CN103705498A

CN103705498A - 非诺贝特在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用

Info

Publication number: CN103705498A
Application number: CN201310665672.XA
Authority: CN
Inventors: 陈绪林; 安利伟; 唐薇
Original assignee: WUHAN WEILIDE BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: WUHAN WEILIDE BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2013-12-11
Filing date: 2013-12-11
Publication date: 2014-04-09

Abstract

本发明公开了非诺贝特（Fenofibrate）在制备预防或治疗流感病毒感染的药物中的应用。至今尚未见有关于非诺贝特抗流感病毒的报道。首先检测非诺贝特对MDCK细胞的毒性，结果显示非诺贝特在可溶解浓度范围对细胞完全无毒性。选用完全无毒性浓度的非诺贝特进行抗病毒实验，结果显示这种小分子化合物具有显著的抗病毒活性，且抗病毒作用呈剂量依赖效应。接着检测了在流感病毒复制的不同时间段给予非诺贝特的抗病毒效果，结果显示非诺贝特在流感病毒的早期阶段给药有效提示其作用机制主要影响病毒复制的早期阶段，与已存的抗流感病毒药物作用机制不同。因此，本发明披露的非诺贝特是一种新型抗流感病毒药物，可以用于制备预防或治疗流感病毒感染的药物。

Description

非诺贝特在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体地，涉及非诺贝特在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用。

背景技术

流感病毒属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），流感病毒属。根据病毒粒子核蛋白（NP）和基质蛋白（M）的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分为A、B、C三型，也称甲、乙、丙三型。A型流感病毒全基因组由8条大小不等的单股负链RNA组成，分别以节段1至节段8命名。病毒基因组全长约13.6 kb，编码10种结构蛋白（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP）和非结构蛋白（NS1）。根据病毒粒子表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同，A型流感病毒可进一步分为17个H(H1-H17)和10个N(N1-N10)亚型。人流感病毒主要是H1、H2和H3亚型。而目前危害严重的高致病性禽流感多为H5、H7和H9亚型，其中以H5N1亚型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大爆发，仅在人和海豹中发现。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，可感染人类和猪。

流感病毒的整个生活周期需要在细胞质和细胞核内完成。感染的起始是病毒颗粒表面的刺突HA识别和结合宿主细胞表面含唾液酸的受体。唾液酸与次末端半乳糖的连接键，决定了病毒的宿主特异性，该连接键在禽类中为α（2-3），在人类中为α（2-6）。病毒吸附细胞后，细胞通过网格蛋白受体介导的胞饮作用摄入病毒。在细胞内，网格蛋白分子解离，病毒与内涵体融合形成吞噬体，使得病毒粒子周围的pH值下降至5.0左右。在此pH条件下，病毒HA蛋白的构象发生变化，使位于轻链（HA2）N端的融合肽暴露，从而引起病毒囊膜与细胞膜融合。低pH环境也致使大量H⁺经由M2离子通道进入病毒粒子内部，导致M1蛋白与vRNPs的解离。两者的共同结果致使病毒粒子的vRNPs释放到被感染细胞的胞浆。vRNPs随后转到细胞核内进行基因组的复制和转录，复制时病毒首先以自身RNA为模板合成互补RNA（cRNA）,然后以cRNA为模板再合成vRNA。转录生成的mRNA由核内转移到胞浆，合成病毒的结构蛋白和非结构蛋白。一部分合成蛋白如NP需要重新转移到核内与新生成的vRNA组装成vRNP，vRNP出核后与其余的病毒蛋白开始装配成子代病毒，新生成的子代病毒通过神经氨酸酶（NA）水解细胞表面的糖蛋白，释放N-乙酰神经氨酸，促使病毒粒子从出芽位点释放出来。病毒成熟的最后一步是HA在宿主蛋白酶的作用下裂解为HA1和HA2多肽，这样的病毒粒子才具有感染性，从而开始新一轮病毒的复制。

流感病毒自20世纪初发现以来已在全球范围内造成五次大流行，十年左右会产生一次暴发流行，在全球范围内造成了巨大的损失。流感流行每年可导致25 万～50 万例死亡，300万～500万重病例，全球约共有5～15％的人被感染。接种疫苗和使用抗病毒药物是应对流感大流行的重要手段，然而由于流感病毒抗原变异能力强，在大流行前基本上不可能大规模生产疫苗。目前，经美国食品和药物管理局(FDA)批准正式上市的抗流感病毒药物有两类：（1）以金刚烷胺和金刚乙胺为代表的M2离子通道阻断剂。此类药只对甲型流感病毒有预防和治疗作用, 研究表明此类药物具有神经毒性等毒副作用，而且由于广泛使用使得耐药株普遍存在，所以CDC建议此类药物不再用于预防流感病毒感染。（2）神经氨酸酶抑制剂，此类药的代表是奥斯他韦和扎拉米韦。此类药物对所有已知的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年来关于奥斯他韦的耐药株确不断有报道。因此，研究并开发新型抗流感病毒药物有重要意义。

非诺贝特，中文别名普鲁脂芬、力平脂、美利普特、苯酸降脂丙酯或苯酰降脂丙酯；英文名为Fenofibrate；分子量360.8，非诺贝特的结构式如图所示；属于贝特类抗血脂药物。非诺贝特在体内经酯酶的作用迅速代谢成非诺贝特酸（Fenofibrate acid），具有明显的降低血清胆固醇，甘油三酯和升高高密度脂蛋白的作用。具体作用机制为通过激活过氧化物增值物激活受体α (PPARα), 进而激活脂蛋白脂肪酶降低脱辅基蛋白CIII合成，从而加速脂类分解。PPARα同时能提高脱辅基蛋白AI和AII合成，从而减低低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL），升高高密度脂蛋白（HDL）。基础研究显示非诺贝特及其代谢产物非诺贝特酸具有抗疟疾活性和抗日本脑炎病毒活性。但到目前为止，并没有见到非诺贝特在抗流感病毒及治疗流感病毒感染引起疾病的相关报道。非诺贝特的结构式如下：

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种非诺贝特在制备防治流感病毒感染药物中的应用。其目的在于通过测定非诺贝特的细胞毒性及抗病毒活性，开发一种安全有效的防治流感病毒感染的活性成分。经实验证实，非诺贝特在无毒性范围内能够有效地抑制流感病毒的复制，且具有明显的剂量依赖效应。因此，其可进一步开发为治疗或预防流感病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。

为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案是：

非诺贝特在制备治疗或预防流感病毒(甲型或乙型)感染的药物中的应用，其步骤是：

非诺贝特对MDCK细胞的毒性实验：狗肾细胞（MDCK）按8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，分别用4.0μM、7.8μM、15.6μM、31.3μM、62.5μM、125.0μM、250.0μM和500.0μM 的非诺贝特进行处理，每组重复两个孔，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养48小时后，Alamarblue法检测细胞的存活率。结果显示，非诺贝特在检测范围内对MDCK完全无毒性，CC₅₀（半数致死浓度）至少大于500.0μM。由于药物溶解性问题无法获得精确的数值。

非诺贝特对抗流感病毒活性的评价：将MDCK细胞按照1.5×10⁴细胞/孔接种于96细胞培养板中，37℃、5% CO₂细胞培养箱中培养18-24h待细胞长成单层后，用100TCID₅₀/孔的流感病毒液(A/PuertoRico/8/34(H1N1),A/Human/Hubei/1/2009(H1N1), B/human/Hubei/1/ 2007）感染细胞，同时加入各梯度浓度的药物至总体积共200μl的细胞维持液（DMEM+0.3%BSA+2.5μg/L胰酶）中，在细胞培养箱中于37℃培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶表达量的检测。结果显示非诺贝特能够明显抑制流感病毒的复制，其对三株病毒的EC₅₀S分别为16.5、26.7和23.5μM。

非诺贝特对流感病毒不同生活周期的抗病毒分析：将MDCK细胞按照1.5×10⁴细胞/孔接种于96细胞培养板中，37℃、5% CO₂细胞培养箱中培养18-24h待细胞长成单层后，用100TCID₅₀/孔的流感病毒液（A/PuertoRico/8/34（H1N1））感染细胞。在感染病毒后不同时间给予相同浓度的药物，于37℃细胞培养箱中培养24h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶活性检测。结果显示非诺贝特主要作用于早期病毒侵入和复制阶段。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1. 非诺贝特是小分子化合物，其CC₅₀（半数致死浓度）大于500.0μM。非诺贝特能够剂量依赖的抑制流感病毒复制，其三株病毒的EC₅₀S分别为16.5、26.7和23.5μM。选择指数（SI）分别大于30.3、18.7和21.3。而且非诺贝特已经在临床上有数十年的应用，安全性良好，这说明非诺贝特是安全有效的抗流感病毒的药物。

2. 非诺贝特主要在病毒感染后早期给药效果最明显，提示其抗病毒机制与广泛使用的达菲等神经氨酸酶抑制剂不同，有利于开发新型不同作用机制药物。

3.利用现代常用药物制剂手段，可将非诺贝特作为活性成分制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂或注射剂等任何一种药学上可接受的剂型。

附图说明

图1为非诺贝特化学结构式。

图2为非诺贝特在MDCK细胞上毒性检测示意图。

图3为非诺贝特处理流感病毒感染细胞培养液上清中神经氨酸酶活性示意图：图3A为甲型流感病毒亚型H1N1株（A/PuertoRico/8/34(H1N1)）；

图3B为甲型流感病毒亚型H1N1株（A/Human/Hubei/1/2009(H1N1)）；

图3C为乙型流感病毒（B/human/Hubei/1/2007）。

图4为非诺贝特在流感病毒感染后不同时间点给药效果图。

具体实施方案

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。

目前，抗流感病毒药物体外筛选模型分为细胞培养模型和病毒酶的无细胞系统筛选模型。酶反应筛选模型具有高通量的特点，但筛选的化合物仍需进行更多的细胞学、组织学和体内毒性、药效实验等以确定其效果。细胞培养模型是最常用的筛选模型，其优点在于：可提供大量遗传性状相同的细胞为研究对象，操作方便，可消除其它外界因素的影响，并可以检测药物的有效浓度和治疗指数，为后期机理研究提供更多基础。本发明采用MDCK细胞培养筛选法检测非诺贝特对流感病毒感染的影响，基于对上清中代表流感病毒复制水平的神经氨酸酶表达水平的检测，定量分析非诺贝特的抗流感病毒活性。

实施例1：非诺贝特抗流感病毒活性的评价

1．实验材料

1.1 细胞、病毒和药物

MDCK细胞购自美国模式菌种保藏中心（ATCC）；病毒株：A/PuertoRico/8/34（H1N1）、A/Human/Hubei/1/2009(H1N1)和B/human/Hubei/1/2007由鸡胚培养扩增得到；药物：非诺贝特购于Sigma公司。

1.2 实验仪器

多标记微孔板读取仪（Perkin Elmer），倒置显微镜 Costar。

2．实验方法与结果

2.1 细胞培养：37℃，5% CO₂加湿培养箱中培养。使用含有10％FBS、100U/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞至90%汇合度后传代，传代比例1/3 – 1/4。

2.2 病毒培养：取9～11日龄SPF鸡胚，接种病毒前用验蛋器检查，并在远离胚胎的位置标记，消毒并打孔后按0.2ml/枚接种2-⁴血凝效价的病毒液，用指甲油封口，置37℃恒温箱孵育48h（接种24h后死亡的鸡胚一般为操作不当致死，弃之）。取出鸡胚置4℃冷胚12h。75%酒精消毒鸡胚气室，无菌操作剪去气室外壳，毛细吸管吸取鸡胚尿囊液和羊水，3000rpm 4℃离心30min，检测血凝效价，200μl/管分装并置-70℃冻存备用。

2.3非诺贝特的细胞毒性检测：MDCK细胞按8×10³细胞/孔（体积100μl）接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；用细胞维持液（DMEM+2%血清）将药物按照4.0μM、7.8μM、15.6μM、31.3μM、62.5μM、125.0μM、250.0μM和500.0μM共8个梯度浓度配制，每个梯度浓度设2个复孔。培养48h后弃掉培养上清，于每孔中加入100μl含有10% Alamarblue试剂的新DMEM培养基，置细胞培养箱中继续培养1h，1h后用微孔板读取仪分别测量荧光强度和吸光值，计算细胞存活率。

结果（图2）显示非诺贝特在500.0μM以下的浓度范围内对MDCK细胞完全没有细胞毒性。本实施例非诺贝特的给药剂量范围为1.6～250.0μM，完全处在安全无毒性浓度范围。

2.4基于神经氨酸酶活性检测非诺贝特抗流感病毒活性的评价

2.4.1.实验原理：MUNANA（4-methylumbelliferyl-α-N-acetyl-neuraminate）是流感病毒神经氨酸酶的特异性底物，在神经氨酸酶作用下产生的催化产物在355nm激发光照射下，可以产生460nm荧光，荧光强度的强弱代表了病毒神经氨酸酶表达量的多少，反映了培养细胞上清中的病毒量。

2.4.2.将MDCK细胞按1.5×10⁴细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。将孔板中培养基弃去，PBS液洗两遍，加100TCID₅₀/孔（100μl）病毒液感染细胞，同时加入各浓度梯度浓度的药物（以200.0μM为起始浓度，连续2倍梯度稀释6个梯度，每梯度两个复孔）至总体积为200μl的细胞维持培养液（DMEM+0.3 %BSA+2.5ug/L胰酶）中，于细胞培养箱中37℃培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶表达量的检测。实验设置空白对照组、阳性对照组（利巴韦林）、阴性对照组（病毒感染后无药物处理）和实验药物组。

2.4.3.黑色96孔微量板中加入40μl缓冲液（32.5mmol/L MES，pH 6.5，4mmol/L CaCl₂）配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各实验孔培养上清20μl，37℃避光孵育60min，加入反应终止液（0.014μM NaOH，83%乙醇）100μl/孔，微孔读板仪上测定荧光值（激发光波长355nm，发射光波长465nm）。

2.4.4.计算各检测孔中药物对流感病毒复制的抑制效率

抑制率（%）=100-（样品孔-空白对照）/（酶活对照-空白对照）* 100%

结果显示：非诺贝特明显抑制了流感病毒复制，并且呈剂量依赖关系(见图3)。

实施例2：非诺贝特抗流感病毒时间点分析

本实验通过非诺贝特对不同生活周期的流感病毒的作用效果进行评价，初步判断非诺贝特作用机制。

1.将MDCK细胞按1.5×10⁴细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养14～18h后，待细胞长成单层后备用。将孔板中培养基弃去，PBS液洗两遍，加100TCID₅₀/孔（100μl）病毒4℃孵育1h。待细胞吸附后，用PBS洗五遍，转入37℃培养箱中培养。分别在37℃培养-2，0，1，2，3，4，6，8h后加入相同浓度的药物。继续培养至24小时后取各实验孔上清进行神经氨酸酶活性检测。

2 黑色96孔微量板中加入40μl缓冲液（32．5mmol/L MES，pH 6.5，4mmol/L CaCl₂）配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各实验孔培养上清20μl，37℃避光孵育60min，加入反应终止液（0.014μM NaOH，83%乙醇）100μl/孔，多功能检测仪上测定荧光值（激发光波长355nm，发射光波长465nm）。

3.计算各检测孔中对流感病毒复制的抑制效率

抑制率（%）=100-（样品孔-空白对照）/ （酶活对照-空白对照）* 100%

结果显示：提前药物孵育细胞对病毒复制无影响，非诺贝特在感染早期阶段给药能够明显抑制流感病毒的复制，提示其抗病毒效果主要作用于早期进入或复制阶段。

Claims

1. 非诺贝特在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的流感病毒为甲型流感病毒或乙型流感病毒。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物是以非诺贝特或非诺贝特酸作为药物活性成分，制成任何一种药学上可接受的剂型。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射液、缓释制剂、控释制剂或纳米制剂等。