CN114732821A - 西多福韦的前药在制备防治非洲猪瘟药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽药领域，具体公开了化合物西多福韦的前药在制备防治非洲猪瘟药物中的应用。本发明发现，化合物Brincidofovir能够显著抑制ASFV结构蛋白的表达，从而阻止病毒感染宿主细胞，能够起到抑制ASFV感染的作用，从而对感染非洲猪瘟病毒的细胞具有显著的保护作用，具有显著的抗非洲猪瘟病毒活性并呈剂量依赖关系。Brincidofovir可以作为有效成分制备防治非洲猪瘟的新药，其应用前景广阔。

Description

西多福韦的前药在制备防治非洲猪瘟药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及西多福韦的前药在制备防治非洲猪瘟药物中的应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的一种家猪和野猪的急性、烈性、高度接触性的传染病，其临床症状从急性、亚急性到慢性不等，以高热、皮肤发绀、全身脏器广泛性出血、呼吸障碍和白细胞减少为主要特征，发病率和死亡率几乎达100％。该病属于世界动物卫生组织(OIE)规定的必须上报的动物疾病之一，在我国被列为“一类动物疫病”。非洲猪瘟自1921年在非洲东部的肯尼亚首次发现，至今近一个世纪的时间里，该病陆续蔓延至非洲、欧洲、美洲、亚洲等地区，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。2018年8月，我国北方首次爆发了非洲猪瘟疫情，随后蔓延至全国，累计扑杀生猪共计超过60余万头，造成直接经济损失超过10亿元人民币，间接损失尚无法估计。非洲猪瘟疫情的爆发给我国养猪业造成毁灭性的打击，对社会经济构成了巨大威胁。非洲猪瘟病毒是目前唯一已知的能够通过虫媒传播的大型双链DNA病毒，且具有独特的5层(外膜、衣壳、双层内膜、核心壳层和基因组)结构，使其对环境、消毒剂、药物等具有强抵抗力。

由于目前没有有效的商品化疫苗和抗病毒特效药物，非洲猪瘟的防控仅依赖于生物安全措施，一旦发生疫情，只能通过扑杀手段控制疫情传播和蔓延，从而导致巨大的经济损失。因此，研制有效的ASF疫情控制措施是目前养猪业亟待解决的问题。

布林西多福韦，化学名称为：[[(1S)-2-(4-氨基-2-氧代-1(2H)-嘧啶基)-1-(羟甲基)乙氧基]甲基]膦酸单[3-(十六烷氧基)丙基]酯，化学式：C₁₂H₅₂N₃O₇P，相对分子质量：561.35，英文名Brincidofovir(CMX001；HDP-CDV；BCV)，为西多福韦(Cidofovir；CDV)磷脂化的前药，CDV和BCV的化学结构式如下：

由于Cidofovir的生物利用度差，同时具有严重的毒副作用，可导致严重的不可逆的肾毒性造成其难以被广泛使用。Brincidofovir作为Cidofovir的前药，通过磷脂化修饰使其可以在细胞内降解释放有效活性成分Cidofovir，从而提高了Cidofovir的活性，也提高了其口服生物利用度。与Cidofovir相比，Brincidofovir具有可口服、对肾脏伤害较小、安全等优势。目前未见Brincidofovir抗非洲猪瘟病毒作用的研究报道，也未见公开的相关专利。

发明内容

本发明通过研究发现，化合物Brincidofovir能够显著抑制ASFV结构蛋白的表达，从而阻止病毒感染宿主细胞，能够起到抑制ASFV感染的作用。

本发明的第一个目的是：

提供了西多福韦的前药或其药学上可接受的盐在制备抗非洲猪瘟病毒药物或防治非洲猪瘟药物中的应用。

优选地，所述应用是将西多福韦的前药或其药学上可接受的盐为有效成分配以辅助剂制备成药物制剂，所述药物制剂的剂型为临床上可接受的任何剂型，如注射剂、粉剂、颗粒剂或片剂。

本发明的第二个目的是：

提供了西多福韦的前药或其药学上可接受的盐在抑制ASFV结构蛋白的表达中的应用。

本发明的第三个目的是：

提供了西多福韦的前药或其药学上可接受的盐在制备抗非洲猪瘟病毒药物或防治非洲猪瘟药物中的应用，所述西多福韦的前药选自以下结构式所示物质中的任意一种：

；

其中R为-CH₂-CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)-C₂H₅、-CH₃、-H、-CH(CH₃)₂，m＝3且n＝13～15，或m＝2且n＝17。

优选地，所述应用是将西多福韦的前药或其药学上可接受的盐为有效成分配以辅助剂制备成药物制剂，所述药物制剂的剂型为临床上可接受的任何剂型，如注射剂、粉剂、颗粒剂或片剂。

本发明的第四个目的是：

提供了西多福韦的前药或其药学上可接受的盐在抑制ASFV结构蛋白的表达中的应用，所述西多福韦的前药选自以下结构式所示物质中的任意一种：

；

其中R为-CH₂-CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)-C₂H₅、-CH₃、-H、-CH(CH₃)₂，m＝3且n＝13～15，或m＝2且n＝17。

进一步地，提供了西多福韦的前药或其药学上可接受的盐在制备抗非洲猪瘟病毒药物或防治非洲猪瘟药物中的应用，所述西多福韦的前药的结构式如下：

进一步地，提供了西多福韦的前药或其药学上可接受的盐在抑制ASFV结构蛋白的表达中的应用，所述西多福韦的前药的结构式如下：

上述西多福韦的前药或其药学上可接受的盐在制备抗非洲猪瘟病毒属病毒药物或防治非洲猪瘟病毒属病毒病药物中的应用。

本发明首先利用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测Brincidofovir对猪肺泡巨噬细胞(PAM)的毒性，确定其安全工作浓度。随后，利用建立的ASFV细胞感染模型，评价Brincidofovir对感染ASFV的PAM细胞的保护效果。评价方式主要为荧光定量PCR(qPCR)试验、半数红细胞吸附(HAD₅₀)试验、间接免疫荧光(IFA)试验以及蛋白免疫印迹(WesternBlot)试验等。

本发明通过体外细胞毒性试验发现化合物Brincidofovir具较低的细胞毒性作用，化合物Brincidofovir体外细胞毒性试验中半数细胞毒性剂量(CC₅₀)为58μM。

本发明通过体外细胞试验发现Brincidofovir具有显著的抑制ASFV结构蛋白表达、抑制ASFV复制的作用，抑制效果随着药物浓度的增加而增强。化合物Brincidofovir体外细胞试验中抗ASFV的半数有效剂量(IC₅₀)为2.76nM。

本发明提出的化合物Brincidofovir或其药学上可接受的盐用于防治非洲猪瘟具有如下优点：

1、Brincidofovir在体外对ASFV具有极强的抑制活性，在2.76nM的浓度下还具有显著的抗ASFV活性，表明其具有高效的抗ASFV作用。

2、Brincidofovir具较低的细胞毒性作用，化合物Brincidofovir体外细胞毒性试验中半数细胞毒性剂量(CC₅₀)为58μM，在高于有效浓度2000倍的情况下才显示出较低的细胞毒性作用。

3、Brincidofovir的原材料来源广泛、成本低廉；其抗病毒有效成分明确、作用机制明确，安全可靠，在开发防治非洲猪瘟新药中具有巨大的潜在价值。

附图说明

图1是用CCK-8法检测不同浓度的Brincidofovir对PAM细胞的细胞毒性试验；

图2是用qPCR测定Brincidofovir在PAM细胞中对ASFV增殖的影响；

图3是用HAD₅₀测定Brincidofovir在PAM细胞中对ASFV滴度的影响；

图4是用Western Blot分析Brincidofovir在PAM细胞中对ASFV结构蛋白表达的影响；

图5是用IFA分析Brincidofovir在PAM细胞中对ASFV早期结构蛋白表达的影响。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特点、目的与功效易于明了，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明，但本发明的保护范围并不局限于以下实施方式。

以下所述试验均获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：

华中农业大学动物生物安全三级实验室(ABSL-3)已获得农业农村部关于开展非洲猪瘟病原研究的许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。

实验中使用的试剂若没有特别说明均为常见的市售试剂；实验中的操作方法若没有特别说明均为本领域知晓的操作方法。

下述实施例中所用非洲猪瘟病毒来自华中农业大学动物生物安全三级实验室(ABSL-3)已获得农业农村部关于开展非洲猪瘟病原研究的许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。下述实施例中所用非洲猪瘟病毒ASFV为基因II型ASFV。

实施例1：CCK-8法检测不同浓度的化合物Brincidofovir对PAM细胞的细胞毒性试验

以每孔1.5×10⁵个细胞将猪肺泡巨噬细胞PAM接种于96孔细胞板中，在37℃细胞培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，用含2％血清的1640培养基将化合物Brincidofovir梯度稀释，稀释后的浓度分别为：200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM；然后分别将稀释后的化合物加入上述细胞中，每个化合物浓度设置3个复孔。接着将细胞置于37℃细胞培养箱中培养72h后，在避光条件下，弃掉细胞培养基，每孔加入100μL无血清的1640培养基和10μL的CCK-8溶液(购自碧云天生物)。在37℃细胞培养箱内继续孵育0.5h后，然后使用酶标仪测定PAM细胞在450nm波长处的吸光值，最后计算PAM细胞的存活率，结果如图1。根据图1计算化合物Brincidofovir对PAM细胞的半数细胞毒性剂量(CC₅₀)为58μM，且Brincidofovir在50μM浓度下时，PAM细胞有80％以上的存活率，说明：化合物Brincidofovir的浓度在50μM以下时，不影响PAM细胞增殖。

实施例2：实时荧光定量qPCR测定化合物Brincidofovir在PAM细胞中对ASFV增殖的影响

以每孔1.5×10⁵个细胞将PAM细胞接种于96孔细胞板，接着在37℃细胞培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，用含2％血清的1640培养基将化合物梯度稀释，稀释后的浓度分别为：1μM、0.1M、0.01μM、0.001μM；将稀释后的化合物Brincidofovir和病毒ASFV(MOI＝0.1)共同加入细胞中，每个化合物浓度设置3个复孔，放置37℃培养箱中培养。72h后收取病毒样，于-80℃下反复冻融3次，进行病毒基因组的提取，通过qPCR检测病毒的拷贝数，所用引物参考团体标准《非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法》T/CVMA 5-2018，计算化合物对病毒的抑制率。

试验结果如图2所示，本发明的化合物Brincidofovir在0.001μM～1μM浓度下均对ASFV有显著抑制作用，并呈现剂量依赖，计算得到化合物Brincidofovir体外细胞试验中抗ASFV的半数有效剂量(IC₅₀)为2.76nM。

实施例3：HAD₅₀测定化合物Brincidofovir在PAM细胞中对ASFV滴度的影响

以每孔10⁶个细胞将PAM细胞接种于24孔细胞板，然后在37℃细胞培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，用含2％血清的1640培养基将化合物梯度稀释，稀释后的浓度分别为：1μM、0.1M、0.01μM、0.001μM；将化合物Brincidofovir和病毒ASFV(MOI＝0.1)的混合液加入细胞中，放置37℃培养箱中培养。72h后收取病毒样，于-80℃下反复冻融3次，进行10倍比稀释至10^-10稀释度，加入到细胞板中，然后每孔加入20μL 1％猪红细胞悬液。置于37℃恒温培养箱，每日观察红细胞凝集现象，连续观察7天。在第七天计算病毒的半数红细胞吸附剂量(HAD₅₀)，方法为Reed-Muench两氏法。

试验结果如图3所示，本发明的化合物Brincidofovir在0.001μM～1μM的浓度下，对感染PAM细胞的ASFV的病毒滴度具有显著抑制效果，且呈现明显的剂量依赖。

实施例4：蛋白质印迹法Western Blot分析化合物Brincidofovir在PAM细胞中对ASFV结构蛋白表达的影响

以每孔5×10⁶个细胞将PAM细胞接种于6孔细胞板，然后在37℃细胞培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，用含2％血清的1640培养基将化合物梯度稀释，稀释后的浓度分别为：1μM、0.1M、0.01μM、0.001μM；将化合物Brincidofovir和病毒ASFV(MOI＝0.1)的混合液加入细胞中，接着放置37℃培养箱中培养48h后，弃培养上清，用PBS缓冲液洗2遍，每孔加入200μLWestern Blot细胞裂解液，冰浴15min，收取裂解液于离心管中，4℃条件下，1200rpm离心15min，取上清进行Western Blot检测ASFV结构蛋白p30与p72蛋白与β-actin内参蛋白条带。

试验结果如图4所示，本发明的化合物Brincidofovir在0.01μM～1μM的浓度下，对感染PAM细胞的ASFV早期结构蛋白p30和晚期结构蛋白p72的表达均具有显著抑制效果，且呈现明显的剂量依赖。

实施例5：IFA分析Brincidofovir在PAM细胞中对ASFV早期结构蛋白表达的影响

以每孔10⁶个细胞将PAM细胞接种于24孔细胞板，然后在37℃细胞培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，用含2％血清的1640培养基将化合物梯度稀释，稀释后的浓度分别为：1μM、0.1M、0.01μM、0.001μM；将化合物Brincidofovir和病毒ASFV(MOI＝0.1)的混合液加入细胞中，接着放置37℃培养箱中培养72h后，弃掉96孔板中的培养液，用PBS缓冲溶液轻柔的洗涤1～2次。加入4％多聚甲醛固定液200μL，室温下固定30min，弃掉固定液，用PBS缓冲溶液洗3次，每次5min。再向其中加入200μL的0.1％TritonX-100，室温下放置20min，弃掉溶液，用PBS缓冲溶液洗3次后，加入200μL的封闭液5％BSA溶液，在37℃下孵育1h，弃掉封闭液，用PBS缓冲溶液洗3次。将ASFVp30蛋白抗体按照1:200稀释，每孔中加200μL稀释后的ASFVp30蛋白抗体，在37℃孵育1h后，PBS溶液洗3次。将FITC标记的羊抗猪IgG抗体稀释至5μg/mL，每孔加200μL，在37℃避光孵育1h，在避光条件下用PBS溶液洗3次。加入抗荧光淬灭封片液，用多功能酶标仪测定荧光值，并在荧光显微镜下观察荧光。

试验结果如图5所示，本发明的化合物Brincidofovir在0.01μM～1μM的浓度下，对感染PAM细胞的ASFV早期结构蛋白p30的表达具有显著抑制效果，且呈现明显的剂量依赖。

实施例6

Brincidofovir为Cidofovir的前药，通过磷脂化修饰使其可以在细胞内降解释放有效活性成分Cidofovir，从而提高了Cidofovir的活性，也提高了其口服生物利用度。与Cidofovir相比，Brincidofovir具有可口服、对肾脏伤害较小、安全等优势。专利CN109475497A公布了Brincidofovir的衍结构，如下所示。

根据前药设计原理及核苷类抗病毒药物的前药研究结果，分析西多福韦的结构特征，西多福韦在化学结构上有三个基团可以进行前药设计，即：

(a):碱基胞嘧啶环上的氨基；

(b):糖基侧链中的磷酸羟基；

(c):糖基侧链中的羟基；

作为Cidofovir的前药，还有以下结构式：

其中R为-CH₂-CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)-C₂H₅、-CH₃、-H、-CH(CH₃)₂，m＝3且n＝13～15，或m＝2且n＝17。

Cycle-Cidofovir为环西多福韦，该药的磷酸基与羟基脱水环合而形成西多福韦前药，较大幅度降低了该药极性，口服吸收后可改善脂水分配系数，降低肾毒性，该药在体内酶的作用下可开环转变为原药西多福韦发挥抗病毒作用，该化合物在组织合细胞中的稳定性比西多福韦高且毒性更低。

目前专利CN1690066B、CN100494207C、CN1690067B的实验均表明IV-1～VI-5的所述衍生物的口服生物利用度优于西多福韦，能在体内释放出原药西多福韦，属于Cidofovir的前药，与Brincidofovir的作用相同。

IV-1～VI-5中R基团的作用是使西多福韦的碱基胞嘧啶上的氨基与氨基酸的碳端形成肽链，其口服后可在体内酶的作用下，释放出原药西多福韦，释放出的氨基酸是人体内所需的氨基酸，无毒性；同时西多福韦被氨基酸酰化后，可改善其脂水分配系数，从而已于透过细胞膜而改善其生物利用度。

III-2～III-6中磷酸羟基与特戊酸甲酯偶联，参考了Tenofovir DF及阿地福韦双特戊酸甲酯的设计。该类化合物在体内代谢时，磷酸酯先单水解，再快速去掉CH₂OH，再水解掉另一酯，再快速释放出CH₂OH，得原药。文献表明水解过程在特戊酸是无毒的。磷酸与特戊酸甲酯偶链可改善脂水分配系数，从而降低毒副作用。

研究：(a)Beadle,J.R.；Hartline,C.；Aldern,K.A.；Rodriguez,N.；Harden,E.；Kern,E.R.；Hostetler,K.Y.Antimicrob.Agents Chemother.2002,46,2381.

及研究：(b)Hostetler,K.Y.Viruses 2010,2,2213.中以西多福韦和环-西多福韦为母核，设计一系列的长链脂肪基前药，如IIV1～IIV5中m＝3，n＝15时称为十六烷丙氧基-环-西多福韦，m＝2，n＝17时称为十八烷乙氧基-环-西多福韦，如IIIV1～IIIV5中m＝3，n＝15时称为十六烷丙氧基-西多福韦，m＝2，n＝17时称为十八烷乙氧基-西多福韦。可以掩蔽磷酸基团，明显提高药物的稳定性和脂溶性，从而提高药物的口服生物利用度，降低毒副作用。

Claims (7)

1.西多福韦的前药或其药学上可接受的盐在制备抗非洲猪瘟病毒药物或防治非洲猪瘟药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是将西多福韦的前药或其药学上可接受的盐为有效成分配以辅助剂制备成药物制剂，所述药物制剂的剂型为临床上可接受的任何剂型。

3.西多福韦的前药或其药学上可接受的盐在抑制ASFV结构蛋白的表达中的应用。

4.根据权利要求1所述的西多福韦的前药或其药学上可接受的盐在制备抗非洲猪瘟病毒药物或防治非洲猪瘟药物中的应用，所述西多福韦的前药选自以下结构式所示物质中的任意一种：

其中R为-CH₂-CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)-C₂H₅、-CH₃、-H、-CH(CH₃)₂，m＝3且n＝13～15，或m＝2且n＝17。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是将西多福韦的前药或其药学上可接受的盐为有效成分配以辅助剂制备成药物制剂，所述药物制剂的剂型为临床上可接受的任何剂型。

6.根据权利要求3所述的西多福韦的前药或其药学上可接受的盐在抑制ASFV结构蛋白的表达中的应用，所述西多福韦的前药选自以下结构式所示物质中的任意一种：

其中R为-CH₂-CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)-C₂H₅、-CH₃、-H、-CH(CH₃)₂，m＝3且n＝13～15，或m＝2且n＝17。

7.根据权利要求书1或4所述西多福韦的前药或其药学上可接受的盐在制备抗非洲猪瘟病毒属病毒药物或防治非洲猪瘟病毒属病毒病药物中的应用。

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