraceutique, qui est généralement sûr, non toxique et ni biologiquement ni autrement non souhaitable et qui est acceptable pour une utilisation vétérinaire ou chez l'Homme.
On désigne par « sels pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables » d'un composé, des sels qui sont pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables, comme défini ci-dessus, et qui possèdent l'activité pharmacologique souhaitée du composé parent. De tels sels comprennent :
(1) les hydrates et les solvates,
(2) les sels d'addition d'acide pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables formés avec des acides inorganiques pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide nitrique, l'acide phosphorique et similaires ; ou formés avec des acides organiques pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables tels que l'acide acétique, l'acide benzènesulfonique, l'acide benzoïque, l'acide camphresulfonique, l'acide citrique, l'acide éthane-sulfonique, l'acide fumarique, l'acide glucoheptonique, l'acide gluconique, l'acide glutamique, l'acide glycolique, l'acide hydroxynaphtoïque, l'acide 2-hydroxyéthanesulfonique, l'acide lactique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide mandélique, l'acide méthanesulfonique, l'acide muconique, l'acide 2-naphtalènesulfonique, l'acide propionique, l'acide salicylique, l'acide succinique, l'acide dibenzoyl-L-tartrique, l'acide tartrique, l'acide p-toluènesulfonique, l'acide triméthylacétique, l'acide trifluoroacétique et similaires, ou
(3) les sels d'addition de base pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables formés lorsqu'un proton acide présent dans le composé parent est soit remplacé par un ion métallique, par exemple un ion de métal alcalin, un ion de métal alcalino-terreux ou un ion d'aluminium ; soit coordonné avec une base organique ou inorganique pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptable. Les bases organiques acceptables comprennent la diéthanolamine, l'éthanolamine, N-méthylglucamine, la triéthanolamine, la trométhamine et similaires. Les bases inorganiques acceptables comprennent l'hydroxyde d'aluminium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de potassium, le carbonate de sodium et l'hydroxyde de sodium.
Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques optimales d'une composition pharmaceutique selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement pharmaceutique adapté à un sujet comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés, le type de peau. En fonction du type d'administration souhaitée, la composition pharmaceutique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. La composition pharmaceutique selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un adjuvant pharmaceutiquement connu de l'homme du métier, choisi parmi les épaississants, les conservateurs, les parfums, les colorants, des filtres chimiques ou minéraux, les agents hydratants, les eaux thermales, etc.
Avantageusement, ladite composition pharmaceutique comprend au moins un extrait selon l'invention en une quantité comprise entre 0,01 et 10%, en particulier entre 0,05 et 5%, plus particulièrement entre 0,1 et 2%, en poids par rapport au poids total de la composition.
Une composition pharmaceutique est particulièrement adaptée pour une administration par voie orale, nasale, transdermique, parentérale, topique, rectale et mucosale. Elle peut se présenter sous forme sèche, telle que par exemple : capsule molle, gélule, comprimé, lyophilisât, poudre, granule, ou patch, ou sous forme liquide, telle que : solution, suspension, spray, crème ou gel.
L'excipient pharmaceutiquement acceptable est connu de l'Homme du Métier et est choisi selon le mode d'administration de la composition pharmaceutique. A titre d'exemple, l'excipient pharmaceutiquement acceptable peut être choisi dans le groupe constitué par les agents diluants, liants, désintégrants, les colorants, les lubrifiants, les agents solubilisants, les agents promoteurs d'absorption, les filmogènes, les agents gélifiants, et leurs mélanges.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un composé choisi dans le groupe constitué par les émollients, les actifs hydratants, les activateurs de la synthèse de kératine, les kératorégulateurs, les kératolytiques, les agents restructurant de la barrière cutanée (activateurs de la synthèse des lipides cutanés, agonistes PPARs ou Peroxysome Proliferator Activated Receptor), les activateurs de la différenciation des kératinocytes (rétinoïdes, calcidone®, le calcium), les antibiotiques, les agents anti-bactériens, les composés antifongiques, les agents anti-viraux, les sébo- régulateurs, les immunomodulateurs, tels que le tacrolimus, le pimécrolimus, les oxazolines, les conservateurs, les agents anti-irritants, les agents apaisants, des filtres et écrans solaires, les agents anti-oxydants, les facteurs de croissance, les agents cicatrisants ou les molécules eutrophiques, les médicaments et les agents anti-inflammatoires, les médicaments et les agents anti-Alzheimer.
La présente invention a pour sixième objet un extrait selon l'invention ou une composition pharmaceutique selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament.
Plus particulièrement, la présente invention a également pour objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition pharmaceutique selon l'invention ou une composition nutraceutique selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament pour stimuler la défense antimicrobienne et/ou pour atténuer ou traiter l'inflammation de la peau et/ou pour favoriser la cicatrisation cutanée, en particulier dans le cas de la fermeture d'une plaie.
Plus particulièrement, la présente invention a également pour objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition pharmaceutique selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament pour prévenir ou ralentir le vieillissement cutané, pour avoir un effet apaisant ou calmant de la peau suite à la sensation d'irritation, pour stimuler la fonction barrière de l'épiderme ainsi que l'hydratation de la peau. Dans ce cas, ledit extrait sera avantageusement associé à un excipient pharmaceutiquement acceptable et adapté pour une application cutanée, et ladite composition pharmaceutique contiendra avantageusement un excipient pharmaceutiquement acceptable et adapté pour une application cutanée.
Selon un autre aspect particulier, la présente invention a également pour objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition pharmaceutique selon l'invention ou une composition nutraceutique selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament pour prévenir ou traiter une maladie neuro-dégénérative.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « maladie neurodégénérative » une maladie impliquant principalement une détérioration du fonctionnement, et éventuellement la mort, des cellules nerveuses, et en particulier des neurones. Ces maladies induisent des troubles d'ordre cognitivo-comportemental, sensoriel et moteur. Selon un aspect particulier, ladite maladie neurodégénérative est choisie parmi : la maladie d'Alzheimer, l'ataxie spinocérébelleuse, l'atrophie multisystématisée, la maladie d'Alexander, la maladie d'Alpers, la maladie de Creutzfeldt-Jakob, la maladie de Huntington, la maladie de Parkinson, la maladie de Pick, la myofasciite à macrophages, la paralysie supranucléaire progressive, la sclérose en plaques et la sclérose latérale amyotrophique.
Dans le cadre de la présente invention, une maladie neurodégénérative peut être une maladie neurodégénérative due au stress oxydatif. C'est le cas notamment de la maladie d'Alzheimer. On entend par « maladie d'Alzheimer » (MA) une maladie affectant principalement les personnes de plus de 65 ans, souffrant de différents symptômes cliniques tels que le déclin progressif de la mémoire, de la pensée, du langage et de la capacité d'apprentissage. Le rôle toxique du peptide β-amyloïde (Αβ) est maintenant passé de fibrilles Αβ insolubles à des plus petits agrégats solubles d'oligomères de Αβ. Il a été prouvé que des oligomères solubles de Αβ isolés de cortex de patients présentant la maladie d'Alzheimer induisent directement l'hyper- phosphorylation de la protéine Tau (T) et la dégénérescence des neurites (Jin M, et al ., Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5; 108(14) : 5819-24). Ainsi, toutes les substances ayant une propriété réductrice de la neurotoxicité du peptide Αβ peuvent être utiles en tant que nouvel agent thérapeutique pour le traitement ou la prévention de la maladie d'Alzheimer.
Selon un aspect particulier, la présente invention a donc pour objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition pharmaceutique selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament pour prévenir ou traiter la maladie d'Alzheimer. La présente invention a également pour objet une méthode de soin cosmétique de la peau visant à prévenir ou retarder l'apparition des effets du vieillissement de la peau, et/ou avoir un effet apaisant ou calmant de la peau suite à la sensation d'irritation et/ou stimuler le renouvellement de l'épiderme ainsi que la fonction barrière de l'épiderme et l'hydratation de la peau, et/ou pour protéger l'épiderme des stress environnementaux, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend l'application, sur au moins une partie de la peau du corps ou du visage, d'une composition cosmétique selon l'invention.
Avantageusement, dans la méthode selon l'invention, la composition cosmétique est appliquée chez un sujet en ayant besoin, notamment en prévision de ou consécutivement à une exposition unique ou répétée de la peau à un stress oxydant. En effet, ce dernier peut générer un excès de radicaux libres pouvant accélérer les signes de vieillissement cutané.
L'invention a enfin pour objet une méthode de prévention et/ou de traitement d'une maladie neurodégénérative, notamment d'une des maladies citées ci- dessus, et particulièrement la maladie d'Alzheimer, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un composé d'un extrait selon l'invention, d'un extrait préparé par un procédé selon l'invention, d'une composition nutraceutique selon l'invention ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention à un patient en ayant besoin. En outre, l'invention concerne une méthode pour prévenir ou ralentir le vieillissement cutané, pour atténuer l'inflammation de la peau, pour avoir un effet apaisant ou calmant de la peau suite à la sensation d'irritation, pour stimuler la fonction barrière de l'épiderme ainsi que l'hydratation de la peau, et pour favoriser la cicatrisation cutanée, en particulier dans le cas de la fermeture d'une plaie, chez un sujet en ayant besoin, comprenant l'administration au sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition nutraceutique selon l'invention ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention. La présente invention concerne également une composition nutraceutique comprenant un extrait selon l'invention, ou un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, et un excipient nutraceutiquement acceptable, pour améliorer les fonctions cognitives chez un patient atteint d'une maladie neurodégénérative, et particulièrement la maladie d'Alzheimer. L'excipient nutraceutiquement acceptable est connu de l'Homme du Métier et est choisi parmi les excipients conformes aux réglementations internationales applicables aux additifs alimentaires. Selon un aspect particulier, d'autres extraits botaniques connus de l'Homme du Métier peuvent également être ajoutés à une composition nutraceutique selon l'invention pour améliorer les fonctions cognitives chez un patient atteint d'une maladie neurodégénérative, et particulièrement la maladie d'Alzheimer. Ces extraits botaniques peuvent être choisies parmi des extraits de plantes ou d'une partie de plantes (par exemple racine, tige, feuille, fleur, graine, bourgeon, fruits) comme les citrus (orange, citron, pamplemousse), le genre Rosa (églantier, rosier), Panax ginseng, Bacopa monnieri, cassis, Ginkgo biloba, la vigne, la sarriette, le romarin, l'aulne, le noyer, l'olivier. Les exemples 1 à 4 qui suivent et les Figures 1 à 4 visent à illustrer la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.
EXEMPLES Exemple 1 : Préparation et caractérisation d'extraits racinaires de Tagetes erecta selon l'invention
Les extraits Tagetes erecta sont préparés à partir de plantes originaires de l'Ile de la Réunion. Le fournisseur est la Société Horticole de Bassin Plat, EARL Bassin Plat 31, Chemin de la Croix de Jubile 97410 Saint Pierre, Ile de la Réunion.
1.1 Extrait préparé à partir d'un solvant glycolé
Un extrait racinaire polyphénolique de Tagetes erecta, riche en ALB, est obtenu selon le procédé suivant : • Culture de Tagetes erecta en aéroponie avec une solution nutritive définie, de composition N/P/K correspondant à 15/10/30 et à une électroconductivité comprise entre 0,4 et 1,6 mS/cm,
• Stimulation de la plante pendant une durée de 2 à 4 semaines par un stress azoté par l'utilisation d'une solution nutritive N/P/K comprenant : moins de 6% d'azote, 15% de phosphore et 40% de potassium, et d'une électroconductivité de 0,6 à 0,8 mS/cm,
• Extraction des molécules d'intérêt par immersion des racines encore accrochées à la plante pendant une durée de 15 à 30 minutes dans un mélange propane 1,2 diol/eau, selon un ratio compris entre 85/15 et
70/30, à température ambiante et à un pH de 3,
• Extraction des molécules d'intérêt par macération des racines coupées de la plante pendant une durée de 48 à 72 heures dans un mélange propane 1,2 diol/eau selon un ratio compris entre 85/15 et 70/30, à température ambiante et à un pH de 3,
• Mélange des extraits obtenus aux deux étapes d'extraction précédentes,
• L'extrait est purifié (élimination des sels par nanofiltration), concentré par nanofiltration et clarifié par filtration clarifiante, et
• Réajustement de la teneur en propane 1,2 diol de l'extrait (au moins 50%) ainsi que du pH (approximativement 3,5) de l'extrait en vue de sa conservation.
L'extrait racinaire de Tagetes erecta ainsi obtenu présente les caractéristiques suivantes :
• Teneur en extrait sec : 13,3 g/L
· Teneur estimée en ALB1 : 154 mg/L (soit 1,15% de l'extrait sec ou 0,6% de la biomasse racinaire sèche)
• Teneur déduite en ALB2 et ALB3 : 813 mg/L (soit 6,1% de l'extrait sec ou 3% de la biomasse racinaire sèche)
• Teneur déduite en ALB totaux (ensemble des isomères) : 967 mg/L (soit 7,3% de l'extrait sec ou 3,6% de la biomasse racinaire sèche)
• Solvant : 62%
pH : 3,66
La quantification des ALB se fait grâce à une gamme étalon préparée à partir d'un standard d'ALBl commercial fourni par Extrasynthèse (Genay, France) solubilisé dans le solvant d'extraction et acidifié au pH 3,5 avec de l'acide phosphorique. Les concentrations de tous les isomères d'ALB sont ainsi exprimées en équivalents d'ALBl dans chaque extrait.
En Figure 1 est présenté un chromatogramme de l'extrait racinaire de Tagetes erecta obtenu selon l'exemple 1. L'appareil utilisé pour analyser l'extrait est une UPLC Shimadzu Nexera X2 (les pompes LC-30AD, passeur d'échantillon SIL-30AC, four CTO-20A, détecteurs à barrette de diodes SPD-M20A ; Kyoto, Japon) fonctionnant en phase inverse avec une colonne Kinetex biphenyl (00F- 4622-AN, Phenomenex, Torrance, CA, USA) de dimensions 150 mm x 2.1 mm, 2.6 pm. La phase mobile est constituée d'un solvant A (Eau ultrapure Mili-Q, Merck Millipore +0.1% d'acide formique, Carlo Erba, Val-de-Reuil, France) et d'un solvant B (Acetonitrile, Sigma-AIdrich Chemie GmbH, Steinheim, Allemagne) dont le gradient a été programmé de la façon suivante : 5-20% B (0-3.5 min), 20-27.5% B (3.5-8 min), 27.5-90% B (8-8.1 min), 90% B (8.1- 10 min), 90-5% B (10-10.1 min), 5% B (10.1-12 min) . Le débit d'analyse est de 0,5 mL/min avec une température de four de 40°C. En sortie de colonne, un détecteur à barrettes de diodes enregistre les spectres UV entre 220 et 370 nm. L'appareil est couplé à un spectromètre de masse (Shimadzu LCMS-2020) fonctionnant avec une ionisation par électrospray (4,5 kV) en mode positif et négatif dans une gamme de m/z entre 100 et 1000. Le logiciel LabSolutions (version 5.60 SP2) est utilisé pour exploiter le système. L'extrait à analyser est filtré sur un filtre 0,2pm avant injection.
1.2 Extrait préparé à partir de solvant hydroéthanolique
Des Tagetes erecta sont cultivées en aéroponie avec un milieu de culture 15/10/30 (azote/phosphore/potassium) ayant une électroconductivité de 0,4 à 1,6 mS/cm, puis les racines sont stimulées pendant une durée de 2 à 4 semaines par un stress azoté par l'utilisation d'une solution nutritive N/P/K comprenant : moins de 6% d'azote, 15% de phosphore et 40% de potassium, et d'une électroconductivité de 0,6 à 0,8 mS/cm. Les racines sont coupées puis sont séchées 48h dans une étuve ventilée à une température comprise entre 40 et 50°C. 450 mg de racines séchée sont broyés à sec puis macérées pendant 3 heures sous agitation à température ambiante dans 45 mL d'une solution hydroéthanolique à 70/30 (éthanol/eau - v/v). Ensuite l'extrait à analyser est filtré sur un filtre 0,2pm avant injection en UPLC selon le matériel et les méthodes décrits ci-dessus dans l'exemple 1.1.
La quantification des ALB est réalisée selon le matériel et les méthodes décrits ci-dessus dans l'exemple 1.1.
L'extrait racinaire de Tagetes erecta ainsi obtenu présente les caractéristiques suivantes :
• Pas d'ALA identifié
• Teneur estimée en ALB1 : 0,5% de la biomasse racinaire sèche ou 2,5% de l'extrait sec
· Teneur déduite en ALB2 et ALB3 : 2,2% de la biomasse racinaire sèche ou 11% de l'extrait sec
• Teneur déduite en ALB totaux (ensemble des isomères) : 2,7% de la biomasse sèche ou 13,5% de l'extrait sec. Exemple 2 : Préparation d'un extrait racinaire et d'un extrait de feuilles de Tagetes patula cultivées en aéroponie sans étape de stimulation et caractérisation de la teneur en ALB de ces extraits
Les extraits de racines ou de feuilles sont préparés à partir de racines et de feuilles séchées de Tagetes patula, originaire de l'Ile de la Réunion. Le fournisseur est la Société Horticole de Bassin Plat, EARL Bassin Plat 31, Chemin de la Croix de Jubile 97410 Saint Pierre, Ile de la Réunion. Les plantes au stade 2 feuilles sont mises en culture en aéroponie avec un milieu de culture 6/10/36 (azote/phosphore/potassium) ayant une électroconductivité de 0,7 mS/cm. Après 2,5 semaines de culture en milieu aéroponique, des racines et des feuilles fraîches sont coupées, puis séchées 48h dans une étuve ventilée à une température comprise entre 40 et 50°C. 20 mg de tissus séchés (feuilles ou racines) sont broyés à sec puis macérées pendant 3 heures sous agitation à température ambiante dans 2 mL d'une solution hydroéthanolique à 70/30 (éthanol/eau - v/v). Ensuite l'extrait est filtré sur un filtre 0,2 pm avant injection en UPLC selon le matériel et les méthodes utilisés pour l'exemple 1. L'extrait racinaire de Tagetes patula selon le chromatogramme présenté en Figure 2 présente les caractéristiques suivantes :
• Pas d'ALA identifié • Teneur estimée en ALB1 : 0,07% de la biomasse sèche ou 0,35% de l'extrait sec
• Teneur déduite en ALB2 : 0,27% de la biomasse sèche ou 1,35% de l'extrait sec
· Teneur déduite en ALB totaux (ensemble des isomères) : 0,34% de la biomasse sèche ou 1,7% de l'extrait sec.
La présence d'ALA ou d'ALB n'a pas été identifiée dans les extraits de feuilles de Tagetes patula.
La quantification des ALB se fait grâce à une gamme étalon préparée à partir d'un standard d'ALBl commercial fourni par Extrasynthèse (Genay, France) solubilisé dans le solvant d'extraction et acidifié au pH = 3,5 avec de l'acide phosphorique. Les concentrations de tous les isomères d'ALB sont ainsi exprimées en équivalents d'ALBl dans chaque extrait.
En Figure 2 est présenté un chromatogramme de l'extrait racinaire de Tagetes patula obtenu selon l'exemple 2, le matériel et les méthodes utilisés pour réaliser la chromatographie sont identiques aux matériels et les méthodes de la chromatographie de l'exemple 1.1.
Exemple 3 : Caractérisation d'un extrait racinaire de Tagetes erecta vis-à-vis d'un bénéfice cosmétique - Identification de cibles par analyse des modifications d'expression de gènes par qRT-PCR sur cartes TaqMan
L'étude consiste à mesurer les effets de l'extrait de Tagetes erecta par qRT- PCR sur cartes TaqMan microfluidiques, d'une part, sur l'expression de 94 gènes impliqués dans la biologie du derme, le remodelage des tissus conjonctifs et le vieillissement (carte « Dermal Benefits » définie par StratiCELL) et, d'autre part, sur l'expression de 94 gènes impliqués dans les fonctions clés de l'épiderme, telles que la fonction barrière en lien direct avec l'hydratation, la réponse antioxydante, ou encore la pigmentation par les mélanocytes (carte « Epidermal Benefits » définie par StratiCELL).
Le protocole a consisté à ajouter de l'extrait de Tagetes erecta dans le milieu de culture de fibroblastes humains NHDFs (Normal Human Dermal Fibroblasts) en monocouche et d'épidermes humains mélanisés reconstitués (RHE/MEL/001), et, après 24 h, à analyser les différentes populations d'ARN pour identifier les gènes différentiellement exprimés par qRT-PCR.
Une étude préalable de cytotoxicité a permis de définir la concentration de travail de l'extrait de Tagetes erecta pour l'étude d'expression génique.
Le TGF-βΙ (Transforming Growth Factor-beta-1) et la vitamine D3 (la, 25- dihydroxyvitamin D3), dont les effets sont documentés dans la littérature, ont été utilisés comme molécules de référence afin de valider les systèmes d'essai et la méthode d'analyse. 3.1. Matériels et méthodes
Extrait
Les plantes Tagetes erecta sont cultivées en aéroponie selon l'exemple 1. Les racines fraîches sont coupées puis macérées à température ambiante pendant 24 heures dans une solution hydroéthanolique à 70/30 (éthanol/eau - v/v). Ensuite l'extrait est filtré. Le solvant est éliminé en utilisant un évaporateur rotatif et la poudre séchée au dessiccateur. Une analyse par chromatographie en phase liquide couplée à une spectrographie de masse (Agilent 1200 séries) a permis de vérifier la présence d'acide léontopodique B dans l'extrait.
Culture Cellulaire
La première partie de l'étude a été réalisée sur des fibroblastes de derme humains NHDFs (ATCC, CRL-2522, origine : prépuce) cultivés en monocouche en milieu DMEM (Invitrogen, 31885-049) contenant des antibiotiques (Pénicilline/Streptomycine, Invitrogen, 15140-122) mais ne contenant pas de sérum. Ces cellules ont été maintenues dans une atmosphère humide à 37°C contenant 5% de C02.
La seconde partie de l'étude a été réalisée sur des épidermes reconstitués (StratiCELL®, RHE/MEL/001) contenant ou non des mélanocytes humains primaires NHEMs (Normal Human Epidermal Mélanocytes) provenant d'un donneur de phototype foncé (phototype IV à V) (Invitrogen, C2025C, lot n°439684). Les tissus ont été cultivés à l'interface air-liquide durant 14 jours dans un milieu de culture approprié, et une atmosphère humide à 37°C contenant 5% de C02. Détermination de la gamme de concentrations d'étude de l'extrait de Tagetes erecta par une étude préliminaire de cytotoxicité
Afin de déterminer la concentration d'analyse optimale pour l'extrait de Tagetes erecta, une expérience préliminaire a été réalisée sur fibroblastes NHDFs, sur mélanocytes humains NHEMs et sur épidermes reconstitués.
Les fibroblastes NHDFs ont effectué 30,1 et 30,7 doublements de population et les mélanocytes NHEMs ont été ensemencés en plaques 24 puits 24 h avant l'application des actifs.
Les épidermes reconstitués (RHE/001 ; lot CB0314/2) ont été transférés dans une plaque 12 puits avant d'être traités avec l'extrait.
L'extrait a été dilué dans le milieu de culture, puis ajouté, sans filtration préalable, dans le milieu de culture des fibroblastes humains NHDFs ne contenant pas de sérum, dans le milieu des mélanocytes humains primaires NHEMs, ou dans le milieu de culture des épidermes différenciés.
Cette étude a consisté à évaluer la viabilité des cellules et des épidermes au MTS (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (Promega,G3581), 24 heures après l'ajout d'extrait de Tagetes erecta et ce, à 5 concentrations et 3 répétions (n = 3) pour les fibroblastes NHDFs et les mélanocytes NHEMs, et à 2 concentrations et 3 répétitions (n = 3) pour les épidermes reconstitués. Les 2 concentrations testées pour les épidermes reconstitués ont été choisies sur la base des résultats de cytotoxicité obtenus pour les mélanocytes NHEMs.
Le SDS (sodium dodécyl sulfate) est toxique pour les cellules et a été utilisé en tant que contrôle positif afin de valider l'expérience.
Au terme de cette expérience, une concentration non cytotoxique a été définie afin de procéder à la mesure des modifications d'expression des gènes cibles. Les concentrations suivantes, en pg d'extrait sec/ml, ont été testées :
Fibroblastes NHDFs et les mélanocytes NHEMs: 0,16 pg/ml, 0,8 pg/ml, 4 pg/ml, 20 pg/ml, lOOpg/ml ;
Epidermes reconstitués : 4 pg/ml et 20 pg/ml.
Analyse des modifications d'expression génique L'extrait a été ajouté, à une concentration choisie, dans le milieu de culture des fibroblastes humains NHDFs (ayant effectué 30,5 et 30,8 doublements de population) en absence de sérum ou dans le milieu de culture des épidermes différenciés mélanisés (RHE/MEL/001, lots CB0314/3 et CB0314/4), sans filtration préalable à la mise en contact des cellules/épidermes.
Des molécules de référence ont été étudiées en parallèle, à savoir, le TGF-βΙ pour les fibroblastes NHDFs et la vitamine D3 (VD3) pour les épidermes reconstitués. Extraction de l'ARIM total
L'extraction des ARNs totaux a été réalisée à l'aide du kit RNeasy Mini (Qiagen, 74106). 24 h après l'ajout de l'extrait, les cellules ont été rincées au PBS et lysées dans le tampon de lyse ad hoc, alors que les épidermes ont été directement plongés dans ce tampon (des triples de culture ont été réalisés pour chaque condition). L'extraction et la purification des ARNs ont été réalisées selon les instructions du fournisseur. Les ARNs totaux ont ensuite été conservés à -80°C.
Qualification des ARNs par spectrophotométrie et électrophorèse capillaire
La concentration des ARNs totaux a été déterminée par mesure spectrophotométrique. La qualité et l'intégrité des ARNs ont ensuite été vérifiées par électrophorèse capillaire (plate-forme Agilent Bioanalyzer 2100 - Agilent RNA 6000Nano Kit, 5067-1511).
- Quantification des ARN par mesure spectrophotométrique : un aliquot de chaque ARN a été dilué dans de l'eau RNase-free et sa concentration a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Ultrospec 1100 Pro (Amersham).
Intégrité des ARN par électrophorèse capillaire sur Bioanalyseur Agilent : l'intégrité de l'ARN total a été évaluée par la visualisation des pics d'électrophorèse correspondant aux ARNs ribosomiaux. Pour les ARN totaux d'eucaryotes supérieurs, la taille des bandes ribosomales doit être de 1,9 kb pour le 18S-ARN et de 4,7 kb pour le 28S-ARN. L'intensité de la bande correspondant au 28S-ARN doit être supérieure à l'intensité de la bande correspondant au 18S-ARN. Des petites bandes diffuses représentant des ARNs de poids moléculaire plus faible (ARNt et l'ARN ribosomique 5S) peuvent être présentes. Lorsque l'ARN est dégradé, on observe un étalement des bandes de l'ARN ribosomal ainsi qu'un bruit de fond des ARN de poids moléculaire plus élevé.
Synthèse des ADNs complémentaires ou ADNc
Les transcriptions inverses (RT) ont été réalisées à l'aide du kit « High Capacity RNA-to-cDNA Kit » (Applied Biosystems, 4387406). Pour la synthèse des ADNc, un mix a été préparé selon les instructions du fournisseur, avec 2 pg d'ARN total, le tampon ad hoc fourni dans le kit et l'enzyme transcriptase inverse. Cette réaction a été réalisée à 37°C pendant 1 heure, puis 5 minutes à 95°C et finalement les échantillons d'ADNc ont mis sur glace et stockés à - 20°C. Validation des systèmes d'essai - qPCR en temps réel à l'aide de sondes fluorescentes de type TaqMan
La méthode de qPCR en temps réel a été utilisée pour quantifier l'expression de différentes cibles spécifiques dans les populations d'ARNs issues des fibroblastes NHDF traités par le TGF-βΙ (20ng/ml) ainsi que des épidermes mélanisés traités par la vitamine D3 (ΙΟΟηΜ) et par le solvant éthanol (EtOH 0,1%), utilisé pour solubiliser la VD3.
Les séquences cibles des gènes d'intérêt ont été amplifiées par PCR en utilisant les « TaqMan Gene Expression Assays » (Applied Biosystems). Ces kits comprennent une sonde TaqMan et 2 amorces spécifiques, qui ont été pré-mélangées à une concentration de 18 μΜ pour chaque amorce et de 5 pM pour la sonde. Ce mélange est concentré 20 fois. Les sondes TaqMan ont été greffées avec un fluorophore (FAM) à l'extrémité 5' de la séquence et avec un «quencher» de fluorescence en 3'.
Les PCRs ont été réalisées à l'aide du système 7900HT Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems). Les réactions ont été réalisées dans un volume de 20 pL. Le mélange réactionnel contient 10 pL de TaqMan Fast Universal Master Mix (Applied Biosystems), 1 pL de TaqMan Gene Expression Assay et 5 pL d'eau RNase-free. Dans chaque puits d'une microplaque 96 puits, 16 μΙ_ du mélange et 4 μΙ_ d'ADNc (4 ng) ont été ajoutés. A des fins de normalisation, des mélanges réactionnels avec des sondes et amorces correspondant à la glycéraldehyde-3- phosphate déshydrogénase (GAPDH) pour les fibroblastes et à la β2- microglobuline (B2M) pour les épidermes mélanisés ont également été préparés avec les mêmes échantillons d'ADNc. Un contrôle sans ADNc a servi de contrôle négatif d'amplification. Les cycles thermiques ont été programmés avec une étape d'incubation à 50°C pendant 2 min, suivie d'une première étape de dénaturation à 95°C pendant 10 min. Le protocole d'amplification PCR s'est poursuivi avec 40 cycles de 15 sec à 95°C suivi d'une min à 60°C. Les niveaux d'expression ont été quantifiés selon la méthode de calcul de l'expression relative par rapport à un gène de ménage (2"Δα), dérivée du calcul des ΔΔΟ: (Pfaffl, A new mathematical model for relative quantification in real- time RT-PCR, Nucleic Acids Res, 29 (9), 2001, 2002-2007; Livak and Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using Real-Time Quantitative PCR and the &a method, Methods, 25 (4), 2001, 402-408) décrite ci-après :
La quantification relative des transcrits a été réalisée par l'utilisation d'une méthode de calcul qui consiste à comparer la moyenne des valeurs de contrôle (Ct) obtenues pour les conditions TGF-βΙ (20ng/ml) et VD3 (ΙΟΟηΜ) avec les conditions témoins respectives (CTL non traité et CTL Ethanol 0,1%). Ces Ct représentent le seuil de détection à partir duquel la quantité d'ADN est telle que le signal se distingue significativement du bruit de fond. Cette valeur moyenne de Ct a été normalisée par rapport à un gène de ménage, à savoir la Glycéraldehyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) pour les fibroblastes NHDF et la β2-microglobuline (B2M) pour les épidermes mélanisés reconstitués. Ainsi, la différence de niveau d'expression (RQ) a été obtenue par utilisation de la formule :
2_ (ACt condition traitée - ACt condition de référence)
Figure imgf000037_0001
où ACt = Ct (gène cible) - Ct (gène de ménage) au sein d'un même échantillon d'ADNc.
Préparation des cartes microfluidiques Taqman, réalisation de la PCR quantitative et analyse des Ct Les mélanges réactionnels pour PCR sur cartes microfluidiques TaqMan, produites à façon par Applied Biosystems, ont été préparés en suivant les instructions détaillées du guide Applied Biosystems Micro Fluidic Card Getting Started Guide. En résumé, 100 ng d'ADNc ont été ajoutés à un mélange spécifique pour PCR (Taqman Universal PCR Master Mix, 4364338, Applied Biosystems) avant d'être injectés dans la carte et dispersés par capillarité. Après avoir centrifugé la carte, celle-ci a été scellée avant la réalisation de la PCR quantitative et l'analyse avec le système 7900HT d'Applied Biosystems, à l'aide du software ABI PRISM® 7900 Séquence Détection System, SDS2.4. Les cycles seuil (Ct) ont été obtenus pour tous les gènes représentés sur les cartes et exprimés par les fibroblastes NHDF et par épidermes reconstruits mélanisés.
Les résultats ont été exportés à partir du dispositif de qPCR en temps réel en utilisant le logiciel SDS RQ Manager (vl .2.1, Applied Biosystems) et l'analyse des modifications d'expression a été réalisée à l'aide du logiciel Data Assist (V3.0., Applied Biosystems) conçu pour réaliser la quantification relative de l'expression génique en utilisant la méthode de comparaison des Ct (ΔΔΟ:) (Pfaffl, 2001 et Livak and Shmittgen, 2001) décrite dans le paragraphe ci- dessus et une combinaison d'analyses statistiques. Comme précisé plus haut, la méthode de calcul des ΔΔΟ: consiste en la comparaison des valeurs de Ct obtenues pour les conditions traitées par l'extrait avec la condition de référence (contrôle DMSO). Ces valeurs de Ct ont elles-mêmes été normalisées par rapport au gène de ménage GAPDH (glycéraldéhyde-3- phosphate déshydrogénase) pour les fibroblastes NHDF et B2M (β-2 microglobulin) pour les épidermes reconstruits mélanisés. La valeur de Ct maximale admissible utilisée comme seuil de détection a été fixée à 36 cycles.
3.2. Résultats 3.2.1. Détermination de la concentration d'analyse de l'extrait par une étude de cytotoxicité
L'étude préalable de cytotoxicité sur les fibroblastes NHDF, sur les mélanocytes humains NHEM et sur les épidermes reconstitués a permis de définir une concentration de travail (préparé dans du DMSO) pour l'étude d'expression génique. Le solvant présent dans l'extrait a été testé en parallèle. Le SDS à 0,08% (pour NHDF) et à 0,05% (pour NHEM) a été utilisé comme contrôle positif de cytotoxicité afin de valider l'expérience. Sur la base de ces résultats (données non montrées), les concentrations suivantes ont été choisies pour la suite de l'étude : 100 pg d'extrait sec /ml (pour les fibroblastes NHDF) et 20 pg d'extrait sec/ml (pour les épidermes mélanisés reconstitués).
3.2.2. Qualification des ARNs par électrophorèse capillaire
Les différentes populations d'ARN démontrent bien la présence de pics étroits, correspondant aux ARNs ribosomiaux 18S et 28S, et un rapport équilibré entre les deux pics. L'absence de pics intermédiaires et étalés, caractéristiques de produits de dégradation des ARNs témoigne de l'intégrité des différentes populations (données non montrées). La qualité et l'intégrité des ARNs extraits étant démontrée, ceux-ci ont dès lors été utilisés pour la poursuite du protocole et engagés dans les réactions de synthèse des ADNs complémentaires.
3.2.3. Effets de l'extrait sur 94 gènes cibles au sein des fibroblastes NHDF
L'extrait a été ajouté dans le milieu de culture des fibroblastes NHDF (n = 3). Des contrôles traités seulement par le solvant DMSO à 1% (véhicule de l'extrait) ont également été analysés. En parallèle, le TGF-βΙ (20 ng/ml) a été étudié en tant que contrôle de validation. Après 24 heures de culture des fibroblastes NHDF, les populations d'ARNs totaux ont été extraites, leur intégrité a été analysée par électrophorèse capillaire, et les différences d'expression géniques ont été analysées par qRT-PCR à l'aide de cartes TaqMan 96-puits, ciblant les fonctions clés du derme.
Les résultats sont présentés de manière récapitulative sous la forme d'un tableau (Tableau 2) indiquant des gènes représentatifs d'un effet cosmétique bénéfique, variant significativement, 24 heures après l'application de l'extrait sur des fibroblastes de derme humains NHDF. Extrait
Symbole- n° essai Nom du gène
RQ p-value
SOD2-Hs00167309_m l Superoxide dismutase 2, mitochondrial 13,58 0
CCL5-Hs00982282_m l Chemokine (C-C motif) ligand 5 2,24 0,0368
HMOX1-Hs01110250_m l Hème oxygènase (decycling) 1 2,05 0,0197
DCN-Hs00754870_sl Décorine (PGS2) 1,77 0,0396
SOX2-Hs01053049_sl Transcription facteur SOX-2 1,71 0,0361
HPSE-Hs00935036_m l Héparanase 1,66 0,0017
TXNRD1-Hs00917067_m l Thiorédoxine réductase 1 1,56 0,0199
NQOl-Hs02512143_sl NAD(H)déshydrogénase, quinone 1 1,51 0,0025
MT2A-Hs02379661_g l Métallothionéine 2A 1,51 0,0208
COL3A1-Hs00943809_m 1 Collagène 3 alpha 1 subunit (COL3A1) 1,43 0,002
CYR61-Hs00998500_g l Protéine CYR61 1,43 0,0293
Collagène sous-unité 16 alpha 1
COL16A1-Hs00156876_m l
(COL16A1) 1,42 0,034
NGF-Hs00171458_m l « Beta-nerve growth factor » 1,32 0,0036
FBLN5-Hs00197064_m l Fibuline-5 1,29 0,0062
MYC-Hs00153408_m l Myc proto-oncogène protéine 1,26 0,039
G6PD-Hs00166169_m l Glucose-6-phosphate déshydrogénase 1,18 0,0411
BDNF/NT-3 Facteurs de croissance
NTRK2-Hs00178811_m l
récepteur 0,56 0,0078
MKI67-Hs01032443_m l Antigène Ki-67 0,48 0,0111
Membre 16 de la superfamille des
NGFR-Hs00609977_m l récepteurs au facteur de nécrose
tumorale (p75NTR) 0,06 0,0006
Tableau 2 : Liste des gènes qui varient de manière significative 24 heures après l'application de l'extrait racinaire de Tagetes erecta (à 100 pg ES/ml) sur des fibroblastes de derme humains NHDFs. Le symbole des gènes et le numéro d'essai, le nom des gènes, l'expression relative (RQ) par rapport au véhicule DMSO à 1% (RQ > 1 : augmentation - RQ < 1 : diminution) et la valeur p (p-value) sont présentés.
• Défense anti-oxydante (6 gènes surexprimés)
L'extrait de Tagetes erecta induit remarquablement l'expression du gène de la superoxyde dismutase 2 (SOD2) (X 13,6). Cette régulation est couplée à la surexpression d'autres gènes impliqués dans la réponse au stress oxydant, tels que HMOXl (hème oxygénase 1 (X2,l)), TXRNDl (thioredoxine réductase 1 (XI, 6)), NQOl (NAD(H) déshydrogénase, quinone 1 (XI, 6)), MT2A (métallothionéine 2A (XI, 5)) et G6PD (Glucose-6-phosphate déshydrogénase (X 1,2)).
La superoxyde dismutase 2 codée par le gène SOD2 est une protéine mitochondriale impliquée en première ligne dans la défense contre les espèces réactives de l'oxygène. En effet, elle convertit l'anion superoxyde en hydroperoxyde qui, lui-même, est convertit en oxygène et en eau par la catalase et les peroxyrédoxines.
La NAD(H) déshydrogénase, quinone 1 (NQOl ) est une autre enzyme détoxifiante qui favorise, par réduction, la formation des hydroquinones à partir des quinones, empêchant la production d'espèces radicalaires. Le gène NQOl est surexprimé en réponse à des agents pro-oxydants, à des métaux lourds, aux UV ou encore à des radiations ionisantes afin de protéger la cellule de leurs effets néfastes.
La glucose-6-phosphate déshydrogénase codée par le gène G6PD est la première enzyme de la voie des pentoses phosphates. Elle catalyse l'oxydation du glucose-6-phosphate en 6-phosphoglucono-5-lactone. Cette réaction est couplée à la réduction d'une molécule de NADP+ en NADPH, nécessaire à la réduction du glutathion GSSG (forme oxydée) en glutathion GSH (forme réduite), un puissant antioxydant.
Les métallothionéines, dont fait partie la métallothionéine 2A (MT2A), sont des protéines de faibles poids moléculaires capables de lier les métaux. Elles sont impliquées dans diverses fonctions biologiques telles que la neutralisation des radicaux libres, le stockage de zinc ou encore dans la protection contre la toxicité du cadmium.
Le gène HMOXl codant pour la protéine HO-1 ou hème oxygénase est souvent surexprimé en réponse à un stress, et joue un rôle crucial dans la protection et le maintien de l'homéostasie cellulaire. La protéine HO-1 est impliquée dans la dégradation de Thème (ayant des propriétés pro-oxydantes) en monoxyde de carbone, fer ferreux et biliverdine. Ces 2 derniers composants sont les précurseurs des antioxydants bilirubine et ferritine. HMOXl est donc connu pour son rôle protecteur contre le stress oxydant. Le système thiorédoxine est un des systèmes majeurs de défense antioxydante. Dans ce système, la thiorédoxine réductase catalyse le transfert d'électrons provenant du NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) vers la thiorédoxine, qui elle-même exerce une action réductrice sur diverses protéines cibles. Parmi les 3 isoformes de la thiorédoxine réductase, l'isoforme 1 codée par le gène TXRND1 est la plus étudiée. Elle est connue pour être notamment sous le contrôle transcriptionnel du facteur de transcription Nrf-2 jouant un rôle majeur dans la défense anti-oxydante.
La surexpression de 6 gènes impliqués dans la défense anti-oxydante témoigne de la capacité de l'extrait à réduire les effets de stress pro-oxydants générant un excès de radicaux libres, comme les UV accélérant les signes de l'âge au niveau de la peau, ou encore de lutter contre diverses pathologies ou conditions pro-inflammatoires, également génératrices d'espèces réactives de l'oxygène.
L'extrait se positionne clairement par rapport à une revendication cosmétique liée au contrôle de la production de radicaux libres, dans une optique anti-âge ou anti-inflammatoire.
• Résistance et élasticité de la peau
Plusieurs gènes codant pour des protéines de la matrice extracellulaire (MEC) sont également induits : DCN, HPSE, COL3A1, COL16A1, FBLN5.
La décorine (DCN) intervient, au niveau du derme, dans l'assemblage des fibrilles de collagène. Les collagènes III (COL3A1 ) et XVI (COL16A1 ) jouent un rôle dans le maintien de l'homéostasie de la MEC et sont donc importants pour la résistance et l'élasticité du derme. L'héparanase encodée par le gène HPSE joue un rôle dans la dégradation des héparans sulfate (HS), des composants de la membrane basale présents au niveau des membranes cellulaires où ils sont associés avec d'autres protéines pour former des protéoglycans (entre autres le perlécan, les syndécans et les glypicans). La fibuline-5 (FBLN5) joue quant à elle un rôle majeur dans l'assemblage des fibres élastiques au niveau du derme.
Ces régulations positionnent donc l'extrait comme potentiellement intéressant afin de favoriser la restructuration du derme dans le contexte du vieillissement cutané. • Neurotrophines et perception de la douleur
Plusieurs gènes sont également réprimés par l'extrait : c'est le cas de NTRK2 (X0,6) et de NGFR (X0,06) . Ces derniers codent pour des récepteurs aux neurotrophines, responsables de la sensation de la douleur. La sous- expression de ces gènes pourrait favoriser un effet apaisant ou calmant sur la peau due à une condition inflammatoire ou une sensation d'irritation qui se développe après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes.
Les neurotrophines font partie d'une famille de facteurs de croissance contrôlant le développement, la maintenance et l'apoptose des cellules neuronales. Les neurotrophines exercent également de multiples fonctions non-neuronales : elles régulent la prolifération et la différenciation cellulaire, l'apoptose et le remodelage des tissus notamment au niveau de la peau .
Les fibroblastes de derme ainsi que les myofibroblastes synthétisent et sécrètent des neurotrophines telles que le Nerve Growth Factor (NGF), le Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) ou encore la neurotrophine-3 (NT- 3) . Les effets des neurotrophines sont médiés par leurs récepteurs exprimés également par les fibroblastes. On distingue deux classes de récepteurs : les récepteurs de la famille des tyrosine kinase receptors (Trk) et le récepteur aux neurotrophines p75 (p75 NTR ou NGFR) . Chaque récepteur a une affinité et spécificité propre vis-à-vis de son ou de ses ligands. TrkB (codé par le gène NTRK2) lie spécifiquement BDN F ainsi que NT-3 et NT-4. P75 NTR est q uant à lui capable de lier toutes les neurotrophines.
Les neurotrophines, via leurs récepteurs, stimulent la prolifération et la migration des fibroblastes ainsi que la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes. Elles pourraient donc être impliquées dans la régulation du remodelage des tissus lors du processus de cicatrisation des plaies cutanées. Le NGF est un facteur neurotrophique, initialement décrit comme un facteur de survie des neurones dans le système nerveux central, mais également au niveau des neurones sensoriels ou des nocicepteurs de la peau . NGF joue également un rôle dans l'inflammation . En effet, la neutralisation du NGF inhibe la sensibilisation des neurones sensoriels (nocicepteurs), avec pour effet de réduire la perception de la douleur associée à un état inflammatoire. L'extrait induit une diminution de l'expression des gènes codant pour des récepteurs aux neurotrophines, incluant notamment les récepteurs TrkB (NTRK2) (X 0,06) et p75 NTR (NGFR) (X 0,06) et du NGF. Celui-ci pourrait donc favoriser un effet apaisant ou calmant pour la peau due à une condition inflammatoire ou une sensation d'irritation qui se développe après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes.
L'extrait favorise un effet apaisant ou calmant pour la peau due à une condition inflammatoire ou une sensation d'irritation qui se développe après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes.
3.2.4. Effets de l'extrait racinaire de Tagetes erecta sur 94 gènes cibles au sein des épidermes reconstruits mélanisés
L'extrait a été ajouté dans le milieu de culture des épidermes mélanisés reconstruits (n = 3) . Des contrôles traités par le solvant DMSO (0,2% pour les épidermes reconstruits) dans lequel a été préparé l'extrait ont également été analysés. En parallèle, la vitamine D3 ( 100 nM) a été étudiée en tant que contrôle de validation . La vitamine D3 ayant été solubilisée dans l'éthanol, une condition « solvant éthanol » a été utilisée en tant que condition témoin . Après 24 h de culture, les populations d'ARNs totaux ont été extraites, leur intégrité a été analysée par électrophorèse capillaire, et les différences d'expression géniques ont été analysées par q RT-PCR à l'aide de cartes Taq Man 96-puits, ciblant les fonctions clés de l'épiderme.
Les résultats sont présentés de manière récapitulative sous forme d'un tableau (Tableau 3) indiquant des gènes représentatifs d'un effet cosmétique bénéfique, variant significativement, 24 heures après l'application de l'extrait sur des épidermes. Extrait
Symbole- n° essai Nom du gène
RQ p-value
HRNR-Hs02340614_m l Hornérine 3,6 0,0003
MMP1-Hs00899658_m l Matrice métalloprotéinase-1 2,1 0,0076
AQP5-Hs00387048_m l Aquaporine-5 1,9 0,0366
LAMA3-Hs00165042_m l Laminine sous-unité alpha-3 0,9 0,0312
HMOX1-Hs00157965_m l Hème oxygénase (Decycling) 1 0,8 0,0384
LCE2B-Hs00863535_g l « Late cornified envelope » protéine 2B 0,8 0,0373
LOR-Hs01894962_sl Loricrine 0,8 0,0258
RNASE7-Hs00922963_sl Ribonucléase 7 0,8 0,0061
PLG-Hs00264877_m l Plasminogène 0,7 0,0026
LTF-Hs00914334_m l Lactotransferrine 0,7 0,0025
Tableau 3 : Liste des gènes qui varient de manière significative 24 heures après l'application de l'extrait racinaire de Tagetes erecta (à 20 pg ES/ml) sur des épidermes reconstruits. Le symbole des gènes et le numéro d'essai, le nom des gènes, l'expression relative (RQ) par rapport au véhicule DMSO à 0,2% (RQ > 1 : augmentation - RQ < 1 : diminution) et la valeur p (p-value) sont présentés.
• Fonction barrière de l'épiderme
L'extrait augmente l'expression des gènes HRNR et AQP5. L'hornérine (HRNR) et l'aquaporine-5 (AQP5) participent toutes deux au maintien de la fonction barrière de l'épiderme et à son hydratation .
L'extrait agit en tant qu'inducteur de l'expression du gène codant pour l'hornérine (HRNR), avec une amplitude de 3,6. L'hornérine est une protéine présente au niveau de la couche cornée et de la couche granuleuse de l'épiderme. De travaux récents démontrent que cette protéine est structurellement assez proche de la pro-filaggrine (précurseur de la filaggrine) .
L'hornérine est une protéine essentielle à la résistance mécanique de la couche cornée. Il s'agit en effet d'un constituant majeur de l'enveloppe cornée, substrat de la transglutaminase-3 et localisée en périphérie des cornéocytes. Un rôle de défense antimicrobienne a également été mis en évidence pour certains peptides dérivés de l'hornérine. Il a aussi été démontré que HRNR est sous-exprimé in vivo dans de nombreux cas de dermatite atopique. Le fait que l'hornérine soit induite par un traitement de la peau aux UV ou après « tape stripping » suggère un rôle de cette protéine au niveau de l'intégrité de la fonction barrière de la peau après restauration de celle-ci suite à des stress occasionnés par l'exposition au soleil ou par le frottement mécanique lié par exemple au rasage. L'extrait induit également la surexpression de AQP5 (X 1,9) codant pour l'aquaporine-5, une protéine membranaire agissant comme transporteur de l'eau au travers la membrane plasmique et jouant donc un rôle important dans l'hydratation de l'épiderme.
Du fait de son effet positif sur l'expression d'une protéine (hornérine) essentielle de la couche cornée et de la couche granuleuse de l'épiderme, l'extrait démontre un rôle positif dans l'intégrité et l'efficacité de la fonction barrière de l'épiderme.
De plus, en induisant la surexpression d'une protéine (aquaporine-5) impliquée dans le transport de l'eau au travers de la membrane plasmique, l'extrait joue un rôle positif dans l'hydratation de la peau.
• Cicatrisation cutanée
L'extrait racinaire de Tagetes erecta induit l'expression du gène de la métalloprotéinase-1 MMP-1 d'un facteur de 2,1. Les MMPs sont des métalloprotéinases capables de cliver la plupart des composants de la MEC et de modifier, par protéolyse, bon nombre de molécules importantes pour la cicatrisation cutanée. En particulier, MMPl joue un rôle majeur dans la ré- épithélialisation des kératinocytes, essentielle dans le processus de cicatrisation des plaies cutanées. MMPl facilite l'assemblage de la MEC, l'élongation et la migration des cellules, la réorganisation du cytosquelette d'actines, et induit l'activation de la kinase ERK (extracellular signal-regulated kinase) nécessaire à la motilité et la capacité d'invasion des cellules épithéliales. En outre, il a été montré que la protéine MMPl est surexprimée au niveau de l'épiderme en réponse aux plaies cutanées.
La surexpression du gène MMP-1 au niveau de l'épiderme par l'extrait permet de le positionner comme un actif favorisant potentiellement la cicatrisation cutanée, en particulier au niveau de la fermeture de la plaie. L'extrait se montre sur ce point très intéressant car il induit une amplitude d'expression de ce gène d'un facteur de 2,1. Exemple 4 : Effet d'extraits racinaires de Tagetes erecta dans du propane 1,2 diol, sur des fibroblastes et des kératinocytes humains - Etude en puces à ADN "GeneChip Human Gene"
Afin d'analyser la possibilité qu'un extrait selon l'invention possède une action bénéfique sur la peau, une étude transcriptomique sur puce à ADN a été réalisée à partir de fibroblastes humains (NHDFs) et de kératinocytes humains (NHEKs) traités durant 24 heures par un extrait racinaire de Tagetes erecta. Les variations d'expression des gènes ont été contextualisées et interprétées biologiquement au travers de la base de données propriétaire « StratiCELL Skin Knowledge database ».
Une étude de cytotoxicité préalable réalisée dans les modèles cellulaires ad hoc, à savoir fibroblastes humains (NHDFs) et kératinocytes humains (NHEKs), a permis de déterminer la concentration optimale de l'extrait utilisé pour l'étude.
4.1. Matériels et méthodes
Extrait racinaire
Un extrait racinaire de Tagetes erecta a été préparé selon l'exemple 1.1.
Culture Cellulaire
L'étude a été réalisée sur des fibroblastes de derme humains NHDFs (Normal Human Dermal Fibroblasts) (ATCC/LGC promoChem, CRL-2522, origine : prépuce) à environ 40% de leur potentiel prolifératif in vitro. Ces cellules ont été cultivées en monocouche en milieu DMEM (Invitrogen, 31885-049) sans sérum et contenant des antibiotiques (pénicilline/streptomycine, Invitrogen, 15140-122).
D'autre part, l'étude a également été réalisée sur des kératinocytes de l'épiderme humains NHEKs (Normal Human Epidermal Kératinocytes ; Lonza, 0019206, origine : prépuce) cultivés en monocouche en milieu Epilife contenant de l'HKGS (Human Keratinocyte Growth Supplément) et de la gentamycine.
Les cellules ont été maintenues dans une atmosphère humide à 37°C contenant 5% de C02.
Détermination de la gamme de concentrations d'étude de l'extrait racinaire de Tagetes erecta par une étude préliminaire de cytotoxicité Afin de déterminer la concentration d'analyse optimale de l'extrait, une expérience préliminaire a été réalisée sur fibroblastes NHDFs et kératinocytes NHEKs.
Les fibroblastes NHDFs et les kératinocytes NHEKs ont été ensemencés en plaques 24 puits 24 heures avant l'application de l'extrait, en milieu DMEM (INVITROGEN, 31885) contenant des antibiotiques (pénicilline/streptomycine, INVITROGEN, 15140) en présence de 10% de sérum pour les NHDFs ou en milieu Epilife (INVITROGEN, M-EPI-500 A) contenant le supplément HKGS (INVITROGEN, S-001-K) et de la gentamycine (INVITROGEN, 15710-049) pour les NHEKs.
L'extrait a été solubilisé dans le milieu de culture approprié, puis placé en contact des fibroblastes NHDFs ou des kératinocytes NHEKs durant 24 heures. Cette étude a consisté à évaluer la viabilité des cellules au MTS (3-(4,5- dimethythiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H- tetrazolium) (Promega,G3581), 24 heures après l'ajout de l'extrait et de son solvant (propane 1,2 diol 60% pH = 3,5) et ce, à 5 concentrations et 3 répétions (n = 3).
Le SDS (sodium dodécyl sulfate) est toxique pour les cellules et a été utilisé en tant que contrôle positif afin de valider l'expérience.
Au terme de cette expérience, une concentration non cytotoxique a été définie afin de procéder à l'analyse transcriptomique.
Les concentrations suivantes, en pourcentage v/v, ont été testées pour l'extrait et le solvant :
Fibroblastes NHDFs et kératinocytes NHEKs: 3%, 1%, 0,33% 0,11%, 0,037% Traitement des cellules
L'extrait ou le solvant ont été appliqués à une concentration choisie, pendant 24h, dans le milieu de culture des fibroblastes NHDFs et des kératinocytes NHEKs. Des quadruples de culture ont été réalisés pour chaque condition (n=4).
Extraction de l'ARIM total
Au terme des traitements, les populations d'ARNs totaux ont été extraites. L'extraction a été réalisée à l'aide du kit RNeasy (Qiagen). Après 24h de traitement, les cellules ont été rincées avec du PBS et lysées dans du tampon ad hoc. L'extraction et la purification des ARNs ont été réalisées selon les instructions du fournisseur. Les ARNs totaux ont ensuite été conservés à -80°C en vue de l'analyse transcriptomique.
Qualification des ARNs par spectrophotométrie et électrophorèse capillaire
La concentration des ARNs totaux a été déterminée par mesure spectrophotométrique. La qualité et l'intégrité des ARNs ont ensuite été vérifiées par électrophorèse capillaire (plate-forme Agilent Bioanalyzer 2100 - Agilent RNA 6000Nano Kit, 5067-1511).
Quantification des ARN par mesure spectrophotométrique : un aliquot de chaque ARN a été dilué dans de l'eau RNAse-free et sa concentration a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Ultrospec 1100 Pro (Amersham). Intégrité des ARN par électrophorèse capillaire sur Bioanalyseur Agilent : l'intégrité de l'ARN total a été évaluée par la visualisation des pics d'électrophorèse correspondant aux ARNs ribosomiaux. Pour les ARN totaux d'eucaryotes supérieurs, la taille des bandes ribosomales doit être de 1,9 kb pour le 18S-ARN et de 4,7 kb pour le 28S-ARN. L'intensité de la bande correspondant au 28S-ARN doit être supérieure à l'intensité de la bande correspondant au 18S-ARN. Des petites bandes diffuses représentant des ARNs de poids moléculaire plus faible (ARNt et l'ARN ribosomique 5S) peuvent être présentes. Lorsque l'ARN est dégradé, on observe un étalement des bandes de l'ARN ribosomal ainsi qu'un bruit de fond des ARNs de poids moléculaire plus élevé.
Phase d'hybridation sur puces GeneChip Human Gene 2.0 ST (Affymetrix)
Les ARNs ont ensuite été dilués à 50 ng/μΙ et 50 μΙ de chaque échantillon (n = 3) ont été utilisés. La quatrième réplique sert de back-up.
Les échantillons d'ARN (50ng) ont été amplifiés par l'utilisation de la technologie Ribo-SPIA, selon 3 étapes (Ovation Pico WTA System V2, NuGEN, 3302-12) et purifiés avec le kit Agencourt RNA Clean up XP Beads (Agencourt - Beckam Coulter Genomics, A29168). Pour chaque échantillon, 5 pg ont été fragmentés et marqués à la biotine, grâce au NuGEN Encore Biotin Module (NuGEN, 4200-12). L'hybridation a été effectuée sur des puces à ADN du modèle GeneChip Human Gene 2.0 ST (Affymetrix, 902112). Les étapes d'hybridation sur puce, lavage et fixation, ont été réalisées suivant le protocole défini par Affymetrix. La solution d'hybridation a été préparée par utilisation des kits Affymetrix Genechip Expression 3' Amplification Reagent Hybridization Controls (Affymetrix, 900454) et Hybridization Module for GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit (Affymetrix, 900720), et mélangée avec l'ADN complémentaire (ADNc) amplifié dans les étapes précédentes. L'hybridation a été réalisée durant 18h dans le four GeneChip Hybridization Oven 640 (Affymetrix, 800139). Le lavage et la révélation ont été réalisés à l'aide de la station fluidique GeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix, 00- 0079) et les mesures d'intensité ont été scannées avec le GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).
Prétraitement des données d'hybridation
Le traitement des données brutes a été réalisé avec les logiciels R (v3.2.3) et le package 'oligo' (vl .34.2) du projet BioConductor (v3.2 ; Gentleman R. et al., Génome Biology 2004, 5, R80). La dernière version des librairies fournies par Affymetrix, construites sur la version 19 du génome humain (UCSC Human génome 19), et la méthode RMA, décrite par Irizarri et al. (Irizarry Ra. et al., Speed Tp. Biostatistics. 2003b, 4 (2), 249-64 ; Irizarry Ra. et al., Boeke Jd . Stat Appl Genêt Mol Biol. 2003a, 2, Epub. 2003 Mar 18) ont été utilisées afin de guider et effectuer le prétraitement et l'annotation des séquences.
Analyse des données, annotation et analyse thématique
L'analyse statistique individuelle des gènes/transcrits a été réalisée avec les méthodes "Moderated t" et "Moderated F" implémentées dans le package R Limma 3.26.8.
L'annotation des gènes et la définition de groupes de gènes pour l'analyse de sur-représentation ont été réalisés au départ de la base de données interne « StratiCELL Skin Knowledge Database » (Salmon M & Berger F. Expression Cosmétique 2014, 30, 91-94).
L'analyse de sur-représentation a été réalisée avec la méthode du test hypergéométrique dans but de caractériser les facteurs thèmes/groupes d'intérêt dermo-cosmétique au départ de la proportion de leurs cibles détectées et différentiellement exprimées. L'analyse a été menée au départ de la liste des gènes détectés avec une p-value de 0,05 et une différence du niveau d'expression (Taux de variation ou fold-change ou FC) supérieur à 1,5 (bi-latéral). 4.2. Résultats
4.2.1. Détermination de la concentration d'analyse de l'extrait racinaire de Tagetes erecta par une étude préliminaire de cytotoxicité Une étude de la cytotoxicité a été réalisée sur des fibroblastes NHDFs et sur des kératinocytes NHEKs. L'extrait et son solvant ont été appliqués dans les milieux de culture, durant 24h (n = 3). Le contrôle non traité a été arbitrairement fixé à 100% de viabilité et le seuil de cytotoxicité a été fixé par convention à 80% de viabilité. La condition SDS constitue le contrôle positif qui valide l'expérience.
Sur la base des résultats de l'étude préliminaire de cytotoxicité (données non montrées), les concentrations optimales (en pourcentage v/v) sélectionnées pour l'extrait et son solvant sont les suivantes : Extrait et solvant (propane 1,2 diol) : pour les fibroblastes NHDFs 3% et pour les kératinocytes NHEKs 1%.
4.2.2. Quantification des ARNs par spectrophotométrie
Le rapport de l'absorbance à 260nm et 280nm est utilisé pour évaluer la pureté de l'ARN . Un rapport proche de 2 permet de considérer l'échantillon comme étant pur et dépourvu de contamination par des protéines. Le rapport 260/230 est utilisé en tant que mesure secondaire de la pureté de l'échantillon. La valeur 260/230 est généralement plus élevée que le ratio 260/280 et est attendue aux environs de 2,2. Les ratios obtenus pour l'ensemble des échantillons de la présente étude sont donc satisfaisants (données non montrées) et ont été qualifiés ensuite par électrophorèse capillaire.
4.2.3. Qualification des ARNs par électrophorèse capillaire
Les différentes populations d'ARN démontrent bien la présence de pics étroits, correspondant aux ARN ribosomiaux 18S et 28S, et un rapport équilibré entre les deux pics. L'absence de pics intermédiaires et étalés, caractéristiques de produits de dégradation des ARNs témoigne de l'intégrité des différentes populations (données non montrées).
La qualité et l'intégrité des ARNs extraits étant démontrées, ceux-ci ont dès lors été utilisés pour la poursuite du protocole et engagés dans les réactions d'amplification, de purification, marquage à la biotine puis hybridation sur puces à ADN.
4.2.4. Analyse des modifications d'expression de gènes induites par l'extrait racinaire de Tagetes erecta
Au terme de l'étude transcriptomique sur des kératinocytes de l'épiderme humains NHEKs, l'extrait racinaire de Tagetes erecta pourrait jouer un rôle potentiel dans le renforcement de la cohésion et de la différenciation épidermique, la protection contre les stress environnementaux et la défense anti-microbienne. Cependant, l'étude sur fibroblastes NDHFs a révélé quelques observations en lien avec une activité détoxifiante. Ci-après, les régulations observées en lien avec ces hypothèses sont renseignées entre parenthèses, comme suit : (nom du gène - Taux de variation ou Fold change - p-value) et remises dans le contexte des fonctions de la biologie cutanée modulées par les protéines correspondantes.
4.2.4.1 Stimulation de la différenciation épidermique
(kératinocytes)
L'épiderme humain est un épithélium stratifié constituant une barrière dont les couches sont définies par le stade de différenciation des cellules qui les composent. Au fur et à mesure de leur différenciation, les kératinocytes se chargent en filaments de kératine et contiennent une matrice retenant l'eau, le tout étant entouré par l'enveloppe cornée. Les kératinocytes en phase terminale de différenciation sont isolés par les lipides intercornéocytaires et sont attachés les uns aux autres par les cornéodesmosomes.
Les kératinocytes basaux progressent à travers les quatre couches de l'épiderme : basale, épineuse, granuleuse et cornée.
La couche basale est formée par une seule assise de kératinocytes cubiques ou prismatiques liés les uns aux autres par les desmosomes. Dans cette couche les cellules se divisent, l'une des deux cellules reste dans la couche basale tandis que l'autre migre vers les couches supérieures. Les kératinocytes basaux sont attachés par les hémi-desmosomes à une membrane basale qui sépare l'épiderme du derme et forme la jonction dermo-épidermique. La couche épineuse est formée par 5 à 15 assises de kératinocytes polygonaux liés les uns aux autres par les desmosomes. Ces cellules contiennent des tonofilaments, les filaments précurseurs de la kératine.
La couche granuleuse est formée par 3 couches de kératinocytes qui contiennent des grains de kératohyaline et des granules lamellaires.
La couche cornée est formée de 5 à 15 couches de cornéocytes, c'est-à-dire des kératinocytes différenciés qui ne présentent plus de noyaux et d'organites, mais ils sont entourés par une enveloppe cornée. Ils sont chargés en filaments de kératine.
• Formation des filaments de kératine
Au cours de la différenciation épidermique, les filaments de kératine (appelés tonofilaments) se font de plus en plus nombreux et commencent à s'agréger dans les cellules de la couche épineuse pour former les tonofibrilles. Au niveau de la couche granuleuse, ils s'associent aux granules de kératohyaline. Les granules de kératohyaline sont composés de loricrine, d'involucrine (IVL - 5,11 - p=0, 00000049), de trichohyaline et de profilaggrine qui sera transformée en filaggrine par différentes protéases, dont la caspase 14 (CASP14 - 10,63 - p=0, 0000014). La réticulation de la filaggrine avec la kératine accélère le processus d'agrégation et d'alignement des tonofilaments permettant de former les câbles de kératine qui composent 85% du volume des cornéocytes. Ceux-ci sont ensuite associés aux desmosomes lors de la formation de l'enveloppe cornée par les transglutaminases (TGM1 - 7,21 - p=0, 00000024). La kératine joue le rôle de structure mécanique rigide en association avec l'enveloppe cornée pour assurer le maintien de l'intégrité épidermique.
Au niveau de la couche basale, les kératinocytes expriment principalement les kératines 5, 14 et 15 (KRT15 - 1,9 - p=0, 00016) alors que les couches supérieures comportent plutôt les kératines 1 (KRT1 - 1,62 - p = 0,015), 2, 10 (KRT10 - 7,38 - p=0, 00000026) et 13 (KRT13 - 13,83 - p=0, 0000075).
• Formation de l'enveloppe cornée
Au cours de la différenciation des kératinocytes stimulée par divers facteurs de transcription tel que la protéine zinc finger 750 (ZNF750 - 9,42 - p=0.00000065), la membrane plasmique est progressivement remplacée par une coque rigide appelée enveloppe cornée. L'initiation de ce changement se traduit par un assemblage protéique intracellulaire coordonné par les transglutaminases (TGMl - 7,21- p=0, 00000024). La périplakine {PPL - 2,08 - p=0,0002), l'envoplakine et l'involucrine (IVL - 5,11 - p=0, 00000049) forment une armature qui recouvre progressivement la face interne de la membrane plasmique. Simultanément, la structure protéique est renforcée par d'autres protéines comme la loricrine, l'hornerine, les protéines « small proline rich » (SPRR1A - 6,75 p=0, 00000011; SPRR1B - 5,71 - p=0, 0000007; SPRR2A - 1,9 - p=0,002; SPRR3 - 2,26 - p=0,0007 et SPRR4 - 1,92 p = 0,0039), les protéines S100 (S100A7 - 2,46 - p=0,0068 ; S100A8 - 6,55 - p=0, 00000016 ; S100A9 - 8,54 - p=0, 0000043 ; S100A12- 2,43 - p=0,0013), et les protéines « late-cornified envelope » (LCE3D - 1,99 - p=0,0012; LCE1C - 1,5 - p=0,031).
• La barrière épidermique
Pour assurer pleinement ses fonctions, l'épiderme nécessite le maintien d'un gradient en eau entre les couches profondes (teneur en eau ~70%) et les couches superficielles (teneur en eau ~20%). Ce gradient est maintenu grâce à plusieurs systèmes, dont principalement les lipides intercornéocytaires, le facteur d'hydratation naturel (NMF) et les jonctions intercellulaires.
Les lipides intercornéocytaires forment une barrière hydrophobe majoritairement composée de céramides à longues chaînes. La synthèse des céramides sont assurés, entre autres, par l'acyl-CoA à longue chaîne synthétase membre 1 de la famille ou «acyl-CoA synthetase long chain family member 1» (ACSL1 - 2,08 - p=0,0002) et la « serine palmitoyltransferase long chain base subunit 3 » (SPTLC3 - 1,79 - p=0, 00025). Le transport des céramides est quant à lui réalisé par, entre autres, la protéine de liaison 5 aux acides gras ou « fatty acid binding protein 5 » (FABP5 - 2,2 p=0, 000036) et l'ATP-binding cassette sous-famille A membre 12 (ABCA12 - 1,99 - p=0,0017).
Le facteur naturel d'hydratation (Natural Moisturizing Factor ou NMF) est spécifique de la couche cornée. Il est composé à 50% d'acides aminés et de leurs dérivés obtenus suite à la protéolyse de la filaggrine 16 par la caspase 14 (CASP14 - 10,63 - p=0, 000014). Les aquaporines, protéines intégrales de la membrane plasmique, constituent un autre groupe d'intervenants dans le transport aqueux et jouent aussi un rôle crucial dans l'hydratation de la peau (AQP3 - 2,57 -p=0, 000019 ; AQP8 - 1,62 - p=0,01).
Parmi les différents types de jonctions intercellulaires, les jonctions serrées sont des structures d'adhésion qui contrôlent le passage paracellulaire de molécules, dont l'eau . Elles sont constituées de plusieurs familles de protéines : les claudines (CLDN1 - 3,01 - p=0, 000035 ; CLDN7 - 1,6 - p=0,0022) et l'occludine qui permettent le rapprochement des membranes plasmiques de deux cellules adjacentes. Les desmosomes représentent un autre type de jonctions situées entre les kératinocytes. Parmi les composants de ce type de structures, les desmocollines (DSC1 - 8,24 - p=0, 00000059 ; DSC2 - 2,78 - p=0, 0000035 ; DSC3 - 1,61 - p=0, 00057) et desmogléines (DSG1 - 10,06 - p=0, 0000013 ; DSG3 - 1,98 p=0, 000048) sont des glycoprotéines transmembranaires appartenant à la famille des cadhérines. Leurs parties extracellulaires assurent l'adhésion intercellulaire tandis que leurs parties cytoplasmiques s'associent avec des protéines intracellulaires telles que la plakoglobine {JUP - 1,93 - p=0, 00082), la plakophiline (PKP1 - 1,99 - p=0, 00019) ou encore la desmoplakine (DSP - 1,78 - p=0, 00017). La desmoplakine interagit elle-même avec les filaments de kératine permettant ainsi l'attachement du cytosquelette au complexe d'adhésion. Au cours de la cornification, les desmosomes sont modifiés, la plaque desmosomale est incorporée à l'enveloppe cornée et la cornéodesmosine y est intégrée. Ils portent alors le nom de cornéodesmosomes.
Les facteurs de transcription « Grainyhead-like » (GRHL1 - 3,24 - p=0, 000031; GRHL3 - 6,28 - p=0,0000037) jouent aussi un rôle essentiel dans la formation de la barrière épidermique et dans sa régénération après une blessure. GRHL3 est impliqué dans la voie contrôlant la polarité des kératinocytes au sein de l'épiderme, une voie essentielle pour assurer une morphologie organisée du tissu et sa réparation.
4.2.4.2 Protection contre le stress environnementaux
(kératinocytes et fibroblastes) La peau constitue une barrière contre les stress environnementaux. Pour faire face à ces stress que sont les polluants et les xénobiotiques, les kératinocytes et les fibroblastes surexpriment un ensemble de gènes capables de les neutraliser et de maintenir l'équilibre cellulaire.
· Les protéines cytochrome P450 des kératinocytes (CYP1A1 - 7,36 - p=0, 000047; CYP1B1 - 5,87 - p=0, 0000039; CYP4B1 - 1.52 p=0,013) et des fibroblastes (CYP1B1 - 2,99 - p=0, 000012) sont des hémoprotéines qui interviennent dans des réactions d'oxydo-réduction de métabolites ou xénobiotiques (monooxygénases). Les CYP sont très impliquées dans la biodégradation de nombreuses molécules exogènes et participent à la détoxification de l'organisme.
L'aldéhyde déshydrogénase 3A1 catalyse la transformation d'aldéhydes en acides. Pour les kératinocytes, l'expression du gène est augmentée (ALDH3A1
- 1,53 p = 0,025). Cette déshydrogénase est impliquée dans la détoxification de l'acétaldéhyde dérivé d'alcool, dans le métabolisme des corticoïdes et dans la peroxydation des lipides.
• L'expression de gènes codant pour des protéines de choc thermique ou « Heat Shock Proteins » ou HSP est augmentée pour les kératinocytes (HSPA4L - 1,57 - p=0,0021 ; HSPB1 - 2,77 - p=0, 000011; HSPB3 - 2,88 - p=0,0011). Les HSP sont des protéines chaperonnes ayant pour fonction principale de gérer la réponse aux stress (infection, inflammation, exercice, exposition aux toxines, famine, hypoxie, manque d'eau, etc.). La crystalline alpha B dont l'expression est aussi augmentée pour les kératinocytes (CRYAB
- 1,96 - p=0, 00012) joue également le rôle de chaperonne en cas de stress pour prévenir l'agrégation des protéines. Ces protéines chaperonnes peuvent être aidées par des protéines co-chaperonnes, comme par exemple « BCL2- associated athanogene » dont l'expression du gène est augmentée pour les kératinocytes {BAG1 - 1,66 p = 0,00053).
• La cellule dispose de régulateurs de toxicité tels que les métallothionéines dont l'expression de deux gènes est augmentée pour les fibroblastes (MT1G - 11,19 - p=0, 00000079 et MT1H - 3,91 - p=0, 00023), de petites protéines qui se caractérisent par leur haute affinité pour les ions métalliques (arsenic, cadmium, etc.). Elles sont directement associées à la régulation de l'homéostasie des cations essentiels et du potentiel d'oxydo- réduction de la cellule.
La ferritine dont le gène FTL est augmentée pour les kératinocytes (FTL light chain - 1,58 - p = 0,0023) est quant à elle, responsable de la détoxification du fer.
• Pour faire face aux effets délétères des rayonnements UVs, et plus particulièrement les espèces réactives de l'oxygène (ROS), les organismes ont développé un système de défense élaboré qui peut dans certains cas être en déséquilibre ou « débordé », on parle alors de stress oxydant. Parmi la batterie de protéines mobilisées pour faire face au stress oxydant, on note la NADPH déshydrogénase quinone 1 dont l'expression du gène est augmentée pour les kératinocytes (NQOl - 1,65 - p=0, 00063) et Thème oxygénase 1 dont l'expression du gène est augmentée pour les fibroblastes (HMOX1 - 3,01
- p=0, 000013). Le potentiel rédox du cytoplasme des cellules est maintenu grâce au glutathion, un tripeptide synthétisé en partie par la glutamate cystéine ligase dont l'expression du gène GCLC est augmentée pour les kératinocytes (GCLC - 2,07 - p=0, 000065), à partir de L-cystéine et de L- glutamate. Le glutathion permet de détoxifier l'organisme des métaux lourds mais aussi d'éliminer les ROS puisque la glutathion peroxydase dont l'expression du gène GPX2 est augmentée pour les kératinocytes (GPX2 - 1,8
- p=0, 00038) utilise le glutathion pour réduire les peroxydes via une réaction d'oxydo-réduction.
4.2.4.3 Stimulation de la défense anti-bactérienne
(kératinocytes)
Pour lutter contre les agressions pathogènes, les kératinocytes peuvent produire des peptides anti-microbiens, responsables de l'attraction et de l'activation des cellules immunitaires.
Les peptides anti-microbiens ont une activité à large spectre et détruisent les organismes en perturbant leur intégrité membranaire. Certains d'entre eux sont exprimés de manière constitutive mais la plupart sont inductibles. Les principaux peptides sont les défensines (DEFB1 - 2,29 - p=0,0027) et la cathélicidine Les kératinocytes expriment d'autres peptides de ce type notamment la calgranuline A (S100A8 - 6,55 - p=0, 00000016) et la calgranuline B (S100A9 - 8,54- p=0, 0000043) qui forment un complexe hétérodimérique antimicrobien appelé calprotectine. Il a été démontré que la calprotectine exerce son activité antibactérienne contre Escherichia coli, Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus Epidermidis, Capnocytophaga sputigena et Borrelia burgdorferi (Maladie de Lyme). La calgranuline C (S100A12 - 2,43 - p = 0,0013) quant à elle, séquestre le zinc et le cuivre nécessaire à la croissance de certaines bactéries (Helicobacter pylori) et les prive de leurs nutriments.
D'autre part, l'étude transcriptomique a permis de mettre en évidence une augmentation très importante de l'expression du gène codant pour la chémokine (C-X-C motif) ligand 14 (CXCL14 - 6,4 - p=0, 00000035). Cette chémokine est constamment produite dans l'épiderme et le derme en conditions saines. Cependant, en plus de ses effets chémo-attractants, elle possède une activité bactéricide reconnue contre Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Finegoldia magna, Streptococcus pyogenes.
Différents mécanismes sont mis en place pour moduler la prolifération des bactéries, parmi ceux-ci, on distingue le processus de desquamation qui permet d'éliminer les micro-organismes indésirables installés sur les cornéocytes. La desquamation repose sur l'équilibre entre la synthèse de protéines structurales des cornéodesmosomes et leur dégradation par des protéases spécifiques comme les kallikréines (KLK5 - 2,82 - p=0, 0000066; KLK7 - 6,47 - p=0, 00000012) et la cathépsine L2 (CTSV - 2,73 - p=0, 0000062). Cet équilibre est également contrôlé par les inhibiteurs de protéases, notamment l'inhibiteur de peptidase de leucocyte sécréteur ou « secretory leukocyte peptidase inhibitor » (SLPI - 5,95 - p=0, 0000012). En plus de cette fonction, SLPI est reconnu comme étant un anti-microbien depuis les années 80.
4.3. Conclusion
En modulant positivement les gènes codant pour les protéines impliquées dans la différenciation épidermique, le renfort de l'enveloppe cornée, les jonctions cellulaires, l'hydratation, la synthèse et le transport des céramides, l'extrait racinaire de Tagetes erecta pourrait potentiellement stimuler le renouvellement de l'épiderme. L'extrait pourrait également renforcer la cohésion de l'épiderme et ses propriétés de barrière, limiter la perte en eau et favoriser de la sorte l'hydratation du tissu.
L'application de l'extrait de Tagetes erecta sur les cultures cellulaires de kératinocytes et fibroblastes suggère par ailleurs une activité potentiellement protectrice face aux stress environnementaux suite à l'induction de l'expression des gènes codant pour les métallothionéines, pour les enzymes impliquées dans le métabolisme des xénobiotiques et pour les protéines et enzymes responsables de la défense antioxydante.
De plus, il pourrait jouer un rôle dans la défense antimicrobienne de l'épiderme en augmentant l'expression des gènes codant pour certains peptides antimicrobiens ou pour des chémokines impliquées dans la défense antibactérienne et antifongique.
Exemple 5 : Effet d'un extrait racinaire de Tagetes erecta sur la survie de neurones corticaux primaires blessés par le peptide Αβ (20 pg, 24 heures) et sur un réseau de neurites de neurones corticaux primaires blessés par le peptide Αβ (20 pg, 24 heures).
Le but de cette étude est d'évaluer les effets de l'extrait racinaire sur des neurones corticaux primaires de rat, intoxiqués par le peptide Αβ selon le modèle in vitro de la maladie d'Alzheimer décrit dans Callizot et al., 2013 (Callizot N. et al., Operational dissection of β-amyloid cytopathic effects on cultured neurons, J Neurosci Res. 2013, 91 : 706-16). La survie des neurones ainsi que l'intégrité du réseau de neurites sont évalués. 5.1. Matériels et méthodes
Extrait racinaire
L'extrait racinaire est préparé à partir de racines séchées de Tagetes erecta. Les plantes sont cultivées en aéroponie selon l'exemple 1. Les racines fraîches sont coupées et séchées. 70 g de racines séchées sont broyées à sec puis macérées pendant 65 heures dans 1 litre de méthanol. Ensuite l'extrait est filtré. Le solvant est éliminé en utilisant un évaporateur rotatif et la poudre séchée au dessiccateur pour au final obtenir 4,15 g de poudre. L'analyse chromatographique réalisée selon l'exemple 1.1 a permis de montrer la présence d'acide léontopodique B dans l'extrait. Quatre concentrations sont testées : 10 ng/mL, 100 ng/mL, 1 pg/mL et 10 pg/mL d'extrait sec dilué dans de l'eau avec 0,1% de DMSO.
Le véhicule utilisé est le milieu de culture (voir la section ci-dessous) contenant 0,1% de DMSO (Pan Biotech, Batch : H 130813).
Culture cellulaire de neurones corticaux
Des neurones corticaux de rat sont cultivés comme décrit dans Singer et al., 1999 (Singer C, et al., Mitogen-activated protein kinase pathway médiates estrogen neuroprotection after glutamate toxicity in primary cortical neurons. J Neurosci. 1999, 19 : 2455-2463) et Callizot et al., (2013). En résumé, des rats femelles gravides sont tuées par dislocation cervicale après 15 jours de gestation. Les fœtus sont collectés et immédiatement placés dans un milieu glacé L15 Leibovitz (Pan Biotech, Batch : 8810315) additionné de 2% pénicilline (10,000 U/ml) et d'une solution de streptomycine (10 mg/ml) (PS; Pan Biotech, batch : 1451013) et 1% de albumine de sérum de bovin (BSA; Pan Biotech, batch : K180713). Le cortex est traité pendant 20 min à 37°C avec une solution de trypsine- EDTA (Pan Biotech, Batch : 3330914) à une concentration finale de 0,05% trypsine et 0,02% EDTA. La dissociation est stoppée par l'ajout du milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's médium) avec 4,5 g/L de glucose (Pan Biotech, Batch : 8530315), contenant de la DNase I grade II (concentration finale 0,5 mg/ml; Pan Biotech, Batch : H140508) et 10% sérum de veau fœtal (FCS; Invitrogen, Batch : 41Q1613K). Les cellules sont mécaniquement dissociées par trois passages forcés à travers des cônes de pipette de 10 mL. Les cellules sont ensuite centrifugées à 515g pendant 10 min à 4°C. Le surnageant est jeté, et le culot est suspendu dans un milieu de culture défini consistant en un milieu Neurobasal (Invitrogen, batch : 1715722) avec une solution à 2% de supplément B27 (Invitrogen, lot: 1709534), 2 mmol/L de L-glutamine (Pan Biotech, lot: 6620314), 2% de solution de PS, et 10 ng/ml de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF; Pan Biotech, Batch : H140108). Les cellules viables sont comptées avec un cytomètre Neubauer, en utilisant le test d'exclusion du bleu trypan. Les cellules sont ensemencées à une densité de 30,000 par puits d'une plaque de 96 puits préenduits de poly-L-lysine (Biocoat, Batch : 21614030) et sont cultivées à 37°C dans un incubateur contenant 95% d'air et 5% de C02. Le milieu est changé tous les jours. Après 11 jours de culture, les neurones corticaux sont intoxiqués par une solution de peptides Αβ1-42 (voir ci- dessous). Préparation du peptide Αβ1-42 et exposition de l'extrait racinaire audit peptide
La préparation du peptide Αβ1-42 est réalisée selon la procédure décrite dans Callizot et al., (2013). En résumé, le peptide Αβ1-42 (Bachem, Batch : 1014012) est dissous dans le milieu de culture défini mentionné ci-dessus, dépourvu de sérum, à une concentration initiale de 40 pmoles/L. Cette solution est doucement agitée pendant 3 jours à 37°C dans le noir et immédiatement utilisée après avoir été diluée dans le milieu de culture à la concentration testée (20 μΜ).
Au onzième jour de culture, l'extrait racinaire testé aux 4 différentes concentrations est dissous dans le milieu de culture et est ensuite préincubé avec les neurones corticaux primaires pendant 1 heure avant l'application du peptide Αβ1-42. La solution de peptide Αβ1-42 est ajoutée à une concentration finale de 20 μΜ diluée dans le milieu de culture en présence de l'extrait à tester et le tout est laissé pendant 24 heures.
Evaluation de la survie des neurones et de l'intégrité du réseau de neurites
24 heures après intoxication par le peptide Αβ1-42, le surnageant de la culture cellulaire a été enlevé et les cultures de neurones corticaux ont été fixées par une solution froide d'éthanol (95%, Sigma, Batch : SZBD3080V) et d'acide acétique (5%, Sigma, Batch : SZBD1760V) pendant 5 min à -20°C. Après perméabilisation avec 0,1% de saponine (Sigma, Batch : BCBJ8417V), les cellules sont incubées pendant 2 heures à température ambiante, avec un anticorps de souris monoclonal anti-microtubule-associated-protein 2 (MAP-2, Callizot et al. , A new long term in vitro model of myelination. Expérimental Cell Research, October 2011. Volume 317, Issue 16, Pages 2374-2383), Sigma, batch : 063M4802) dilué à 1/400 dans du PBS (PAN, Batch : 1870415) contenant 1% de sérum de veau fœtal (FCS) et 0,1% de saponine. Cet anticorps spécifique des corps cellulaires et des neurites, permet l'étude de la mort des cellules neuronales ainsi que l'effet de l'extrait sur la croissance des neurites. Cet anticorps est révélé par un IgG de chèvre anti-souris marqué par un Alexa Fluor 488 (Molecular Probe, Batch : 1664729) à une dilution de 1/400 dans du PBS contenant 1% FCS, 0,1% saponine, pendant 1 heure à température ambiante.
L'extrait est testé pour une culture. Pour chaque concentration d'extrait et les contrôles, 6 puits sont évalués, 30 photos par plaque sont prises en utilisant ImageXpress (Molecular Devices) avec un grossissement x20, pour évaluer le réseau de neurites et le nombre de neurones. L'analyse des photos est réalisée en utilisant Custom Module Editor (Molecular Devices). Les résultats sont présentés en termes de nombre de cellules positives ou de réseau de neurite marqué par le marqueur MAP-2.
Chaque ligne de la plaque est organisée de la façon suivante :
- Pas de traitement (contrôle négatif) / 0,1% DMSO
- Peptide Αβ1-42 20 μΜ / 0,1% DMSO
- Peptide Αβ1-42 20 μΜ / Extrait racinaire (10 ng/mL) / 0,1% DMSO
- Peptide Αβ1-42 20 μΜ / Extrait racinaire (100 ng/mL) / 0,1% DMSO
- Peptide Αβ1-42 20 μΜ / Extrait racinaire (1 pg/mL)/ 0,1% DMSO
- Peptide Αβ1-42 20 μΜ / Extrait racinaire (10 pg/mL) / 0,1% DMSO Chaque ligne est répétée 6 fois.
Analyse statistique
Toutes les données sont exprimées en pourcentage du contrôle des conditions (contrôle = 100%). Toutes les valeurs sont exprimées en moyenne +/- l'erreur standard de la moyenne (Standard Error of the Mean SEM) (s.e.mean) de n =6 puits par condition. Les analyses statistiques réalisées pour les différentes conditions sont des analyses de variances ou ANOVA suivie par le test PLSD de Fischer ou le test de Dunnett en utilisant le logiciel GraphPad Prism.
5.2. Résultats
La Figure 3 représente l'effet de l'extrait racinaire de Tagetes erecta sur la survie des neurones corticaux primaires intoxiqués pendant 24 heures par le peptide Αβ1-42 ajouté à une concentration finale de 20 μΜ . La Figure 4 représente l'effet de l'extrait racinaire de Tagetes erecta sur la croissance du réseau de neurites intoxiqués pendant 24 heures par le peptide Αβ1-42 ajouté à une concentration finale de 20 μΜ . Ces données permettent de vérifier l'état de santé des neurones corticaux, car le stress engendré par la pathologie Alzheimer par le biais du peptide Αβ1-42 affecte le nombre de connexions neuronales (neurites).
Le témoin contrôle n'a pas été traité avec le peptide Αβ1-42. Seul le véhicule utilisé pour l'extrait racinaire (le milieu de culture contenant 0,1% de DMSO) a été ajouté à la culture cellulaire de neurones corticaux. On observe 100% de survie des neurones dans cette condition.
L'ajout du peptide Αβ1-42 à une concentration finale de 20 μΜ, induit au bout de 24 heures une mort significative des neurones (Figure 3) ainsi qu'une perte significative du réseau de neurites (Figure 4) comme précédemment indiqué dans la littérature (Callizot et al., 2013).
L'extrait racinaire pre-incubé avec les cellules neuronales en culture 1 heure avant l'ajout du peptide Αβ1-42 apporte un effet sur la survie des neurones de plus en plus important avec des concentrations croissantes d'extrait. L'extrait racinaire à la concentration la plus forte (10 pg/mL) montre un effet significatif sur la survie des neurones (par 30%). L'effet protecteur semble donc dépendre de la dose appliquée : l'effet augmente avec la dose appliquée (Figure 3).
L'extrait racinaire pre-incubé 1 heure avec les cellules neuronales en culture avant l'ajout du peptide Αβ1-42 montre un effet significatif sur le réseau de neurites dès sa plus faible concentration de 10 ng/mL (Figure 4).
Ces résultats montrent que l'extrait racinaire de Tagetes erecta permet de réduire la neurotoxicité causée par le peptide Αβ. Cet extrait selon l'invention est un bon candidat pour la protection des neurones corticaux et le maintien de leurs connections, c'est-à-dire le maintien de l'intégrité du réseau de neurites. Ainsi, l'extrait selon l'invention présente un intérêt en tant que nouvel agent thérapeutique pour la prévention et/ou le traitement de la maladie d'Alzheimer.

Claims

REVENDICATIONS
Extrait de plantes du genre Tagetes caractérisé en ce qu'il est enrichi en acide léontopodique B et qu'il comprend au moins 2,5%, en particulier au moins 5,5%, plus particulièrement au moins 8% en poids d'acide léontopodique B, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec.
Extrait selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite plante du genre Tagetes est choisie dans le groupe constitué par Tagetes erecta et Tagetes patula.
Procédé de préparation d'un extrait de plantes du genre Tagetes selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, comprenant :
a) une étape de culture de Tagetes en conditions hors-sol, et particulièrement en aéroponie,
b) optionnellement une étape de stimulation des racines des plantes, c) une étape d'extraction solide/liquide des racines optionnellement stimulées lors de l'étape b), et
d) la récupération de l'extrait obtenu lors de l'étape c).
Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'étape c) comprend une première phase de mise en présence des racines encore liées à la plante avec un solvant, en particulier pendant une durée comprise entre 15 minutes à 30 minutes, suivie d'une seconde phase comprenant la section desdites racines et la macération des racines sectionnées dans un solvant, ledit solvant, identique ou différent dans la première et la deuxième phase, étant choisi parmi les alcools, les glycols et les solvants eutectiques, et étant utilisé pur ou sous la forme d'une solution aqueuse d'alcool, de glycol ou de solvant eutectique.
5. Composition cosmétique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon la revendication 1 ou 2, ou un extrait obtenu par un procédé selon la revendication 3 ou 4, et au moins un excipient. Extrait selon la revendication 1 ou 2, extrait obtenu par un procédé selon la revendication 3 ou 4, ou composition cosmétique selon la revendication 5, pour prévenir ou ralentir le vieillissement cutané, et/ou avoir un effet apaisant ou calmant de la peau suite à la sensation d'irritation et/ou stimuler le renouvellement de l'épiderme ainsi que la fonction barrière de l'épiderme et l'hydratation de la peau et/ou pour protéger l'épiderme des stress environnementaux.
Composition pharmaceutique ou composition nutraceutique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon la revendication 1 ou 2, ou un extrait obtenu par un procédé selon la revendication 3 ou 4, et au moins un excipient pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptable.
Extrait selon la revendication 1 ou 2, extrait obtenu par un procédé selon la revendication 3 ou 4, composition pharmaceutique ou composition nutraceutique selon la revendication 7, pour son utilisation en tant que médicament pour prévenir ou traiter une maladie neuro- dégénérative, en particulier la maladie d'Alzheimer.
Extrait selon la revendication 1 ou 2, extrait obtenu par un procédé selon la revendication 3 ou 4, composition pharmaceutique ou composition nutraceutique selon la revendication 7, pour son utilisation en tant que médicament pour stimuler la défense antimicrobienne et/ou pour atténuer ou traiter l'inflammation de la peau et/ou pour favoriser la cicatrisation cutanée, en particulier dans le cas de la fermeture d'une plaie.
Méthode de soin cosmétique de la peau visant à prévenir ou retarder l'apparition des effets du vieillissement de la peau, et/ou avoir un effet apaisant ou calmant de la peau suite à la sensation d'irritation et/ou stimuler le renouvellement de l'épiderme ainsi que la fonction barrière de l'épiderme et l'hydratation de la peau, et/ou pour protéger 1'épiderme des stress environnementaux, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend l'application, sur au moins une partie de la peau du corps ou du visage, d'une composition cosmétique selon la revendication 5.
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