CN106031731A - 牛磺熊去氧胆酸的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，主要提供了牛磺熊去氧胆酸的新用途。该新用途是通过抑制病毒经内吞作用进入宿主细胞，实现预防、治疗病毒感染和抗损伤、抗纤维化作用。本发明提供了牛磺熊去氧胆酸在治疗急性肺损伤、肺纤维化的药物中的应用。拓宽了牛磺熊去氧胆酸的应用范围，也为病毒感染患者提供了一种新的药物选择。本发明确证了牛磺熊去氧胆酸能够有效预防和治疗H5N1型禽流感病毒、人腺病毒和扎伊尔型埃博拉病毒，同时明确了牛磺熊去氧胆酸防治肺纤维化效果显著优于氯喹。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及牛磺熊去氧胆酸的新用途。
背景技术
牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)化学名称为3α，7β二羟基胆烷酰-N-牛磺酸，是由熊去氧胆酸(UDCA)的羧基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型胆汁酸。TUDCA为白色结晶，易溶于水。1902年首次自熊胆中发现TUDCA，它是熊胆中标志性有效成分。熊胆为中医药瑰宝，为各胆之首，位列中国四大动物药材之首，拥有上千年用药历史，素有“药中黄金”之美誉。《本草纲目》记载：熊胆，味苦、性寒、无毒，可清热、平肝、利胆、明目、杀虫。现代研究表明，TUDCA具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用。熊胆中天然的TUDCA是一种胆固醇结石的溶解剂，能减少肝脏对胆固醇的分泌，降低胆汁中胆固醇的饱和度，促进胆汁酸的分泌，增加胆固醇在胆汁中的溶解度，使胆固醇结石溶解或防止结石形成。但现有技术的研究结果并未表明，TUDCA能够治疗或预防病毒感染或肺纤维化。
流感病毒属于RNA病毒的正粘病毒科流感病毒属，分为甲、乙、丙3个型。其中以鸟禽类为天然宿主的禽流感病毒属于甲型流感病毒。根据流感病毒表面的血凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同可将流感病毒划分为不同的亚类，现在已知有18种HA的亚类和11种NA的亚型，他们之间可以任意组合从而构成不同亚型的流感病毒。HA和NA在流感病毒对宿主细胞受体识别、病毒进入和病毒释放等过程中起着重要的作用。禽流感病毒根据其致病能力的不同分为高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)，其中HPAIV是由H5和H7亚毒株引起的疾病。高致病性禽流感因其在禽类中传播快、危害大、病死率高，被世界动物卫生组织列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，亦严重影响人类健康。禽流感病毒可通过消化道和呼吸道进入人体传染给人。人类直接接触受禽流感病毒感染的家禽及其呼吸道分泌物、粪便、有相当数量病毒的物品，如家禽的羽毛和血液等或直接接触禽流感病毒可被感染。截止至2014年2月以来，全世界共有16个国家向世界卫生组织报告了人感染H5N1型禽流感病毒的病例，累积感染人数650人，死亡386人，病死率接近60％。不同流感毒株会因为基因重排提高致病性，同时单个氨基酸突变或几个突变组合起来也会增强病毒的毒力，病毒混合变异可能繁衍新病种，流感病如此变化多端，使人类不得不被动应战。高致病性禽流感病毒感染人体后能引起重症肺炎，诱导免疫系统的过度激活，释放大量前炎症因子，引起高细胞因子血症，导致肺部募集大量的淋巴细胞，并最终诱发急性呼吸窘迫综合征等较为严重的全身性、出血性、败血性症状，死亡率较高。通常，对高致病性禽流感疑似及确诊病例主要是在病毒感染48小时内进行抗流感病毒治疗，包括神经氨酸酶抑制剂抑制病毒释放(达菲)和离子通道M2阻滞剂(金刚烷胺和金刚乙胺)抑制甲型流感病毒脱壳或穿入宿主细胞。但现有的治疗方法对于H5N1禽流感病毒引起的肺脏及全身性损害疗效有限，到目前为止，尚无广谱的、能够应对不同流感病毒株的有效预防药物或疫苗。因此，仍需要通过更多更广泛的研究思路来寻找预防和治疗高致病性禽流感方面的药物。
腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，在自然界分布广泛。根据腺病毒的宿主范围可将腺病毒分为哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和禽类腺病毒(Aviadenovirus)。人腺病毒(human adenoviruses，HAdV)属于哺乳动物腺病毒属腺病毒科，根据免疫学、生物学和生物化学特性不同，可将其分为A～G共7个亚型，52个血清型，不同的血清型有不同的器官亲和性并引起相应的临床表现。现已知约有20余种亚型可感染人类。腺病毒感染病是世界流行的一种传播范围广泛的急性传染病，具有嗜上皮细胞性，易侵犯呼吸道及消化道粘膜、眼结膜和淋巴结，常在咽、结膜、肠道及淋巴组织内繁殖，并导致各种临床症状，如呼吸系统感染、结膜炎、胃肠炎、肝炎、出血性膀胱炎、神经系统的紊乱等。人群对腺病毒普遍易感，感染者多见于儿童，其中婴幼儿易患腺病毒肺炎，病情重，病死率高。临床上除抗病毒及对症治疗外尚无其他特效治疗方法。
埃博拉出血热是指由埃博拉病毒引起的，以发热、出血倾向及肾脏损害为主要临床特征的一种严重疾病，是目前已知的毒性最大的病毒性疾病之一，病死率高达50～90％。目前已确定了埃博拉病毒的5个亚型：埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire，ZEBO)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan，SEBO)、埃博拉-莱斯顿型(EBO-R，REBO)、埃博拉-科特迪瓦型(EBO-CI，ICEBO)和埃博拉-本迪布乌干达型(EBO-Bundibugyo Uganda，BEBO)，其中ZEBO致病性最强。埃博拉病毒可以通过接触传播，传播速度很快。患者一旦发病，可在24小时内死亡。主要症状可表现为高热、头痛、恶心、呕吐、腹泻、体内外大出血、全身酸痛等。它属于生物安全等级四级(BSL-4)病毒，具有极高的生物危险性。从遗传角度来看，埃博拉病毒属于单股负链RNA病毒，其基因组约19kb，具有7个基因：NP、vp35、vp40、gp、vp30、vp24和L，其中NP，VP30，VP35和RNA依赖的RNA聚合酶构成病毒体的中心，即核糖核蛋白复合物，该复合物负责转录和复制。VP40和VP24负责核壳体的形成，病毒的出芽和包装以及决定宿主范围。在这些编码的蛋白质中，GP表面糖蛋白可能介导埃博拉病毒和靶细胞的结合和融合，在埃博拉出血热的发病机理中起非常重要的作用。将GP单独转到人源化细胞或其他几种非人源化细胞中，会导致细胞变圆、脱落，并引起细胞表面粘附因子下调；将GP转入到人或猪血管中，会增加血管的通透性，从而导致血管出血。在埃博拉出血热的治疗方面，一般的抗病毒药物包括利巴韦林和干扰素都对埃博拉病毒无效。尽管有实验显示，凝固干扰素在感染埃博拉病毒的猴群中似乎可以起一些作用，但凝固干扰素在人体的效果如何尚未确定。此外，目前也尚无对人类有效的疫苗，埃博拉出血热的康复者的血清也没有太大的作用，甚至有可能带来更坏的影响。目前的治疗仍以支持治疗为主，如使病毒的侵入最小化，或及时补充损失的血小板，平衡电解质，保持血液中氧元素含量以及对并发症的治疗等。现今唯一的治疗方法为注射NPC1阻碍剂，因埃博拉病毒需通过NPC1进入细胞核进行自我复制，NPC1蛋白于细胞间进行运输胆固醇，但阻碍剂会阻挡胆固醇的运输路线造成尼曼匹克症。因此，还需要通过更多更广泛的研究思路来寻找预防和治疗埃博拉出血热疾病方面的药物。
肺纤维化病是由多种原因引起的肺部纤维化的统称，包括特发性肺纤维化、结节病、尘肺、过敏性肺炎、间质性肺炎以及药物、病原微生物或放射线导致的肺纤维化等，其中特发性肺纤维化(idiopathicpulmonary fibrosis，IPF)发病率高且不可逆转，确诊后平均存活期为2～4年，5年生存率仅为20％～40％。特发性肺纤维化的发展受到遗传和环境因素共同影响，其中一个重要的环境因素是病毒感染。研究证实，许多肺纤维化患者在病变初始均有病毒感染史，提示病毒感染在纤维化发生、发展过程中有一定作用。同时，甲型流感病毒危重患者临床治愈后胸部影像学可表现为肺纤维化。肺纤维化是一种渐进性疾病，其病理演变过程大多表现为初始的下呼吸道炎症细胞浸润，肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的损伤，伴有成纤维母细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞的增殖及细胞因子等的释放，及后期细胞外基质蛋白和胶原沉积，最终引起肺结构的损害。由于在肺纤维化的损害区有中性粒细胞、嗜酸粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞的浸润，并有多种细胞因子和炎症介质等的释放，故多认为肺纤维化是继发于炎性过程的肺结构重建。虽然这些用于肺结构重建的增生的基质纤维修复了缺损，但却不具备原来器官实质细胞的结构和功能，肺泡无法进行正常气体交换，造成患者表现为进行性呼吸困难，最终会发展为呼吸衰竭、死亡。肺纤维化发病十分隐匿，病人就诊时多半已跨越肺泡炎症阶段，基本形成肺部的纤维化，而肺组织形成纤维化的病因尚不明确。肺纤维化过程中，成纤维细胞(fibroblast)扮演着极为重要的角色。生理条件下，成纤维细胞用以构造和维持肺脏的正常形态和功能，并在组织损伤后及时大量聚集修复损伤组织。在肺纤维化过程中，尤其是大量细胞因子的刺激作用会使成纤维细胞不断地增殖和转型为肌成纤维细胞(myofibroblast)。其中最关键的因素是转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β。肌成纤维细胞是一种特殊阶段的成纤维细胞，能够大量分泌细胞外基质，分泌能力是成纤维细胞的4-5倍。其与成纤维细胞的主要区别在于是否明显表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)，因此α-SMA是肌成纤维细胞的标志物之一。随着成纤维细胞/肌成纤维细胞数目的不断增加，大量分泌的细胞外基质触发肺部的成纤维灶逐渐形成，并且逐渐取代正常的肺组织，引起肺部结构的异常，进而触发肺纤维化。除成纤维细胞外，肺泡上皮细胞向间质细胞转化，即上皮-间质转分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)也被认为是纤维化过程中局部成纤维细胞的重要来源。TGF－β是EMT的强烈诱导者，是肺纤维化进程中最主要的致病因子。研究表明在博莱霉素诱发的纤维化动物模型中，虽然TGF－β1的增加主要发生在急性肺泡炎期，但TGF－β1在肺内的短暂表达便可以诱发驱动持续、进行性的纤维化过程。肺上皮细胞在TGF－β1刺激后表现为上皮细胞的细胞间接触减少，上皮E-钙粘蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白(ZO-1)及各种角蛋白(keratins)等上皮类蛋白质下调，而纤连蛋白(fibronectin)、成纤维细胞特异蛋白(fibroblast-specific protein)1、α-SMA和波形蛋白(vimentin)等特定的间充质蛋白上调。此外，TGF－β1可激活RAS、MAPK和p38MAPK等多种激酶启动EMT。目前肺纤维化的治疗主要是延缓或逆转肺纤维化的发生、发展。糖皮质激素泼尼松是传统的治疗纤维化的主要药物，它通过抑制炎症和免疫反应，减轻肺泡炎，从而延缓肺纤维化的进程。但研究表明泼尼松仅对20％的IPF患者有效，而且常常为一过性反应，效果不甚理想。因免疫反应参与了肺间质纤维化形成，临床上亦常用免疫抑制剂，如环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢菌素A等治疗手段，但临床数据显示免疫抑制并不能改善患者的生活质量或延长其生存期。秋水仙碱是一种较早应用于临床治疗肺纤维化的药物，它不仅可以抑制成纤维细胞增殖、减少胶原合成，还具有抗炎等作用。然而也有研究发现秋水仙碱并不能明显改善患者的预后。此外，抗氧化剂、血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI)、大环内酯类抗生素、花生四烯酸环加氧酶代谢产物前列腺素E2(prostaglandin,PGE2)、及细胞因子等方法对肺纤维化的干预也有报道，但其确切疗效尚未被得到广泛认可。吡非尼酮是一种新的抗纤维化药物，已于2014年10月经美国食品和药品监督管理局(FDA)批准上市。吡非尼酮可通过降低肺血管通透性，下调细胞间黏附分子ICAM-1水平，抑制炎症细胞迁移及在转录水平抑制转化生长因子TGF-β及I型、III型胶原mRNA表达来发挥其作用。该药在实验和临床中显示出的较好的抗纤维化效应，但仍需大量临床研究才能进一步肯定其有效性。因此，肺纤维化尚无统一有效的治疗手段，仍然存在对新类型的肺纤维化治疗药物、更为完善的治疗方案的需求。
针对上述疾病，现有技术中的药物仍不能满足治疗的需求。因此，仍需要提供更多种类的药物，以满足病人多样化的需求。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种TUDCA的新用途。
为了实现本发明的目的，本发明提供了TUDCA在制备预防或治疗病毒感染的药物中的应用。
在本发明的实施例中，TUDCA预防或治疗的病毒经内吞作用进入宿主细胞而导致的病毒感染。
在一些实施例中，病毒为流感病毒、腺病毒或埃博拉病毒。
在一些实施例中，流感病毒为人流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒或禽流感病毒。
在一些实施例中，禽流感病毒为H5N1型禽流感病毒。
在另一些实施例中，H5N1型禽流感病毒为A/Jilin/9/2005H5N1型病毒株。
在一些实施例中，TUDCA用于预防H5N1型禽流感病毒的剂量为50mg/kg～500mg/kg；预防H5N1型禽流感病毒的时间为感染前6小时。
作为优选，TUDCA用于预防H5N1型禽流感病毒的剂量为250mg/kg/次。
在一些实施例中，TUDCA用于治疗H5N1型禽流感病毒的剂量为0.5mM～3mM；治疗H5N1型禽流感病毒的时间为感染后2小时内。
作为优选，TUDCA用于治疗H5N1型禽流感病毒的剂量为3mM。
在一些实施例中，腺病毒包括哺乳动物腺病毒和禽类腺病毒。
在另一些实施例中，哺乳动物腺病毒为人腺病毒。
在一些实施例中，腺病毒为血清5型的人腺病毒。
在另一些实施例中，血清5型的人腺病毒包括具有E1基因区缺失的腺病毒的重组质粒。
在另一些实施例中，重组质粒为包含腺病毒E1基因区缺失的腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV重组得到的pAdTrack-CMV/pAdEasy-1重组质粒。
在一些实施例中，埃博拉病毒为扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、莱斯顿型埃博拉病毒、科特迪瓦型埃博拉病毒或本迪布乌干达型埃博拉病毒。
在另一些实施例中，埃博拉病为扎伊尔型埃博拉病毒。
在另一些实施例中，扎伊尔型埃博拉病毒包括插入埃博拉病毒GP基因的腺病毒质粒。
在另一些实施例中，插入埃博拉病毒GP基因的腺病毒质粒为pAdTrack-CMV-GP/pAdEasy-1。
优选的，TUDCA用于预防扎伊尔型埃博拉病毒感染的剂量为0.5mM～3mM；预防扎伊尔型埃博拉病毒感染的时间为感染前24小时。
优选的，TUDCA用于治疗扎伊尔型埃博拉病毒感染的剂量为预防埃博拉病毒感染的剂量为1mM；预防扎伊尔型埃博拉病毒感染的时间为感染后48小时内。
本发明还提供了TUDCA在制备治疗急性肺损伤药物中的应用。
在一些实施例中，急性肺损伤的表现为肺水肿、肺组织病理损伤。
在一些实施例中，急性肺损伤的肺水肿或肺组织病理损伤表现由呼吸道病毒引起。
在另一些实施例中，呼吸道病毒为流感病毒。
在另一些实施例中，呼吸道病毒为禽流感病毒。
在另一些实施例中，呼吸道病毒为H5N1型禽流感病毒。
本发明提供了TUDCA在制备α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)或纤连蛋白(fibronectin)表达抑制剂中的应用。
本发明还提供了TUDCA在制备防治肺纤维化的药物中的应用。
在一些实施例中，肺纤维化的致病因子为TGF-β。
在一些实施例中，TUDCA用于预防肺纤维化的浓度为100μM～1mM。
作为优选，TUDCA用于预防肺纤维化的浓度为1mM。
在一些实施例中，TUDCA用于治疗肺纤维化的浓度为100μM～1mM。
作为优选，TUDCA用于治疗肺纤维化的浓度为1mM。
本发明还提供了TUDCA在体外筛选用于制备治疗病毒感染的药物或治疗肺纤维化的药物中的应用。
在一些实施例中，筛选具体为：建立筛选模型；将TUDCA添加到筛选模型中作为阳性对照；将待筛选药物添加到筛选模型，以及将阳性对照与待筛选药物得到的病毒感染情况进行比对。也可以作为筛选抗纤维化药物的阳性对照。
在一些实施例中，筛选模型包括来源于人体或动物的细胞。
作为优选，筛选制备治疗病毒感染的药物中，细胞为人II型肺泡上皮细胞系或人脐静脉血管内皮细胞。
优选的，细胞为人II型肺泡上皮细胞系A549细胞。
作为优选，筛选制备治疗病毒感染的药物中，筛选制备治疗肺纤维化的药物所用细胞为人胚肺成纤维细胞MRC-5。
在一些实施例中，作为阳性对照，TUDCA的添加量为0.5mM～3mM。
作为优选，作为阳性对照，TUDCA的添加量为1mM～3mM。
本发明还提供了一种抗病毒药物组合物，包括TUDCA和抗病毒药物。
作为优选，抗病毒药物为利巴韦林(Ribavirin)、芦丁(Rutin)、维生素C(Vitamin C)、高剂量甲强龙(methylprednisolone，5～3毫克/公斤体重/天)、他汀类药物(Statins)、重组线虫抗凝肽C2(rNAPc2)、法匹拉韦(T-750)、核苷类似物BCX-4430、马普(ZMapp)、TKM-埃博拉(Tekmira TKM-Ebola)、氯喹(Chloroquine)、氯底胺酚(Clomiphene)、托瑞米酚(Toremifene)、胺碘酮(Amiodarone)、决奈达隆(Dronedarone)、维拉帕米(Verapamil)、伊马替尼(Imatinib)、奥司他韦(Oseltamivir)、扎那米韦(Zanamivir)、金刚烷胺(Amantadine)、金刚乙胺(Rimantadine)、帕拉米韦(Peramivir)或干扰素中任一种或两者以上的组合物。
本发明还提供了一种治疗肺纤维化的药物组合物，包括TUDCA和治疗肺纤维化的药物。
作为优选，所述治疗肺纤维化的药物为：吡非尼酮，环磷酰胺，硫唑嘌呤，环孢菌素A，秋水仙碱，抗氧化剂，血管紧张素转化酶抑制剂，大环内酯类抗生素，前列腺素E2，或细胞因子。
本发明提供了TUDCA的一种新用途，该新用途能够通过抑制病毒经内吞作用进入宿主细胞中，从而实现预防或治疗病毒感染的作用。并提供了TUDCA在制备治疗急性肺损伤及肺纤维化的药物中的应用。不仅增加了TUDCA的应用范围，而且为病毒感染患者提供了一种新的药物选择。实验表明，采用TUDCA能够有效预防和治疗H5N1型禽流感病毒、人腺病毒和扎伊尔型埃博拉病毒。且采用TUDCA防治肺纤维化的效果优于阳性对照药物氯喹。
附图说明
图1a示出了100μM、300μM、1mM和3mM TUDCA作用于体外培养的人II型肺泡上皮细胞系A549细胞48小时后用MTT实验检测的细胞存活率，以此表示TUDCA对体外培养的人II型肺泡上皮细胞系A549细胞的毒性强弱；
图1b示出H5N1型禽流感病毒感染体外培养的人II型肺泡上皮细胞系A549细胞，在感染H5N1型禽流感病毒前24小时分别给予300μM、1mM和3mM TUDCA处理，并在感染后48小时进行MTS实验检测细胞的存活率；
图2示出了H5N1型禽流感病毒感染体外培养的人II型肺泡上皮细胞系A549细胞，分别在感染H5N1型禽流感病毒前24小时、6小时和3小时以及感染H5N1型禽流感病毒后1小时、2小时和3小时给予3mM TUDCA处理，并在感染后48小时进行MTS实验检测细胞的存活率；
图3示出了野生型C57BL/6J小鼠感染病毒对照或TCID50为1.6x106的H5N1型禽流感病毒，在感染前6小时，腹腔注射溶剂对照或250mg/kg TUDCA；记录其10天内存活情况，绘制死亡率曲线；每组10只小鼠；
图4示出了野生型C57BL/6J小鼠感染病毒对照或TCID50为1.6x106的H5N1型禽流感病毒，在感染前6小时，腹腔注射溶剂对照或250mg/kg TUDCA；在感染5天后取小鼠肺组织进行肺组织湿干比检测；每组4只小鼠；
图5示出了野生型C57BL/6J小鼠感染病毒对照或TCID50为1.6x106的H5N1型禽流感病毒，在感染前6小时，腹腔注射溶剂对照或250mg/kg TUDCA；在感染5天后取小鼠肺组织进行肺组织病理检测；每组3只小鼠；
图6a和6b示出了H5N1禽流感病毒感染体外培养的人II型肺泡上皮细胞系A549细胞，在感染H5N1型禽流感病毒前24小时给予3mM TUDCA处理，并分别在感染后3小时、6小时和12小时时通过免疫荧光染色法检测A549细胞感染H5N1型禽流感病毒的数量，并通过计算H5N1型禽流感病毒阳性细胞与细胞核总数的比值，检测A549细胞的病毒载量；其中，图6a为免疫荧光染色图；图6b是结果统计图；
图6c示出了H5N1禽流感病毒感染体外培养的人II型肺泡上皮细胞系A549细胞，在感染H5N1型禽流感病毒前24小时给予3mM TUDCA处理，并分别在感染后1小时、3小时和6小时时通过免疫荧光染色法对被感染的A549细胞中的病毒定位；
图7示出了100μM、300μM、1mM和3mM TUDCA作用于体外培养的人脐静脉上皮HUVEC细胞48小时后用MTT实验检测的细胞存活率，以表示TUDCA对体外培养的人脐静脉上皮HUVEC细胞毒性强弱；
图8示出了GFP荧光蛋白重组腺病毒Ad-△E1感染体外培养的人脐静脉上皮HUVEC细胞，在感染前24小时给予1mM TUDCA处理，并在感染后48小时进行GFP荧光蛋白的荧光强度检测，计算腺病毒进入HUVEC细胞的数量；
图9a和9b示出了埃博拉GP蛋白重组腺病毒与腺病毒载体对照感染体外培养的人脐静脉上皮HUVEC细胞，在感染前24小时给予1mM TUDCA处理，并在感染后48小时进行MTS实验检测细胞的存活率以及HUVEC细胞变圆脱落情况；其中，图9a为HUVEC细胞存活率检测结果图；图9b是HUVEC细胞变圆脱落结果统计图；
图10示出了埃博拉GP蛋白重组腺病毒与腺病毒载体对照感染体外培养的人脐静脉上皮HUVEC细胞，分别在感染埃博拉GP蛋白重组腺病毒与腺病毒载体对照后0.5小时、1小时和3小时给予1mM TUDCA处理，并在感染后48小时进行MTS实验检测细胞的存活率；
图11示出了H5N1禽流感病毒感染体外培养的人II型肺泡上皮细胞系A549细胞，在感染H5N1型禽流感病毒前48小时敲低其核受体FXR、在感染H5N1型禽流感病毒前24小时给予3mM TUDCA处理，并分别在感染后0小时、12小时和24小时收集A549细胞裂解液，通过免疫印记法检测A549细胞在上述不同实验条件下感染H5N1型禽流感病毒后的病毒载量，以H5N1型禽流感病毒的NS1成分作为病毒载量检测指标，β-actin作为实验内参；
图12a示出了3mM TUDCA作用24小时后对pH依赖的内吞过程特异性感受器pHrodo探针的调节作用，孵育pHrodo探针20分钟和60分钟后，通过流式细胞仪检测的荧光强度来表示pH依赖的内吞作用的强弱；
图12b示出了3mM TUDCA作用24小时后对非pH依赖的内吞过感受器绿色荧光葡聚糖探针的调节作用，孵育绿色荧光葡聚糖探针20分钟和60分钟后，通过流式细胞仪检测的荧光强度来表示非pH依赖的内吞作用的强弱；
图13示出了100μM、300μM、1mM和3mM TUDCA作用于体外培养的人胚肺成纤维MRC-5细胞60小时后用MTS实验检测的细胞存活率，以表示TUDCA对体外培养的人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞毒性强弱；
图14a示出了使用3ng/ml TGF-β1诱导体外培养的人胚肺成纤维MRC-5细胞48小时，形成体外肺纤维化模型；分别在暴露于TGF-β1前12小时、1小时和暴露后3小时、6小时给予100μM、300μM和1mM TUDCA以及阳性对照药物10μM氯喹处理；在暴露于TGF-β148小时后收取总RNA样本，通过逆转录反应获得cDNA，使用时时定量PCR技术检测α-SMAmRNA表达情况；
图14b示出了使用3ng/ml TGF-β1诱导体外培养的人胚肺成纤维MRC-5细胞48小时，形成体外肺纤维化模型；分别在暴露于TGF-β1前12小时、1小时和暴露后3小时、6小时给予100μM、300μM和1mM TUDCA以及阳性对照药物10μM氯喹处理；在暴露于TGF-β148小时后收取总蛋白样本并通过western blot技术检测α-SMA表达情况；
图15a示出了使用3ng/ml TGF-β1诱导体外培养的人胚肺成纤维MRC-5细胞48小时，形成体外肺纤维化模型；分别在暴露于TGF-β1前12小时、1小时和暴露后3小时、6小时给予100μM、300μM和1mM TUDCA以及阳性对照药物10μM氯喹处理；在暴露于TGF-β148小时后收取总RNA样本，通过逆转录反应获得cDNA，使用时时定量PCR技术检测fibronectinmRNA表达情况；
图15b示出了使用3ng/ml TGF-β1诱导体外培养的人胚肺成纤维MRC-5细胞48小时，形成体外肺纤维化模型；分别在暴露于TGF-β1前12小时、1小时和暴露后3小时、6小时给予100μM、300μM和1mM TUDCA以及阳性对照药物10μM氯喹处理；在暴露于TGF-β148小时后收取总蛋白样本并通过western blot技术检测fibronectin表达情况。
具体实施方式
本发明提供了TUDCA的新用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
现有技术中，TUDCA在临床上主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎，上述用途主要是利用了TUDCA作为一种胆固醇结石的溶解剂，能减少肝脏对胆固醇的分泌，降低胆汁中胆固醇的饱和度，促进胆汁酸的分泌的性质。
而病毒进入宿主细胞是病毒致病的先决条件，而多数病毒家族是利用宿主细胞的内吞作用侵入宿主细胞的。病毒细胞根据其是否存在包膜分为有包膜病毒和无包膜病毒，其中，有包膜病毒如流感病毒和埃博拉病毒在入侵宿主细胞时，需要将病毒包膜和宿主细胞膜或内体膜融合，然后将病毒核酸释放到细胞质中进行复制和翻译。流感病毒是通过其表面HA糖蛋白与含唾液酸的宿主细胞膜表面受体介导的内吞作用完成病毒包膜与宿主细胞膜的融合，并利用网格蛋白依赖的胞吞通路内化，并在后期通过融合蛋白的暴露促进病毒与内吞泡膜的融合，将病毒核糖核蛋白复合体释放至宿主细胞内。埃博拉病毒感染宿主细胞的过程与跨膜蛋白GP关系密切。埃博拉病毒根据宿主细胞大小以及病毒颗粒大小的不同选择内吞作用或巨胞饮作用(也是一种特殊的内吞作用)完成内化。网格蛋白介导的内吞作用先是由接头蛋白和网格蛋白招募、在细胞膜内表面聚集开始，其后被网格蛋白包裹的有被小凹陷发生内陷、缢缩和脱壳，并将病毒释放。较大的埃博拉病毒颗粒很难通过内吞作用进入细胞，必须借助巨吞饮作用。埃博拉的GP蛋白首先与细胞膜受体结合，通过激活细胞膜表面的肌动蛋白调节分子，引发细胞表面褶皱并开始巨吞饮作用，将病毒内化释放。而无包膜的腺病毒感染宿主细胞则是通过其纤维蛋白与宿主受体结合介导的内吞作用完成内化，继而腺病毒通过一系列破坏内吞泡膜过程将泡膜水解，并将病毒释放至宿主细胞内。
本发明采用pH敏感的pHrodo染料探针作为内吞过程的特异性感受器，来检测细胞TUDCA对宿主细胞的内吞过程的抑制作用。pHrodo染料进入细胞的过程也是需要经过与病毒进入宿主细胞类似的内吞过程的，因此，用pHrodo染料探针进入细胞内的内涵体中的过程来模拟病毒经宿主细胞内吞进入细胞内的过程。pHrodo染料是内涵体特异性的糖蛋白，内涵体中pH值低，显酸性。而pHrodo染料探针在pH值呈中性的环境中不发荧光，而在酸性环境下发荧光，因而利用其在低pH值下的荧光信号增强的特点，可以检测内吞过程及TUDCA对这一过程的调节作用。本发明通过实验证实：预防性给予人II型气道上皮细胞系A549细胞TUDCA 24小时后可以有效减少pHrodo的荧光强度。由此证明TUDCA在减缓细胞内吞过程中发挥重要作用。表明TUDCA能够有效抑制宿主细胞对病毒的内吞途径，进而阻断病毒进入宿主细胞，从而抑制病毒感染。由于宿主细胞的内吞机制适用于所有病毒，不具有病毒特异性亦不易产生耐药，因此，TUDCA通过作用于广谱抗病毒药物的潜在靶点而具有广谱的抗病毒作用。可见，TUDCA可以作为广谱的阻断病毒经内吞过程进入宿主细胞的抗病毒药物。
TUDCA在制备预防或治疗病毒感染的药物中的应用。
在本发明的实施例中，TUDCA预防或治疗的病毒经内吞作用进入宿主细胞而导致的病毒感染。
在一些实施例中，病毒为流感病毒、腺病毒或埃博拉病毒。
在一些实施例中，流感病毒为人流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒或禽流感病毒。
根据TUDCA均能抑制H5N1流感病毒进入A549细胞并降低A549细胞的死亡率，且能抑制腺病毒进入人脐静脉血管内皮细胞，降低人脐静脉血管内皮细胞的死亡率；以及降低埃博拉病毒引起的细胞死亡率，发明人认为，在上述流感病毒、腺病毒和埃博拉病毒感染存在共同的致病机制，包括通过内吞途径进入宿主细胞，而TUDCA刚好能够作用于该内吞机制中的某一环节，从而能够缓解或抑制上述病毒引起的症状。因此，TUDCA能够用于制备抑制包括流感病毒、腺病毒以及埃博拉病毒经内吞作用进入宿主细胞的药物。
在另一些实施例中，禽流感病毒为H5N1型高致病性禽流感病毒。
在另一些实施例中，H5N1型高致病性禽流感病毒为A/Jilin/9/2005H5N1型病毒株。
本发明首先利用TUDCA预防野生型小鼠后再用H5N1型禽流感病毒攻击小鼠，结果表明，TUDCA对小鼠在感染H5N1型禽流感病毒A/Jilin/9/2005(H5N1)株导致的急性肺组织损伤中发挥了重要保护作用，而对照PBS缓冲液在禽流感病毒A/Jilin/9/2005(H5N1)株感染导致小鼠死亡的过程中未发挥显著预防作用。同时，本发明利用TUDCA预防人II型气道上皮细胞系A549细胞再用H5N1型禽流感病毒感染A549细胞，结果显示TUDCA可以有效抑制H5N1型禽流感病毒进入人II型气道上皮细胞，从而发挥保护作用。因此，TUDCA对H5N1型高致病性禽流感病毒的抑制作用在临床上的应用价值更高。
本发明亦采取先感染H5N1型禽流感病毒，随后分别在染毒1小时、2小时及3小时后治疗性给予TUDCA，结果显示治疗性给予TUDCA在H5N1型禽流感病毒感染早期具有保护作用。因此，本发明证明了TUDCA在阻止或减缓H5N1型禽流感病毒感染所造成的严重后果的过程中发挥预防和早期治疗的作用。在本发明一种典型的实施方式中，提供了TUDCA用于延缓H5N1型禽流感病毒进入人呼吸道宿主细胞，进而降低H5N1型禽流感病毒感染所致的肺组织损伤的药物应用，该应用能够以禽流感病毒为对象在体外开展用于制备预防和治疗禽流感病毒感染的药物研究，亦可应用于预防和治疗其他类型的流感病毒引起的呼吸道感染。
并且，向4周龄的C57BL/6J小鼠中注射50～500mg/kg的TUDCA。发现将TUDCA的用量按照小鼠的体重控制在上述范围内，均能起到限制的抑制H5N1型禽流感病毒感染的作用；而用量过少，则抑制作用不明显；用量过多，造成药物浪费或其他副作用。
作为优选，TUDCA用于预防H5N1型禽流感病毒的剂量为250mg/kg/次；预防H5N1型禽流感病毒的时间为感染前6小时。
本发明通过实验表明：在H5N1型禽流感病毒感染前24小时、6小时和3小时分别提前预防性给予3mM TUDCA及病毒感染后1小时、2小时分别治疗性给予3mM TUDCA可以明显缓解H5N1型禽流感病毒所致的细胞死亡，而病毒感染后3小时治疗性给予3mMTUDCA则无此效果。
在本发明实施例中，TUDCA用于治疗H5N1型禽流感病毒的剂量为0.5mM～3mM；治疗H5N1型禽流感病毒的时间为感染后2小时内。
作为优选，TUDCA用于治疗H5N1型禽流感病毒的剂量为3mM。
并且，本发明将腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV与腺病毒骨架载体pAdEasy-1重组(以下简称Ad-△E1)并介导绿色荧光蛋白表达。TUDCA的干预在预防腺病毒Ad-△E1感染所导致的损伤中，有可能发挥重要作用。本发明利用TUDCA预防人脐静脉血管内皮细胞Human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)后再用腺病毒Ad-△E1攻击HUVEC，结果说明，TUDCA在减缓Ad-△E1腺病毒进入HUVEC细胞中发挥了重要作用，而对照PBS缓冲液在腺病毒Ad-△E1进入HUVEC的过程中未发挥显著作用。因此，证明了TUDCA的预防可以阻止或减缓腺病毒感染所造成的症状。
在一些实施例中，腺病毒包括哺乳动物腺病毒和禽类腺病毒。
在另一些实施例中，哺乳动物腺病毒为人腺病毒。
在一些实施例中，腺病毒为血清5型的人腺病毒。
在另一些实施例中，血清5型的人腺病毒包括具有E1基因区缺失的腺病毒的重组质粒。
在另一些实施例中，重组质粒为包含腺病毒E1基因区缺失的腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV重组得到的pAdTrack-CMV/pAdEasy-1重组质粒。
在另一些实施例中，埃博拉病为扎伊尔型埃博拉病毒。
在另一些实施例中，扎伊尔型埃博拉病毒包括插入埃博拉病毒GP基因的腺病毒质粒。
在另一些实施例中，插入埃博拉病毒GP基因的腺病毒质粒为pAdTrack-CMV-GP/pAdEasy-1。
本发明将介导埃博拉病毒进入宿主细胞的扎伊尔型埃博拉病毒糖基化蛋白GP的基因序列插入pAdTrack-CMV质粒中，构建pAdTrack-CMV-GP质粒。将pAdTrack-CMV-GP质粒及不含GP基因的对照空载体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1重组，分别构建pAdTrack-CMV-GP/pAdEasy-1重组质粒(埃博拉GP蛋白质粒)和pAdTrack-CMV/pAdEasy-1重组质粒(以下简称对照质粒)。本发明利用TUDCA预防HUVEC细胞后再用埃博拉GP蛋白质粒攻击HUVEC，结果说明，TUDCA在预防埃博拉GP蛋白质粒介导的埃博拉病毒GP所致的HUVEC细胞变圆、脱落以致死亡的过程中发挥重要作用，而对照质粒在此过程中未发挥显著作用。因此，本发明证明了TUDCA的预防可以阻止或减缓埃博拉GP所致的HUVEC细胞变圆、脱落，甚至死亡的严重后果。在本发明的病毒感染的实际研究中，通过借助于携带有腺病毒和扎伊尔型埃博拉病毒的基因组片段的重组质粒来模拟病毒感染的过程。在本发明中，人工改造过的腺病毒质粒中不包括腺病毒致病性的基因E1区，人工改造的含有埃博拉病毒GP蛋白的腺病毒质粒，TUDCA不仅能够抑制感染缺失基因E1区的腺病毒的人脐静脉血管内皮细胞的死亡率，而且能够抑制感染了携带有GP蛋白的代表埃博拉病原性的腺病毒的人脐静脉血管内皮细胞的死亡率，提高了人脐静脉血管内皮细胞的存活率。
本发明中，还采取先用埃博拉GP蛋白质粒攻击HUVEC，随后分别在加入埃博拉GP蛋白质粒早期，即0.5小时、1小时及3小时后治疗性给予TUDCA，结果显示治疗性给予TUDCA在埃博拉GP蛋白质粒攻击HUVEC早期具有良好的保护作用。因此，本发明证明了TUDCA在阻止或减缓埃博拉GP蛋白所造成的严重细胞死亡，变圆脱落以及出血热的严重后果中发挥预防和治疗的作用。在本发明一种典型的实施方式中，提供了TUDCA用于制备延缓埃博拉GP蛋白质粒进入HUVEC宿主细胞，进而降低埃博拉GP蛋白所致的血管内皮细胞损伤的药物中的应用，该应用能够以埃博拉GP蛋白为对象在体外开展用于预防和治疗埃博拉病毒感染的药物研究，亦可应用于预防和治疗其他类型出血热病毒引起的各种出血热。
优选的，TUDCA用于预防扎伊尔型埃博拉病毒感染的剂量为1mM；预防扎伊尔型埃博拉病毒感染的时间为感染前24小时。
优选的，TUDCA用于治疗扎伊尔型埃博拉病毒感染的剂量为预防埃博拉病毒感染的剂量为1mM；预防扎伊尔型埃博拉病毒感染的时间为感染后48小时内。
本发明将TUDCA注射入感染或未感染H5N1型禽流感病毒的小鼠，5天后，观察肺部组织并测量小鼠的肺脏湿重/干重比值以及肺脏病理损伤，以此考察TUDCA对H5N1型禽流感病毒所致小鼠肺水肿、肺脏病理损伤的影响。结果显示：未感染组中，野生型C57BL/6J小鼠经腹腔注射溶剂对照后，小鼠肺脏病理学无明显改变，而在感染病毒滴度为1.6x106TCID50的H5N1型禽流感病毒后的感染组中，注射了溶剂对照的小鼠在H5N1型禽流感病毒感染后第5天肺水肿严重且肺脏病理改变明显，主要表现在大量炎性细胞浸润的病理损伤，而提前6小时预防性给予了TUDCA的小鼠肺脏的水肿情况明显缓解，炎性细胞浸润状况基本恢复正常。结果说明：TUDCA在H5N1型禽流感病毒感染导致小鼠肺水肿的过程中发挥重要作用，TUDCA能够预防H5N1型禽流感病毒感染所导致的损伤。未感染组中，野生型C57BL/6J小鼠经腹腔注射溶剂对照后，小鼠肺脏病理学无明显改变，而在感染病毒滴度为1.6x106TCID50的H5N1型禽流感病毒后的感染组中，注射了溶剂对照的小鼠在H5N1型禽流感病毒感染后第5天肺脏病理改变明显，主要表现在大量炎性细胞浸润的病理损伤，而提前6小时预防性给予了TUDCA的小鼠肺脏的炎性细胞浸润状况基本恢复正常。结果表明，TUDCA在H5N1型禽流感病毒感染导致小鼠肺组织病理损伤的过程中发挥重要作用，TUDCA能够预防H5N1型禽流感病毒感染所导致的急性肺损伤。
本发明还提供了TUDCA在制备治疗急性肺损伤药物中的应用。
在一些实施例中，急性肺损伤的表现为肺水肿、肺组织病理损伤。
在一些实施例中，肺水肿或肺组织病理损伤由呼吸道病毒引起。
在另一些实施例中，呼吸道病毒为流感病毒。
在另一些实施例中，呼吸道病毒为禽流感病毒。
在另一些实施例中，呼吸道病毒为H5N1型禽流感病毒。
本发明采用TGF-β1诱导MRC-5细胞α-SMA和fibronectin的mRNA和蛋白表达升高的纤维化表型。并用不同剂量的TUDCA及阳性对照药物氯喹处理纤维化表型后，检测α-SMA和fibronectin的mRNA和蛋白表达，造模后3小时和6小时给予TUDCA可以持续抑制α-SMA mRNA的表达量。结果表明：造模型前12小时和前1小时给予TUDCA、氯喹均可以降低α-SMA mRNA的表达量；造模型前12小时和前1小时以及造模后3小时和6小时给予TUDCA和氯喹均可以降低α-SMA的蛋白表达量。造模前1小时、造模后3小时和6小时给予TUDCA可以降低纤连动蛋白mRNA的表达量，而造模前12小时给予TUDCA则效果不明显；造模型前12小时和前1小时以及造模后3小时和6小时给予TUDCA均可显著降低fibronectin的蛋白表达量。
基于上述实验结果，本发明提供了TUDCA在制备α-SMA或fibronectin表达抑制剂中的应用。
本发明还提供了TUDCA在制备防治肺纤维化的药物中的应用。
在一些实施例中，肺纤维化的致病因子为TGF-β。
本发明提供的实验结果说明，1mM TUDCA对人胚肺成纤维MRC-5细胞无明显毒副作用。小剂量100μM、中剂量300μM和高剂量1mM TUDCA在mRNA和蛋白水平上对TGF-β1诱导的α-SMA升高的纤维化表型均有明显预防和治疗作用。与阳性对照药物10μM氯喹相比，1mM TUDCA对TGF-β1诱导的纤维化表型特征性因子α-SMA的抑制作用更具优势。1mM TUDCA对人胚肺成纤维MRC-5细胞无明显毒副作用。大剂量1mMTUDCA在mRNA和蛋白水平上对TGF-β1诱导的fibronectin升高的纤维化表型均有明显预防和治疗作用，而小剂量100μM和中剂量300μM TUDCA与阳性对照药物10μM氯喹对TGF-β1诱发的fibronectin表达升高的纤维化表型的预防和治疗效果不显著。
在一些实施例中，TUDCA用于预防肺纤维化的浓度为100μM～1mM。
作为优选，TUDCA用于预防肺纤维化的浓度为1mM。
在一些实施例中，TUDCA用于治疗肺纤维化的浓度为100μM～1mM。
作为优选，TUDCA用于治疗肺纤维化的浓度为1mM。
在本发明的指导下，通过采用制药领域常用的各种筛选体系或模型，将TUDCA应用到上述筛选过程中，可用于筛选预防和/或治疗上述病毒感染所引起的疾病、或肺纤维化的药物。
本发明还提供了TUDCA在体外筛选用于制备治疗病毒感染的药物或治疗肺纤维化的药物中的应用。
上述应用通过将TUDCA作为对病毒感染的阳性药物，来筛选其他新的抗病毒药物。
在一些实施例中，筛选具体为：建立筛选模型；将TUDCA添加到筛选模型中作为阳性对照；将待筛选药物添加到筛选模型，以及将阳性对照与待筛选药物得到的病毒感染情况进行比对。
在一些实施例中，筛选模型包括来源于人体或动物的细胞。
作为优选，筛选制备治疗病毒感染的药物中，细胞为人II型肺泡上皮细胞或人脐静脉血管内皮细胞。
优选的，细胞为人II型肺泡上皮细胞系A549细胞。
作为优选，筛选制备治疗病毒感染的药物中，筛选制备治疗肺纤维化的药物所用细胞为人胚肺成纤维细胞MRC-5。
在本发明的上述应用中，上述细胞为本领域常用的实验细胞，本领域技术人员可以根据研究目的的不同，选择合适的细胞类型或细胞株系。在本发明中，上述实验细胞包括人或动物细胞。其中，动物细胞优选小鼠的肺组织细胞。在本发明一种更优选的实施例中，人细胞包括人II型肺泡上皮细胞系或人脐静脉血管内皮细胞。人II型肺泡上皮细胞系主要用于以肺组织为主要感染对象的病毒感染的研究中，而人脐静脉血管内皮细胞主要用于以出血为主要症状的病毒感染的研究中。
在本发明一种更优选的实施例中，本发明的上述在体外筛选用于制备治疗病毒感染的药物中的应用中，作为阳性对照，可以在病毒感染前或感染后，向上述细胞中添加TUDCA；或者在病毒感染前或感染后，向实验小鼠中注射TUDCA。在感染前向细胞中添加或向实验小鼠中注射TUDCA，能够显著抑制病毒进入细胞内、降低细胞死亡率，或者能够延缓小鼠急性肺损伤的肺水肿症状、改善肺组织病理损伤、降低小鼠死亡率。
在一些实施例中，作为阳性对照，TUDCA的添加量为0.5mM～3mM。
作为优选，作为阳性对照，TUDCA的添加量为1mM～3mM。
在本发明上述优选的实施例中，作为阳性对照，在病毒感染前或感染后，向A549细胞中添加0.5mM～3mM的TUDCA，优选添加3mM。在使用人脐静脉血管内皮细胞时，在病毒感染前或感染后，向实验细胞中添加0.5mM～3mM的TUDCA，优选添加1mM。在本发明的具体实验中，发现将TUDCA的细胞实验用量控制在上述浓度范围内，均能起到限制的抑制病毒感染的作用；而用量过少，则抑制作用不明显；用量过多，可能会引起其他副作用或造成药物浪费。
在本发明又一种典型的实施方式中，还提供了一种由病毒感染所导致的疾病的治疗方法，该治疗方法采用TUDCA作为药物对疾病进行治疗。该治疗方法通过TUDCA能够抑制病毒经内吞作用进入宿主细胞而有效抑制了相应病毒感染所导致的疾病，为治疗病毒感染提供了一种新的有效药物。
上述治疗方法中，TUDCA能够治疗的疾病包括但不仅限于流感病毒、腺病毒及埃博拉病毒感染所导致的疾病。上述流感病毒包括人流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒和禽流感病毒。优选，其中，禽流感病毒为H5N1型禽流感病毒，更优选为H5N1型高致病性禽流感病毒；进一步优选H5N1型高致病性禽流感病毒为A/Jilin/9/2005H5N1型病毒株。本发明通过实验证明TUDCA能够显著抑制H5N1型高致病性禽流感病毒进入人II型肺泡上皮细胞系A549细胞中，并降低细胞的死亡率，因此，TUDCA对H5N1型高致病性禽流感病毒的抑制作用在临床上的应用价值更高。
在本发明上述治疗方法中，上述腺病毒包括哺乳动物腺病毒和禽类腺病毒，优选哺乳动物腺病毒为人腺病毒。更优选，上述腺病毒为血清5型的人腺病毒，进一步地，优选血清5型的人腺病毒包括具有E1基因区缺失的腺病毒的重组质粒，更优选地，重组质粒为包含腺病毒E1基因区缺失的腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV重组得到的pAdTrack-CMV/pAdEasy-1重组质粒。
在本发明治疗方法中，上述埃博拉病毒包括扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、莱斯顿型埃博拉病毒、科特迪瓦型埃博拉病毒以及本迪布乌干达型埃博拉病毒。优选地，埃博拉病为扎伊尔型埃博拉病毒，优选地，扎伊尔型埃博拉病毒包括插入埃博拉病毒GP基因的腺病毒质粒；更优选地，插入埃博拉病毒GP基因区的腺病毒质粒为pAdTrack-CMV-GP/pAdEasy-1。
基于本发明的研究结果，本发明还提供了一种药物组合物，包括TUDCA和抗病毒药物。
作为优选，抗病毒药物为利巴韦林、芦丁、维生素C、高剂量甲强龙、他汀类药物、重组线虫抗凝肽C2、法匹拉韦、核苷类似物BCX-4430、马普、TKM-埃博拉、氯喹、氯底胺酚、托瑞米酚、胺碘酮、决奈达隆、维拉帕米、伊马替尼、奥司他韦、扎那米韦、金刚烷胺、金刚乙胺、帕拉米韦或干扰素中任一种或两者以上的组合物。
本发明提供的抗病毒组合物能够用于抑制病毒经内吞作用进入宿主细胞。这种新的抑制病毒感染的新药物所能抑制的病毒为流感病毒、腺病毒或埃博拉病毒。
上述流感病毒包括人流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒和禽流感病毒。作为优选，其中，更优选为H5N1型高致病性禽流感病毒；进一步优选H5N1型高致病性禽流感病毒为A/Jilin/9/2005H5N1型病毒株。本发明通过实验证明TUDCA能够显著抑制H5N1型高致病性禽流感病毒进入人II型肺泡上皮细胞系A549细胞中，并降低细胞的死亡率，因此，TUDCA对H5N1型高致病性禽流感病毒的抑制作用在临床上的应用价值更高。
本发明提供药物能偶抑制的腺病毒为哺乳动物腺病毒或禽类腺病毒，优选的，哺乳动物腺病毒为人腺病毒。更优选，上述腺病毒为血清5型的人腺病毒，进一步地，优选血清5型的人腺病毒包括具有E1基因区缺失的腺病毒的重组质粒，更优选地，重组质粒为包含腺病毒E1基因区缺失的腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV重组得到的pAdTrack-CMV/pAdEasy-1重组质粒。
在本发明治疗方法中，上述埃博拉病毒包括扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、莱斯顿型埃博拉病毒、科特迪瓦型埃博拉病毒以及本迪布乌干达型埃博拉病毒。优选地，埃博拉病为扎伊尔型埃博拉病毒，优选地，扎伊尔型埃博拉病毒包括插入埃博拉病毒GP基因的腺病毒质粒；更优选地，插入埃博拉病毒GP基因的腺病毒质粒为pAdTrack-CMV-GP/pAdEasy-1。
将上述的抗病毒药物与TUDCA联用形成的药物组合物具有更广谱更有效的抗感染效果。其中，利巴韦林(Ribavirin)、芦丁(Rutin)、维生素C(Vitamin C)、高剂量甲强龙(methylprednisolone，5～3mg/kg/day)、他汀类药物(Statins)、重组线虫抗凝肽C2(rNAPc2)、法匹拉韦(T-750)、核苷类似物BCX-4430、马普(ZMapp)、TKM-埃博拉(TekmiraTKM-Ebola)、氯喹(Chloroquine)、氯底胺酚(Clomiphene)、托瑞米酚(Toremifene)、伊马替尼(Imatinib)以及离子通道抑制剂，如胺碘酮(Amiodarone)、决奈达隆(Dronedarone)、维拉帕米(Verapamil)是目前已知的可以用于治疗埃博拉病毒的药物；与本发明的TUDCA联用能够对埃博拉病毒感染起到更好的抗感染效果。而奥司他韦(Oseltamivir)、扎那米韦(Zanamivir)、金刚烷胺(Amantadine)、金刚乙胺(Rimantadine)、帕拉米韦(Peramivir)和干扰素是目前应用于预防流感病毒的主要药物，与这些药物组合联用对预防和/或治疗流感具有更有效的抗感染效果。
本发明还提供了一种治疗肺纤维化的药物组合物，包括TUDCA和治疗肺纤维化的药物。
作为优选，所述治疗肺纤维化的药物为：吡非尼酮，环磷酰胺，硫唑嘌呤，环孢菌素A，秋水仙碱，抗氧化剂，血管紧张素转化酶抑制剂，大环内酯类抗生素，前列腺素E2，或细胞因子。
上述药物组合物可以制备成固体组合物如片剂，可以通过将上述组合物的主要活性组分与药物赋形剂(或载体)进行混合形成。当称这些预配制组合物为均匀的时候，它是指活性组分被均匀分散在整个组合物中，以致组合物可以容易地被细分成相同有效的单位剂型如片剂、丸剂以及胶囊剂。
本发明的片剂或丸剂可以被涂布或用其它方式被复合以提供一种具有延长作用优点的剂型，或保护片剂或丸剂免受胃中酸性条件的作用。例如，片剂或丸剂可以包括内剂量和外剂量成分，后者具有在前者之上的外皮的形式。可以用肠溶层来分隔两种成分，其中肠溶层用来阻止在胃中的崩解以及允许内成分完整进入十二指肠或被延迟释放。各种材料可以用于这样的肠溶层或涂层，上述材料包括许多高分子酸以及高分子酸与这样的材料如虫胶、十六烷醇、以及醋酸纤维素的混合物。
本发明的上述药物组合物能够单独或与其他可药用的赋形剂制成各种临床上使用的剂型。本发明优选制成局部注射剂、喷雾剂、涂抹剂或生物可降解的包埋剂。注射剂、喷雾剂、和涂抹剂可以按照药学领域的常规方法制备，成品于4℃保存。而喷雾剂、涂抹剂直接在伤口处涂抹即可，使用方便。包埋剂因使用生物可降级材料，包埋材料能够直接被人体吸收，无需后续处理。
本发明的上述“治疗”是指对于哺乳动物体内疾病的任何治疗，包括：防止疾病，即造成疾病的临床症状不发展；抑制疾病，即阻止临床症状的发展；和/或减轻疾病，即造成临床症状的消退。
在本发明的上述治疗方法中，具体使用的药物TUDCA的使用量包括“预防有效量”和“治疗有效量”。“预防有效量”指在必要的剂量和时间期限内，有效实现所希望的预防结果，如预防或抑制疼痛发作的量。“治疗有效量”指在必要的剂量和时间期限内，有效实现所希望的治疗结果，如疼痛减轻的量。在一个具体的实施方案中，可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别、体重以及制剂在个体中引起所希望的应答的能力等因素来调节用量以提供最佳治疗应答剂量。治疗有效量还是治疗有益效果超过其毒性或者有害效果的量。可以根据上述对治疗有效量的描述确定预防有效量。对于任何具体受试者，可以根据个体需要和施用人的职业判断随时间调节特定剂量。
本发明提供了TUDCA的一种新用途，该新用途能够通过抑制病毒经内吞作用进入宿主细胞中，从而实现预防或治疗病毒感染的作用。并提供了TUDCA在制备治疗急性肺损伤、肺纤维化的药物中的应用。不仅增加了TUDCA的应用范围，而且为病毒感染患者提供了一种新的药物选择。实验表明，采用TUDCA能够有效预防和治疗H5N1型禽流感病毒、人腺病毒和扎伊尔型埃博拉病毒。且采用TUDCA防治肺纤维化的效果优于阳性对照药物氯喹。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：TUDCA能够预防性抑制H5N1型禽流感病毒感染所致的人II型肺泡上皮细胞系A549细胞的死亡
实验材料：
(1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、移液器、移液管、CORNING公司细胞培养耗材等。
(2)主要实验试剂：TUDCA(T0266，购自Sigma-Aldrich公司)、细胞增殖与毒性检测试剂盒(MTS，Cell titer 96Aqueous One Solution，Cell Proliferation Assay，Promega)。
(3)病毒：H5N1禽流感病毒A/Jilin/9/2004(H5N1)。
(4)实验细胞：人II型肺泡上皮细胞系A549细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所)、F-12/HAM’s培养基(购自Hyclone)、胎牛血清(26140-079，购自Invitrogen公司)、消化液(0.05％胰酶，0.02％EDTA，pH 8.0，0.22μm过滤)、青霉素、链霉素(购自中国医学科学院基础医学研究所)。
实验方法：
(1)将A549细胞培养在F-12/HAM’s培养基上，F-12/HAM’s培养基中含有10％胎牛血清、100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素，然后置于CO2含量为5％的孵箱中，37℃进行培养；
(2)在检测TUDCA对A549细胞的毒性时，加入TUDCA的前一天，将处于对数生长期的A549细胞用胰酶消化，以3×104个细胞/ml的密度均匀地分至96孔板中，补充培养基至100μl。24小时后，向96孔板每孔分别加入100μM、300μM、1mM以及3mM的TUDCA，对照用同样体积的PBS替代。给药后48小时进行MTT检测(见下述)，检测TUDCA药物对细胞的毒性影响；
(3)在检测TUDCA预防给药的有效计量时，病毒感染的前一天，将处于对数生长期的A549细胞用胰酶消化，以3×104个细胞/ml的密度均匀地分至96孔板中，补充培养基至100μl。24小时后，向96孔板每孔加入2.5μl感染复数(M.O.I.)为4的病毒原液，对照用同样体积的鸡胚尿囊液替代(由于扩增流感病毒时是在鸡胚中，所以扩增后的流感病毒是混在鸡胚尿囊液中的，因此去除去病毒的鸡胚尿囊液作为病毒对照)。在病毒感染前24小时分别将终浓度为300μM、1mM以及3mM的TUDCA加入到96孔板相应的孔中作为预防给药组(染毒前给予TUDCA)，对照用与3mM TUDCA体积相当的PBS替代，继续孵育48小时；
(4)在给药后48小时(上述2)或染毒后48小时(上述3)进行MTS检测，分别向上述预防给药组细胞和治疗给药组细胞中加入20μl MTS试剂，在37℃孵育1～2小时后，在490nm下进行检测。
实验结果：
如图1a及表1所示，100μM、300μM、1mM以及3mM TUDCA处理A549细胞48小时后，细胞活力值未发生显著性改变，说明100μM、300μM、1mM以及3mM TUDCA在此时间点(48小时)对A549细胞没有细胞毒性，A549细胞对TUDCA的耐受性良好。
表1：与溶剂对照相比TUDCA对A549细胞存活率的影响
如图1b及表2所示，H5N1型禽流感病毒感染A549细胞引起细胞生存率明显下降，在病毒感染48小时后，细胞活力值降低到对照组的50％以下，说明H5N1型禽流感病毒感染引起了细胞的大量死亡。然而，在H5N1型禽流感病毒感染前24小时分别提前预防性给予1mM以及3mM TUDCA可以明显缓解H5N1型禽流感病毒所致的细胞死亡，其中3mM TUDCA可以将A549细胞生存率从41.6％提高到82.5％，而病毒感染前预防性给予300μM TUDCA则无此效果，故推荐预防给药效果较好的3mM作为后续TUDCA实验用药浓度。
表2 H5N1型禽流感病毒感染A549细胞后的细胞生存率
注：***:示与病毒对照/溶剂对照比有显著性差异；
#，###：示与模型对照比有显著性差异；其中：
#，p<0.05；
***，###，p<0.005；
上述结果表明，TUDCA对A549细胞没有细胞毒性，A549细胞对TUDCA的耐受性良好。3mM TUDCA是预防H5N1型禽流感病毒感染导致的人II型肺泡上皮细胞系A549细胞死亡过程的优选用药浓度，并在此过程中发挥重要作用。
实施例2：TUDCA可以预防性和治疗性减少H5N1型禽流感病毒感染所致的人II型肺泡上皮细胞系A549细胞死亡率
实验材料：
(1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、移液器、移液管、CORNING公司细胞培养耗材等。
(2)主要实验试剂：TUDCA(T0266，购自Sigma-Aldrich公司)、细胞增殖与毒性检测试剂盒(MTS，Cell titer 96Aqueous One Solution，Cell Proliferation Assay，Promega)。
(3)病毒：H5N1禽流感病毒A/Jilin/9/2004(H5N1)。
(4)实验细胞：同实施例1；
实验方法：
(1)将A549细胞培养在F-12/HAM’s培养基上，F-12/HAM’s培养基中含有10％胎牛血清、100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素，然后置于CO2含量为5％的孵箱中，37℃进行培养；
(2)在病毒感染的前一天，将处于对数生长期的A549细胞用胰酶消化，以3×104个细胞/ml的密度均匀地分至96孔板中，补充培养基至100μl；
(3)24小时后，向96孔板每孔加入2.5μl M.O.I.为4的病毒原液，对照用同样体积的尿囊液替代；
(4)在病毒感染前24小时、6小时和3小时或病毒感染后1小时、2小时和3小时各时间点，分别将终浓度为3mM的TUDCA加入到96孔板相应的孔中，作为预防给药组(染毒前给予TUDCA)和治疗给药组(染毒后给予TUDCA)；
(5)在染毒后48小时进行MTS检测，分别向上述预防给药组细胞和治疗给药组细胞中加入20μl MTS试剂，在37℃孵育1～2小时后，在490nm下进行检测。
实验结果：
如图2及表3所示，H5N1型禽流感病毒感染A549细胞引起细胞生存率明显下降，在病毒感染48小时后，细胞活力值降低到对照组的50％以下，说明H5N1型禽流感病毒感染引起了细胞的大量死亡。然而，在H5N1型禽流感病毒感染前24小时、6小时和3小时分别提前预防性给予3mM TUDCA及病毒感染后1小时、2小时分别治疗性给予3mMTUDCA可以明显缓解H5N1型禽流感病毒所致的细胞死亡，而病毒感染后3小时治疗性给予3mM TUDCA则无此效果。
表3 H5N1型禽流感病毒感染A549细胞引起细胞生存率
注：**，***：示与病毒对照/溶剂对照比有显著性差异；
**，p<0.01；
***，p<0.005；
NS，没有统计学差异；
上述结果表明，TUDCA在预防和早期治疗H5N1型禽流感病毒感染导致的人II型肺泡上皮细胞系A549细胞死亡过程中发挥重要作用。
实施例3：TUDCA可以降低H5N1型禽流感病毒感染致小鼠死亡率
实验材料：
(1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、动物饲养柜、小鼠饲养笼、小动物手术器械、无菌注射器、移液器、移液管。
(2)主要实验试剂：TUDCA(T0266，购自Sigma-Aldrich公司)、对照溶剂PBS、1％(W/V)的戊巴比妥钠溶液、病毒稀释液、消毒剂(2.5％碘酒和75％酒精)。
(3)病毒：H5N1禽流感病毒A/Jilin/9/2004(H5N1)。
(4)实验动物：SPF级野生型(WT)C57BL/6J小鼠(4周龄)(购于中国药品生物制品检定所)。
实验方法：
(1)分组：
未感染组：病毒对照+溶剂对照组、病毒对照+药物组；
感染组：病毒+溶剂对照组、病毒+药物组分成四组；每组10只小鼠。
(2)小鼠腹腔注射溶剂对照或药物，每只小鼠每次按250mg/kg的剂量腹腔注射TUDCA，注射时间是在感染前6小时；
(3)安全固定小鼠，按照每克体重6μl体积腹腔注射1％(W/V)戊巴比妥钠溶液麻醉；
(4)保持麻醉小鼠头部向上向后倾斜姿势，使其鼻腔向上。用酒精消毒颈部，用剪刀剪开颈部皮肤，分离气管，用注射器注入滴度为1.6x106TCID50的H5N1型禽流感病毒；
(5)保持小鼠此体位5分钟，使病毒均匀分布于肺组织。将小鼠置于鼠笼内，待其恢复清醒后，给予水及食物；
(6)感染后观察，24小时内发生死亡的小鼠为非特异性死亡，在进行死亡率统计时不予计算在内；
(7)连续观察10天，每天记录每组小鼠死亡情况；
(8)用GraphPad Prism 5软件统计小鼠死亡率情况。
实验结果：
如图3及表4所示，未感染组中，H5N1型禽流感病毒的野生型C57BL/6J小鼠经腹腔注射溶剂对照或注射TUDCA后，连续10天的观察中，小鼠存活率一直保持在100％；而感染病毒滴度为1.6×106TCID50的H5N1型禽流感病毒的感染组中，注射了PBS溶剂的溶剂对照组小鼠，在H5N1型禽流感病毒后第3天小鼠死亡率达到60％，至第6天全部死亡。提前6小时预防给予TUDCA药物的小鼠在病毒感染后第4天开始出现死亡，第6天死亡率达到60％，并持续到第10天，死亡率依旧保持在60％。
表4 TUDCA对感染H5N1型禽流感病毒的小鼠生存率的影响
注：**,***:示与病毒对照/溶剂对照比有显著性差异；
##：示与模型对照比有显著性差异；其中：
**，##，p<0.01；
***，p<0.005；
上述结果表明，TUDCA在H5N1型禽流感病毒感染导致小鼠死亡的过程中发挥重要作用，TUDCA在预防H5N1型禽流感病毒感染所导致的损伤中，能够延缓损伤引起的死亡。
实施例4：TUDCA缓解H5N1型禽流感病毒感染后小鼠的肺水肿
实验材料：同实施例3
实验方法：
(1)分组：同实施例3，每组4只小鼠；
(2)小鼠腹腔注射溶剂对照或药物，每只小鼠每次按250mg/kg的剂量腹腔注射TUDCA，注射时间是在感染前6小时；
(3)安全固定小鼠，按照每克体重6μl体积腹腔注射1％(W/V)戊巴比妥钠溶液麻醉；
(4)保持麻醉小鼠头部向上向后倾斜姿势，使其鼻腔向上。用酒精消毒颈部，用剪刀剪开颈部皮肤，分离气管，用注射器注入滴度为1.6x106TCID50H5N1型禽流感病毒；
(5)保持小鼠此体位5分钟，使病毒均匀分布于肺组织。将小鼠置于鼠笼内，待其恢复清醒后，给予水及食物；
(6)感染后观察，24小时内发生死亡的小鼠为非特异性死亡，在进行死亡率统计时不予计算在内；
(7)感染病毒后第5天，用腹腔注射过量麻醉剂的方法使小鼠死亡；
(8)将小鼠固定于小动物手术台，移除胸部皮肤及骨骼，暴露胸腔，将小鼠完整肺脏取出，去除表面血液及多余结缔组织，称量并记录肺脏湿重；
(9)肺脏置于55℃高温组织干燥器中干烤，24小时后取出，待温度降至室温进行肺脏干重的称量并记录；
(10)计算小鼠肺脏的湿重/干重比值，进行统计分析。
实验结果：
如图4及表5所示，未感染组中，野生型C57BL/6J小鼠经腹腔注射溶剂对照或TUDCA后，小鼠肺脏湿重/干重比值均保持在正常水平，而在感染病毒滴度为1.6x106TCID50的H5N1型禽流感病毒后的感染组中，注射了溶剂对照的小鼠在H5N1型禽流感病毒感染后第5天肺脏的湿重/干重比增加7.0％，而提前6小时预防性给予了TUDCA的小鼠肺脏的湿重/干重比降至正常。
表5 TUDCA对H5N1感染后小鼠肺脏的湿重/干重比例的影响
注：**示与病毒对照/溶剂对照比有显著性差异；
##示与模型对照比有显著性差异；其中：**，##，p<0.01；
此结果表明，TUDCA在H5N1型禽流感病毒感染导致小鼠肺水肿的过程中发挥重要作用，TUDC能够预防H5N1型禽流感病毒感染所导致的损伤。
实施例5：TUDCA缓解H5N1型禽流感病毒感染后小鼠的肺组织病理损伤
实验材料：同实施例3
实验方法：
(1)分组：未感染组：溶剂对照组
感染组：病毒+溶剂对照组、病毒+药物组分成三组；每组3只小鼠；
(2)小鼠腹腔注射溶剂对照或药物，每只小鼠每次按250mg/kg的剂量腹腔注射TUDCA，注射时间是在感染前6小时；
(3)安全固定小鼠，按照每克体重6μl体积腹腔注射1％(W/V)戊巴比妥钠溶液麻醉；
(4)保持麻醉小鼠头部向上向后倾斜姿势，使其鼻腔向上。用酒精消毒颈部，用剪刀剪开颈部皮肤，分离气管，用注射器注入滴度为1.6x106TCID50H5N1型禽流感病毒；
(5)保持小鼠此体位5分钟，使病毒均匀分布于肺组织。将小鼠置于鼠笼内，待其恢复清醒后，给予水及食物；
(6)感染后观察，24小时内发生死亡的小鼠为非特异性死亡，在进行死亡率统计时不予计算在内；
(7)感染病毒后第5天，用腹腔注射过量麻醉剂的方法使小鼠死亡；
(8)将小鼠固定于小动物手术台，移除胸部皮肤及骨骼，暴露胸腔，将小鼠完整肺脏取出，去除表面血液及多余结缔组织，用4％多聚甲醛固定24小时后经梯度酒精脱水、浸蜡制成蜡块，切片5μm，常规脱蜡水化，苏木素-伊红染色后观察，保留观察结果。
实验结果：
如图5所示，未感染组中，野生型C57BL/6J小鼠经腹腔注射溶剂对照后，小鼠肺脏病理学无明显改变，而在感染病毒滴度为1.6x106TCID50的H5N1型禽流感病毒后的感染组中，注射了溶剂对照的小鼠在H5N1型禽流感病毒感染后第5天肺脏病理改变明显，主要表现在大量炎性细胞浸润的病理损伤，而提前6小时预防性给予了TUDCA的小鼠肺脏的炎性细胞浸润状况基本恢复正常。
此结果表明，TUDCA在H5N1型禽流感病毒感染导致小鼠肺组织病理损伤的过程中发挥重要作用，TUDC能够预防H5N1型禽流感病毒感染所导致的损伤。
实施例6：TUDCA可抑制H5N1进入人II型肺泡上皮细胞系A549细胞
实验材料：
(1)主要实验仪器：二级生物安全实验室、二级生物安全柜、移液器、移液管、CORNING公司细胞培养耗材、激光共聚焦显微镜(FV-1000，购自Olympus公司)。
(2)主要实验试剂：TUDCA(T0266，购自Sigma-Aldrich公司)、4％多聚甲醛(购自Sigma-Aldrich公司)、抗流感病毒NP蛋白一抗(C01321M，购自Millipore公司，稀释比例1/2000)、荧光标记二抗(Alexa488，购自Invitrogen公司,稀释比例1/500)、含细胞核燃料DAPI和抗淬灭剂的封片液(P36935，购自Life Technologies公司)。
(3)病毒：H5N1禽流感病毒A/Jilin/9/2004(H5N1)。
(4)实验细胞：同实施例1；
实验方法：
(1)将A549细胞培养在F-12/HAM’s培养基上，F-12/HAM’s培养基中含有10％胎牛血清、100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素，置于37℃下，CO2含量为5％的孵箱中培养；
(2)在病毒感染的前一天，将处于对数生长期的A549细胞用胰酶消化，以1x106个细胞/ml的密度均匀地分至放有载玻片24孔板中，补充培养基至1ml；
(3)在病毒感染前24小时将终浓度为3mM的TUDCA加入到24孔板相应的孔中，作为预防给药组；
(4)24小时后，向24孔板每孔加入M.O.I.为4的病毒原液，对照用同样体积的尿囊液替代；
(5)分别在染毒后3小时、6小时和12小时时用37℃预热的PBS清洗细胞，后用4％多聚甲醛将细胞固定；
(6)将固定的细胞用0.2％TritonX-100处理20分钟后，室温1％BSA封闭一小时；
(7)室温孵育抗流感病毒NP蛋白一抗2小时；
(8)室温孵育荧光标记二抗1小时；
(9)使用封片液封片；
(10)激光共聚焦显微镜观察，拍摄至少10个不同视野，并用Olympus Fluoview 3.0软件分析；
(11)计算H5N1型流感病毒阳性细胞数/细胞核总数，进行统计分析。
实验结果：
如图6a、6b和图6c、表6所示，H5N1型禽流感病毒感染A549细胞3小时后有近18.3％的细胞呈H5N1型禽流感病毒阳性，6小时后升至67.1％，12小时时达到86.6％。而病毒感染前24小时向细胞中预防性加入3mM TUDCA，可以明显减少进入到A549细胞内的H5N1型禽流感病毒的数量，即在感染后3小时有1.2％的细胞呈H5N1型禽流感病毒阳性，6小时有10.4％以及12小时才有18.9％的细胞呈H5N1型禽流感病毒阳性，也就是说，在细胞感染病毒前，预防性给予TUDCA药物，能够使H5N1型禽流感病毒滞后约9小时进入A549细胞。如图6c所示，H5N1型禽流感病毒感染A549细胞1小时后已有病毒颗粒进入A549细胞，3小时后被感染的细胞中病毒颗粒已经进入细胞核，代表感染的不断进展，6小时后已有病毒开始复制并回到细胞浆组装新的病毒颗粒。而病毒感染前24小时向细胞中预防性加入3mM TUDCA，可以明显将病毒阻止在A549细胞膜外，大大延迟其在A549细胞中的释放与入核复制过程。
表6 TUDCA对H5N1亚型禽流感病毒感染细胞阳性率的影响
注：**,***:示与病毒对照/溶剂对照比有显著性差异；
###：示与模型对照比有显著性差异；其中：
**，p<0.01；
***，###，p<0.005；
此结果表明，TUDCA能够显著地延迟H5N1型禽流感病毒进入人II型肺泡上皮细胞系A549细胞。
实施例7：TUDCA对体外培养的人脐静脉内皮HUVEC细胞的细胞毒作用
实验材料：
(1)主要实验仪器：二级生物安全实验室、二级生物安全柜、移液器、移液管、CORNING公司细胞培养耗材。
(2)主要实验试剂：人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC；Science II)；内皮细胞培养基(Endothelial Cell Medium，ECM，Science II)；含5％胎牛血清(FBS，0025，Science II)；1％内皮细胞生长添加剂(endothelial cell growthsupplement，1052，ECGS，Science II)和1％青霉素链霉素溶液(penicillin/streptomycinsolution，P/S，0503，Science II)；TUDCA(T0266，购自Sigma-Aldrich公司)。细胞增殖与毒性检测试剂盒(MTS，Cell titer 96Aqueous One Solution，Cell Proliferation Assay，Promega)。
实验方法：
(1)将HUVEC细胞培养在ECM中，置于37℃下，CO2含量为5％的孵箱中培养；
(2)将HUVEC用ECM重悬成单细胞溶液，种到96孔板，每孔体积100μl，每孔的细胞密度为1x105细胞/ml，然后置于37℃，CO2含量为5％的孵箱进行培养；
(3)在检测TUDCA对HUVEC细胞的毒性时，分别向96孔板每孔分别加入100μM、300μM、1mM以及3mM的TUDCA，对照用同样体积的PBS替代。给药后48小时进行MTT检测(见下述)；
(4)在给药后48小时进行MTS检测，分别向上述预防给药组细胞和治疗给药组细胞中加入20μl MTS试剂，在37℃孵育1～2小时后，在490nm下进行检测。
实验结果：
如图7及表7所示，100μM、300μM、1mM以及3mM TUDCA处理HUVEC细胞48小时后，100μM、300μM、1mM组细胞活力值未发生显著性改变，说明100μM、300μM、1mM TUDCA对HUVEC细胞没有细胞毒性，而3mM TUDCA处理HUVEC细胞48小时后细胞活力值降低到对照组的50％，显示出明显的细胞毒作用，故选用1mM作为后续HUVEC相关实验的药物浓度。
表7 TUDCA对HUVEC细胞生存率的影响
注：###：示与模型对照比有显著性差异，p<0.005；
此结果说明，1mM TUDCA对HUVEC无明显毒副作用，HUVEC细胞对1mM TUDCA的耐受性良好。3mM TUDCA对HUVEC则产生较强的细胞毒作用。
实施例8：TUDCA可抑制腺病毒Ad-△E1进入人脐静脉血管内皮细胞
实验材料：
(1)主要实验仪器：二级生物安全实验室、二级生物安全柜、移液器、移液管、CORNING公司细胞培养耗材、激光共聚焦显微镜(FV-1000，购自Olympus公司)。
(2)主要实验试剂：人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC；Science II)；内皮细胞培养基(Endothelial Cell Medium，ECM，Science II)；含5％胎牛血清(FBS，0025，Science II)；1％内皮细胞生长添加剂(endothelial cell growthsupplement，1052，ECGS，Science II)和1％青霉素链霉素溶液(penicillin/streptomycinsolution，P/S，0503，Science II)；TUDCA(T0266，购自Sigma-Aldrich公司)；加入了巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)强启动子的经过序列改造的pEAK13质粒，该质粒上带有氨卡青霉素和嘌呤霉素抗性基因，分别可用于原核细胞和真核细胞的筛选；腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV(已标记绿色荧光蛋白)；腺病毒骨架载体pAdEasy-1。
实验方法：
(1)将HUVEC细胞培养在ECM中，置于37℃下，CO2含量为5％的孵箱中培养；
(2)腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1重组，构建pAdTrack-CMV/pAdEasy-1重组质粒(以下简称Ad-△E1)。重组腺病毒构建具体步骤参照：Jinyong Luo，Zhong-Liang Deng，Xiaoji Luo，etal.A protocol for rapid generation ofrecombinant adenoviruses using the AdEasy system.Nature.2007；doi:10.1038。(注：腺病毒骨架质粒是腺病毒复制缺陷型质粒，即缺失E1基因区，简写为△E1)；
(3)将HUVEC用ECM重悬成单细胞溶液，种到96孔板，每孔体积100μl，每孔的细胞密度为1x105细胞/ml，然后置于37℃，CO2含量为5％的孵箱进行培养；
(4)在转导Ad-△E1腺病毒前24小时，将终浓度为1mM的TUDCA加入到96孔板相应的孔中，作为预防给药组；
(5)24h后转导Ad-△E1腺病毒：96孔板每孔加入2.5μl(M.O.I.为500)的病毒原液，对照用同样体积的ECM替代；
(6)在转入Ad-△E1腺病毒48小时后，移去病毒上清，37℃预热PBS清洗后，进行GFP荧光检测。
实验结果：
如图8及表8所示，Ad-△E1腺病毒感染HUVEC 48小时后，1mM TUDCA预防组中检测到进入HUVEC的Ad-△E1腺病毒量(GFP荧光强度)，比未经TUDCA预处理的溶剂对照组降低68.4％。
表8 TUDCA对Ad-△E1腺病毒进入人脐静脉血管内皮细胞的影响
注：***:示与病毒对照/溶剂对照比有显著性差异；p<0.005；
此结果说明，TUDCA在防止Ad-△E1腺病毒进入人脐静脉血管内皮细胞的过程中发挥重要作用，能显著降低腺病毒进入人脐静脉血管内皮细胞。
实施例9：TUDCA可预防性缓解埃博拉GP蛋白所致的人脐静脉血管内皮细胞死亡及变圆、脱落表型
实验材料：
(1)主要实验仪器：二级生物安全实验室、二级生物安全柜、移液器、移液管、CORNING公司细胞培养耗材、荧光显微镜。
(2)主要实验试剂：细胞增殖与毒性检测试剂盒(MTS，Cell titer 96Aqueous OneSolution，Cell Proliferation Assay，Promega)、TUDCA(T0266，购自Sigma-Aldrich公司)，其余同实施例7和实施例8。
实验方法：
(1)将HUVEC细胞培养在ECM中，置于37℃下，CO2含量为5％的孵箱中培养；
(2)将埃博拉(扎伊尔型)病毒糖蛋白GP的基因序列插入pAdTrack-CMV质粒中，构建pAdTrack-CMV-GP质粒。扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白GP的基因序列SEQ ID NO.1所示；
(3)pAdTrack-CMV-GP质粒及不含GP的对照空载体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1重组，分别构建pAdTrack-CMV-GP/pAdEasy-1重组质粒(以下简称：埃博拉GP蛋白质粒)和pAdTrack-CMV/pAdEasy-1重组质粒(对照质粒)；
(4)将HUVEC用ECM重悬成单细胞溶液，种到96孔板，每孔体积100μl，每孔细胞密度为1x105细胞/ml，然后置于37℃下，CO2含量为5％的孵箱中培养；
(5)在转导对照质粒及埃博拉GP蛋白质粒前24小时，将终浓度为1mM的TUDCA加入到96孔板相应的孔中，作为预防给药组；
(6)24小时后转导对照质粒及埃博拉GP蛋白质粒：向96孔板的每个孔中加入M.O.I.为500的病毒原液2.5μl，对照用同样体积的ECM替代；
(7)为检测细胞存活率，染毒后48小时进行MTS检测，向各组细胞中加入20μl MTS试剂，在37℃下孵育1～2小时后在490nm波长下进行检测；
(8)细胞脱落模型的建立：用荧光显微镜观察细胞形态的变化，如图9b所示，在感染48小时后，埃博拉GP蛋白质粒感染的细胞组中约50％的细胞明显变圆、脱落，而对照质粒感染的细胞组中并未受到明显的影响，长势良好。此现象表明GP蛋白所致的细胞脱落模型构建成功；
(9)计算HUVEC细胞变圆脱落比率。
实验结果：
如图9a及表9所示，在溶剂对照组中，埃博拉GP蛋白质粒感染48小时后的HUVEC的细胞活力比对照质粒感染48小时后的HUVEC的细胞活力下降50％。而在提前24小时预防给药1mM TUDCA的细胞中，埃博拉GP蛋白质粒感染48小时后的HUVEC的细胞活力与对照质粒感染48小时后的HUVEC的细胞活力相当，即提前24小时预防给予1mM的TUDCA药物能够将HUVEC细胞活力恢复到正常水平。
表9 TUDCA对埃博拉GP蛋白质粒感染细胞存活率的影响
注：**:示与病毒对照/溶剂对照比有显著性差异，p<0.01；
###：示与模型对照比有显著性差异，p<0.005；
如图9b及表10所示，在溶剂对照组中，埃博拉GP蛋白质粒感染HUVEC 48小时后，HUVEC细胞变圆、脱落比率约为52.7％，显著高于非毒性的对照质粒感染后细胞变圆、脱落的比例。而在预防给药组中，提前24小时预防性给予1mM的TUDCA药物可以将HUVEC细胞变圆、脱落比率降低到25.1％，即能够使细胞变圆、脱落的比例降低52.4％。
表10 TUDCA对埃博拉GP蛋白质粒感染细胞细胞变圆率的影响
注：**示与病毒对照/溶剂对照比有显著性差异；
##，示与模型对照比有显著性差异；其中：**，##，p<0.01；
此结果表明，TUDCA在预防埃博拉GP蛋白质粒介导的埃博拉病毒GP所致的人脐静脉血管内皮细胞死亡的过程及中发挥重要作用，能够减低细胞的死亡率。同时，TUDCA在预埃博拉GP蛋白质粒介导的埃博拉病毒GP所致的人脐静脉血管内皮细胞变圆、脱落的过程中发挥重要作用。
实施例10：TUDCA可治疗性缓解埃博拉GP蛋白所致的人脐静脉血管内皮细胞死亡
实验材料：
(1)主要实验仪器：二级生物安全实验室、二级生物安全柜、移液器、移液管、CORNING公司细胞培养耗材。
(2)主要实验试剂：同实施例7、实施例8和实施例9。
实验方法：
(1)将HUVEC细胞培养在ECM中，置于37℃下，CO2含量为5％的孵箱中培养；
(2)将埃博拉(扎伊尔型)病毒糖蛋白GP的基因序列插入pAdTrack-CMV质粒中，构建pAdTrack-CMV-GP质粒。扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白GP的基因序列SEQ ID NO.1所示；
(3)pAdTrack-CMV-GP质粒及不含GP的对照空载体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1重组，分别构建pAdTrack-CMV-GP/pAdEasy-1重组质粒(以下简称：埃博拉GP蛋白质粒)和pAdTrack-CMV/pAdEasy-1重组质粒(对照质粒)；
(4)将HUVEC用ECM重悬成单细胞溶液，种到96孔板，每孔体积100μl，每孔细胞密度为1x105细胞/ml，然后置于37℃下，CO2含量为5％的孵箱中培养；
(5)24小时后转导对照质粒及埃博拉GP蛋白质粒：向96孔板的每个孔中加入M.O.I.为500的病毒原液2.5μl，对照用同样体积的ECM替代；
(6)分别在转导对照质粒及埃博拉GP蛋白质粒后0.5小时、1小时和3小时将终浓度为1mM的TUDCA加入到96孔板相应的孔中，作为治疗给药组，溶剂对照为PBS；
(7)为检测细胞存活率，染毒后48小时进行MTS检测，向各组细胞中加入20μl MTS试剂，在37℃下孵育1～2小时后在490nm波长下进行检测。
实验结果：
如图10及表11所示，在溶剂对照组中，埃博拉GP蛋白质粒感染48小时后的HUVEC的细胞活力比对照质粒感染48小时后的HUVEC的细胞活力下降30％。而在0.5小时、1小时和3小时治疗性给予1mM TUDCA的细胞中，埃博拉GP蛋白质粒感染48小时后的HUVEC的细胞活力与对照质粒感染48小时后的HUVEC的细胞活力相当，即染毒后早期治疗性给予1mM TUDCA能够将HUVEC细胞活力恢复到正常水平。
表11 TUDCA对埃博拉GP蛋白质粒感染HUVEC的细胞活力的影响
注：*示与病毒对照/溶剂对照比有显著性差异，p<0.05；
上述结果表明，TUDCA在预防和早期治疗埃博拉GP蛋白导致的人脐静脉内皮细胞死亡过程中发挥重要作用。
实施例11：TUDCA通过其核受体FXR发挥抑制病毒进入的作用
实验材料：
(1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、移液器、移液管、CORNING公司细胞培养耗材等。
(2)主要实验试剂：TUDCA(T0266，购自Sigma-Aldrich公司)、抗NS1兔多克隆抗体(Affinity Bioreagents公司，编号PA1-43511，稀释比例1/200)、抗β-actin鼠单克隆抗体(Sigma公司，编号A5441，稀释比例1/5000)。
(3)病毒：H5N1禽流感病毒A/Jilin/9/2004(H5N1)。
(4)实验细胞：人II型肺泡上皮细胞系A549细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所)、F-12/HAM’s培养基(购自Hyclone)、胎牛血清(26140-079，购自Invitrogen公司)、消化液(0.05％胰酶，0.02％EDTA，pH 8.0，0.22μm过滤)、青霉素、链霉素(购自中国医学科学院基础医学研究所)。
实验方法：
(1)将A549细胞培养在F-12/HAM’s培养基上，F-12/HAM’s培养基中含有10％胎牛血清、100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素，然后置于CO2含量为5％的孵箱中，37℃进行培养；
(2)在加入TUDCA的前一天，将处于对数生长期的A549细胞用胰酶消化，以4×105个细胞/孔的密度均匀地分至6孔板中，补充培养基至2ml。24小时后，向相应6孔板中加入3mM的TUDCA，对照用同样体积的PBS替代。
(3)24小时后，向6孔板相应孔加入2.5μl感染复数(M.O.I.)为4的病毒原液，对照用同样体积的尿囊液替代；
(4)感染后0h、12h和24h用细胞裂解液裂解细胞收取细胞蛋白样品；
(5)利用BCA蛋白质定量试剂盒(天根，PA115)将样品蛋白浓度调成一致；
(6)加入等体积的2×SDS加样缓冲液，95℃变性10分钟，放回冰上；
(7)将蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝胶电泳；
(8)显影检测蛋白表达情况，用密理博(millipore)ECL显色液，发光时间约为10分钟。
实验结果：
如图11所示，在对照组中，H5N1型禽流感病毒载量(NS1表达量)随染毒时延长而增加，而TUDCA处理组NS1表达量较对照组则明显下降，代表其对病毒的抑制作用。当TUDCA的核受体FXR被敲低后，未经TUDCA处理组的NS1表达量与对照组无明显差异，而经TUDCA处理组中TUDCA对NS1的抑制效果则明显减低，表明TUDCA的是通过FXR发挥药效的。实验内参β-actin在各组间未见明显差异，表明实验可信。
上述结果表明，TUDCA是通过其核受体FXR发挥其对病毒进入的抑制作用。
实施例12：TUDCA抑制体外培养的人II型肺泡上皮细胞系A549细胞的内吞作用
实验材料：
(1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、移液器、移液管、CORNING公司细胞培养耗材、BD Accuri C6个人型流式细胞仪(BD Biosciences)。
(2)主要实验试剂：TUDCA(T0266，购自Sigma-Aldrich公司)、pHrodo内吞、吞噬、内化指示剂(P10361，购自Invitrogen公司)。
(3)实验细胞：同实施例1；
实验方法：
(1)将A549细胞培养在F-12/HAM’s培养基上，F-12/HAM’s培养基中含有10％胎牛血清、100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素，然后置于CO2含量为5％的孵箱中，37℃进行培养；
(2)在加入TUDCA的前一天，将处于对数生长期的A549细胞用胰酶消化，以1×105个细胞/ml的密度均匀地分至24孔板中，补充培养基至1ml。24小时后，向相应24孔板中加入3mM的TUDCA，对照用同样体积的PBS替代。给药后48小时进行流式细胞荧光检测；
(3)在给药后24小时，更换每孔培养基至250μl，并向孔中加入40μl/ml pHrodo指示剂，然后置于CO2含量为5％的孵箱中，37℃进行孵育20分钟或60分钟。20分钟或60分钟后，去除孔中指示剂，胰酶消化，并将细胞悬浮于PBS中，立即进行流式细胞荧光强度检测，选取Accuri C6流式细胞仪的FL2红色荧光通道，每个样品计50,000个细胞；
(4)Accuri C6软件进行荧光分析。
实验结果：
如图12a、图12b及表12所示，如图12a所示，未经TUDCA处理的A549细胞表现出较强的内吞活力，20分钟对pHrodo的内化作用与基值比增加25％，60分钟增加70％。而经过TUDCA处理24小时的A549细胞的内吞活力在20分钟和60分钟两个时间点均受到明显抑制，20分钟时与基值比仅增加6.7％，60分钟后增加的内吞百分比仅为38％，是未经TUDCA处理的A549细胞内吞活力的54％。如图12b所示，未经TUDCA处理的A549细胞与经过TUDCA处理的A549细胞在孵育Dextran，Alexa 488的20分钟和60分钟后表现出相同的内吞活性。
表12 TUDCA对A549内吞活力的影响
注：*,**:示与病毒对照/溶剂对照比有显著性差异；
#，##，：示与模型对照比有显著性差异；其中：
*，#，p<0.05；
**，##，p<0.01；
上述结果表明，TUDCA对A549细胞的内吞、吞噬和内化作用具有明显的抑制作用，此抑制过程可能发挥在抑制病毒进入过程中，进而降低病毒的致病力。
从本发明上述的实施例可以看出：TUDCA在预防和早期治疗H5N1型高致病性禽流感病毒、腺病毒以及埃博拉病毒感染中具有非常重要的作用，能够显著延缓病毒进入细胞内，减轻感染症状，降低细胞死亡率。因此，TUDCA能够广泛应用于各种体内或体外的针对上述病毒感染、甚至病毒类感染方面的预防或治疗研究中。
实施例13：TUDCA对体外培养的人胚肺成纤维MRC-5细胞的细胞毒作用
实验材料：
(1)主要实验仪器：二级生物安全柜、移液器、移液管、CORNING公司细胞培养耗材。
(2)主要实验试剂：人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast，MRC-5；购自协和细胞资源中心，资源编号：3111C0001CCC000044)；MEM/EBSS培养基(SH30024.01B，购自HyClone)；含10％胎牛血清(FBS，购自GIBCO，货号：1453373)；TUDCA(T0266，购自Sigma-Aldrich公司)；细胞增殖与毒性检测试剂盒(MTS，Cell titer 96Aqueous OneSolution，Cell Proliferation Assay，Promega)
实验方法：
(1)将MRC-5细胞培养在MEM/EBSS培养基中，其中含有10％FBS和100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素，并置于37℃，CO2含量为5％的孵箱中培养；
(2)将MRC-5用MEM/EBSS重悬成单细胞溶液，种到96孔板，每孔体积100μl，每孔的细胞密度为1x105细胞/ml，然后置于37℃，CO2含量为5％的孵箱进行培养；
(3)在检测TUDCA对MRC-5细胞的毒性时，分别向96孔板每孔分别加入100μM、300μM、1mM以及3mM的TUDCA，对照用同样体积的PBS替代。给药后60小时进行MTS检测(见下述)；
(4)在给药后60小时进行MTS检测，分别向上述预防给药组细胞和治疗给药组细胞中加入20μl MTS试剂，在37℃孵育1～2小时后，在490nm下进行检测。
实验结果：
如表13及图13所示，100μM、300μM、1mM以及3mM TUDCA处理MRC-5细胞60小时后，100μM、300μM、1mM组细胞活力值未发生显著性改变，说明100μM、300μM、1mM TUDCA对MRC-5细胞没有细胞毒性，而3mM TUDCA处理MRC-5细胞60小时后细胞活力值降低到对照组的50％，显示出明显的细胞毒作用，故选用1mM作为后续MRC-5相关实验的药物浓度。
表13 TUDCA对MRC-5细胞存活率的影响
注，***示与病毒对照/溶剂对照比有显著性差异p<0.005；
此结果说明，1mM TUDCA对MRC-5无明显毒副作用，MRC-5细胞对1mM TUDCA的耐受性良好。3mM TUDCA对MRC-5则产生较强的细胞毒作用。
实施例14：TUDCA可预防或缓解TGF-β1诱导的MRC-5细胞α-SMAmRNA和蛋白表达升高的纤维化表型
实验材料：
(1)主要实验仪器：二级生物安全柜、移液器、移液管、CORNING公司细胞培养耗材。
(2)主要实验试剂：人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast，MRC-5；购自协和细胞资源中心，资源编号：3111C0001CCC000044)；MEM/EBSS培养基(SH30024.01B，购自HyClone)；含10％胎牛血清(FBS，购自GIBCO，货号：1453373)；TUDCA(T0266，购自Sigma-Aldrich公司)；氯喹(C6628，购自Sigma-Aldrich公司)；TGF-β1(100-21，PEPROTECH公司)；ABI High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(4368813,购自Invitrogen)；SYBR Green Master Mix(10244023,购自Roche)；抗α-SMA小鼠单克隆抗体(Abcam，编号ab7817，稀释比例1/300)、抗GAPDH小鼠单克隆抗体抗(联科生物，Mab5465，稀释比例1/1000)。
实验方法：
(1)将MRC-5细胞培养在MEM/EBSS培养基中，其中含有10％FBS和100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素，并置于37℃，CO2含量为5％的孵箱中培养；
(2)将MRC-5用MEM/EBSS重悬成单细胞溶液，种到12孔板，每孔体积1ml，每孔的细胞密度为6x105细胞/ml，然后置于37℃，CO2含量为5％的孵箱进行培养；
(3)24小时后，向12孔板相应孔中加入3ng/mlTGF-β1诱导纤维化表型48小时，对照用同样体积的PBS替代。
(4)在使用TGF-β1诱导纤维化表型前12小时和前1小时以及诱导后3小时和6小时向相应孔中加入100μM、300μM和1mM的TUDCA以及阳性对照药物10μM氯喹。48小时后，收集总RNA样本及细胞蛋白样品；
(5)RNA样本处理：将细胞培养基弃去，用1ml PBS漂洗两次后加入1ml Trizol，吹打混匀，转移到1.5ml灭菌的EP管中。在每管中加入200μl的氯仿，充分震荡，室温静置5分钟后12000rpm，4℃离心10分钟。吸取上层液体500μl，转移到新的灭菌的EP管中，再加入400μl预冷的异丙醇，颠倒混匀。-20℃放置20分钟后12000rpm，4℃离心10分钟。弃去上清，留下沉淀，加入1ml 75％的乙醇，洗涤沉淀。12000rpm，4℃离心10分钟后去上清，留下沉淀，加入1ml 75％的乙醇，洗涤沉淀。再12000rpm，4℃离心10分钟，弃去上清，留下沉淀，晾干后加入11μl的Nuclease-free水溶解。测浓度调RNA浓度一致150(ng/μl)。逆转录(ABI逆转录试剂盒High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits)每个逆转录体系20μl,其中有2μl 10x RT buffer，2μl 10x RT Random Primers,0.8μl 25x dNTPMix(100Mm),3.2μlNuclease-free H2O，1μlMultiScribeTM Reverse Transcriptase,1μlRNaseInhibitor和10μl RNA。逆转录反应程序:25℃，10分钟；37℃，120分钟；85℃，5分钟；4℃，保持。逆转录后的cDNA稀释两倍，使用时时定量PCR反应检测α-SMA的mRNA表达量。每个反应体系为10μl，其中：5μlSYBR Green Master Mix,3μl Nuclease-freeH2O,0.5μl前向引物，0.5μl后向引物和1μlcDNA。反应程序为：55℃，2分钟；95℃10分钟，继而95℃15秒，60℃60秒，循环40次。
(6)蛋白样本处理：弃去培养基，加入1ml PBS漂洗两次后，加入75μl RIPA强裂解液，反复刮培养板底部，充分裂解出蛋白收集至1.5ml EP管，12000rpm，4℃离心10分钟。吸走上清，转移至新管，并吸取5μl用BCA法调蛋白浓度至一致。调好浓度的蛋白在95℃变性5分钟后立刻放于冰上。将10μg/18μl蛋白样本进行8％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝胶电泳。显影检测蛋白表达情况，用密理博(millipore)ECL显色液，发光时间约为10分钟。
实验结果：
如图14a及表14所示，3ng/mlTGF-β1处理48小时明显引起纤维化特征性因子α-SMAmRNA的表达量增高，表明模型建立成功。造模型前12小时和前1小时给予100μM、300μM和1mM的TUDCA以及阳性对照药物10μM氯喹均可以降低α-SMAmRNA的表达量，说明TUDCA与阳性对照药物10μM氯喹均可以预防TGF-β1引起的肺纤维化改变。与阳性对照药物10μM氯喹相比，造模前12小时给予TUDCA的预防效果弱于阳性对照药物10μM氯喹；造模前1小时给予高剂量1mM TUDCA的预防效果与阳性对照药物10μM氯喹持平。高剂量1mM TUDCA的在治疗TGF-β1引起的肺纤维化改变中的效果远远优于阳性对照药物10μM氯喹，如造模后3小时和6小时给予1mM TUDCA可以持续抑制α-SMAmRNA的表达量。
表14 TUDCA对TGF-β1诱导α-SMAmRNA表达增高模型的影响
注：*,**,***:示与病毒对照/溶剂对照比有显著性差异；
#，##，###：示与模型对照比有显著性差异；其中：
*，#，p<0.05；
**，##，p<0.01；
***，###，p<0.005；
如图14b所示，3ng/mlTGF-β1处理48小时明显引起纤维化特征性因子α-SMA的蛋白表达量增高，造模型成功。造模型前12小时和前1小时以及造模后3小时和6小时给予100μM、300μM和1mM的TUDCA和阳性对照药物10μM氯喹均可以降低α-SMA的蛋白表达量，说明TUDCA与阳性对照药物10μM氯喹均可有效预防和治疗TGF-β1引起的肺纤维化改变，与图14aα-SMA的mRNA水平结果吻合。从α-SMA的蛋白水平分析，与阳性对照药物10μM氯喹相比，造模前12小时、前1小时和造模后6小时给予高剂量1mMTUDCA对TGF-β1诱发的纤维化表型的预防和治疗效果均明显优于阳性对照药物10μM氯喹。小剂量100μM和中剂量300μMTUDCA的也有一定的预防和治疗效果，但略与高剂量1mM TUDCA。
此结果说明，1mM TUDCA对人胚肺成纤维MRC-5细胞无明显毒副作用。小剂量剂量100μM、中剂量300μM和高剂量1mM TUDCA在mRNA和蛋白水平上对TGF-β1诱导的α-SMA升高的纤维化表型均有明显预防和治疗作用。与阳性对照药物10μM氯喹相比，1mM TUDCA对TGF-β1诱导的纤维化表型特征性因子α-SMA的抑制作用更具优势。
实施例15：TUDCA可预防或缓解TGF-β1诱导的MRC-5细胞fibronectinmRNA和蛋白表达升高的纤维化表型
实验材料：
(1)主要实验仪器：二级生物安全柜、移液器、移液管、CORNING公司细胞培养耗材。
(2)主要实验试剂：人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast，MRC-5；购自协和细胞资源中心，资源编号：3111C0001CCC000044)；MEM/EBSS培养基(SH30024.01B，购自HyClone)；含10％胎牛血清(FBS，购自GIBCO，货号：1453373)；TUDCA(T0266，购自Sigma-Aldrich公司)；氯喹(C6628，购自Sigma-Aldrich公司)；TGF-β1(100-21，PEPROTECH公司)；ABI High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(4368813,购自Invitrogen)；SYBR Green Master Mix(10244023,购自Roche)；抗fibronectin小鼠单克隆抗体(Abcam，编号ab6328，稀释比例1/400)、抗GAPDH小鼠单克隆抗体抗(联科生物，Mab5465，稀释比例1/1000)。
实验方法：
(1)将MRC-5细胞培养在MEM/EBSS培养基中，其中含有10％FBS和100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素，并置于37℃，CO2含量为5％的孵箱中培养；
(2)将MRC-5用MEM/EBSS重悬成单细胞溶液，种到12孔板，每孔体积1ml，每孔的细胞密度为6x105细胞/ml，然后置于37℃，CO2含量为5％的孵箱进行培养；
(3)24小时后，向12孔板相应孔中加入3ng/mlTGF-β1诱导纤维化表型48小时，对照用同样体积的PBS替代。
(4)在使用TGF-β1诱导纤维化表型前12小时和前1小时以及诱导后3小时和6小时向相应孔中加入100μM、300μM和1mM的TUDCA以及阳性对照药物10μM氯喹。48小时后，收集总RNA样本及细胞蛋白样品；
(5)RNA样本处理：同实施例14(5)；
(6)蛋白样本处理：同实施例14(6)。
实验结果：
如图15a及表15所示，3ng/mlTGF-β1处理48小时明显引起纤维化特征性因子fibronectinmRNA的表达量增高，表明模型建立成功。造模型前1小时、造模后3小时和6小时给予高剂量1mM TUDCA均可以降低纤连动蛋白mRNA的表达量，而造模前12小时给予高剂量1mM TUDCA则效果不明显。小剂量100μM和中剂量300μM TUDCA在造模后治疗性给予TUDCA也显示出部分缓解效果。说明TUDCA可以预防和治疗TGF-β1引起的肺纤维化改变。而阳性对照药物10μM氯喹仅在造模前12小时和1小时给药时有降低fibronectinmRNA表达的效果，而在治疗性给药中则无效。
表15 TUDCA对TGF-β1诱导fibronectinmRNA表达增高模型的影响
注：*,**,***:示与病毒对照/溶剂对照比有显著性差异；
#，##，###：示与模型对照比有显著性差异；其中：
*，#，p<0.05；
**，##，p<0.01；
***，###，p<0.005；
如图15b所示，3ng/mlTGF-β1处理48小时明显引起纤维化特征性因子fibronectin的蛋白表达量增高，造模型成功。造模型前12小时和前1小时以及造模后3小时和6小时给予高剂量1mMTUDCA均可显著降低αfibronectin的蛋白表达量，表明TUDCA可有效预防和治疗TGF-β1引起的肺纤维化改变，与图15a fibronectin的mRNA水平结果基本吻合。从fibronectin的蛋白水平分析，小剂量100μM和中剂量300μM TUDCA与阳性对照药物10μM氯喹在造模前12小时、前1小时和造模后3小时及6小时对TGF-β1诱发的fibronectin表达升高的纤维化表型的预防和治疗效果不显著。
此结果说明，1mM TUDCA对人胚肺成纤维MRC-5细胞无明显毒副作用。大剂量1mMTUDCA在mRNA和蛋白水平上对TGF-β1诱导的fibronectin升高的纤维化表型均有明显预防和治疗作用，而小剂量100μM和中剂量300μM TUDCA与阳性对照药物10μM氯喹对TGF-β1诱发的fibronectin表达升高的纤维化表型的预防和治疗效果不显著。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (17)
1.牛磺熊去氧胆酸在制备预防或治疗病毒感染的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒感染的途径为病毒经内吞作用进入宿主细胞。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述病毒为流感病毒、腺病毒或埃博拉病毒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述流感病毒为人流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒或禽流感病毒。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述禽流感病毒为H5N1型禽流感病毒。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述腺病毒为哺乳动物腺病毒或禽类腺病毒；优选为哺乳动物腺病毒；更优选为人腺病毒。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述埃博拉病毒为扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、莱斯顿型埃博拉病毒、科特迪瓦型埃博拉病毒或本迪布乌干达型埃博拉病毒；优选为扎伊尔型埃博拉病毒。
8.牛磺熊去氧胆酸在制备治疗急性肺损伤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述急性肺损伤的表现为肺水肿或肺组织病理损伤。
10.牛磺熊去氧胆酸在制备α-平滑肌肌动蛋白或纤连蛋白表达抑制剂中的应用。
11.牛磺熊去氧胆酸在制备防治肺纤维化的药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述肺纤维化的致病因子为TGF-β。
13.牛磺熊去氧胆酸在体外筛选用于制备治疗病毒感染的药物或治疗肺纤维化的药物中的应用。
14.一种抗病毒药物组合物，其特征在于，包括牛磺熊去氧胆酸和抗病毒药物。
15.根据权利要求14所述的抗病毒药物组合物，其特征在于，所述抗病毒药物为利巴韦林、芦丁、维生素C、高剂量甲强龙、他汀类药物、重组线虫抗凝肽C2、法匹拉韦、核苷类似物BCX-4430、马普、TKM-埃博拉、氯喹、氯底胺酚、托瑞米酚、胺碘酮、决奈达隆、维拉帕米、伊马替尼、奥司他韦、扎那米韦、金刚烷胺、金刚乙胺、帕拉米韦或干扰素中任一种或两者以上的组合物。
16.一种治疗肺纤维化的药物组合物，其特征在于，包括牛磺熊去氧胆酸和治疗肺纤维化的药物。
17.根据权利要求16所述的治疗肺纤维化的药物组合物，其特征在于，所述治疗肺纤维化的药物为：吡非尼酮，环磷酰胺，硫唑嘌呤，环孢菌素A，秋水仙碱，抗氧化剂，血管紧张素转化酶抑制剂，大环内酯类抗生素，前列腺素E2，或细胞因子中任一种或两者以上的组合物。
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