CN103893187B

CN103893187B - 三甲丙咪嗪在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用

Info

Publication number: CN103893187B
Application number: CN201410155070.4A
Authority: CN
Inventors: 吴建国; 陈绪林; 邬开朗; 刘映乐; 潭秋萍; 刘芳
Original assignee: WUHAN SHENGDAKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WUHAN SHENGDAKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-04-17
Filing date: 2014-04-17
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2034-04-17
Also published as: CN103893187A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体公开了一种三甲丙咪嗪在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用。本发明首先检测了三甲丙咪嗪对MDCK细胞的毒性，结果显示三甲丙咪嗪的最大无毒性浓度为50.0μM；其次，在完全无毒性的浓度范围内测定了三甲丙咪嗪的抗病毒活性，结果显示这种小分子化合物具有显著的抗病毒活性，且抗病毒作用呈剂量依赖效应；最后，检测了三甲丙咪嗪对不同型和亚型的流感病毒的抗病毒活性，结果显示三甲丙咪嗪可以剂量依赖地抑制所有被检测流感病毒株的复制，表明三甲丙咪嗪的抗流感病毒活性具有广谱性。因此，本发明首次披露了三甲丙咪嗪是一种新型广谱抗流感病毒药物，可以用于制备预防或治疗流感病毒感染的药物。

Description

三甲丙咪嗪在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种三甲丙咪嗪在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用。

背景技术

流感病毒属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），流感病毒属。根据病毒粒子核蛋白（NP）和基质蛋白（M）的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分为A、B、C三型，也称甲、乙、丙三型。A型流感病毒全基因组由8条大小不等的单股负链RNA组成，分别以节段1至节段8命名。病毒基因组全长约13.6kb，编码10种结构蛋白（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP）和非结构蛋白（NS1）。根据病毒粒子表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同，A型流感病毒可进一步分为17个H(H1-H17)和10个N(N1-N10)亚型。人流感病毒主要是H1、H2和H3亚型。而目前危害严重的高致病性禽流感多为H5、H7和H9亚型，其中以H5N1亚型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大爆发，仅在人和海豹中发现。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，可感染人类和猪。

流感病毒的整个生活周期需要在细胞质和细胞核内完成。感染的起始是病毒颗粒表面的刺突HA识别和结合宿主细胞表面含唾液酸的受体。唾液酸与次末端半乳糖的连接键，决定了病毒的宿主特异性，该连接键在禽类中为α（2-3），在人类中为α（2-6）。病毒吸附细胞后，细胞通过网格蛋白受体介导的胞饮作用摄入病毒。在细胞内，网格蛋白分子解离，病毒与内涵体融合形成吞噬体，使得病毒粒子周围的pH值下降至5.0左右。在此pH条件下，病毒HA蛋白的构象发生变化，使位于轻链（HA2）N端的融合肽暴露，从而引起病毒囊膜与细胞膜融合。低pH环境也致使大量H⁺经由M2离子通道进入病毒粒子内部，导致M1蛋白与vRNPs的解离。两者的共同结果致使病毒粒子的vRNPs释放到被感染细胞的胞浆。vRNPs随后转到细胞核内进行基因组的复制和转录，复制时病毒首先以自身RNA为模板合成互补RNA（cRNA），然后以cRNA为模板再合成vRNA。转录生成的mRNA由核内转移到胞浆，翻译出病毒的结构蛋白和非结构蛋白。一部分合成蛋白如NP需要重新转移到核内与新生成的vRNA组装成vRNP，vRNP出核后与其余的病毒蛋白开始组装成新的病毒粒子，新生成的子代病毒通过神经氨酸酶（NA）水解细胞表面的糖蛋白，释放N-乙酰神经氨酸，促使病毒粒子从出芽位点释放出来。病毒成熟的最后一步是HA在宿主蛋白酶的作用下裂解为HA1和HA2多肽，这样的病毒粒子才具有感染性，从而开始新一轮病毒的复制。

流感病毒自20世纪初发现以来已在全球范围内造成五次大流行，十年左右会产生一次暴发流行，在全球范围内造成了巨大的损失。流感流行每年可导致25万～50万例死亡，300万～500万重病例，全球约共有5～15％的人被感染。接种疫苗和使用抗病毒药物是应对流感大流行的重要手段，然而由于流感病毒抗原变异能力强，在大流行前基本上不可能大规模生产疫苗。目前，经美国食品和药物管理局(FDA)批准正式上市的抗流感病毒药物有两类：（1）以金刚烷胺和金刚乙胺为代表的M2离子通道阻断剂。此类药只对甲型流感病毒有预防和治疗作用，研究表明此类药物具有神经毒性等毒副作用，而且由于耐药株的普遍存在，所以CDC建议此类药物不再用于预防流感病毒感染。（2）神经氨酸酶抑制剂，此类药的代表是奥斯他韦和扎拉米韦。此类药物对所有已知的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年来关于奥斯他韦耐药株的确不断有报道。因此，研究并开发新型抗流感病毒药物有重要意义。

三甲丙咪嗪，英文名为Trimipramine，是一种三环类抗抑郁药物，临床上主要用来治疗各种忧郁症和焦虑症。药物学上经常与马来酸一起制成马来酸三甲丙咪嗪。其药理作用在若干方面和其他的三环类抗抑郁药物作用不同。其对去甲肾上腺素、多巴胺和5-HT的再摄取抑制作用较弱，但对5-HT₂，α₁-肾上腺素受体有极强的拮抗能力。但具体的作用机制并不清楚。但目前为止，并未发现任何关于三甲丙咪嗪抗流感病毒的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术中存在的不足，提供一种小分子化合物三甲丙咪嗪在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用，从而为临床上流感的治疗提供一种安全有效的小分子化合物。三甲丙咪嗪在无毒性范围内能够有效地抑制流感病毒的复制，可进一步开发为治疗或预防流感病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。

为了证明三甲丙咪嗪在制备治疗或预防流感病毒（甲型或乙型）感染药物中的可行性，本发明采取了以下实验进行验证：

三甲丙咪嗪对MDCK细胞的毒性实验：犬肾细胞（MDCK）按8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，分别用0.8μM、1.6μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25.0μM、50.0μM和100.0μM的三甲丙咪嗪进行处理，每组重复两个孔，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养48小时后，Alamarblue检测细胞的存活率。结果显示，三甲丙咪嗪对MDCK的CC₅₀（半数致死浓度）为95.4μM。

三甲丙咪嗪抗流感病毒活性的评价：将MDCK细胞按照1.5×10⁴细胞/孔接种于96细胞培养板中，37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养。18-24h后，用100TCID₅₀的病毒液（A/PuertoRico/8/34（H1N1））感染细胞，同时加入不同浓度梯度药物。细胞于37℃细胞培养箱中培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶活性检测。结果显示三甲丙咪嗪能够剂量依赖地抑制流感病毒的复制，其IC₅₀为6.4μM。

三甲丙咪嗪抗流感病毒作用的广谱性分析：将MDCK细胞按照1.5×10⁴细胞/孔接种于96细胞培养板中，37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养18-24h且长成单层后，用100TCID₅₀的流感病毒液（分别为A/human/Hubei/3/2005(H3N2)、A/human/WSN/33/(H1N1,S31N)、A/Duck/Hubei/5/2010(H6N6),、A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8)和B/human/Hubei/1/2007）感染细胞，同时加入不同浓度梯度药物。细胞于37℃细胞培养箱中培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶活性检测。结果显示三甲丙咪嗪能够剂量依赖地抑制甲型流感亚型H1N1株、甲型流感病毒亚型H3N2株、甲型流感病毒亚型H1N1金刚烷胺耐药株、甲型流感病毒亚型H6N6株、甲型流感病毒亚型H7N8株和乙型流感病毒的复制。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.三甲丙咪嗪是小分子化合物，其CC₅₀（半数致死浓度）为95.4μM。碘塞罗宁能够剂量依赖地抑制流感病毒复制，其IC₅₀（半数抑制浓度）为6.4μM。选择指数（SI）约为14.9。而且三甲丙咪嗪已经在临床上有数十年的应用，安全性良好。这说明三甲丙咪嗪是安全有效的抗流感病毒药物。

2.三甲丙咪嗪能够剂量依赖地抑制甲型流感病毒亚型H3N2株、甲型流感病毒亚型H1N1金刚烷胺耐药株、甲型流感病毒亚型H6N6株、甲型流感病毒亚型H7N8株和乙型流感病毒的复制，具有非常广谱的抗流感病毒活性。

3.利用现代常用药物制剂手段，可将三甲丙咪嗪作为活性成分制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂或注射剂等任何一种药学上可接受的剂型。

附图说明

图1为三甲丙咪嗪细胞毒性检测示意图。

图2为三甲丙咪嗪处理剂量依赖抑制流感病毒复制水平示意图。

图3为三甲丙咪嗪抗流感病毒活性广谱性检测示意图，其中：

图3A为甲型流感病毒亚型H3N2株（A/human/Hubei/3/2005(H3N2)）；

图3B为甲型流感病毒亚型H1N1金刚烷胺耐药株（A/WSN/S31N(H1N1)）；

图3C为甲型流感病毒亚型H6N6株（A/Duck/Hubei/5/2010(H6N6)）；

图3D为甲型流感病毒亚型H7N8株（A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8)）；

图3E为乙型流感病毒（B/human/Huber/1/2007）。

具体实施方式

为了更好地阐述本发明的内容，下面申请人将结合具体实施例对本发明内容作进一步的详细说明，但本发明请求保护的范围不局限于以下实施例。

目前，抗流感病毒药物体外筛选模型分为细胞培养模型和病毒酶的无细胞系统筛选模型。酶反应筛选模型具有高通量的特点，但筛选的化合物仍需进行更多的细胞学、组织学和体内毒性、药效实验等以确定其效果。细胞培养模型是最常用的筛选模型，其优点在于：可提供大量遗传性状相同的细胞为研究对象，操作方便，可消除其它外界因素的影响，并可以检测药物的有效浓度和治疗指数，为后期机理研究提供更多基础。本发明采用MDCK细胞培养筛选法检测三甲丙咪嗪对流感病毒感染的影响，基于对上清中代表流感病毒复制水平的神经氨酸酶表达水平的检测，定量分析三甲丙咪嗪的抗流感病毒活性。

实施例1：三甲丙咪嗪抗流感病毒活性的评价

1.实验材料

1.1细胞、病毒和药物

MDCK细胞购自美国模式菌种保藏中心（ATCC）；病毒株：A/PuertoRico/8/34（H1N1）；药物：三甲丙咪嗪（CAS:739-71-9），购于Sigma公司。

1.2实验仪器

多标记微孔板读取仪（PerkinElmer）。

2.实验方法与结果

2.1细胞培养：37℃，5%CO₂加湿培养箱中培养。使用含有10％FBS、100U/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞至90%汇合度后传代，传代比例1/3–1/4。

2.2病毒培养：取9～11日龄SPF鸡胚，接种病毒前用验蛋器检查，并在远离胚胎的位置标记，消毒并打孔后按0.2ml/枚接种2⁴血凝效价的病毒液，用指甲油封口，置37℃恒温箱孵育48h（接种24h后死亡的鸡胚一般为操作不当致死，弃之）。取出鸡胚置4℃冷胚12h。75%酒精消毒鸡胚气室，无菌操作剪去气室外壳，毛细吸管吸取鸡胚尿囊液和羊水，3000rpm4℃离心30min，检测血凝效价，200μl/管分装并置-70℃冻存备用。

2.3三甲丙咪嗪的细胞毒性检测：MDCK细胞按8×10³细胞/孔（体积100μl）接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；用细胞维持液（DMEM+2%血清）将药物按照0.8μM、1.6μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25.0μM、50.0μM和100.0μM共8个梯度浓度配制，每个梯度浓度设2个复孔。培养48h后弃掉培养上清，于每孔中加入100μl含有10%Alamarblue试剂的新DMEM培养基，置细胞培养箱中继续培养1h，1h后用微孔板读取仪分别测量荧光强度和吸光值，计算细胞存活率。

结果（图1）显示三甲丙咪嗪在50.0μM范围内对MDCK细胞完全没有毒性。本实施例中三甲丙咪嗪细胞水平抗病毒实验的给药剂量范围为0.0～50.0μM，完全处在安全无毒性浓度范围。

2.4三甲丙咪嗪对流感病毒株A/PuertoRico/8/34(H1N1)的抗病毒活性评价

2.4.1.实验原理：MUNANA（4-methylumbelliferyl-α-N-acetyl-neuraminate）是流感病毒神经氨酸酶的特异性底物，在神经氨酸酶作用下产生的催化产物在355nm激发光照射下，可以产生460nm荧光，荧光强度的强弱代表了病毒神经氨酸酶表达量的多少，反映了培养细胞上清中的病毒量。

2.4.2.将MDCK细胞按1.5×10⁴细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。将孔板中培养基弃去，PBS清洗两遍后，加入100TCID₅₀病毒液（100μl）和不同浓度药物（100μl）于37℃细胞培养箱中培养。药物以50.0μM为起始浓度，连续2倍梯度稀释6个梯度，每梯度设置两个复孔。培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶活性检测。实验设置空白对照组、阳性对照组（利巴韦林）、阴性对照组（病毒感染后无药物处理）和实验药物组。

2.4.3.黑色96孔微量板中加入40μl缓冲液（32.5mmol/LMES，pH6.5，4mmol/LCaCl₂）配制的底物20umol/LMUNANA，再加入各实验孔培养上清20μl，37℃避光孵育60min，加入反应终止液（0.014μMNaOH，83%乙醇）100μl/孔，微孔读板仪上测定荧光值（激发光波长355nm，发射光波长465nm）。

2.4.4.计算各检测孔中药物对流感病毒复制的抑制率。

抑制率（%）=100-（样品孔-空白对照）/（酶活对照-空白对照）*100%

结果显示：随着三甲丙咪嗪药物浓度的增加，药物对流感病毒复制的抑制率逐渐升高，呈现很明显的剂量依赖效果，其在6.4μM浓度时能够抑制50%的病毒复制，选择指数为14.9，在25.0μM浓度时达到接近100%抑制率。(见图2)。

实施例2：三甲丙咪嗪抗流感病毒作用广谱性的评价

在实施例1的基础上，本实施例进一步检测了三甲丙咪嗪对甲型流感病毒亚型H3N2株、甲型流感病毒亚型H1N1金刚烷胺耐药株、甲型流感病毒亚型H6N6株、甲型流感病毒亚型H7N8株和乙型流感病毒的抗病毒活性。

1.实验使用的病毒株包括：A/human/Hubei/3/2005(H3N2),

A/human/WSN/33/(H1N1,S31N)，A/Duck/Hubei/5/2010(H6N6),

A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8)和B/human/Hubei/1/2007。

2.将MDCK细胞按1.5×10⁴细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。将孔板中培养基弃去，PBS清洗两遍后，加入100TCID₅₀病毒液（100μl）和不同浓度药物（100μl）于37℃细胞培养箱中培养。药物以50.0μM为起始浓度，连续2倍梯度稀释6个梯度，每梯度设置两个复孔。培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶活性检测。

3.黑色96孔微量板中加入40μl缓冲液（32.5mmol/LMES，pH6.5，4mmol/LCaCl₂）配制的底物20umol/LMUNANA，再加入各实验孔培养上清20μl，37℃避光孵育60min，加入反应终止液（0.014μMNaOH，83%乙醇）100μl/孔，多功能检测仪上测定荧光值（激发光波长355nm，发射光波长465nm）。

4.计算各检测孔中药物对流感病毒复制的抑制效率。

结果显示：三甲丙咪嗪在药物浓度范围内明显抑制了各种流感病毒毒株的复制，并且呈剂量依赖关系(见图3)。其对甲型流感病毒H3N2、甲型流感病毒金刚烷胺耐药株、甲型流感病毒H6N6、甲型流感病毒H7N8和乙型流感病毒的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为27.2μM、25.3μM、20.0μM、10.4μM和9.7μM，对应的选择指数分别为3.5、3.8、4.8、9.2和9.8。表明三甲丙咪嗪是一种广谱的抗流感病毒药物。

Claims

1.三甲丙咪嗪作为抗病毒活性成分在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用；所述的流感病毒为甲型流感病毒或乙型流感病毒。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物为口服给药剂型、注射给药剂型、粘膜给药剂型或经皮给药剂型。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物为任何一种药学上可接受的剂型。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液或注射液。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的药物为缓释制剂、控释制剂或纳米制剂。